CN114275751B - 一种六边形大孔羟基磷灰石的制备方法及其产品与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种六边形大孔羟基磷灰石的制备方法及其产品与应用，包括以下步骤：1)碳点的制备；2)碳点与羟基磷灰石的复合；本发明中利用碳点取代传统的致孔剂CTAB，合成非棒状的六边形介孔羟基磷灰石，并且使其尺寸控制在了200纳米以下，孔径为10纳米左右，使其可以更好的应用在大分子蛋白药物的输送中。本发明的中的碳点采用含有氨基的苯甲酸和氨基苯作为原料，在控制碳点的形貌的同时，碳点自身是含有氨基的，可以调控羟基磷灰石的形貌，而且可以更好的实现与羟基磷灰石的复合。本实验提供了一个合成固定形貌的不同介孔尺寸的羟基磷灰石的方法平台。利用合成碳点的不同尺寸，可以灵活的调整羟基磷灰石的介孔大小。

Description

一种六边形大孔羟基磷灰石的制备方法及其产品与应用

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种六边形大孔羟基磷灰石的制备方法及其产品与应用。

背景技术

近年来，人们越来越关注发展更有效的新药物输送体系，相比较传统的药物输送，新体系要具备更好的生物利用度，还得兼具高效，低毒，控释等特点。目前为止，许多材料，包括聚合物胶束，树枝状大分子，脂质体和多种无机纳米颗粒已经应用到药物输送体系。其中，介孔羟基磷灰石(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂，简称mHAP)受到很多学者的青睐，介孔羟基磷灰石具有大孔结构和大的比表面积，以及表面容易修饰的特质，使得其可以实现药物的体内靶向输送。另外，羟基磷灰石是人类和动物骨骼中主要的无机成分，它含有人体必需的钙、磷等元素。因此，mHAP是常见的被认为是最适合生物医学应用的材料。但是目前为止，纳米级别的mHAP的孔径大多数都是低于5纳米，这样限制了他们对大分子蛋白药物的输送，有关研究报告发现，一旦形成大孔结构，羟基磷灰石就会转变成微米级别的材料，微米级别的大尺寸限制了其进一步在药物载体上的发展应用。制备介孔材料羟基磷灰石，通常有软模法和硬模板法，硬模板主要是用硅球等一些材料合成有序形状的纳米材料，合成阵列的较多，软模板主要是材料表面活性剂如CTAB，SDS等通过胶束作用，形成一定形状的纳米材料，这两种区别比较大，合成机理不一样，前者采用模板定纳米材料形状，后者一般是组装，合成的目标也相差较大，前者一般是阵列，后者一般是纳米线，棒之类的。

蛋白作为新型药物，它是细胞内一种很重要的营养物质维持着细胞的正常功能。因此在细胞内蛋白的过表达或不足都是很多疾病的根源。目前，蛋白药物是很前言的一种治疗疾病的方式。因此，向细胞内输送蛋白药物是一种治疗这类疾病的最直接的办法。蛋白药物的分子量主要分布在12kDa到480kDa，尺寸主要分布在2～10纳米之间，如此一来，需要的药物载体孔径大小应为10纳米左右。因而研发一种大孔的羟基磷灰石用于输送蛋白类药物有重大的研究意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种六边形大孔羟基磷灰石的制备方法及其产品与应用，通过利用碳点作为硬模板，控制羟基磷灰石的形貌，合成孔径6～12nm左右的六边形介孔羟基磷灰石，从而实现对大分子蛋白类药物的负载。

本发明这种六边形大孔羟基磷灰石的制备方法，包括以下步骤：

1)碳点的制备：将4-氨基苯甲酸和1,4-二氨基苯溶于无水乙醇中，接着将其转移到聚四氟乙烯反应釜，在设定温度下进行反应，反应完毕后，将获得的悬浮液进行过滤，滤液进行旋蒸，得到的黑色产物，将黑色产物重新溶解于去离子水，进行离心，得到的黑棕色的碳量子点水溶液，然后进行透析，移除小分子后，过滤，收集的黑棕色溶液，冻干后，即得碳点；

2)碳点与羟基磷灰石的复合：将步骤1)中的碳点溶解于水中，得到碳点溶液，接着将碳点溶液进行过滤，然后向滤液中加入磷酸氢二胺溶液，搅拌混匀后，得到混合液，接着将混合液滴加到硝酸钙溶液中，滴加完毕后，有白色的胶状沉淀生成后，转移至反应釜中，进行反应，反应完毕后，待反应釜自然冷却至室温，取出反应釜，离心，获得的沉淀经过洗涤后冻干，得到棕色的冻干粉，将棕色的冻干粉研磨后，煅烧，得到白色粉末，即为大孔羟基磷灰石。

所述步骤1)中，4-氨基苯甲酸和1,4-二氨基苯的质量比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)；设定温度为170～190℃，反应时间为10～14h；透析所用的透析膜载留分子量为500～1000Da。

所述步骤2)中，碳点溶液的浓度为0.01～0.02g/mL；磷酸氢二胺溶液的浓度为0.06～0.07g/mL；硝酸钙为4水合硝酸钙，4水合硝酸钙的浓度为0.1～0.2g/mL；碳点溶液，磷酸氢二胺溶液和硝酸钙溶液的体积比为(6～8):(4～6):(7～9)；搅拌混匀是在700～900rpm转速下混匀0.5～1.5h；滴加混合液的过程需要控制pH为11～12；反应温度为100～200℃，反应时间为18～30h；煅烧温度为700～900℃，煅烧时间为1～3h。

根据上述的方法制备得到大孔羟基磷灰石。

所述的大孔羟基磷灰石在作为蛋白类药物载体中的应用。

所述的大孔羟基磷灰石负载蛋白类药物的方法，包括以下步骤：

S1大孔羟基磷灰石氨基化处理：将PEI加入到超纯水中，超声分散均匀，得到PEI溶液；将大孔羟基磷灰石在超声下溶于超纯水中，得到羟基磷灰石溶液；超声条件下，将羟基磷灰石溶液滴加入到PEI溶液中，超声均匀后，室温下搅拌反应，反应完毕，离心，洗涤后，得到氨基改性的大孔羟基磷灰石；

S2药物负载处理：将氨基改性的大孔羟基磷灰石分散于超纯水中，然后加入蛋白类药物，设定温度下，搅拌反应，反应完毕后，离心，沉淀冻干后，得到负载有蛋白药物的大孔羟基磷灰石。

所述步骤S1中，PEI的分子量为500～700，PEI溶液的体积浓度为0.1～0.2；羟基磷灰石溶液的浓度为40～60mg/mL；PEI溶液与羟基磷灰石溶液的体积比为(4～5):1；搅拌反应时间为18～36h；离心转速为10000～12000rpm，离心时间为4～6min。

所述步骤S2中，氨基改性的大孔羟基磷灰石在超纯水中的浓度为20～30mg/mL，氨基改性的大孔羟基磷灰石与蛋白类药物的质量比为(20～30):(10～15)；搅拌反应温度为0～5℃，反应时间为8～24h，搅拌速度为800～1200rpm。

本发明的有益效果：1)本发明中利用碳点取代传统的致孔剂CTAB，合成六边形的介孔羟基磷灰石，并且使其尺寸控制在了200纳米以下，孔径为10纳米左右，使其可以更好的应用在大分子蛋白药物的输送中。2)本发明的中的碳点采用含有氨基的苯甲酸和苯作为原料，在控制碳点的形貌的同时，碳点自身是含有氨基的，可以调控羟基磷灰石的形貌，而且可以更好的实现与羟基磷灰石的复合。3)本实验提供了一个合成固定形貌的不同介孔尺寸的羟基磷灰石的方法平台。利用合成碳点的不同尺寸，可以灵活的调整羟基磷灰石的介孔大小。4)本发明中的实施例中以以葡萄糖氧化酶GOx为例，它的尺寸为6.0nm×5.2nm×7.7nm，成功的负载到了实施例制备的大孔羟基磷灰石上，负载率达到了79.9％，说明本发明的羟基磷灰石可以实现大分子蛋白药物的负载。

附图说明

图1实施例1中碳点的表征结果图，A：TEM图；B:FTIR图。

图2实施例1中大孔羟基磷灰石的表征结果图，A:TEM图，B:XRD图，C:FTIR图，D:N₂吸附脱附表征。

图3实施例1中氨基化处理的羟基磷灰石的FTIR图。

图4实施例1中负载了葡萄糖氧化酶的羟基磷灰石的紫外光谱图。

具体实施方式

实施例中用到的试剂：

4-氨基苯甲酸(PABA),1,4-二氨基苯(1,4-DB),无水乙醇，硝酸钙[Ca(NO₃)₂·4H₂O]，磷酸氢二胺[(NH₄)₂HPO₄,DAHP]均购自于Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI)。其他的化学试剂来自北京试剂(Beijing,China)。所有试剂在使用前都没进行进一步的纯化，去离子水(DIW)来自密理博Milli-Q-RO₄水纯化系统，电阻率高于18MΩ·cm(Bedford,MA)，并且贯穿于整个研究过程。

实施例1

1)碳点的合成：4-氨基苯甲酸(0.05g)和0.05g1,4-二氨基苯溶于10ml无水乙醇，然后,这些溶液转移到聚四氟乙烯反应釜，180℃反应12h。反应完成后，反应产物自然冷却至室温。获得的黑棕色悬浮液依次过滤，旋蒸，重新溶解在去离子水，再离心。然后，得到的黑棕色碳点水溶液进行透，透析膜的载留分子量为500～1000Da，用去离子水透析72小时，每6小时更换一次水，移除小分子后，过滤。最后，收集的黑棕色溶液冻干，得到黑色的粉末即为碳点。

对碳点进行TEM和FTIR测试，其结果如图1所示，从图1A可以看出，合成的碳点在水中均匀分散，直径为5～6nm。在图1B红外投射光谱中，显示峰值在3671cm^-1为O-H的伸缩振动峰，3391cm^-1和3222cm^-1为N-H的伸缩振动峰，2986cm^-1和2898cm^-1为C-H的伸缩振动峰，2121cm^-1和1932cm^-1为C＝N和C＝C的伸缩振动峰，1639cm^-1为C＝O的伸缩振动峰，1454cm^-1和1406cm^-1为C＝C的伸缩振动峰，1231cm^-1为C-N的伸缩振动峰。从这些峰值可以了解到在碳点的反应过程中发生了原料的裂解行为，分子间的环化作用，和缩合反应，最后形成氧化程度高的产物。得到的碳点在去离子水中的Zeta电势为+12.6mv。

2)碳点与羟基磷灰石的复合：取0.1g的碳点，溶于7ml水，过滤弃掉不溶物。取0.9835g硝酸钙[Ca(NO₃)₂·4H₂O]溶于8ml水，另取0.33g磷酸氢二胺[(NH₄)₂HPO₄,DAHP]溶于5ml水中。接下来，将碳点和磷酸氢二胺溶液混合，800rpm搅拌1小时，搅拌好的混合液逐滴加入到硝酸钙溶液中，整个滴加过程要严格室温搅拌，反应混合物的pH在滴加前后总是维持在11～12。滴加完毕后，有白色的胶状沉淀生成，转移到100ml体积的反应釜里面，150℃反应24h，待反应釜自然冷却至室温，取出反应釜，形成的沉淀离心，水和乙醇依次洗三次。得到的棕色沉淀冻干，干燥的粉末产物用研钵研磨处理均匀，800℃煅烧2h移除致孔模板碳点。收集最终的白色粉末固体产物即为大孔的羟基磷灰石mHAP。

对大孔的羟基磷灰石进行表征，其结果如图2所示：从图2A看出，合成的介孔羟基磷灰石尺寸为100纳米左右，介孔尺寸为6-12纳米。X射线粉末衍射图谱(XRD,图2B)显示合成的羟基磷灰石属于标准的六方晶系P63/m空间群。红外吸收(FTIR,图2C)显示合成的介孔羟基磷灰石含有磷酸根和羟基。其中，羟基(-OH)的吸收峰在3572cm^-1和636cm^-1波段处。磷酸根(PO₄ ^3-)的红外吸收分别出现在1097cm^-1,1052cm^-1,962cm^-1,603cm^-1,和570cm^-1波段。双峰1472cm^-1和1413cm^-1属于碳酸根离子(CO₃ ^2-)，原因是在合成过程中空气中的二氧化碳进入反应体系中，取代了部分的磷酸根离子。N₂吸附脱附(图2D)实验表征数据显示，合成的羟基磷灰石是标准的介孔结构材料，材料的比表面积为160.98m2/g,平均孔径大小为18.89nm。所有的表征数据显示介孔的羟基磷灰石已经成功合成。得到的羟基磷灰石在去离子水中的Zeta电势为-13.9mv。

3)介孔羟基磷灰石氨基化：将500uL的PEI(分子量600)加入到4.5mL超纯水中，超声分散均匀。将mHAP(50mg)超声下溶于1mL超纯水中。超声下将mHAP慢慢滴加入到PEI的溶液中，超声均匀后，室温下搅拌24h.反应完毕，离心(11000rpm，5min)，沉淀水洗两次，溶于1mL超纯水备用，得到含氨基化的羟基磷灰石的溶液。

对氨基化的羟基磷灰石进行红外表征，其结果如图3所示，比较图2C和图3，在红外吸收光谱中，我们发现在图3中有新的红外吸收峰出现，波段位于1631cm^-1，这个位置的吸收带是属于氨基N–H键的伸缩振动峰，另外我们可以看出在图3中，1483cm^-1的吸收峰变宽，这是N-H的弯曲振动导致的。去离子水中测量得到的氨基修饰产物Zeta电势为+15.4mV。结合红外和电势数据，可以说明氨基成功的包覆在羟基磷灰石的表面。

4)葡萄糖氧化酶与氨基化介孔羟基磷灰石的复合：氨基化羟基磷灰石25mg(2.5ml步骤3)中的产物溶液)离心，重新分散在1mL水中，加入13.8mg葡萄糖氧化酶(1mL水)，4℃，1000rpm搅拌过夜，离心(12000rpm，5min)，沉淀水洗2次，得到纳米复合物mHAPG，在离心过程中，需要收集上清液，BCA试剂盒方法测试上清液中蛋白的剩余含量。

葡萄糖氧化酶的负载实验可以通过紫外吸收(UV-vis)的数据来进行表征结果如图4所示，在图4中，我们发现与单纯的羟基磷灰石相比，葡糖糖氧化酶负载的纳米复合物在280nm处有新的吸收峰出现。此位置正好是蛋白的特殊吸收峰位置。具体的蛋白负载效率，经过BCAProteinAssayKit测定为79.9％。

考察合成的纳米复合物的生物活性，主要是考察纳米复合物是否消耗葡萄糖，由于葡萄糖氧化酶可以催化葡萄糖形成葡萄糖酸，形成的酸性条件可以诱导介孔羟基磷灰石的分解，所以羟基磷灰石是否加速分解产生钙离子成为我们测试纳米复合物活性的关键因素。实验中，我们准备4管12mM葡萄糖溶液,每管体积20mL，溶剂为DPBS，样本分别为葡萄糖氧化酶(GOx),介孔羟基磷灰石(mHAP)，纳米复合物(mHAPG)，空白组。37℃摇床反应5小时后,离心，取上清液分析。上清液中的葡萄糖浓度用菲林试剂检测。在添加组分为Gox和mHAPG的两组中可以看到明亮的蓝色，证明葡萄糖已经消耗殆尽。但是在控制组mHAP和空白组出现了砖红色沉淀，证明在这两个组分中葡萄糖仍然存在。最终pH值测试结果是Gox、mHAP、mHAPG和空白组分别为2.87,4.8，5.66和7.5。ICP-mas元素分析数据显示，加入mHAPG对待的葡萄糖溶液中Ca²⁺浓度是250mg/ml，而单纯用mHAP对待的对比组Ca²⁺浓度是7.5mg/mL，前者是后者的36倍。增强的Ca²⁺浓度说明了负载GOx可以使得mHAP的分解加速，综合以上因素，可以归结为Gox与mHAP形成的纳米复合物仍具有很强的生物活性，可以高效催化葡萄糖分解。

Claims (8)

1.一种介孔羟基磷灰石的制备方法，包括以下步骤：

1）碳点的制备：将4-氨基苯甲酸和1,4-二氨基苯溶于无水乙醇中，接着将其转移到聚四氟乙烯反应釜，在设定温度下进行反应，反应完毕后，将获得的悬浮液进行过滤，滤液进行旋蒸，得到的黑色产物，将黑色产物重新溶解于去离子水，进行离心，得到的黑棕色的碳量子点水溶液，然后进行透析，移除小分子后，过滤，收集的黑棕色溶液，冻干后，即得碳点；

2）碳点与羟基磷灰石的复合：将步骤1）中的碳点溶解于水中，得到碳点溶液，接着将碳点溶液进行过滤，然后向滤液中加入磷酸氢二胺溶液，搅拌混匀后，得到混合液，接着将混合液滴加到硝酸钙溶液中，滴加完毕后，有白色的胶状沉淀生成后，转移至反应釜中，进行反应，反应完毕后，待反应釜自然冷却至室温，取出反应釜，离心，获得的沉淀经过洗涤后冻干，得到棕色的冻干粉，将棕色的冻干粉研磨后，煅烧，得到白色粉末，即为介孔羟基磷灰石；

所述步骤2）中，碳点溶液的浓度为0.01~0.02g/mL；磷酸氢二胺溶液的浓度为0.06~0.07g/mL；硝酸钙为4水合硝酸钙，4水合硝酸钙的浓度为0.1~0.2g/mL；碳点溶液，磷酸氢二胺溶液和硝酸钙溶液的体积比为(6~8):(4~6):(7~9)。

2.根据权利要求1所述的介孔羟基磷灰石的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中，4-氨基苯甲酸和1,4-二氨基苯的质量比为(0.5~1.5):(0.5~1.5)；设定温度为170~190℃，反应时间为10~14h；透析所用的透析膜载留分子量为500~1000 Da。

3.根据权利要求1所述的介孔羟基磷灰石的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中，搅拌混匀是在700~900rpm转速下混匀0.5~1.5h；滴加混合液的过程需要控制pH为11~12；反应温度为100~200℃，反应时间为18~30h；煅烧温度为700~900℃，煅烧时间为1~3h。

4.根据权利要求1~3中任意一项所述的方法制备得到六边形介孔羟基磷灰石。

5.根据权利要求4所述的介孔羟基磷灰石在作为蛋白类药物载体中的应用。

6.根据权利要求4所述的介孔羟基磷灰石负载蛋白类药物的方法，包括以下步骤：

S1介孔羟基磷灰石氨基化处理：将PEI加入到超纯水中，超声分散均匀，得到PEI溶液；将介孔羟基磷灰石在超声下溶于超纯水中，得到羟基磷灰石溶液；超声条件下，将羟基磷灰石溶液滴加入到PEI溶液中，超声均匀后，室温下搅拌反应，反应完毕，离心，洗涤后，得到氨基改性的介孔羟基磷灰石；

S2药物负载处理：将氨基改性的介孔羟基磷灰石分散于超纯水中，然后加入蛋白类药物，设定温度下，搅拌反应，反应完毕后，离心，沉淀冻干后，得到负载有蛋白药物的介孔羟基磷灰石。

7.根据权利要求6所述的介孔羟基磷灰石负载蛋白类药物的方法，其特征在于，所述步骤S1中，PEI的分子量为500~700，PEI溶液的体积浓度为0.1~0.2；羟基磷灰石溶液的浓度为40~60mg/mL；PEI溶液与羟基磷灰石溶液的体积比为(4~5):1；搅拌反应时间为18~36h；离心转速为10000~12000rpm，离心时间为4~6min。

8.根据权利要求6所述的介孔羟基磷灰石负载蛋白类药物的方法，其特征在于，所述步骤S2中，氨基改性的介孔羟基磷灰石在超纯水中的浓度为20~30mg/mL，氨基改性的介孔羟基磷灰石与蛋白类药物的质量比为(20~30):(10~15)；搅拌反应温度为0~5℃，反应时间为8~24h，搅拌速度为800~1200rpm。

Images