CN114317269A - 一种多器官芯片及其在药物评价中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多器官芯片，包括芯片基体以及贴合于所述芯片基体上的芯片盖板，所述芯片基体上形成至少两个细胞培养室，所述至少两个细胞培养室分别用于培养不同种类的细胞以模拟不同的器官；至少一个所述细胞培养室设有微藻培养室，所述微藻培养室形成于芯片基体上，用于培养微藻以产生或消耗氧气；所述细胞培养室与对应的微藻培养室之间相互连通且允许气体交换；通过调节不同微藻培养室中微藻的光合作用或呼吸作用的强度，实现每一细胞培养室中氧气浓度的独立控制。本发明的多器官芯片，实现了芯片上不同器官区域的控氧，克服了以往方法不适用于多器官芯片上氧含量操控的问题。

Description

一种多器官芯片及其在药物评价中的应用
技术领域
本发明涉及器官芯片技术领域，尤其涉及一种多器官芯片及其在药物评价中的应用。
背景技术
药物研发是一个漫长且耗资巨大的过程，大多数新药未能顺利地进入临床，其主要原因是现有基于体外细胞培养技术以及动物模型都不能真实地反映人体内的微环境。器官芯片在这一背景下被提出来了，它是一种在载玻片大小的芯片上构建的器官生理微系统，包含有活体细胞、组织界面、生物流体和机械力等器官微环境关键要素。它可在体外模拟人体不同组织器官的主要结构功能特征和复杂的器官间联系，用以预测人体对药物或外界不同刺激产生的反应，在生命科学和医学研究、新药研发、个性化医疗、毒性预测和生物防御等领域具有广泛的应用前景。
微环境中的氧气介导着器官细胞的代谢、分化和生长。器官中氧气浓度的变化，从高于生理氧气水平到低于生理氧气水平，甚至到没有氧气，都会触发器官不同的生物学反应。因此器官芯片中氧气的浓度与器官芯片能实现的生理功能息息相关。
目前控制器官芯片中的氧气浓度主要有三种方法：1）化学法消耗或产生氧气：设计化学反应腔室，通过化学反应产生或消耗氧气。但是化学反应的反应强度不能过于剧烈，且要不断地补充反应物，排出产物。2）电解水产生氧气：通过施加高压电，或者催化光能转变为电能，在嵌入芯片的电极表面通过电解水产生氧气。但是该方法会同时产生氢气，且微环境下的产热效应强；3）直接充入氧气或氮气：利用精确流量控制设备，向培养基中鼓入氧气或氮气。该方法虽然简单，但因器官芯片所处的无菌细胞间的通风强度一般不高，外溢的氧气或氮气有可能会导致局部浓度过高，造成爆炸或人员的窒息。上述3种方法，有的对细胞不友好，有的增加了器官芯片加工的复杂性，有的则存在安全隐患，因此实际将它们用于器官芯片中的氧气浓度的调节的报导并不多。
人体芯片是器官芯片发展至今的最新形式，它是在一个芯片上集成多个器官以模拟人体，可以用于考察药物对整个人体的综合作用，意义十分重大。但是人体芯片上不同的器官对氧气含量的需求是不同的，因此每个器官都需要有一套单独的控氧系统。由于原理的限制，对于人体芯片中多个器官的差异化氧气浓度调节，上述传统方法均显得力不从心，需要研发新技术来解决仿生人体芯片的这一问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多器官芯片，利用微藻在有光的时候发生光合作用释放氧气，黑暗时通过呼吸作用消耗氧气这一特性，实现了芯片上不同器官区域的控氧，克服了以往方法不适用于多器官芯片上氧含量控制的问题。
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了如下的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种多器官芯片，包括芯片基体以及贴合于所述芯片基体上的芯片盖板，其中，所述芯片基体上形成有至少两个细胞培养室，所述至少两个细胞培养室分别用于培养不同种类的细胞以模拟不同的器官；至少一个所述细胞培养室设有微藻培养室，所述微藻培养室形成于芯片基体上，用于培养微藻以产生或消耗氧气；所述细胞培养室与对应的微藻培养室之间相互连通且仅允许气体交换。
本发明的多器官芯片中，微藻培养室中的微藻在光线充足时，光合作用强于呼吸作用，表现为产生氧气；在光线不充足或无光照时，呼吸作用强于光合作用，表现为消耗氧气。因此通过调节微藻培养室中微藻所受光强，可以使得不同培养室中微藻表现出供氧或耗氧的现象，从而实现对每一细胞培养室中氧气浓度的独立控制。该方法可以实现芯片不同区域氧含量的调节，且方法简单、灵活，芯片制作和加工的复杂度比其他方法均低。
本发明中，所述微藻包括但不限于肋骨条藻(Skeletonema costatum)，膝沟藻属(Gonyaulax)，隐秘小环藻(Cyclotella cryptica)，球等鞭金藻(Isochrysis galbana)，链状裸甲藻 (Gymnodinium catenatum)，具槽直链藻(Melosira sulcate)，尖刺拟菱形藻(Pseudo-nitzschiapungensHalse)，杜氏盐藻(Dunaliella salina)，利玛原甲藻(Prorocentrum lima)，赫氏艾米里颗石藻(Emiliania huxleyi(Lohm.)Hay et Mohler)，大洋桥石藻(Gephyrocapsa oceanica Kamptner)，亚历山大藻(Alexandrium sp.)，斜纹硅藻(Pleurosigma sp.)，虫黄藻(Zooxanthella)，梅尼小环藻(Cyclotella meneghinianakiits )，异双鞭裸藻(Eutreptiella sp.)，代尔五隔藻(Pentapharsodinium dalei)，微小亚历山大藻(Alexandrium minutum Halim)，颗石藻(Emiliania huxleyi(Lohm.)Hay etMohler)，多列拟菱形藻(Pseudo-nitzschia multiseries)，锥状斯克里普藻(Scrippsiella trochoidea)，布氏双尾藻(Ditylum brightwelii)，东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)，海洋原甲藻(Prorocentrum micans)，微型原甲藻(Prorocentrum minimum)，球形棕囊藻(Phaeocystis globsa)，米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)，强壮前沟藻(Amphidinium carterae Hulburt)，塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)，孟氏小环藻(Cyclotella meneghiniana)，海洋卡盾藻(Chattonella marina)，纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis/ceratosporus)，旋链角毛藻(Chaetoceros curvisetus Cleve 1889)，伪矮海链藻(Thalassiosira pseudonana)，威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)，链状亚历山大藻 (Alexandrium catenella)，赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)，圆海链藻(Thalassiosira rotula)，血红哈卡藻/红色裸甲藻(Akashiwo sanguinea)，紫球藻(Porphyridium cruentum)，扁藻(Platymonas sp.)，巴夫藻(Pavlova viridis)，等鞭金藻OA3011(Isochrysis galbana OA3011)，微绿球藻(Nannochloropsis sp.)，日本小球藻(Chlorella sp.)，牟氏角毛藻(Chaetoceros meülleri)，雨生红球藻(H.pluvialis)，三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，小新月菱形藻(Nitzschia closterium f.minutissima)，大溪地球等鞭金藻(Isochrysis galbanadaxidi)，亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)，中国小球藻(Chlorella sp.)，湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)，青岛大扁藻(Platymonas helgolandicatsingtaoensis)，转板藻属(Mougeotia)，栅藻(Scenedesmus Meyen)，羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)，纤细裸藻(Euglena gracilis)，丝藻(Ulothrix sp.)，水华束丝藻(Aphanizomenon flosaquae)，鞘藻(Oedocladium sp.)，囊裸藻(Trachelomonassp.)，念珠藻( Nostoc sp.)，淡水卵囊藻(Oocystis sp.)，黄群藻(Synura sp.)，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，螺旋藻(Spirulina platensis)，蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，布朗葡萄藻B12藻株(Botryococcus braunii)，淡水普通小球藻ZF藻株(Chlorella vulgaris)，多芒藻(Golenkinia radiata)，四球藻(Westella sp.)，椭圆小球藻(GY-D20 Chlorella ellipsoidea)，斜生栅藻(Scendesmus obliquus)，空星藻(Coelastrum sp.)，肥壮蹄形藻(Kirchneriella obesa)，多棘栅藻(Scenedesmusabundans)，被甲栅藻(Scenedesmus armatus)，二形栅藻(Scenedesmus dimorphus)，波吉卵囊藻(Oocystis borgei)，绿球藻(Cladophora aegagrophila)和纤维藻(Ankistrodesmus sp.)。
进一步地，每个微藻培养室中均可培养一种或多种微藻。所述微藻的培养方式包括贴附在微藻培养室的表面、悬浮于液体培养基中或者在三维基质中培养。
进一步地，所述芯片盖板上对应每个微藻培养室均设置有至少一个流体接口，所述流体接口与对应的微藻培养室连通。因此根据需要，可以通过流体接口在线添加或更换培养基或微藻。在优选的实施方式中，每个微藻培养室均配置有一对流体接口，所述流体接口通过微通道与微藻培养室连通。
本发明中，微藻培养室可以同时或者分别从多个方向透过波长介于390~1000 nm的光，使得微藻进行光合作用，以产生氧气。
进一步地，所述细胞培养室与对应的微藻培养室之间通过微通道、多孔膜、微栅栏或水凝胶连接。微通道、多孔膜、微栅栏或水凝胶的存在，既避免了细胞培养室中的细胞进入到微藻培养室中或微藻培养室中的微藻进入到细胞培养室中，同时允许气体交换，因此可以实现对细胞培养室中氧浓度的控制。
本发明的多器官芯片，可以模拟动物器官和植物器官。对于动物器官，包括但不限于肝、肺、肠、心脏、肾、脂肪、眼睛、耳朵、鼻子、胰岛、骨骼、脑、皮肤、血管、子宫、牙周、脾、胎盘、肌肉、喉、骨髓等器官。其中，细胞培养室中培养的细胞可以为单种细胞或多种细胞，可以为原代细胞、干细胞或细胞系，可以以细胞球、类器官、活体组织等细胞的聚集体的形式存在。细胞的培养方式包括贴附在细胞培养室的表面、悬浮于液体培养基中或者在三维基质中培养。
在优选的实施方式中，所述细胞培养室中除培养细胞外，还可同时培养一种或多种细菌，从而可以更好地模拟器官的真实环境。其中，共培养的细菌可以为单一菌种，也可以为菌群，可以为厌氧菌，也可以为需氧菌。例如，将肠上皮细胞与大肠杆菌共培养，能够更好地模拟肠器官。
在优选的实施方式中，至少一个细胞培养室和/或微藻培养室中安装有氧含量监控器件，以实时监测细胞培养室/微藻培养室中的氧气浓度。所述氧含量监控器件优选为氧传感器。
在优选的实施方式中，所述多器官芯片还包括至少一个光源，用于照射所述微藻培养室。所述光源优选为可动态调节亮度的光源，从而可以调节各微藻培养室的光照强度。
在优选的实施方式中，所述多器官芯片还包括一控制器，所述控制器与所述氧含量监控器件和光源电性连接，其能够接收所述氧含量监控器件传回的含氧量数据，并根据接收的含氧量数据动态调节各光源的光照强度，从而独立、动态地控制每一细胞培养室内的氧气含量。
第二方面，本发明提供了一种微藻-肠-肝-肿瘤芯片，包括芯片基体以及贴合于所述芯片基体上的芯片盖板，所述芯片基体包括自上而下依次层叠设置的第一基板、第二基板、第三基板和第四基板；
所述第一基板上设有第一细胞培养室和第一微藻培养室，所述第一细胞培养室与第一微藻培养室通过微通道连接；所述第二基板上设有第二细胞培养室、第三细胞培养室、第二微藻培养室和第三微藻培养室，所述第二细胞培养室位于第一细胞培养室的下方，所述第二细胞培养室与第二微藻培养室通过微通道连接，所述第三细胞培养室和第三微藻培养室通过微通道连接；所述第三基板上设有第一中间腔室和第二中间腔室，所述第一中间腔室位于第二细胞培养室的下方，所述第二中间腔室位于第三细胞培养室的下方；所述第四基板上设有微通道；
其中，所述第一细胞培养室、第二细胞培养室、第三细胞培养室、第一中间腔室和第二中间腔室均为设置于基板上的通孔，所述第一细胞培养室与第二细胞培养室之间、第二细胞培养室与第一中间腔室之间、第三细胞培养室与第二中间腔室之间均通过多孔膜隔开；当第三基板与第四基板贴合时，第四基板上的微通道连通所述第一中间腔室和第二中间腔室；
所述第一微藻培养室、第二微藻培养室和第三微藻培养室均用于培养微藻，所述芯片盖板上对应每个微藻培养室均设置至少一个流体接口，所述流体接口通过微通道与对应的微藻培养室连通；
所述第一细胞培养室用于培养肠上皮细胞和大肠杆菌，所述第二细胞培养室用于培养肝细胞，所述第三细胞培养室用于培养肿瘤细胞；所述第一细胞培养室、第二细胞培养室和第三细胞培养室中均设有用于检测氧浓度的氧传感器。
上述微藻-肠-肝-肿瘤芯片中，多孔膜的存在阻隔了细胞，但是药物分子却可以通过该多孔膜，因此该芯片能够很好地模拟药物经肠吸收和肝代谢后的抗肿瘤效果，具有更好的仿生性。本发明对于多孔膜的材质不限，包括但不限于聚碳酸酯膜、陶瓷膜、聚氯乙烯膜、PU膜。
进一步地，所述微藻-肠-肝-肿瘤芯片还包括一底板，所述底板设置于所述第四基板的下方。
进一步地，所述微藻-肠-肝-肿瘤芯片还包括控制器以及分别用于照射第一微藻培养室、第二微藻培养室和第三微藻培养室的多个光源，所述控制器与所述氧传感器和光源电性连接，其接收所述氧传感器传回的含氧量数据，并根据所述含氧量数据调节各光源的光照强度。
第三方面，本发明还提供了一种微藻-脑血管-神经芯片，包括芯片基体以及贴合于所述芯片基体上的芯片盖板，所述芯片基体包括自上而下依次层叠设置的第一基板和第二基板；
所述第一基板上设有第一细胞培养室和第一微藻培养室，所述第一细胞培养室与第一微藻培养室通过微通道连接；所述第二基板上设有第二细胞培养室和第二微藻培养室，所述第二细胞培养室位于第一细胞培养室的下方，所述第二细胞培养室与第二微藻培养室通过微通道连接；
其中，所述第一细胞培养室为设置于基板上的通孔，所述第一细胞培养室与第二细胞培养室之间通过多孔膜隔开；所述第一微藻培养室和第二微藻培养室均用于培养微藻，所述芯片盖板上对应每个微藻培养室均设置至少一个流体接口，所述流体接口通过微通道与对应的微藻培养室连通；所述第一细胞培养室用于培养人神经细胞，所述第二细胞培养室用于培养间充质干细胞；所述第一细胞培养室和第二细胞培养室中均设有用于检测氧浓度的氧传感器。
上述微藻-脑血管-神经芯片中，对于多孔膜的材质不限，包括但不限于聚碳酸酯膜、陶瓷膜、聚氯乙烯膜、PU膜。
进一步地，所述微藻-脑血管-神经芯片还包括一底板，所述底板设置于所述第二基板的下方。
进一步地，所述微藻-脑血管-神经芯片还包括控制器以及分别用于照射第一微藻培养室和第二微藻培养室的多个光源，所述控制器与所述氧传感器和光源电性连接，其接收所述氧传感器传回的含氧量数据，并根据所述含氧量数据调节各光源的光照强度。
第四方面，本发明还提供了上述的多器官芯片、微藻-肠-肝-肿瘤芯片和微藻-脑血管-神经芯片在药物评价中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
1. 本发明的多器官芯片，每一细胞培养室均连结一个独立的微藻培养区，可通过微藻的光照强度和时间来控制每一细胞培养室中的氧气含量，从而可以实现同一个芯片中每种器官差异化的氧气含量控制。与现有的方法相比，本发明的器官芯片不同区域氧气控制方法更加简单，且并未使芯片的设计和加工复杂化。
2. 本发明的多器官芯片，对于提高人体芯片的仿生性和扩展人体芯片的应用范围具有重大意义。
附图说明
图1为实施例1中微藻-肠-肝-肿瘤芯片的设计图；
图2为实施例1中控制微藻产氧的工作站设计图；
图3为实施例1中微藻-肠-肝-肿瘤芯片中肠区域（a）、肝区域（b）和肿瘤区域（c）的氧气含量变化图；
图4为实施例2中微藻-肠-肝-肿瘤芯片中Caco-2细胞的生长状态图；
图5为实施例2中通过光照控氧后芯片中抗肿瘤活性药物CTX的活性结果，所有结果均经过统计学差异分析，*P<0.05，n=3；
图6为实施例3中通过光照控氧后芯片中抗肿瘤活性药物紫杉醇的活性结果，所有结果均经过统计学差异分析，*P<0.05，n=3；
图7 为实施例4中微藻-脑血管-神经芯片的设计图；
图8为实施例4中微藻-脑血管-神经芯片中脑血管区域（a）、神经区域（b）的氧气含量的变化图；
图9为实施例5中通过光照控氧后芯片中血脑屏障功能的活性结果，所有结果均经过统计学差异分析，**P<0.01，n=3；
其中：1、盖板；2、第一基板；3、第二基板；4、第三基板；5、第四基板；6、底板；7、微通道；8、微流道；
A1、第一腔室；B1、第二腔室；A2、第三腔室；B2、第四腔室；A3、第七腔室；B3、第六腔室；A4、第五腔室；A5、第八腔室；C1~C3、多孔膜；D1~D3、LED灯；E、智能控制系统；F、氧传感器；
1'~8'''''、流体接口。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1：微藻-肠-肝-肿瘤器官芯片的构建
肠-肝-肿瘤器官芯片是最新的口服抗肿瘤药物筛选体外平台，它能一次性考察药物经肠吸收和肝代谢后的抗肿瘤效果，比常规体外抗肿瘤药物筛选平台更为先进。在体内，肝处于富氧的状态，肠处于无氧的状态，而肿瘤处于低氧的状态。但是，目前已报道的肠-肝-肿瘤器官芯片中，各个器官中的氧含量是相同的，这与体内的情况并不一致。这将导致其仿生性不足，进而降低药物评价结果的参考价值。
肠-肝-肿瘤器官芯片控氧的难点在于：在一块芯片内同时构建富氧区、无氧区和低氧区，采用传统的任一控氧方法，都会导致芯片在设计、加工、操作和控制等多方面的复杂性大幅提升，因此目前还没有利用传统方法控氧、对多器官芯片分区控氧的报道。
本发明中，通过微藻实现了对肠-肝-肿瘤芯片进行分区控氧，如图1所示，该芯片包括自上而下依次层叠设置的盖板1、第一基板2、第二基板3、第三基板4、第四基板5和底板6。
第一基板2上设置有第一通孔和第二通孔，且第一通孔和第二通孔通过微通道7连接。
第二基板3上设置有第三通孔、第四通孔、第五通孔和第六通孔，且第三通孔和第四通孔之间、第五通孔和第六通孔之间均通过微通道7连接。
第三基板4上设置有第七通孔和第八通孔。
第三通孔位于第一通孔的正下方，中间间隔一层多孔膜C1，多孔膜C1和第一通孔组成第一腔室A1，第一腔室A1内培养肠上皮细胞和大肠杆菌。第二通孔和盖板1及第二基板3构成第二腔室B1，第二腔室B1内包含三维培养的微绿球藻。通过盖板1和第一基板2上的流体接口1'，1''，2'，2''，可以实时更换第二腔室B1内的微绿球藻。
第七通孔位于第三通孔的正下方，中间间隔一层多孔膜C2，多孔膜C2和第三通孔组成第三腔室A2，第三腔室A2内三维培养肝细胞。第四通孔和第一基板2及第三基板4组成第四腔室B2，第四腔室B2内包含三维培养的微绿球藻。通过盖板1、第一基板2和第二基板3上的流体接口3'，3''，3'''，4'，4''，4'''，可以实时更换第四腔室B2内的微绿球藻。
第八通孔位于第五通孔正下方，中间间隔一层多孔膜C3，多孔膜C3和第五通孔组成第五腔室A4，第五腔室A4内培养肿瘤细胞。第六通孔和第一基板2及第三基板4组成第六腔室B3，第六腔室B3内包含三维培养的微绿球藻，通过盖板1、第一基板2和第二基板3上的流体接口5'，5''，5'''，6'，6''，6'''，可以实时更换第六腔室B3内的微绿球藻。
第七通孔与第二基板3、第四基板5组成第七腔室A3，第八通孔与第二基板3、第四基板5组成第八腔室A5。第四基板上设置有微流道8，当第三基板4和第四基板5贴合时，微流道8可以通过流体接口7''''，7'''''，8''''，8'''''连通第七腔室A3和第八腔室A5。
控制微藻产氧的工作站设计如图2所示，其包括D1~D3为三个LED灯，分别用于照射第二腔室B1、第四腔室B2和第六腔室B3内的微绿球藻，LED灯由智能控制系统E控制。其还包括分别设置于第一腔室A1、第三腔室A2和第五腔室A4内的氧传感器F，智能控制系统E接受氧传感器F传来的氧含量信息，确定D1~D3三个LED灯的光照强度。
微藻-肠-肝-肿瘤器官芯片的构建操作：
Caco-2细胞用DMEM高糖培养液（含10%FBS和1%青霉素-链霉素混合溶液)培养，于37℃、5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱内进行传代培养。HepG2细胞用ɑ-MEM培养基（含10%FBS和1%青霉素-链霉素混合溶液)培养，于37℃、5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱内进行传代培养。MCF-7细胞用RPMI1640培养基（10%FBS 和1%青霉素-链霉素混合溶液)培养，于37℃、5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱内进行传代培养。
将透明聚碳酸酯多孔膜浸于75%乙醇中24 h，取出后用超纯水冲洗3次后紧密排布于35 mm培养皿中，随后用鼠尾Ⅰ型胶原包被培养皿中晾干的多孔膜。分别将消化成细胞悬液的Caco-2细胞、HepG2细胞、MCF-7细胞接种于3个多孔膜上，分别培养14天、2天和1天。再将培养的细胞和多孔膜转移至芯片上。
取对数生长后期的绿藻细胞(5×107/mL)，1500 r／min离心浓缩2 min，用无硫人工海水洗涤3次，再悬浮在无硫人工海水中，添加1％的无硫康维方营养盐，与Matrigel按照1 : 1的体积比混合，调节藻液的pH为7.7，接种在第二腔室B1、第四腔室B2和第六腔室B3中。第二腔室B1设置为无光照，此时绿藻发生呼吸作用，消耗氧气，大约50分钟后，第一腔室A1（肠腔）内处于低氧状态（如图3所示），Caco-2细胞正常生长（如图4所示）。第四腔室B2的光照强度约为5500 lx，约40分钟后，第三腔室A2（肝脏腔）内的氧分压达到400mmHg，肝细胞维持较高活力。第六腔室B3光照强度约为2500 lx，第五腔室A4内的氧分压维持在40 mmHg左右，处于一个较低的水平，便于MCF-7细胞的生长。
实施例2：微藻-肠-肝-肿瘤器官芯片在评价环磷酰胺抗肿瘤活性中的应用
广谱抗肿瘤药环磷酰胺本身为弱活性药物，其在体内经过CYP450酶（主要是CYP2B6）代谢后转变为活性物质醛磷酰胺，再运转到肿瘤组织中形成磷酰胺氮芥而发挥抑制癌细胞生长的作用。
细胞和绿藻按照先前所述的方法接种于微藻-肠-肝-肿瘤器官芯片上，静置于具有LED系统和氧含量监测系统的培养箱中培养24h，等待细胞完全贴壁，并使用氧传感器监测各腔室直至各腔室内均达到生理氧气浓度。对照组去除光源与绿藻，放置在普通培养箱中以37℃、5%CO2的条件进行常规培养。
使用肿瘤细胞培养基RPMI-1640稀释环磷酰胺母液得到5μM的环磷酰胺（CTX）溶液，向第一腔室A1中加入1mL的CTX溶液，药物通过多孔膜经由第三腔室A2、第七腔室A3、第八腔室A5后渗入第五腔室A4中，将芯片置于具有LED系统和氧含量监测系统的培养箱内。对照组按同样的方法注入CTX后放入普通培养箱中培养。
培养24h后，将上清液移去，使用CCK-8试剂盒对实验组和对照组的细胞抑制率进行测试，结果如图5所示。
从图5中可以看出，对于无光照培养的对照组，抗肿瘤药物CTX对于肿瘤细胞的抑制率达到42.93%；而经过光照控氧调节后，CTX对于肿瘤细胞的抑制率可达67.61%，显示出统计学差异。
该实验表明，通过微藻控氧得到的多器官联用芯片在抗肿瘤活性方面有着明显的增加。该应用可以为抗肿瘤药物的筛选提供有力的支持。
实施例3：微藻-肠-肝-肿瘤器官芯片在评价紫杉醇抗肿瘤活性中的应用
紫杉醇的抗癌作用机制是化合物本身能够诱导和促进微管蛋白聚合、抑制微管解聚、诱导细胞周期阻滞和促进凋亡，从而发挥抗肿瘤的作用，其在体内会被肝脏内的CYP3A4酶代谢为抗癌活性弱的代谢产物。
细胞和绿藻按照先前所述的方法接种于微藻-肠-肝-肿瘤器官芯片上，静置于具有LED系统和氧含量监测系统的培养箱中培养24h，等待细胞完全贴壁，并使用氧传感器监测各腔室，直至各腔室内均达到生理氧气浓度。对照组去除光源与绿藻，放置在普通培养箱中以37℃、5%CO2的条件进行常规培养。
使用肿瘤细胞培养基RPMI-1640稀释紫杉醇母液至浓度为0.4μM，超声溶解40min。
向第一腔室A1中注入1mL的紫杉醇溶液，药物通过多孔膜经由第三腔室A2、第七腔室A3、第八腔室A5后渗入第五腔室A4中，将芯片置于具有LED系统和氧含量监测系统的培养箱内培养。对照组按同样的方法注入紫杉醇溶液后放入普通培养箱中培养。
培养24h后，将上清液移去，使用CCK-8试剂盒对实验组和对照组的细胞抑制率进行测试，结果如图6所示。
从图6中可以看出，在控氧后，紫杉醇的抑制细胞效果从42%降低到20%，这一方面是由于HepG2细胞在氧气充足的条件下，CYP3A4酶表达量增加，紫杉醇经过肝CYP3A4酶代谢后，更少的本体化合物到达肿瘤细胞；另一方面可能是由于肿瘤细胞在低氧下微管蛋白的合成速度改变，导致紫杉醇的抑制率改变。
通过以上实验证明，该芯片系统可以为不同的肿瘤药物（如前药类、非前药类）的筛选提供多种选择的可能性。
实施例4：微藻-脑血管-神经芯片的构建
脑血管-神经芯片可以模拟血脑屏障和脑缺血病症，具有很重要的意义，在模拟过程中，氧气的浓度扮演着关键的角色，芯片不同区域的氧气浓度不同，而且需要不断变化。本实施例采用微藻动态控氧，构建脑血管-神经芯片，模拟血脑屏障（BBB）和脑缺氧病症。
该微藻-脑血管-神经芯片的设计如图7所示，其自上而下包括依次层叠设置的盖板1、第一基板2、第二基板3和底板6。
第一基板2上设置有第一通孔和第二通孔，且第一通孔和第二通孔之间通过微通道7连接。
第二基板3上设置有第三通孔和第四通孔，且第三通孔和第四通孔之间通过微通道7连接。
第三通孔位于第一通孔的正下方，中间间隔一层多孔膜C1，多孔膜C1和第一通孔组成第一腔室A1，第一腔室A1内培养人神经细胞。第二通孔和盖板1及第二基板3构成第二腔室B1，第二腔室B1内包含三维培养的微绿球藻，通过盖板1和第一基板2上的流体接口1'，1''，2'，2''，可以实时更换第二腔室B1内的微绿球藻。
第三通孔和多孔膜C1以及底板6构成第三腔室A2，第三腔室A2内培养间充质干细胞。第四通孔和第一基板2及底板6组成第四腔室B2，第四腔室B2内包含三维培养的微绿球藻，通过盖板1、第一基板2和第二基板3上的流体接口3'，3''，3'''，4'，4''，4'''，可以实时更换第四腔室B2内的微绿球藻。
控制微藻产氧的工作站包括D1、D2两个LED灯，分别用于照射第二腔室B1和第四腔室B2内的微绿绿藻，LED灯由智能控制系统E控制。其还包括设置于第一腔室A1和第三腔室A2内的氧传感器F，智能控制系统E接受氧传感器F传来的氧含量信息，确定D1、D2两个LED灯的光照强度。
本实施例的微藻-脑血管-神经芯片模拟血脑屏障和脑缺氧的方法如下：
首先，采用密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs），并在体外通过血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及内皮细胞生长因子（ECGF）向血管内皮细胞诱导分化。具体操作如下：
① hMSCs培养。无菌条件下，取健康志愿者骨髓6-8 mL，加入含有肝素的离心管中，以1400 rpm的转速离心10 min，弃上清液，细胞沉淀加胎牛血清重悬，再加入到含有10mL Percoll梯度离心液的离心管中，以2000 rpm的转速离心30 min，离心后得到3层内容物，在上、中层之间的液体界面处可见浑浊乳白色的单个核细胞层，吸管沿管壁边缘吸取界面层单个核细胞，放入另一试管中；加入DMEM稀释混匀，1400 rpm离心10 min，弃去上清后用DMEM培养液重悬细胞并洗涤；再次离心以后，在去除上清液的试管中加含有少量10%FBS的DMEM重悬，接种于65 cm2培养瓶内，置入37℃、5%CO2的培养箱中培养。间隔48 h及72 h各换液1次，以后每3天换液。至细胞生长到80%-90%时离心细胞悬液，以1 : 3的比例加入0.05%胰酶+0.02%EDTA液进行消化传代。
② hMSCs诱导分化为血管内皮细胞。hMSCs用血管内皮细胞诱导分化培养液(含有10%FBS的M199培养基+肝素50 IU/mL+ECGF 10ng/mL，bFGF 10ng/mL，VEGF 10 ng/mL)重悬，置入37℃，5％CO2培养箱中培养，显微镜下可观察到内皮细胞。
神经细胞的诱导分化：用人来源的诱导多能干细胞（iPSCs）先诱导分化为神经干细胞，神经干细胞进一步诱导分化为神经元。具体操作如下：
① iPSCs的培养。iPSCs从北京赛贝生物技术有限公司购买，将iPSCs用复苏培养基复苏于2 mL matrix工作液（1:100稀释为工作液）包被过的6 cm培养皿中，加入4mL含ROCK inhibitor Y27632的PSCeasy人多潜能干细胞完全培养基。ROCK inhibitor终浓度为10 μM。每日用PSCeasy人多潜能干细胞完全培养基进行换液。
②神经干细胞诱导分化。当iPSCs细胞汇合度达到100%以上时开始诱导分化，弃去iPSCs培养基，在培养皿中加入适量无钙镁的PBS溶液清洗，弃去PBS溶液，加入NeuroEasy人神经干细胞诱导完全培养基4 mL/孔（6孔板），放入5% CO2的37℃恒温细胞培养箱中培养，每天观察细胞，显微镜下观察出现多个Rosette(玫瑰花环状)结构，即诱导结束。
③神经元诱导分化。选择形态较好的贴壁神经干细胞进行分化，吸去培养皿中上清液，加入无钙镁的PBS清洗培养皿。弃上清，加入人NeuroEasy神经干细胞消化液，37℃培养箱消化5-10分钟，细胞变圆时可终止消化。取出培养皿，加入等体积NeuroEasy人神经元分化接种完全培养基终止消化，用移液器将贴壁细胞吹打下来，收集于15 mL离心管中。1000 rpm离心5分钟。弃上清液，在离心管中加入适量NeuroEasy人神经元分化接种完全培养基，重悬细胞按细胞贴壁后5-10%汇合度接种，37℃恒温、5%CO2细胞培养箱中培养24小时。显微镜下观察细胞贴壁，弃上清液，更换为NeuroEasy人神经元分化维持培养基。37℃恒温、5% CO2细胞培养箱中继续培养，每2-3 天使用NeuroEasy神经元分化维持培养基换液。大约培养8 -10天左右，显微镜下可观察到神经元。长期培养可得到成熟神经元。
控制第一腔室A1内的氧气处于较高的分压，给予神经细胞一个富氧的状态，使其处于活跃状态；然后控制第三腔室A2内氧气分压恒定为40mmHg左右，使间充质干细胞定向分化为脑血管内皮细胞，因此形成血脑屏障。此后，降低第三腔室A2内分压到7mmHg左右，使其处于缺氧状态，脑血管内皮细胞以及血脑屏障因此停止功能，此时便可以模拟脑缺血状态；恢复氧气分压为40mmHg，血脑屏障恢复功能。整个过程氧分压的变化如图8所示。
实施例5：微藻-脑血管-神经芯片应用于多柔比星毒性评价
按实施例4描述的方法在微藻-脑血管-神经芯片上构建血脑屏障。
使用NeuroEasy神经元分化维持培养基稀释多柔比星母液至浓度为5μM，作为工作液。
向第一腔室A1中注入1mL的工作液，将微藻-脑血管-神经芯片置于具有LED系统和氧含量监测系统的培养箱内。
对照组调节光照，降低第三腔室A2内分压到7mmHg左右，使其处于缺氧状态，脑血管内皮细胞以及血脑屏障因此停止功能。向第一腔室A1中注入1mL的工作液，将芯片置于具有LED系统和氧含量监测系统的培养箱内。
孔板组按同样的方法在孔板中使iPSCs分化为内皮细胞，模拟BBB，向其中注入1mL的工作液，放置在培养箱中培养24h。
通过量化乳酸脱氢酶（LDH）评估多柔比星的神经毒性，结果如图9所示。在芯片上通过控氧构建的BBB表现出良好的生物功能，LDH量与孔板组相当。当通过控制氧气浓度关闭BBB功能后，具有神经毒性的多柔比星穿过功能受损的BBB模型，产生较强的神经毒性。该结果一方面证实了该芯片可以构建血脑屏障，提供了一种功能屏障，保护大脑侧免受药物引起的神经毒性，另一方面也证实该芯片可以模拟病理状态下的BBB，可用于病理模型的构建。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (16)

1.一种多器官芯片，包括芯片基体以及贴合于所述芯片基体上的芯片盖板，其特征在于，所述芯片基体上形成有至少两个细胞培养室，所述至少两个细胞培养室分别用于培养不同种类的细胞以模拟不同的器官；至少一个所述细胞培养室设有微藻培养室，所述微藻培养室形成于芯片基体上，用于培养微藻以产生或消耗氧气；所述细胞培养室与对应的微藻培养室之间相互连通且允许气体交换；通过调节不同微藻培养室中微藻的光合作用或呼吸作用的强度，实现每一细胞培养室中氧气浓度的独立控制。
2.根据权利要求1所述的一种多器官芯片，其特征在于，所述细胞培养室与对应的微藻培养室之间通过微通道、多孔膜、微栅栏或水凝胶连接以实现气体交换。
3.根据权利要求1所述的一种多器官芯片，其特征在于，所述芯片盖板上对应每个微藻培养室均设置有至少一个流体接口，所述流体接口与对应的微藻培养室连通，用于在线添加或更换培养基或微藻。
4.根据权利要求1所述的一种多器官芯片，其特征在于，每个微藻培养室中均培养有一种或多种微藻，所述微藻贴附在微藻培养室的表面、悬浮于液体培养基中或者在三维基质中培养。
5.根据权利要求1所述的一种多器官芯片，其特征在于，每个细胞培养室中均培养有一种或多种细胞，所述细胞贴附于细胞培养室的表面、悬浮于液体培养基中或者在三维基质中培养。
6.根据权利要求1所述的一种多器官芯片，其特征在于，所述细胞培养室用于培养细胞或细胞与细菌的混合体。
7.根据权利要求1所述的一种多器官芯片，其特征在于，至少一个细胞培养室和/或微藻培养室安装有氧含量监控器件。
8.根据权利要求7所述的一种多器官芯片，其特征在于，所述多器官芯片还包括至少一个光源，所述至少一个光源用于照射所述微藻培养室。
9.根据权利要求8所述的一种多器官芯片，其特征在于，还包括一与所述氧含量监控器件和光源电性连接的控制器，所述控制器接收所述氧含量监控器件传回的含氧量数据，并根据接收的含氧量数据调节光源的光照强度。
10.一种微藻-肠-肝-肿瘤芯片，包括芯片基体以及贴合于所述芯片基体上的芯片盖板，其特征在于，所述芯片基体包括自上而下依次层叠设置的第一基板、第二基板、第三基板和第四基板；
所述第一基板上设有第一细胞培养室和第一微藻培养室，所述第一细胞培养室与第一微藻培养室通过微通道连接；所述第二基板上设有第二细胞培养室、第三细胞培养室、第二微藻培养室和第三微藻培养室，所述第二细胞培养室位于第一细胞培养室的下方，所述第二细胞培养室与第二微藻培养室通过微通道连接，所述第三细胞培养室和第三微藻培养室通过微通道连接；所述第三基板上设有第一中间腔室和第二中间腔室，所述第一中间腔室位于第二细胞培养室的下方，所述第二中间腔室位于第三细胞培养室的下方；所述第四基板上设有微通道；
其中，所述第一细胞培养室、第二细胞培养室、第三细胞培养室、第一中间腔室和第二中间腔室均为设置于基板上的通孔，所述第一细胞培养室与第二细胞培养室之间、第二细胞培养室与第一中间腔室之间、第三细胞培养室与第二中间腔室之间均通过多孔膜隔开；当第三基板与第四基板贴合时，第四基板上的微通道连通所述第一中间腔室和第二中间腔室；
所述第一微藻培养室、第二微藻培养室和第三微藻培养室均用于培养微藻，所述芯片盖板上对应每个微藻培养室均设置至少一个流体接口，所述流体接口通过微通道与对应的微藻培养室连通；
所述第一细胞培养室用于培养肠上皮细胞和肠道细菌，所述第二细胞培养室用于培养肝细胞，所述第三细胞培养室用于培养肿瘤细胞；所述第一细胞培养室、第二细胞培养室和第三细胞培养室中均设有用于检测氧浓度的氧传感器。
11.根据权利要求10所述的微藻-肠-肝-肿瘤芯片，其特征在于，还包括一底板，所述底板设置于所述第四基板的下方。
12.根据权利要求10所述的微藻-肠-肝-肿瘤芯片，其特征在于，还包括控制器以及分别用于照射第一微藻培养室、第二微藻培养室和第三微藻培养室的多个光源，所述控制器与所述氧传感器和光源电性连接，其接收所述氧传感器传回的含氧量数据，并根据所述含氧量数据调节各光源的光照强度。
13.一种微藻-脑血管-神经芯片，包括芯片基体以及贴合于所述芯片基体上的芯片盖板，其特征在于，所述芯片基体包括自上而下依次层叠设置的第一基板和第二基板；
所述第一基板上设有第一细胞培养室和第一微藻培养室，所述第一细胞培养室与第一微藻培养室通过微通道连接；所述第二基板上设有第二细胞培养室和第二微藻培养室，所述第二细胞培养室位于第一细胞培养室的下方，所述第二细胞培养室与第二微藻培养室通过微通道连接；
其中，所述第一细胞培养室为设置于基板上的通孔，所述第一细胞培养室与第二细胞培养室之间通过多孔膜隔开；所述第一微藻培养室和第二微藻培养室均用于培养微藻，所述芯片盖板上对应每个微藻培养室均设置至少一个流体接口，所述流体接口通过微通道与对应的微藻培养室连通；所述第一细胞培养室用于培养人神经细胞，所述第二细胞培养室用于培养间充质干细胞；所述第一细胞培养室和第二细胞培养室中均设有用于检测氧浓度的氧传感器。
14.根据权利要求13所述的微藻-脑血管-神经芯片，其特征在于，还包括一底板，所述底板设置于所述第二基板的下方。
15.根据权利要求13所述的微藻-脑血管-神经芯片，其特征在于，还包括控制器以及分别用于照射第一微藻培养室和第二微藻培养室的多个光源，所述控制器与所述氧传感器和光源电性连接，其接收所述氧传感器传回的含氧量数据，并根据所述含氧量数据调节各光源的光照强度。
16.权利要求1-9任一项所述的多器官芯片、权利要求10-12任一项所述的微藻-肠-肝-肿瘤芯片和权利要求13-15任一项所述的微藻-脑血管-神经芯片在药物评价中的应用。
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