CN111621419A - 一种模拟脑缺血再灌注病理模型的芯片 - Google Patents

Abstract

一种模拟脑缺血再灌注病理模型的芯片，属于微流控技术领域。主要包括四层，第一层为培养液以及接种细胞入口，第二层与二三层芯片之间的多孔膜共同模拟的是血脑屏障系统，每层芯片上都设有液体流入或流出的通道，第三层芯片与三四层芯片之间的多孔膜共同模拟脑组织功能单元，芯片上同样有液体流入或者流出的通道，第四层芯片为培养液出口，此外，二三层芯片以及三四层芯片之间设有细微孔道。本发明具备多细胞共培养能力，通过多孔膜和培养孔设计能够实现多细胞间通过培养液流动的细胞间不接触的信息交流，进而模拟人脑缺糖缺氧过程进而模拟人脑缺血过程、脑缺血后的再灌注。

Description

一种模拟脑缺血再灌注病理模型的芯片

技术领域

本发明属于微流控技术领域，涉及一种基于微流控芯片的脑缺血再灌注病理模型通用芯片。

背景技术

一、脑缺血再灌注危害以及微流控芯片概述

脑是人体对缺氧最为敏感的器官，脑组织缺血将会导致局部脑组织功能的损害，其损害程度与缺血时间长短及残存血流量多少有关，短期不完全性缺血只会引起可逆性损害，而长时间的完全缺血或严重缺血会引起梗死。脑缺血再灌注会给大脑带来严重的损伤，主要表现在大脑代谢异常、大脑功能障碍以及大脑的结构损伤上：缺血再灌注会导致大脑代谢异常，因为脑缺血会导致细胞内ATP的匮乏，Na⁺、Ca²⁺泵无法正常工作，从而导致细胞内外Na⁺、Ca²⁺离子浓度失调。同时，缺血时大量的糖酵解反应使乳酸迅速堆积，致使细胞内含有大量乳酸，致使细胞酸中毒。缺血还会导致细胞内Fe离子大量流出，从而引起脂质过氧化；脑缺血再灌注也会导致大脑功能障碍，缺血导致兴奋性递质含量降低，抑制性递质含量上升，出现病理性慢波，大脑信息传递功能出现障碍；此外，全脑缺血再灌注也会导致大脑组织的超微结构的破坏，比如线粒体的肿胀、钙盐的沉积、核染色质的凝集、内质网的高度肿胀，结构的明显破坏、星形细胞的肿胀等损伤，对人体造成很大伤害，甚至导致失去生命。基于这种情况我们急需了解其脑缺血再灌注病发的机理从而筛选出合适的药物来预防或者治疗病症的发生，不过新药的研究与开发是一个成本巨大、时间冗长且成功率极低的过程。传统的二维细胞实验难以构建细胞及体内组织的真实微环境，也不能实现器官之间的真实串扰。动物实验则耗时长、成本高、存在伦理争议，且由于种属差异导致测试结果难以应用到人类身上。因此，需要开发出更接近人体真实体内情况且成本较低的体外模型以应用于临床前药物筛选。药物的研发往往还需要现在体外进行反复多次的模拟实验才能进入临床实验乃至进入市场，这使得新药研发更为困难，据统计，大量的目标化合物在经过临床前的细胞实验和动物实验之后被淘汰，而进入临床一期试验的化合物仍有90％被淘汰，能够顺利通过三期临床试验的药物仅有10.8％，造成巨大的浪费。当今作为重要的脑缺血再灌注新药研发工具的体外细胞培养和动物模型主要是选取大鼠作为实验对象，通过线栓法对大鼠造成局灶性脑缺血，再通过对大鼠进行不同处理将大鼠分为假手术组，手术组以及手术后给药处理组等以形成对比来筛选药物。不过此方法培养周期长、成本高，而且使用大鼠等哺乳动物进行筛选由于其脑的结构与人脑存在差异，也并不能够保证筛选出来的药物适用于人，可见我们需要一种更为准确更为合适的模型来进行药物筛选。器官芯片是基于微流控技术制造模拟人体器官主要生理特征或功能的系统，通过将多种结构集成到一个由玻璃、硅或者高分子材料加工而成的芯片上从而实现对微米、纳米尺度的流体的精确控制的技术，能够将制备、反应、分析等过程集成到一个仅有几平方厘米甚至更小的芯片上。微流控技术在微尺度下对流体进行精准操控，实现对生物、化学等样品的微尺度试验，且因其与细胞尺寸相匹配、近生理的微环境以及时空可控性，易于通过灵活的结构设计和多样的制作方法实现细胞水平的应用而逐渐成为新型的细胞学研究的重要技术手段和平台，可实现高度集成化、小体积、高通量等目标。基于微流控技术制作器官芯片可通过微通道及泵阀之间的连接实现细胞或组织之间的串扰连接，可在体外较为真实地反映人体的部分功能。微流控芯片还可以对某些信号进行检测，目前微流控芯片领域最常见的检测方法是激光诱导荧光，其他的检测方法还有电化学检测、质谱检测、紫外检测、化学发光检测和传感器监测等。激光诱导荧光检测系统主要由激光器、激发和收集光学系统及信号采集记录系统组成，检测极其灵敏，可达单分子层面的检测水平。电化学检测一般是将电极集成到芯片上利用安培或者电导法进行检测，通过选用铂丝、铜丝、金丝以及碳纤维等作为电极材料，适用于氨基酸、碳水化合物、神经递质肽等物质的检测。电化学检测具有选择性高、灵敏度高、成本低、设备简单、易微型化的优点，因此，电化学检测在微流控芯片检测方面得到了广泛的应用，不过电泳分离电压对检测电流的干扰是目前还无法避免的一个问题。基于微流控芯片的优点以及相关的电化学检测建立脑缺血再灌注病理模型，通过电极外接设备实时检测血脑屏障芯片内皮细胞之间黏连蛋白和小带闭塞蛋白结合程度以及脑神经功能单元谷氨酸，γ-氨基丁酸等关键神经递质传递情况。再通过显微电镜拍摄缺血或者供给血后神经元细胞及其周围星形胶质细胞形态大小的变化情况，可以初步判断新药对于脑缺血再灌注疾病的预防和治疗效果。由于使用的是人源细胞，药物筛选的吻合度高的同时也符合伦理要求，为脑缺血再灌注疾病的预防和治疗提供了基础。

二.本次发明的设计理念

本次发明从仿生的角度在微流控芯片中模拟人的血脑屏障系统以及人脑组织功能单元以用于药物筛选。传统的脑缺血再灌注药物筛选是对大鼠采用线栓法构造缺血模型，不符合伦理道德的同时由于种属的差异筛选药物的成功率也较低。将人源细胞接种到芯片上进行药物筛选可以符合伦理要求，完成多次独立重复性实验，同时接种的人源细胞进行实验及药物筛选的吻合度也较高。微流控芯片的上层芯片为血脑屏障系统，实验前芯片用75％乙醇冲洗，浸泡过夜，注入聚赖氨酸，牛血浆纤连蛋白以及胶原蛋白于上层芯片的聚四氟乙烯膜上包被，放入超净工作台吹干。翻转微流控芯片，在聚四氟乙烯膜一侧接种已纯化的周细胞和星型胶质细胞，用微流泵进行灌注2小时后换液，培养2天。将聚四氟乙烯膜翻转至另一侧，通入内皮细胞完全培养基，加入纯化鉴定后传一代的血管内皮细胞，将细胞保持在37℃，5％CO₂，95％空气加湿的条件下共培养观察，通过跨膜电阻测量仪相连精准测定TEER值或加入共轭右旋糖酐(PTFC)进行渗透性检测确定血脑屏障芯片的拟合程度。下层芯片脑组织功能单元接种神经元细胞以及神经胶质细胞，芯片用75％乙醇冲洗，浸泡过夜，注入聚赖氨酸于上层芯片里聚四氟乙烯膜上包被，放入超净工作台吹干，接着使用微量注射器将神经元细胞以及神经胶质细胞接种在下层芯片的多孔膜上，同样将细胞保持在37℃，5％CO₂，95％空气加湿的条件下。细胞接种成功后从培养液入口向芯片通入培养液以维持细胞的代谢发育，一段时间后通过减少进入芯片的培养液中糖浓度，并且向芯片培养孔中加入抗氧剂或将芯片置于低氧环境中来模拟细胞的缺糖缺氧状态进而模拟脑细胞缺血状态，再通过恢复进入脑细胞的培养液中糖浓度以及氧含量模拟脑缺血后的再灌注现象，病理模型模拟好之后，将药物加入到培养液中去，药物经由血脑屏障芯片进入到脑组织功能单元中的脑神经元细胞以及星形胶质细胞中去，通过对谷氨酸，γ-氨基丁酸等关键神经递质进行实时监测以及共聚焦显微镜下细胞的形态大小对比，来判断药物是否由预防或者治疗脑缺血再灌注带来的损伤的功效。

发明内容

本发明提供一种基于微流控芯片技术的脑缺血再灌注病理模型芯片，整个系统可以实现在体外培养血管内皮细胞，星形胶质细胞，周细胞以及神经元细胞，通过减少细胞生长所需的氧含量以及糖含量完成对细胞缺血的病理模型模拟，通过对恢复细胞氧含量以及糖含量完成对细胞缺血再灌注的病理模型模拟，模型建立完成后对模型进行药物处理，通过给药前后细胞生长状态的实时检测对比来完成脑缺血再灌注的药物筛选。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于脑缺血再灌注病理模型的微流控芯片，整体效果图如图1所示。该芯片主要由四层芯片组成，第一层芯片和第四层芯片材料为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，也就是俗称的有机玻璃，第二层芯片和第三层芯片采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为加工材料。且第二层芯片与第三层芯片之间，第三层芯片与第四层芯片之间夹有聚四氟乙烯(PTFE)多孔膜，采用硅酮胶在65℃下干燥4小时将PDMS与聚四氟乙烯多孔膜完全粘合。所述微流控芯片内培养液的通道与中间培养孔的连接放大图如图3所示，各层芯片的尺寸一致，长宽均为30mm，高度根据各层芯片功能的不同各异，从上到下四层芯片的高度依次为2mm，4mm，4mm，2mm。在芯片整体封装之后，最终形成长为30mm，宽为30mm，高为14mm的微流控芯片。

所述第一层芯片单元上设有八个尺寸大小相同的孔道，八个孔道呈圆周排布，孔道半径均为0.5mm，孔道深度与第一层芯片的高度一致，均为2mm。八个孔道分别为：模拟血脑屏障系统细胞接种孔道1，模拟脑组织功能的脑神经元细胞接种孔道2，维持芯片内各类细胞生长代谢所需的培养液流入孔道3，抗氧剂孔道4，四个完全相同的气泵疏通孔道5，为防止芯片内通道堵塞，所述四个完全相同的孔道5与孔道1-4对称，在通道堵塞时可外接气泵以畅通通道；抗氧剂孔道4用于使脑神经元细胞缺氧，为脑组织功能单元培养孔造成缺氧环境的亚硫酸钠孔道。

所述的第二层芯片单元的中央设有半径为5mm的血脑屏障培养孔15，高度与第二层芯片高度一致，为4mm。所述血脑屏障培养孔15外围设有四个通道，通道长7mm，宽0.8-1.2mm，高0.8-1.2mm，分别为：血脑屏障细胞接种通道6，与第一层芯片单元中的孔道1相连，作为模拟血脑屏障系统的细胞接种通道；培养液的流入通道7，与第一层芯片单元中的孔道3相连，作为实验中维持血脑屏障系统中的血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞以及脑组织功能单元芯片中的脑神经细胞以及星形胶质细胞正常代谢的培养液的流入通道；血脑屏障接种细胞的流出通道8，作为血脑屏障系统接种的多余量的流出通道，若实验前向培养孔中接种细胞的量过多，多余的量可以通过此通道排出；培养液的流出通道9，实验时不能通过血脑屏障芯片的培养液以及实验时的代谢废物可由此出口排出，从而避免了大分子废物以及代谢废物的滞留，有利于细胞的生长代谢。所述四个通道6-9两两之间均设有通道，分别为：通道6与通道7之间设有脑神经元细胞接种过渡通道10，通道7与通道8之间亚硫酸钠过渡通道11，通道10、11的半径均为0.5mm，作为从第一层芯片流入到第三层芯片的脑神经元细胞接种以及亚硫酸钠通道的过渡段，培养液通过此孔道流入到第三层芯片中去；为防止芯片内通道堵塞，在通道8与通道9之间、通道9与通道6之间均设有气泵疏通孔道12，两个孔道12完全相同，深度与第二层芯片的高度一致，同样为4mm，芯片通道堵塞时与5孔道共同连接外接气泵可使通道畅通。所述的流出通道8与培养液流出孔道13连通，流出通道9与代谢废物流出孔道14连通，流出通道8、9的孔道半径为0.5mm，用于接种细胞时多余的量、不能通过血脑屏障芯片的培养液或者药物以及实验时的代谢废物通过此孔排到芯片外。所述的第二层芯片单元的最下端设有一个与培养孔15相连的电极通道16，长10mm，宽0.2-0.3mm，高0.2-0.3mm，电极通道16用于插入电极以对信号进行实时检测。

所述的第三层芯片单元的中央设有半径为5mm的脑组织功能单元培养孔26，高度与第三层芯片高度一致，为4mm，培养孔与第三层芯片单元与第四层芯片单元之间的聚四氟乙烯多孔膜共同作用，协同完成对脑组织功能单元的模拟。所述脑组织功能单元培养孔26外围设有四个通道，通道长7mm，宽0.8-1.2mm，高0.8-1.2mm，分别为：与第一层芯片中的孔道2相连的脑组织功能单元细胞接种通道19，作为脑组织功能单元的脑神经元细胞接种通道；与第一层芯片中的孔道4相连的抗氧剂的流入通道20，为实验中造成脑组织功能单元缺氧的亚硫酸钠等抗氧剂的流入通道；脑组织功能单元接种细胞的流出通道21，作为脑组织功能单元接种的多余量的流出通道，若实验前向培养孔中接种细胞的量过多，多余的量可以通过此通道排出；培养液的流出通道22，实验时不能被脑组织功能单元吸收的培养液以及代谢废物可由此出口排出。与流出通道21、22通道相连的脑组织功能单元接种细胞的流出孔道23、培养液的流出孔道24的孔道半径为0.5mm，接种细胞时多余的量以及不能通过脑组织功能单元的培养液、药物和代谢废物通过此孔道排到芯片外。为防止芯片内通道堵塞，设计2个完全相同的气泵疏通孔道25，位于20与22、22与21之间，深度与第三层芯片的高度一致，同样为4mm，如遇芯片通道堵塞，孔道25与流出通道29、31共同连接外接气泵疏通孔道。为加工制作对称美观，另设计2个完全相同的普通通道27，位于19与20、19与21之间，深度与第三层芯片的高度一致，同样为2mm。所述三层芯片单元的上端以及下端分别设有与脑组织功能单元培养孔26相连的通道17、18，长10mm，宽0.2-0.3mm，高0.2-0.3mm，通道17与第二层芯片的通道16共同作用，通道18与第四层芯片的检测电极插入孔32共同作用，里面可插入电极以对信号进行实时检测。

所述第四层芯片单元上面同样设有八个尺寸大小相同的孔道，八个孔道呈圆周排布，与第一层芯片上的八个孔道布局相似，孔道半径均为0.5mm，孔道深度与第一层芯片的高度一致。八个孔道分别为：抗氧剂流出通道28(作为促使脑神经元细胞缺氧，为培养孔造成缺氧环境的亚硫酸钠流出通道)、培养液流出通道29(维持芯片内各类细胞生长代谢所需的培养液流出通道)、向脑组织功能单元接种脑神经细胞以及星形胶质细胞的多余流出通道30、向血脑屏障系统接种血管内皮细胞、星形胶质细胞以及周细胞时的多余流出通道31。为加工制作对称美观，四个完全相同普通孔道33，与孔道28、29、30、31对称设置，深度与第四层芯片的高度一致，同样为2mm。所述第四层芯片单元上还设有检测电极插入孔32。

上述四层芯片主要模拟两个组织功能单元：第二层芯片与第三层芯片之间，第三层芯片与第四层芯片之间均有长为10mm，宽为10mm，厚度为10μm的聚四氟乙烯(PTFE)膜，膜上的孔径为0.01mm，通过在聚四氟乙烯多孔膜上接种不同的细胞以和不同的芯片层作用模拟不同的组织功能单元。在第二层芯片与第三层芯片之间的聚四氟乙烯多孔膜接种星形胶质细胞和周细胞以及血管内皮细胞，共同作用模拟人的血脑屏障系统；在第三层芯片与第四层芯片之间的聚四氟乙烯多孔膜接种神经元细胞和星形胶质细胞，用于模拟脑组织功能单元。血脑屏障系统与脑组织功能单元通过培养液联系到一起，培养液中的大分子物质以及部分小分子物质还有药物不会通过血脑屏障系统，只有一小部分小分子物质以及药物会通过由多孔膜构成的血脑屏障系统传输到脑组织功能单元区域，由此通过培养液的传输实现了上下两层细胞培养体系的细胞非接触式信息交流。

通过减少控制流经血脑屏障系统进入脑组织功能单元的培养液中糖含量模拟人脑细胞的缺糖过程，通过向与脑神经细胞培养孔的通道中加入微量亚硫酸钠或者抗坏血酸纳等还原剂以迅速消耗神经元细胞附近的氧或者将芯片置于低氧环境，从而模拟细胞的缺氧过程，通过对神经元细胞进行缺氧缺糖操作进而来模拟脑缺血过程。一段时间后，恢复流经血脑屏障进入脑的培养液中糖含量，亚硫酸钠或者抗坏血酸纳等抗氧剂消耗殆尽，或者将芯片从低氧环境中取出置于正常氧环境下，神经元细胞以及神经胶质细胞附近重新恢复氧气持续供给的状态，由此实现了细胞缺血后的再灌注，建立了基于微流控芯片技术的脑缺血再灌注病理模型。

芯片的第二层芯片下端，第三层芯片上端以及第三层芯片下端以及第四层芯片上端均留有与培养腔室相连的细微孔道，里面插入Pt电极，Pt电极的一端与芯片上的细胞表面相连。位于第二层下端和第三层上端的Pt电极的另一端与跨膜内阻测量仪相连以实时检测血脑屏障芯片的TEER值以检测模拟血脑屏障的通透性，通过与标准值对比来验证血脑屏障芯片模型建立的可行性。位于第三层下端和第四层上端的Pt电极的另一端以氧含量检测仪相连以实时检测脑神经元培养腔室中氧含量以判断脑神经元细胞的缺氧以及氧气再灌注情况。此外，Pt电极的另一端还可以与微电极阵列相连通过实时检测细胞之间兴奋性或抑制性电位来检测谷氨酸，γ-氨基丁酸等关键神经递质的传递情况，与标准电位作比较来更加准确的判断脑神经细胞经缺氧缺糖模拟后的变化。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明将血脑屏障系统以及脑组织功能单元这两种不同的组织功能单元结合到一起，利用多层微流控芯片集成的方法，根据体内组织功能单元之间运行的先后顺序将两种不同的组织功能单元结合。不同的细胞培养单元相互独立互不干扰，通过培养液的传递进行无接触的信息交流，便于观察培养以及检测。

(2)本发明具备独立的细胞培养腔室，根据需要，腔室外接不同的测量仪器设备以实时检测腔室内细胞的生长发育情况，既可以验证模型的合理性以及可行性，又可对腔室内的细胞有实时准确的监控。

附图说明

图1为本发明整体结构示意图。

图2为本发明拆分结构示意图。

图3为本发明芯片培养液通道端口的局部放大图。

图4为本发明第一层芯片单元结构示意图。

图5为本发明第二层芯片单元结构示意图。

图6为本发明第三层芯片单元结构示意图。

图7为本发明第四层芯片单元结构示意图。

图中：1为血脑屏障系统细胞接种孔道；2为脑神经元细胞接种孔道；3为培养液流入孔道；4为抗氧剂孔道；5为气泵疏通孔道；6为血脑屏障细胞接种通道；7为培养液的流入通道，8作为血脑屏障接种细胞的流出通道；9为培养液的流出通道；10为脑神经元细胞接种过渡通道；11为亚硫酸钠过渡通道；12为气泵疏通孔道；13为培养液流出孔道；14为代谢废物流出孔道；15为血脑屏障培养孔；16电极通道；17上端通道；18下端通道；19为脑组织功能单元细胞接种通道；20为抗氧剂的流入通道；21作为脑组织功能单元接种细胞的流出通道；22作为培养液的流出通道；23为脑组织功能单元接种细胞的流出孔道；24为培养液的流出孔道；25为气泵疏通孔道；26为脑组织功能单元培养孔；27普通孔道：28为抗氧剂流出通道；29为培养液流出通道；30为向脑组织功能单元接种脑神经细胞以及星形胶质细胞的多余流出通道；31为向血脑屏障系统接种血管内皮细胞、星形胶质细胞以及周细胞时的多余流出通道；32为检测电极插入孔；33为普通孔道。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细说明，但并不因此而限制于本发明。

实施例1

一种基于微流控技术的脑缺血再灌注病理模型芯片，该芯片主要由四层芯片组成，整体效果图如图1所示，具体粘合顺序如说明书附图2所示。第一层芯片和第四层芯片材料为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，第二层芯片和第三层芯片采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为加工材料。所述微流控芯片内培养液的通道与中间培养孔的连接放大图如图3所示，各层芯片的尺寸一致，长宽均为30mm，从上到下四层芯片的高度依次为2mm，4mm，4mm，2mm。在芯片整体封装之后最终形成长为30mm，宽为30mm，高为14mm的微流控芯片。第二层芯片与第三层芯片之间，第三层芯片与第四层芯片之间均有长为10mm，宽为10mm，厚度为10μm的聚四氟乙烯(PTFE)膜，膜上的孔径为0.01mm，通过在聚四氟乙烯多孔膜上接种不同的细胞以和不同的芯片层作用模拟不同的组织功能单元。在第二层芯片与第三层芯片之间的聚四氟乙烯多孔膜接种星形胶质细胞和周细胞以及血管内皮细胞，共同作用模拟人的血脑屏障系统；在第三层芯片与第四层芯片之间的聚四氟乙烯多孔膜接种神经元细胞和星形胶质细胞，用于模拟脑组织功能单元。血脑屏障系统与脑组织功能单元通过培养液联系到一起，培养液中的大分子物质以及部分小分子物质还有药物不会通过血脑屏障系统，只有一小部分小分子物质以及药物会通过由多孔膜构成的血脑屏障系统传输到脑组织功能单元区域，由此通过培养液的传输实现了上下两层细胞培养体系的细胞非接触式信息交流。

如图4所示为模拟脑缺血再灌注病理模型微流控芯片的第一层：所述第一层芯片单元上设有八个尺寸大小相同的孔道，八个孔道呈圆周排布，孔道半径均为0.5mm，孔道深度与第一层芯片的高度一致，均为2mm。八个孔道分别为：模拟血脑屏障系统细胞接种孔道1，模拟脑组织功能的脑神经元细胞接种孔道2，维持芯片内各类细胞生长代谢所需的培养液流入孔道3，抗氧剂孔道4，四个完全相同的气泵疏通孔道5，为防止芯片内通道堵塞，所述四个完全相同的孔道5与孔道1-4对称，在通道堵塞时可外接气泵以畅通通道；抗氧剂孔道4用于使脑神经元细胞缺氧，为脑组织功能单元培养孔造成缺氧环境的亚硫酸钠孔道。如图5所示为模拟脑缺血再灌注病理模型微流控芯片的第二层：所述的第二层芯片单元的中央设有半径为5mm的血脑屏障培养孔15，高度与第二层芯片高度一致，为4mm。所述血脑屏障培养孔15外围设有四个通道，通道长7mm，宽0.8-1.2mm，高0.8-1.2mm，分别为：血脑屏障细胞接种通道6，与第一层芯片单元中的孔道1相连，作为模拟血脑屏障系统的细胞接种通道；培养液的流入通道7，与第一层芯片单元中的孔道3相连，作为实验中维持血脑屏障系统中的血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞以及脑组织功能单元芯片中的脑神经细胞以及星形胶质细胞正常代谢的培养液的流入通道；血脑屏障接种细胞的流出通道8，作为血脑屏障系统接种的多余量的流出通道，若实验前向培养孔中接种细胞的量过多，多余的量可以通过此通道排出；培养液的流出通道9，实验时不能通过血脑屏障芯片的培养液以及实验时的代谢废物可由此出口排出，从而避免了大分子废物以及代谢废物的滞留，有利于细胞的生长代谢。所述四个通道6-9两两之间均设有通道，分别为：通道6与通道7之间设有脑神经元细胞接种过渡通道10，通道7与通道8之间亚硫酸钠过渡通道11，通道10、11的半径均为0.5mm，作为从第一层芯片流入到第三层芯片的脑神经元细胞接种以及亚硫酸钠通道的过渡段，培养液通过此孔道流入到第三层芯片中去；为防止芯片内通道堵塞，在通道8与通道9之间、通道9与通道6之间均设有气泵疏通孔道12，两个孔道12完全相同，深度与第二层芯片的高度一致，同样为4mm，芯片通道堵塞时与5孔道共同连接外接气泵可使通道畅通。所述的流出通道8与培养液流出孔道13连通，流出通道9与代谢废物流出孔道14连通，流出通道8、9的孔道半径为0.5mm，用于接种细胞时多余的量、不能通过血脑屏障芯片的培养液或者药物以及实验时的代谢废物通过此孔排到芯片外。第二层芯片单元的最下端有一个长为10mm，横截面为0.25mm×0.25mm，与培养孔相连的通道16，第三层芯片的17与第二层芯片的16相同，里面可插入Pt电极，以保证与EVOM2跨膜电阻测量仪相连精准测定TEER值测定黏连蛋白以及小带闭塞蛋白的黏合程度以反映血脑屏障芯片设计的完整性，合理性以及可行性。

如图6所示为模拟脑缺血再灌注病理模型微流控芯片的第三层：所述的第三层芯片单元的中央设有半径为5mm的脑组织功能单元培养孔26，高度与第三层芯片高度一致，为4mm，培养孔与第三层芯片单元与第四层芯片单元之间的聚四氟乙烯多孔膜共同作用，协同完成对脑组织功能单元的模拟。所述脑组织功能单元培养孔26外围设有四个通道，通道长7mm，宽0.8-1.2mm，高0.8-1.2mm，分别为：与第一层芯片中的孔道2相连的脑组织功能单元细胞接种通道19，作为脑组织功能单元的脑神经元细胞接种通道；与第一层芯片中的孔道4相连的抗氧剂的流入通道20，为实验中造成脑组织功能单元缺氧的亚硫酸钠等抗氧剂的流入通道；脑组织功能单元接种细胞的流出通道21，作为脑组织功能单元接种的多余量的流出通道，若实验前向培养孔中接种细胞的量过多，多余的量可以通过此通道排出；培养液的流出通道22，实验时不能被脑组织功能单元吸收的培养液以及代谢废物可由此出口排出。与流出通道21、22通道相连的脑组织功能单元接种细胞的流出孔道23、培养液的流出孔道24的孔道半径为0.5mm，接种细胞时多余的量以及不能通过脑组织功能单元的培养液、药物和代谢废物通过此孔道排到芯片外。为防止芯片内通道堵塞，设计2个完全相同的气泵疏通孔道25，位于20与22、22与21之间，深度与第三层芯片的高度一致，同样为4mm，如遇芯片通道堵塞，孔道25与流出通道29、31共同连接外接气泵疏通孔道。为加工制作对称美观，另设计2个完全相同的普通通道27，位于19与20、19与21之间，深度与第三层芯片的高度一致，同样为2mm。第三层芯片单元的上端以及下端分别有长为10mm，横截面为0.25mm×0.25mm，与培养孔相连的通道17，18，通道17与第二层芯片的通道16共同作用，插入Pt电极连接跨膜内阻测量仪以完成对血脑屏障芯片跨膜电阻的实时检测。通道18与第四层芯片的通道32共同作用，分别插入电极可以与氧含量检测仪相连接以完成对神经元细胞生长环境的氧含量的检测，还可以与微电极阵列相连通过实时检测细胞之间兴奋性或抑制性电位来检测谷氨酸，γ-氨基丁酸等关键神经递质的传递情况，与标准电位作比较来更加准确的判断脑神经细胞经缺氧缺糖模拟后的变化。

如图7所示为模拟脑缺血再灌注病理模型微流控芯片的第四层：所述第四层芯片单元上面同样设有八个尺寸大小相同的孔道，八个孔道呈圆周排布，与第一层芯片上的八个孔道布局相似，孔道半径均为0.5mm，孔道深度与第一层芯片的高度一致。八个孔道分别为：抗氧剂流出通道28(作为促使脑神经元细胞缺氧，为培养孔造成缺氧环境的亚硫酸钠流出通道)、培养液流出通道29(维持芯片内各类细胞生长代谢所需的培养液流出通道)、向脑组织功能单元接种脑神经细胞以及星形胶质细胞的多余流出通道30、向血脑屏障系统接种血管内皮细胞、星形胶质细胞以及周细胞时的多余流出通道31。为加工制作对称美观，四个完全相同普通孔道33，与孔道28、29、30、31对称设置，深度与第四层芯片的高度一致，同样为2mm。所述第四层芯片单元上还设有检测电极插入孔32。

所述芯片在使用时，可以采用可逆封装，可逆封装的PDMS微流体芯片最突出的一个特点是芯片可以根据实验需要进行任意拆洗，反复使用。芯片在封装用75％乙醇冲洗，浸泡过夜，注入聚赖氨酸，牛血浆纤连蛋白以及胶原蛋白于上层芯片的聚四氟乙烯膜上包被，放入超净工作台吹干；最后，使用硅酮胶在65℃下干燥4小时将PDMS与聚四氟乙烯多孔膜完全粘合。实验时使用微型注射器通过血脑屏障系统细胞接种孔道1在聚四氟乙烯膜一侧接种已纯化的周细胞和星型胶质细胞，培养2天后将聚四氟乙烯膜翻转至另一侧，使用微型注射器通过血脑屏障系统细胞接种孔道1通入内皮细胞完全培养基，加入纯化鉴定后传一代的血管内皮细胞，一段时间后通过向电极通道16、上端通道17通道里面插入Pt电极与EVOM2跨膜电阻测量仪相连精准测定TEER值，或者加入共轭右旋糖酐(PTFC)进行渗透性检测从而测定黏连蛋白以及小带闭塞蛋白的黏合程度以反映血脑屏障芯片设计的完整性，合理性以及可行性。接着使用微型注射器通过脑神经元细胞接种孔道2向三四层芯片间模拟血脑屏障系统的多孔膜上接种神经元细胞以及星形胶质细胞。将接种成功的芯片保持在37℃，5％CO₂，95％空气加湿的条件下。细胞接种成功后使用微量注射器向芯片以0.05-0.33mL/s的流量从培养液流入孔道3通入培养液以保证模拟的系统满足大脑毛细血管0.3-2Pa剪切应力下的生理水平以维持血脑屏障系统以及脑组织功能单元内细胞的代谢发育。通过减少由培养液流入孔道3进入芯片的培养液中糖浓度以及通过抗氧剂孔道4向芯片培养孔中加入抗氧剂或将芯片置于低氧环境中来模拟细胞的缺糖缺氧状态进而模拟脑细胞缺血状态，再通过恢复进入脑细胞的培养液中糖浓度以及停止通过抗氧剂孔道4加入抗氧剂或将芯片从低氧环境中取出以恢复神经元细胞的氧含量模拟脑缺血后的再灌注现象，病理模型模拟好之后，将药物加入培养液中去，药物经由血脑屏障芯片进入到脑组织功能单元中的脑神经元细胞以及星形胶质细胞中去，通过对谷氨酸，γ-氨基丁酸等关键神经递质进行实时监测以及共聚焦显微镜下细胞的形态大小对比，来判断药物是否由预防或者治疗脑缺血再灌注带来的损伤的功效。

本发明具备多细胞共培养能力，并通过多孔膜和培养孔的设计实现了多细胞间通过培养液流动的细胞间不接触的信息交流，通过控制进入脑组织功能单元的培养液中葡萄糖的含量以及向脑组织功能单元中加入亚硫酸钠等抗氧剂或将芯片整体置于低氧培养环境下模拟了人脑缺糖缺氧过程进而模拟人脑缺血过程，再通过恢复向脑芯片中提供培养液中的葡萄糖含量以及抗氧剂消耗殆尽或者将芯片从无氧环境中取出置于有氧环境恢复脑芯片氧气环境来模拟脑缺血后的再灌注。以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种基于脑缺血再灌注病理模型的微流控芯片，其特征在于，该芯片主要由四层芯片组成，第一层芯片和第四层芯片材料为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，第二层芯片和第三层芯片采用聚二甲基硅氧烷PDMS作为加工材料；且第二层芯片与第三层芯片之间，第三层芯片与第四层芯片之间夹有聚四氟乙烯PTFE多孔膜；从上到下四层芯片的高度依次为2mm，4mm，4mm，2mm；

所述第一层芯片单元上设有八个呈圆周排布、尺寸相同的孔道，孔道半径均为0.5mm；八个孔道分别为：模拟血脑屏障系统细胞接种孔道(1)，模拟脑组织功能的脑神经元细胞接种孔道(2)，维持芯片内各类细胞生长代谢所需的培养液流入孔道(3)，抗氧剂孔道(4)，四个完全相同的气泵疏通孔道(5)，气泵疏通孔道(5)用于防止芯片内通道堵塞；

所述的第二层芯片单元的中央设有半径为5mm的血脑屏障培养孔(15)；所述血脑屏障培养孔(15)外围设有四个通道，通道长7mm，宽0.8-1.2mm，高0.8-1.2mm，分别为：血脑屏障细胞接种通道(6)，与第一层芯片单元中的孔道(1)相连，作为模拟血脑屏障系统的细胞接种通道；培养液的流入通道(7)，与第一层芯片单元中的孔道(3)相连，作为维持血脑屏障系统中的血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞以及脑组织功能单元芯片中的脑神经细胞以及星形胶质细胞正常代谢的培养液的流入通道；血脑屏障接种细胞的流出通道(8)，作为血脑屏障系统接种的多余量的流出通道；培养液的流出通道(9)，实验时不能通过血脑屏障芯片的培养液以及实验时的代谢废物由此出口排出；所述四个通道之间均设有连通通道，分别为：通道(6)与通道(7)之间设有脑神经元细胞接种过渡通道(10)，通道(7)与通道(8)之间亚硫酸钠过渡通道(11)，通道(10)、(11)的半径均为0.5mm，作为从第一层芯片流入到第三层芯片的脑神经元细胞接种以及亚硫酸钠通道的过渡段，培养液通过此孔道流入到第三层芯片中去；为防止芯片内通道堵塞，在通道(8)与通道(9)之间、通道(9)与通道(6)之间均设有气泵疏通孔道(12)；所述的流出通道(8)与培养液流出孔道(13)连通，流出通道(9)与代谢废物流出孔道(14)连通，流出通道(8)、(9)的孔道半径为0.5mm；所述的第二层芯片单元的最下端设有一个与培养孔(15)相连的电极通道(16)，用于插入电极以对信号进行实时检测；

所述的第三层芯片单元的中央设有半径为5mm的脑组织功能单元培养孔(26))，培养孔与第三层第四层芯片单元之间的聚四氟乙烯多孔膜共同作用，协同完成对脑组织功能单元的模拟；所述脑组织功能单元培养孔((26))外围设有四个通道，分别为：与第一层芯片中的孔道(2)相连的脑组织功能单元细胞接种通道(19)，作为脑组织功能单元的脑神经元细胞接种通道；与第一层芯片中的孔道(4)相连的抗氧剂的流入通道(20)，为实验中造成脑组织功能单元缺氧的亚硫酸钠等抗氧剂的流入通道；脑组织功能单元接种细胞的流出通道(21)，作为脑组织功能单元接种的多余量的流出通道；培养液的流出通道(22)，实验时不能被脑组织功能单元吸收的培养液以及代谢废物由此出口排出；与流出通道(21)、(22)通道相连的脑组织功能单元接种细胞的流出孔道(23)、培养液的流出孔道(24)的孔道半径为0.5mm，接种细胞时多余的量以及不能通过脑组织功能单元的培养液、药物和代谢废物通过此孔道排到芯片外；为防止芯片内通道堵塞，在流入通道(20)与流出通道(22)、流出通道(22)与流出通道(21)之间分别设有气泵疏通孔道(25)；所述三层芯片单元的上端以及下端分别设有与脑组织功能单元培养孔(26)相连的通道(17)、(18)，通道(17)与第二层芯片的通道(16)共同作用，通道(18)与第四层芯片的检测电极插入孔32共同作用；

所述第四层芯片单元上面同样设有八个呈圆周排布且尺寸相同的孔道，与第一层芯片上的八个孔道布局相似，孔道半径均为0.5mm；八个孔道分别为：抗氧剂流出通道(28)、培养液流出通道(29)、向脑组织功能单元接种脑神经细胞以及星形胶质细胞的多余流出通道(30)、向血脑屏障系统接种血管内皮细胞、星形胶质细胞以及周细胞时的多余流出通道(31)；四个完全相同普通孔道(33)，与孔道(28)、(29)、(30)、(31)对称设置，深度与第四层芯片的高度相同；所述第四层芯片单元上还设有检测电极插入孔(32)；

上述四层芯片主要模拟两个组织功能单元：通过在第二层与第三层芯片之间，第三层与第四层芯片之间的聚四氟乙烯多孔膜上接种不同的细胞，以和不同的芯片层作用模拟不同的组织功能单元：在第二层与第三层芯片之间的聚四氟乙烯多孔膜上接种星形胶质细胞和周细胞以及血管内皮细胞，共同作用模拟人的血脑屏障系统；在第三层与第四层芯片之间的聚四氟乙烯多孔膜上接种神经元细胞和星形胶质细胞，用于模拟脑组织功能单元；血脑屏障系统与脑组织功能单元通过培养液联系到一起，通过培养液的传输实现上下两层细胞培养体系的细胞非接触式信息交流；

芯片的第二层芯片下端，第三层芯片上端以及第三层芯片下端以及第四层芯片上端均留有与培养腔室相连的细微孔道，里面插入Pt电极，Pt电极的一端与芯片上的细胞表面相连；位于第二层下端和第三层上端的Pt电极的另一端与跨膜内阻测量仪相连，以实时检测血脑屏障芯片的TEER值，进而检测模拟血脑屏障的通透性；位于第三层下端和第四层上端的Pt电极的另一端与氧含量检测仪相连，以实时检测脑神经元培养腔室中氧含量，进而判断脑神经元细胞的缺氧以及氧气再灌注情况。

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