CN114259543A - 一种石斛组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种石斛组合物及其制备方法和应用，属于植物组合物领域。所述石斛组合物包括如下重量份数的原料：铁皮石斛1.0份、黄芪1.2‑2.0份、太子参1.0‑2.5份、枸杞0.2‑0.6份。本发明还公开了石斛组合物的制备方法和应用。本发明石斛组合物具有降血糖、降血脂、改善高血糖症状等功效。

Description

一种石斛组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及植物组合物领域，具体涉及一种石斛组合物及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病是一种以长期高血糖为主要特征的慢性内分泌代谢疾病，是由于人体代谢出现紊 乱，胰岛素的产生或作用发生障碍而导致血液中的葡萄糖水平升高。其中，2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus)是在胰岛素抵抗的条件下，胰岛β细胞分泌胰岛素逐步减少的代谢疾病， 约占所有糖尿病患者的90％。文章(Rood JA,Ryan C M,CobitzAR,Waterhouse B R,Strachan M.Benefits Beyond Glycemia of Adding Rosiglitazonerather than Glyburide to Metformin Monotherapy in Type 2Diabetes Mellitus(2型糖尿病)[J].Diabetes,2004,532:A480.)公开二甲 双胍是治疗2型糖尿病的一线药物，除了可以降低血糖水平外，还可以抑制肝脏葡萄糖生成， 增强肝脏和骨骼肌对外周葡萄糖的摄取，同时具有胰岛素增敏作用。文章(Lee H,Ko G.Effect of Metformin on MetabolicImprovement and Gut Microbiota[J].Applied and Environmental Microbiology,2014,80(19):5935-5943.)公开二甲双胍还可以改善2型糖尿病患者的肠道菌群 组成，增加Akkermansia菌属、双歧杆菌等有益菌的丰度，从而改善2型糖尿病。

口服降糖药物是目前2型糖尿病的主要治疗方式，尽管在血糖控制方面有效，但可能无 法预防糖尿病的长期并发症。文章(孙静,罗仁.我国医院糖尿病药物治疗及基本药物应用[J]. 中国药房,2016,27(24):3313-3319.)公开长期服用降糖药物往往伴随一些副作用的产生，例如 阿卡波糖会导致胃肠道紊乱，格列本脲会导致粒细胞减少和低血糖，二甲双胍会导致乳酸酸 中毒等。

近年来，植物活性物质治疗2型糖尿病的研究较多，如铁皮石斛多糖、黄连素等，这些 活性物质在缓解高血糖症状方面具有明显的效果，且可以预防和延缓并发症。同时，与口服 降糖药物相比，植物活性物质一般无明显的副作用，安全性较高。因此，植物活性物质在未 来的治疗药物开发方面具有很大的潜力。

中国专利(CN201410508301.5)公开了一种复方铁皮石斛降糖胶囊，包括以下重量份的 原料：铁皮石斛28％～30％、黄芪12％～14％、葛根10％～12％、生地10％～12％、天花粉 8％～10％、黄精8％～10％、枸杞子8％～10％、赤芍8％～10％，该胶囊具有促进胰岛β细胞 分泌胰岛素、抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素、抑制肾上腺素引起的肝糖原分解和促进肝糖原 合成、降低血糖值等功效，但该复方胶囊成分较复杂。

开发一种功效显著、成分安全、且降低糖尿病患者并发症的产品具有非常重要的意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种石斛组合物及其制备方法，该石斛组合物一方 面具有降血糖、改善高血糖症状、增加糖尿病患者体重、促进肝糖原合成、调节糖脂代谢、 降血脂等功效，另一方面具有保护肝脏、改善肾脏、脾脏和胰腺损伤等功效，同时，还具有 调节肠道菌群失调的功效。

为此，本申请提供的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种石斛组合物。

根据本发明，所述石斛组合物包括铁皮石斛、黄芪、太子参、枸杞。

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)味甘，性微寒，入胃、肾经，具有养 胃生津、滋阴除热的作用。铁皮石斛是中药石斛中的上品，具有最佳的滋阴、除热效果，为 滋阴圣药，且可多服、久服。

黄芪(Astragali Radix)味甘，性微温，入脾、肺经，具有补气升阳，益卫固表，托毒生 肌，利水退肿的功效。“消渴”通常伴有气虚的征象，而黄芪素有“补气诸药之最”的美称，黄 芪的化学成分包括黄酮类、皂苷类、多糖类、生物碱类、氨基酸类，此外还包括多种微量元 素Mn、Se、Fe等以及蔗糖、黏液质、苦味素等物质。其药理作用主要表现在提高免疫力、抗肿瘤、保肝、抗衰老、调节血糖的作用等。

太子参味甘，微苦，性平，入脾、肺经，具有补气生津的功效。太子参性略偏寒凉，属于补气药中的清补之品，为临床上治疗糖尿病的常用补气药材。太子参的化学成分主要包括： 多糖、核苷类、氨基酸、磷脂类以及一些微量元素，其药理活性主要表现在心肌保护、增强 机体免疫、抗疲劳、抗氧化、降血糖等。

枸杞(Lycii Fructus)味甘，性平，入肝、肾、肺经，具有滋补肝肾、明目、润肺的功效。 枸杞是常用的滋阴药，也是临床上治疗糖尿病的核心用药。枸杞的化学成分主要包括枸杞多 糖、黄酮类、类胡萝卜素、生物碱等，此外还含有一些其他的化合物，如维生素、氨基酸、 无机盐、酶类等。现代药理学实验表明，枸杞具有抗氧化、抗肿瘤、保肝、神经保护、保护视力、调节血糖和血脂的功能。

传统中医认为消渴病的病机主要在于阴虚燥热，以阴虚为本，燥热为标，二者互为因果， 以清热润燥，养阴生津为治疗原则。从消渴病的发病历程中可以看出，糖尿病会造成人体气 虚，故除滋阴清热外，补气也不可忽视。中药复方应当以滋阴药和补气药(药食同源中药材) 为主进行搭配，铁皮石斛具有养胃生津、滋阴除热的作用。已经备案的降糖口服液的中药原 料有27种，其中属于药食同源的有13种，分别为：桑叶、黄芪、山药、玉竹、枸杞、山茱 萸、昆布、菊花、沙棘、决明子、山楂、麦芽和鸡内金。上述13种药食同源中药材中，具 有滋阴功能的药材为玉竹、枸杞，具有补气功能的药材为山药、黄芪，我们的配方中药材也 将从这四种药材中产生。出于成本及工艺简化考虑，将从这四种中药材中，选取两种(一种 补气、一种滋阴)，与铁皮石斛一同组成降糖口服液配方。并进一步依据中草药特性、使用范围、功效作用选择滋阴补气药材，其中，滋阴药材选择枸杞，补气药材选择黄芪。

根据本发明，所述石斛组合物包括以下重量份数的原料：铁皮石斛1.0份、黄芪1.2-2.0 份、太子参1.0-2.5份、枸杞0.2-0.6份。

根据本发明的一些具体实施方式，所述石斛组合物包括以下重量份数的原料：铁皮石斛 1.0份、黄芪1.2份、太子参2.0份、枸杞0.6份。

根据本发明，所述石斛组合物通过包括以下步骤的制备方法制备：

(1)铁皮石斛、黄芪、太子参与枸杞混合，将湿原料按一定料液比加入提取溶剂煎煮提 取，得提取液。

根据本发明，所述湿原料为铁皮石斛、黄芪、太子参与枸杞混合原料通过浸水得到。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(1)中湿原料吸水量为60.2％-87.7％。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(1)中料液比为1:8-1:12(m/m)。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(1)中提取溶剂为水。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(1)中提取时间为30-90min。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(1)中提取次数为1-3次。

根据本发明，所述石斛组合物制备方法还包括：

(2)过滤步骤(1)所得提取液；

(3)减压浓缩，得浓缩液；

(4)灭菌。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(3)中浓缩温度为60℃-65℃。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(4)中灭菌方式为本领域常规灭菌方式。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(4)中灭菌条件为灭菌温度100℃-121℃、 灭菌时间15min-30min。

根据本发明，所述石斛组合物活性成分包括：槲皮素、山奈酚、木犀草素、 7-O-methylisomucronulatol、β-谷甾醇、刺芒柄花素、异鼠李素、植物甾醇、阿托品、金合 欢素、常春藤皂苷元、3,9-di-O-methylnissolin、甜菜碱、黄豆黄素、(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benz ofurano[3,2-c]chromen-3-ol、毛蕊异黄酮、 华良姜素、柚皮素、黄芪甲苷IV、N-p-香豆酰酪胺等。

本发明第二方面提供了石斛组合物的制备方法。

根据本发明，所述制备方法包括如下步骤：

(1)称取铁皮石斛1.0份、黄芪1.2-2.0份、太子参1.0-2.5份、枸杞0.2-0.6份混合，所 述铁皮石斛、黄芪、太子参与枸杞混合原料浸泡吸水量为60.2％-87.7％，得湿原料；

(2)湿原料与水按1:8-1:12(m/m)料液混合煎煮30-90min，煎煮1-3次，得提取液；

(3)过滤步骤(2)所得提取液；

(4)60℃-65℃温度下减压浓缩滤液，得浓缩液；

(5)灭菌。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(1)中湿原料吸水量为60.2％-87.7％。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(2)中料液比为1:8-1:12(m/m)。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(2)中提取溶剂为水。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(2)中提取时间为30-90min。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(2)中提取次数为1-3次。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(3)中浓缩温度为60℃-65℃。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(5)中灭菌方式为本领域常规灭菌方式。

根据本发明的一些具体实施方式，所述步骤(5)中灭菌条件为灭菌温度100℃-121℃、 灭菌时间15min-30min。

根据本发明，所述石斛组合物活性成分包括：槲皮素、山奈酚、木犀草素、 7-O-methylisomucronulatol、β-谷甾醇、刺芒柄花素、异鼠李素、植物甾醇、阿托品、金合 欢素、常春藤皂苷元、3,9-di-O-methylnissolin、甜菜碱、黄豆黄素、 (6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benz ofurano[3,2-c]chromen-3-ol、毛蕊异黄酮、 华良姜素、柚皮素、黄芪甲苷IV、N-p-香豆酰酪胺等。

本发明第三方面提供了本发明第一方面所述石斛组合物和/或本发明第二方面所述制备 方法制备的石斛组合物的应用。

根据本发明，所述石斛组合物在制备具有降血糖和/或降血脂和/或改善高血糖症状和/或 增加糖尿病患者体重和/或促进肝糖原合成和/或调节糖脂代谢功效的产品中的应用。

根据本发明，所述石斛组合物在制备具有保护肝脏和/或改善肾脏、脾脏和胰腺损伤和/ 或调节肠道菌群失调的功效的产品中的应用。

根据本发明，所述产品为保健品、药品等。

本发明第四方面提供了本发明第一方面所述石斛组合物和/或本发明第二方面所述制备 方法制备的石斛组合物的使用方法。

根据本发明，所述石斛组合物的口服量为0.37g/(kg·d)-1.49g/(kg·d)。

本发明有益效果：

本发明石斛组合物按照“君臣佐使”的配伍规律配制，其中黄芪为君药、太子参为臣药、 铁皮石斛为佐药，枸杞为使药。本发明成分简单、功效显著。该石斛组合物一方面具有降血 糖、改善高血糖症状、增加糖尿病患者体重、促进肝糖原合成、调节糖脂代谢、降血脂等功 效，另一方面具有保护肝脏、改善肾脏、脾脏和胰腺损伤等功效，同时，还具有调节肠道菌 群失调的功效。本发明石斛组合物可用于2型糖尿病人群、糖尿病前期人群以及糖尿病高危 人群的日常保健。

附图说明

图1是石斛组合物对小鼠体重的影响；

图2是12周内小鼠空腹血糖值变化趋势；

图3是石斛组合物对小鼠空腹血糖值的影响；

图4是石斛组合物对小鼠耐糖量的影响；

图5是石斛组合物小鼠耐糖量曲线下面积；

图6是石斛组合物对小鼠脏器系数的影响；

图7是石斛组合物对小鼠糖化血清蛋白(GSP)、胰岛素和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR) 水平的影响；

图8是石斛组合物对小鼠胰腺免疫荧光分析的影响；

图9是石斛组合物对小鼠α细胞和β细胞阳性率的影响；

图10是石斛组合物对小鼠肝脏抗氧化水平的影响；

图11是石斛组合物对小鼠肝脏H&E染色结果的影响；

图12是石斛组合物对小鼠肝糖原含量的影响；

图13是石斛组合物对小鼠肝脏PAS染色结果的影响；

图14是石斛组合物对小鼠肾脏H&E染色结果的影响；

图15是石斛组合物对小鼠脾脏H&E染色结果的影响；

图16是肠道菌群基因序列长度范围分布图；

图17是石斛组合物对肠道菌群α多样性的影响；

图18是不同组肠道菌群组成的Venn图；

图19是门水平群落组成图；

图20是科水平群落组成图；

图21是属水平群落组成图；

图22是PCoA分析比较各组样本；

图23是NMDS分析比较各组样本；

图24是Heatmap图分析对干预起响应的关键菌群类型；

图25是石斛组合物“活性成分-潜在靶点”网络图；

图26是石斛组合物复方-2型糖尿病Venn图；

图27是石斛组合物潜在靶点PPI网络图；

图28是石斛组合物关键靶点网络图；

图29是石斛组合物潜在靶点GO细胞组成富集分析条目图；

图30是石斛组合物潜在靶点GO生物过程富集分析条目图；

图31是石斛组合物潜在靶点GO分子功能富集分析条目图

图32是石斛组合物KEGG富集分析气泡图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不受下述实施例限定。

下面实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述的实验材料和试剂， 如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下列实施例中，黄芪购自北京鹤延龄药业发展有限公司，批号：190202；太子参购自北 京四方中药饮片有限公司，批号：18091601；铁皮石斛购自北京东方淼森生物科技有限公司， 批号：A31419021801；枸杞购自北京四方中药饮片有限公司，批号：19012901。

本发明中使用的仪器如表1所示。

表1试验仪器信息

名称	型号	供应商
			旋转蒸发仪	RE-52A	上海亚荣生化仪器厂

1、粗多糖的测定

口服液中粗多糖的测定采用苯酚-硫酸法进行测定。取1.0mL提取液于试管中，随后加 入无水乙醇4.0mL，室温下静置2h，离心(4000r，20min)，弃去上清液，沉淀用80％(v/v) 乙醇溶液洗涤两次，随后加入热蒸馏水溶解沉淀，沉淀溶解后转移至50mL容量瓶中，定容， 摇匀备用。取待测液0.2mL，加入1.8mL蒸馏水，随后加入1.0mL 5％(w/v)苯酚溶液和5.0 mL浓硫酸，摇匀，沸水浴15min，流水冷却5min，在490nm下测定溶液的吸光度(OD490)。

式中，c表示待测溶液的浓度；V为提取液体积；m为药材重量。

2、总皂苷的测定

采用香草醛-高氯酸分光光度法进行测定，取提取液15.0mL，离心(3500r，20min)，吸取上清液10.0mL，置于250mL分液漏斗中，加入蒸馏水至25.0mL，加入水饱和正丁醇20.0mL，充分震荡(每次震荡约1min)，静置10min，取正丁醇层，连续萃取三次，合并萃 取液，随后用20mL氨水洗涤3次，提取液置于旋转蒸发仪(水浴温度：60-65℃)中蒸干， 残渣用甲醇溶解并转移至25mL容量瓶中，用无水甲醇定容，摇匀备用。

式中，c表示待测溶液的浓度；V为提取液体积；m为药材重量。

3、出膏率的测定

将蒸发皿置于105℃烘箱中烘干，称量蒸发皿的重量，记为W1，用量筒量取50.0mL提 取液置于蒸发皿中，水浴蒸干，随后置于105℃烘箱中干燥3h后取出，置于干燥器中冷却30min，迅速称量蒸发皿的重量，记为W2，计算出膏率。

式中：W1为蒸发皿净重，W2为蒸发皿净重加干膏重量，V为提取液的体积，m为 药材重量。

实施例1：

称取铁皮石斛18.75g、黄芪22.5g、太子参37.5g、枸杞11.25g混合，浸水吸收原料干重 重量87.7％的水，然后与水按1:8(m/m)料液混合煎煮30min，煎煮1次，得实施例1提取液。

实施例2：

称取铁皮石斛18.75g、黄芪22.5g、太子参37.5g、枸杞11.25g混合，浸水吸收原料干重 重量87.7％的水，然后与水按1:10(m/m)料液混合煎煮30min，煎煮2次，得实施例2提取 液。

实施例3：

称取铁皮石斛18.75g、黄芪22.5g、太子参37.5g、枸杞11.25g混合，浸水吸收原料干重 重量87.7％的水，然后与水按1:12(m/m)料液混合煎煮30min，煎煮3次，得实施例3提取 液。

实施例4：

称取铁皮石斛18.75g、黄芪22.5g、太子参37.5g、枸杞11.25g混合，浸水吸收原料干重 重量87.7％的水，然后与水按1:10(m/m)料液混合煎煮60min，煎煮1次，得实施例4提取 液。

实施例5：

称取铁皮石斛18.75g、黄芪22.5g、太子参37.5g、枸杞11.25g混合，浸水吸收原料干重 重量87.7％的水，然后与水按1:12(m/m)料液混合煎煮60min，煎煮2次，得实施例5提取 液。

实施例6：

称取铁皮石斛18.75g、黄芪22.5g、太子参37.5g、枸杞11.25g混合，浸水吸收原料干重 重量87.7％的水，然后与水按1:8(m/m)料液混合煎煮60min，煎煮3次，得实施例6提取液。

实施例7：

称取铁皮石斛18.75g、黄芪22.5g、太子参37.5g、枸杞11.25g混合，浸水吸收原料干重 重量87.7％的水，然后与水按1:12(m/m)料液混合煎煮90min，煎煮1次，得实施例7提取 液。

实施例8：

称取铁皮石斛18.75g、黄芪22.5g、太子参37.5g、枸杞11.25g混合，浸水吸收原料干重 重量87.7％的水，然后与水按1:8(m/m)料液混合煎煮90min，煎煮2次，得实施例8提取液。

实施例9：

称取铁皮石斛18.75g、黄芪22.5g、太子参37.5g、枸杞11.25g混合，浸水吸收原料干重 重量87.7％的水，然后与水按1:10(m/m)料液混合煎煮90min，煎煮3次，得实施例9提取 液。

实施例10：

称取铁皮石斛18.75g、黄芪22.5g、太子参37.5g、枸杞11.25g混合，浸水吸收原料干重 重量87.7％的水，然后与水按1:12(m/m)料液混合煎煮60min，煎煮3次，得实施例10提取液。

实施例11：

称取铁皮石斛26.47g、黄芪31.76g、太子参26.27g、枸杞5.29g混合，浸水吸收原料干 重重量87.7％的水，然后与水按1:10(m/m)料液混合煎煮90min，煎煮3次，得实施例11提取液。

实施例12：

称取铁皮石斛14.75g、黄芪29.5g、太子参36.88g、枸杞8.85g混合，浸水吸收原料干重 重量87.7％的水，然后与水按1:10(m/m)料液混合煎煮90min，煎煮3次，得实施例12提取液。

实施例13：

(1)称取铁皮石斛18.75g、黄芪22.5g、太子参37.5g、枸杞11.25g混合，浸水吸收原料 干重重量87.7％的水，得湿原料，

(2)湿原料与水按1:12(m/m)料液混合煎煮60min，煎煮3次，得提取液；

(3)将步骤(1)所得提取液采用4层纱布过滤，除去滤渣，得滤液；

(4)60℃-65℃温度下减压浓缩滤液，得浓缩液；

(5)100℃温度下灭菌30min，得实施例13石斛组合物。

对比例1：

(1)称取铁皮石斛18.75g、黄芪22.5g、太子参37.5g、枸杞11.25g混合，浸水吸收原料 干重重量87.7％的水，然后与水按1:12(m/m)料液混合煎煮60min，煎煮3次，得提取液；

(2)将步骤(1)所得提取液采用4层纱布过滤，除去滤渣，得滤液；

(3)常压浓缩滤液，得浓缩液；

(4)100℃温度下灭菌30min，得对比例1石斛组合物。

实验结果：

称取石斛组合物原料，通过实施例和对比例工艺制备石斛提取液和石斛组合物，并测试 其粗多糖含量(mg/g)、总皂苷含量(mg/g)、出膏率(％)，测试结果如表2所示：

表2石斛组合物活性成分含量

序号	粗多糖含量(mg/g)	总皂苷含量(mg/g)	出膏率(％)
				实施例1	37.132	0.740	19.91
实施例2	46.387	1.203	28.78
				实施例3	47.192	1.553	31.80
实施例4	41.881	0.960	24.50
				实施例5	52.841	1.457	31.34
实施例6	54.223	1.005	30.29
				实施例7	43.534	0.630	24.22
实施例8	48.272	0.690	28.65
				实施例9	55.882	0.977	31.73
实施例10	67.658	1.613	32.8
				实施例13	66.432	1.101	/
对比例1	59.250	0.928	/

以粗多糖含量、总皂苷含量、出膏率为研究目标，采用高温煎煮联合减压浓缩工艺，考 察料液比、提取时间、提取次数对石斛提取液和石斛组合物中活性成分含量影响，优化出适 宜的工艺参数为：每次煎煮60min，煎煮3次，料液比为1:12(m/m)，第一次加水需考虑 药材的吸水量，减压浓缩温度为60℃-65℃。

模型构建：

4周龄雄性C57BL/6J小鼠购回后，适应性饲养1周，期间饲喂小鼠维持饲料。1周后，随机选取8只作为正常对照组(NC)，一直饲喂小鼠维持饲料，其余小鼠作为造模组，饲喂45％高脂高糖饲料，连续饲养4周。禁食不禁水12h过夜，对造模组小鼠连续3天腹腔注射60mg/kg的高脂高糖饮食联合链脲佐菌素(STZ)溶液(溶解于pH 4.2～4.5柠檬酸缓冲液)，NC组小鼠连续3天腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液。1周后测定小鼠的空腹血糖(FastingBlood Glucose,FBG)满足FBG≥16.7mmol/L且保持1周的小鼠即可视为2型糖尿病小鼠，模型构 建成功。

将造模成功的小鼠随机分为5组，每组8只，分别为模型对照组(MC)、二甲双胍阳性对照组(PC)、实施例13石斛组合物低剂量组(LD)、实施例13石斛组合物中剂量组(MD) 和实施例13石斛组合物高剂量组(HD)。各组小鼠连续灌胃干预12周，干预过程中，PC组 每天灌胃200mg/(kg·d)的二甲双胍，LD组、MD组和HD组每天灌胃3.4g/(kg·d)、6.8g/(kg·d)、13.6g/(kg·d)的口服液，NC组和MC组每天灌胃等量的生理盐水。除NC组每天饲喂小鼠维持饲料外，其余组小鼠均饲喂45％高脂高糖饲料。其中，PC组二甲双胍的灌胃剂量是根据说明书建议的成年人日服用剂量换算后得到的小鼠每日灌胃剂量，石斛组合物中剂量是根据人日 服用生药材量换算后得到的小鼠每日灌胃剂量(小鼠剂量＝人体剂量*9.1)，口服液低剂量和 高剂量分别为中剂量的1/2和2倍。

试验例1：石斛组合物对2型糖尿病小鼠表观指标的影响

1、石斛组合物对小鼠体重的影响

小鼠的体重变化趋势如图1A所示，NC组小鼠体重一直呈稳定上升的趋势，而其余组小 鼠在第4周注射STZ后体重均明显下降，与2型糖尿病体重下降的症状相符，进一步说明了 2型糖尿病小鼠模型构建成功。干预开始后，MC组小鼠体重在干预前两周明显下降，后缓慢 上升，而其余药物处理组体重均呈稳定上升的趋势。进一步分析灌胃干预前后各组小鼠体重 的变化比例，如图1B所示，NC组小鼠干预12周后体重为28.55±1.81g，相比干预之前增加 5.27±0.90％；MC组小鼠干预12周后体重为24.56±0.84g，相比干预之前增加2.79±0.63％，与 NC组相比显著下降(p＜0.05)。其余药物处理组与MC组相比体重变化比例均显著上升，其 中HD组干预12周后体重为26.83±1.15g，相比干预之前增加9.23±0.47％，上升最为显著(p ＜0.001)。以上结果表明不同剂量石斛组合物均在不同程度上有助于2型糖尿病小鼠体重的 增加。

2、石斛组合物对小鼠空腹血糖值(FBG)的影响

石斛组合物对小鼠空腹血糖的变化趋势如图2所示。干预前2周，除NC组外，其余各组FBG值均明显上升，可能是由于模型构建后存在的稳定期以及开始灌胃干预的影响。MC组小鼠的FBG保持缓慢上升的趋势，PC组小鼠灌胃降糖药二甲双胍，在第4周出现急剧下降，与MC组相比出现显著性差异(p＜0.01)，之后保持稳定下降的趋势。各口服液干预组 的FBG值从第4周开始均出现下降的趋势，其中LD组在干预后期基本保持稳定，MD组在 第8周与MC组相比出现显著性差异(p＜0.05)，HD组在第6周与MC组相比出现显著性差 异(p＜0.05)，之后MD和HD组小鼠的FBG值均保持下降的趋势。

干预12周之后各组小鼠的FBG值如图3所示，MC组小鼠FBG值为25.15±3.35mmol/L， PC组小鼠FBG值下降为14.65±3.13mmol/L，与MC组相比显著下降(p＜0.001)，降糖效果最好。各剂量口服液干预之后，LD组小鼠FBG值为23.06±3.13mmol/L，与MC组相比未出 现显著性差异，但在一定程度上控制了2型糖尿病小鼠血糖水平的增加；MD组小鼠FBG值 为20.25±3.98mmol/L，与MC组相比显著下降(p＜0.05)；HD组小鼠FBG值为19.84±3.21mmol/L，与MC组相比也出现显著性差异(p＜0.01)。以上结果表明，中、高剂量石斛组合 物均可以改善2型糖尿病小鼠的高血糖症状，其中高剂量口服液效果最好。

3、石斛组合物对小鼠糖耐量的影响

葡萄糖耐量是指机体对血液中葡萄糖的调节能力，糖耐量异常也是2型糖尿病的典型症 状之一。如图4所示，小鼠口服葡萄糖30min之后，血糖迅速升高，各组2型糖尿病小鼠的 血糖明显高于NC组。30min后NC组小鼠血糖持续下降，120min后恢复至接近初始值，而MC组缓慢下降，120min后血糖值仍处于较高水平。其余组小鼠120min后的血糖值均低于 MC组，其中MD和HD组小鼠120min后的血糖值下降最为明显。AUC值越小表示机体在 摄入葡萄糖后，可以快速代谢葡萄糖，使血糖维持在正常水平，说明对血糖的调节能力越强。 如图5所示，NC组AUC值最小，与NC组相比，MC组小鼠AUC值显著上升(p＜0.001)， 说明2型糖尿病小鼠对血糖的调节能力较差，而MD和HD组小鼠与MC组相比AUC值显 著下降(p＜0.001)。以上结果表明，中、高剂量石斛组合物可以显著改善2型糖尿病小鼠的 血糖调节能力，也与其可以降低2型糖尿病小鼠FBG值的结果一致。

4、石斛组合物对小鼠脏器系数的影响

脏器系数是指小鼠脏器或组织与体重的比值，正常情况下保持相对稳定。脏器系数增大 时，说明脏器可能充血、肿大或发生脂肪堆积；脏器系数减小时，说明脏器可能萎缩或功能 衰退，因此脏器系数是判定小鼠是否发生生理病变的重要指标。

如图6所示，MC组相比NC组小鼠胰腺系数显著上升(p＜0.01)，其余组小鼠胰腺系数 与MC组相比均显著下降(图6A)，其中高剂量组最为明显(p＜0.001)；MC组相比NC组 小鼠肝脏系数显著升高(p＜0.001)，二甲双胍和石斛组合物的干预并没有显著改变2型糖尿病小鼠的肝脏系数(图6B)；MC组相比NC组小鼠肾脏系数显著升高(p＜0.001)，而PC、 MD和HD组小鼠肾脏系数与MC组相比均显著下降(图6C)，可能与这三组小鼠干预后血 糖值降低进而改善多饮多尿症状的因素有关；MC组相比NC组小鼠脾脏系数显著上升(p＜ 0.001)，LD、MD和HD组小鼠的脾脏系数与MC组相比均显著下降(图6D)。以上结果表 明，高脂饮食联合STZ诱导会使小鼠的肝、肾、脾和胰腺的脏器系数发生变化，而石斛组合 物可以改善肾、脾和胰腺组织的这种异常变化。

试验例2：石斛组合物对2型糖尿病小鼠代谢指标的影响

1、干预对小鼠糖代谢的影响

干预对各组小鼠糖化血清蛋白(GSP)、胰岛素和胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)水平的影响如图7所示。GSP可以反映小鼠过去1～3周的平均血糖水平，由图7A可知，NC组小鼠 的GSP含量为1.94±0.31mmol/L，与NC组相比，MC组小鼠GSP含量上升为4.66±0.16mmol/L (p＜0.001)，PC组小鼠的GSP含量与MC组相比显著下降(p＜0.001)，说明2型糖尿病小 鼠出现了明显的高血糖症状，二甲双胍可以明显改善2型糖尿病小鼠的血糖水平。石斛组合 物干预之后，各组小鼠的GSP水平与MC组相比均呈下降的趋势，其中MD和HD组小鼠的 GSP含量分别下降为4.03±0.07mmol/L和3.93±0.16mmol/L(p＜0.05)。以上结果说明，中、 高剂量石斛组合物具有改善2型糖尿病小鼠血清GSP含量的作用。

HOMA-IR是预测胰岛素敏感性的数学模型，常用来评估胰岛素的抵抗水平，HOMA-IR 值越大，胰岛素的抵抗水平越高。由图7B可知，各组小鼠胰岛素水平之间差异不大，均未出现显著性差异。而各组HOMA-IR值之间差异明显(图7C)，与NC组相比，MC组小鼠的 HOMA-IR值显著上升(p＜0.001)，说明2型糖尿病小鼠出现了严重的胰岛素抵抗症状。干 预之后，与MC组小鼠相比，PC组小鼠的HOMA-IR值显著下降(p＜0.001)，各口服液干 预组小鼠的HOMA-IR值均呈下降的趋势，尤其是MD和HD组，下降较为明显(p＜0.01)， 与Chen H等的研究结果一致。以上结果说明，中、高剂量石斛组合物可以明显改善2型糖尿 病小鼠的胰岛素抵抗现象，提高胰岛素的敏感性，进而改善2型糖尿病小鼠的高血糖症状。

2、石斛组合物对小鼠血脂水平的影响

采用高脂高糖饮食联合STZ诱导的方法构建2型糖尿病小鼠模型，一般会伴随脂质代谢 的异常，各组小鼠的血清脂质水平如表3所示。与NC组相比，MC组小鼠总甘油三酯(Total triglycerides,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)和高密度脂蛋白-胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的含量显著上升，低密度脂蛋白-胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的含量上升但未出现显著性差异。HDL-C有利于胆固醇的代谢和排出， 其含量上升可能是因为TC含量上升的原因，以上结果说明2型糖尿病小鼠出现了血脂水平 异常的现象。

与MC组相比，PC组小鼠TG、TC和LDL-C的含量显著下降，HDL-C的含量下降但未 出现显著性差异，说明二甲双胍可以在一定程度上改善2型糖尿病小鼠的血脂水平。石斛组合物干预之后，MD和HD组小鼠血脂水平变化明显，其中MD组小鼠血清中TG和LDL-C 的含量显著下降(p＜0.01)，HD组小鼠血清中TG、TC和LDL-C的含量均显著下降，各组 小鼠HDL-C的含量并未出现显著性差异，与Dong J等的研究结果一致。以上结果说明中、 高剂量石斛组合物在降低2型糖尿病小鼠血糖水平的同时具有改善血脂水平的作用。

表3石斛组合物对小鼠血脂指标的影响

3、石斛组合物对小鼠肝功能、肾功能的影响

谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartateaminotransferase, AST)是血清中检验肝功能的重要指标，CR和UREA是血清中检验肾功能的重要指标，如 表4所示。

ALT分布在肝细胞胞浆中，AST主要分布在肝细胞线粒体中。当肝细胞轻微受损时，肝 细胞膜通透性增加，主要从细胞内释放ALT；当肝细胞严重受损时，线粒体内AST释放，会导致血清中AST指标的升高。由表可知，与NC组(ALT 43.55±2.94U/L，AST 150.04±6.22U/L) 相比，MC组小鼠ALT的含量上升为52.21±2.56U/L(p＜0.05)，AST的含量上升为 191.90±25.28U/L(p＜0.05)，说明2型糖尿病小鼠出现了肝功能异常的现象。石斛组合物干 预12周之后，与MC组相比，MD和HD组小鼠血清中ALT的含量显著下降(p＜0.05)，其 余虽呈下降趋势但未出现显著性差异，说明中、高剂量石斛组合物具有降低2型糖尿病小鼠 血清ALT水平的作用，也表明2型糖尿病小鼠的肝功能指标得到了一定程度的改善。

肌酐(Creatinine,CR)是肌肉的代谢产物，尿素(UREA)是蛋白质代谢的终产物，当肾功能受损时，肾小球过滤功能异常，会导致血清中CR和UREA的含量增加。由表可知， 与NC组小鼠相比，MC组小鼠血清CR的含量未出现明显变化，UREA的含量显著下降(p ＜0.01)，不同剂量石斛组合物干预之后，各组小鼠CR和UREA的含量并未出现显著性差异， 说明石斛组合物对2型糖尿病小鼠的血清肾功能指标无显著影响。

表4石斛组合物对小鼠肝、肾功能的影响

组别	ALT(U/L)	AST(U/L)	CR(μmol/L)	UREA(mmol/L)
					NC	43.55±2.94	150.04±6.22	17.35±0.78	11.61±0.80
MC	52.21±2.56<sup>#</sup>	191.90±25.28<sup>#</sup>	16.48±2.13	8.06±0.23<sup>##</sup>
					PC	41.05±4.67<sup>**</sup>	159.27±17.22	12.91±2.51	8.28±0.81
LD	56.95±8.96	192.97±18.12	14.33±3.03	7.64±0.53
					MD	43.02±6.65<sup>*</sup>	180.37±15.47	13.38±0.59	7.75±1.90
HD	45.86±2.08<sup>*</sup>	167.44±21.42	13.10±1.90	6.81±0.54

4、石斛组合物对小鼠胰腺组织形态的影响

胰腺中胰岛β细胞是机体中分泌胰岛素的场所，胰腺组织的变化与2型糖尿病的发生发展 密切相关。为进一步探究干预对小鼠胰腺组织的影响，对小鼠胰腺切片进行免疫荧光分析， 其中胰岛α细胞为绿色，胰岛β细胞为红色(图8)，并计算α细胞和β细胞各自所占的比例(图 9)。由图可知，NC组小鼠胰岛β细胞面积及亮度明显占优，其中胰岛α细胞占14.82±4.16％， 胰岛β细胞占83.26±3.76％。而MC组小鼠胰岛β细胞面积和亮度明显下降，胰岛β细胞比例下 降为25.99±4.34％(p＜0.001)，胰岛α细胞面积和亮度明显上升，胰岛α细胞比例上升为 65.00±4.86％(p＜0.001)，说明2型糖尿病小鼠的胰岛β细胞发生凋亡，胰岛的功能出现障碍。

二甲双胍干预12周之后，PC组小鼠胰岛β细胞所占的比例显著上升(p＜0.05)，胰岛α 细胞所占的比例显著下降(p＜0.05)，说明二甲双胍减轻了2型糖尿病小鼠的胰岛损伤，胰 岛β细胞的功能得到恢复。文章(Chen H,Nie Q,Hu J,et al.Metabolismamelioration of Dendrobium officinale polysaccharide on type II diabetic rats[J].Food Hydrocolloids,2019, 102(3):105582.)公开了石斛多糖可以保护糖尿病中的胰岛损伤，使胰岛细胞相对完整的结构， 但与二甲双胍治疗组相比效果并不显著(Fig.4A)。

石斛组合物干预12周之后，HD组小鼠胰岛β细胞面积及亮度明显增加，胰岛β细胞比例 上升为66.56±8.72％(p＜0.01)，胰岛α细胞面积和亮度明显降低，胰岛α细胞比例下降为 19.77±11.19％(p＜0.01)，与高剂量口服液降血糖作用最好的结果一致，这也可能是口服液发 挥降血糖作用的原因。而LD和MD组中胰岛α细胞比例呈下降趋势，胰岛β细胞比例呈上升 趋势，但未出现显著性差异。以上结果说明高剂量石斛组合物可以改善2型糖尿病小鼠胰岛β 细胞凋亡的现象，改善胰岛形态，使胰岛β细胞的功能得到恢复，进而发挥降血糖的作用。

5、石斛组合物对小鼠肝脏组织形态的影响

1)干预对小鼠肝脏氧化应激的影响

肝脏内脂肪过多蓄积时，脂肪酸在氧化过程中会产生大量的活性氧，导致机体形成氧化 应激的状态。氧化应激状态会导致丙二醛(MDA)含量的升高，MDA是脂质过氧化反应的 产物，会促进泡沫细胞的形成，也易修饰低密度脂蛋白，对细胞产生毒害作用。超氧化物歧 化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)是抗氧化防御系统的重要抗氧化酶，其活性代表了机体的抗氧化能力。高血糖和血脂异常时产生的活性氧会激活细胞内与胰岛素抵抗密 切相关的信号通路，氧化应激也会损伤肝脏细胞，进而促进2型糖尿病的发生发展，对氧化 应激状态的改善也有助于2型糖尿病的改善。小鼠肝脏MDA、SOD和GSH-PX水平如图10 所示。

由图10可知，与NC组小鼠相比，MC组小鼠MDA的含量显著增加(p＜0.001)，SOD 和GSH-PX酶的活性显著下降(p＜0.01)，说明2型糖尿病小鼠肝脏出现了氧化应激的状态。 石斛组合物干预之后，LD、MD和HD组小鼠GSH-PX酶的活性显著增加(p＜0.05)，MDA 的含量均呈下降的趋势(p＜0.001)，SOD酶的活性均呈增加的趋势，其中MD和HD组小鼠 SOD酶的活性显著增加(p＜0.05)。以上结果表明，石斛组合物可以通过增加抗氧化酶的活 性增强2型糖尿病小鼠的抗氧化能力，进而改善2型糖尿病小鼠的氧化应激状态。

2)干预对小鼠肝脏H&E染色的影响

H&E染色常用来观察组织的病理变化，各组小鼠肝脏H&E染色结果如图11所示。NC组小鼠肝脏组织表现为正常、清晰的肝小叶结构，中央静脉周围有单层肝细胞，沿中心静脉呈放射状排列分布。而MC组小鼠肝脏组织脂肪沉积，胞浆空泡化，可以观察到较多脂空泡。石斛组合物干预之后，MD和HD组小鼠肝脏组织结构改变，脂空泡减少。以上结果表明， 中、高剂量石斛组合物可以减轻2型糖尿病小鼠肝脏出现的病理变化以及肝脏中脂肪的沉积，促进肝脏的正常化。

3)干预对小鼠肝脏PAS染色和肝糖原的影响

糖原是葡萄糖在肝脏中主要的胞内储存形式，肝糖原的含量与胰岛素抵抗密切相关，且 肝脏中的糖原类物质可经PAS染色显示。小鼠肝糖原含量(图12)和PAS染色(图13)的结果如图所示。

由图12可知，与NC组小鼠相比，MC组小鼠肝脏中肝糖原的含量显著下降(p＜0.001)， 与Wang H等的研究结果一致。干预12周之后，与MC组小鼠相比，PC组小鼠肝糖原的含 量显著上升(p＜0.05)，MD和HD组小鼠肝糖原的含量也显著上升(p＜0.01)。PAS染色的结果与肝糖原含量的结果基本一致，进一步证明了干预对2型糖尿病小鼠肝糖原的影响。以上结果表明，中、高剂量石斛组合物可以调节2型糖尿病小鼠的肝脏代谢，促进肝糖原的合成，增加肝糖原的含量，进而发挥降血糖的作用。

4)干预对小鼠肾脏、脾脏组织形态的影响

2型糖尿病小鼠会出现多饮多尿的症状，增加肾脏负担，并发生炎症反应，对肾脏、脾 脏等组织造成损伤，干预对各组小鼠肾脏、脾脏H&E染色结果如图14-15所示。

由图14可知，NC组小鼠的肾小球结构正常，未出现病变。MC组小鼠部分肾小球结构破坏，出现肾小管上皮细胞水肿的现象，说明2型糖尿病小鼠的肾脏出现了明显的病变。干预12周之后，PC、MD和HD组小鼠肾脏的肾小管上皮细胞水肿的现象得到明显的改善，肾 小球的结构也趋于正常。

脾脏的实质主要由红髓和白髓两部分组成，由图15可知，NC组小鼠脾脏中红髓和白髓 分布正常，而MC组小鼠的脾脏出现红髓增生的现象，有轻微淤血，说明2型糖尿病小鼠的 脾脏受到轻度损伤。干预之后，各组小鼠脾脏红髓增生的现象均得到缓解，脾脏损伤得到改 善。

以上结果说明，中、高剂量石斛组合物可以使2型糖尿病小鼠肾脏和脾脏的轻度病理损 伤得到恢复。

试验例3：石斛组合物对2型糖尿病小鼠肠道菌群的影响

通过肠道菌群16S rRNA基因的Illumina MiSeq测序，对原始序列的去杂拼接优化，36 个样本总共得到1958399条优化序列，序列长度范围分布如图16A所示，所有样本的序列均 分布在401-420bp和421-440bp之间，分别占所测序列的33％和67％。

Core物种，即核心物种，是所有样本共有的物种数目，用于观测随着样本数目增加，共 有物种数目的减少情况，可以用来判断样本量是否充分。由图16B可知，观测到OTU的Core 物种稀释曲线基本达到平缓，说明样本量比较充分。

Ran-Abundance曲线可以解释多样性的两个方面，即物种丰富度和群落均匀度。在水平 方向，物种的丰富度由曲线的宽度反映，曲线在横轴上的范围越大，物种的丰富度就越高； 曲线的形状(平缓程度)反映了样本群落的均匀度，曲线越平缓，物种分布越均匀。由图16C 可知，测序样本的物种数目主要分布在100-350之间，且各样本中物种分布均匀。

稀释曲线(Rarefaction curve)可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度、均 一性或多样性，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。当曲线趋向平坦时，说明测序 数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的物种，反之则表明继续测序还可能产生较多新 的物种。由图16D可知，样本数据量在30000-35000之间OTU水平趋于平缓，即继续增加数 据量也不能有效得到更多的OTU，说明样本的测序数据量合理。

综合以上结果可知，测序样本量足够，此次测序有效，样品微生物分析深度足够。

(1)干预对肠道菌群α多样性的影响

α多样性是指一个特定区域或者生态系统内的多样性，可以反映微生物群落的丰富度和多 样性，包括一系列统计学分析指数，例如Ace指数、Chao指数、Sobs指数和Shannon指数 等。干预对肠道菌群α多样性的影响如图17所示。

Ace指数、Chao指数和Sobs指数是反映群落丰富度的指标，代表每个样本中物种的数 量OTU数目)，不考虑每个物种的丰度情况，数值越大，样品中的物种越丰富。由图18可知， 与NC组相比，MC组小鼠肠道菌群的Ace、Chao和Sob指数均显著下降(p＜0.001)，即2 型糖尿病小鼠肠道菌群的物种丰富度降低。PC组与MC组相比，相关指数均没有出现明显改变，说明二甲双胍不能改变2型糖尿病小鼠肠道菌群的物种丰富度。而不同剂量石斛组合物干预之后，2型糖尿病小鼠肠道菌群的Ace、Chao和Sob指数均显著上升，尤其是MD组， 上升最为明显(p＜0.001)，说明石斛组合物的干预可以增加2型糖尿病小鼠肠道菌群的丰富度，尤其是中剂量口服液。

Shannon指数是反映群落多样性的指标，数值越大，说明群落的多样性越高。由图17D 可知，与NC组相比，MC组小鼠肠道菌群的Shannon指数显著下降(p＜0.001)，说明2型糖尿病小鼠肠道菌群的群落多样性下降。与MC组相比，PC组小鼠肠道菌群的Shannon指数没有明显改变，LD组小鼠肠道菌群的Shannon指数显著上升(p＜0.05)，MD和HD组小鼠 肠道菌群的Shannon指数也呈上升趋势，但未出现显著性差异，说明石斛组合物的干预可以 增加2型糖尿病小鼠肠道菌群的多样性。

(2)干预对肠道菌群相似度的影响

Venn图可用于统计多组或多个样本中共有和独有的物种(如OTU)数目，可以直观地展 现不同环境样本中物种(如OTU)组成的相似性及重叠情况。由图18A可知，NC组共含有512个OTU，MC组含有329个OTU，出现明显下降，PC组含有320个OTU，与MC组相 比基本没有差别。而不同剂量口服液干预之后，LD、MD和HD组的OTU数目与MC组相 比均明显上升，分别上升为441、496和478。通过Venn图分析6组样本共有和独有OTU的 数目，由图18A可知，6组样本共有153个OTU，NC组独有121个OTU，MC组独有5个 OTU，PC组独有3个OTU，LD组独有10个OTU，MD组独有11个OTU，HD组独有13 个OTU，可以看出正常对照组独有OTU数目相比其他组明显多，2型糖尿病模型对照组较少， 说明糖尿病改变了小鼠的肠道菌群组成，抑制了某些菌的生长，造成肠道菌群紊乱。

前面结果显示中、高剂量口服液可以改善2型糖尿病小鼠的高血糖症状，因此进一步单 独分析MD组和HD组与NC、MC组之间的相似性。由图18B、C可知，NC组与MC组共 有8个OTU，而NC组与MD组共有128个OTU，NC组与HD组共有134个OTU，说明中、 高剂量口服液有利于增加2型糖尿病小鼠与正常小鼠肠道菌群的相似度。

以上结果说明，中、高剂量石斛组合物可能通过改善2型糖尿病小鼠肠道菌群紊乱的现 象，增加与正常小鼠肠道菌群的相似度，进而发挥降血糖的作用。

(3)干预对肠道菌群结构组成的影响

a)门(Phylum)分类学水平上的差异

在正常小鼠的肠道菌群中，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)是最主 要的两种菌门，其余还包括放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和疣微菌 门(Verrucomicrobia)等，各组小鼠肠道菌群门水平的群落组成如图19所示。其中，NC组 小鼠厚壁菌门占39.44％，拟杆菌门占51.67％；而MC组厚壁菌门上升为88.16％，拟杆菌门 下降为1.76％。以上表明2型糖尿病小鼠肠道菌群门水平的群落组成发生明显改变，厚壁菌 门所占的比例显著上升，拟杆菌门所占的比例显著下降，说明2型糖尿病小鼠的肠道菌群在 门水平上出现紊乱。文章(张家林.石斛合剂对糖尿病大鼠认知功能及肠道菌群的影响[D]. 福建中医药大学,2020.)公开了糖尿病认知功能障碍模型组变形菌门增加占1.34％，石斛合剂 (由石斛、黄芪、生地、知母、丹参、地龙、石菖蒲、五味子、葛根、黄连等组成)干预后， 石斛合剂组变形菌门丰度减少占1.06％，正常组变形菌门丰度占0.99％，提示石斛合剂可一 定程度降低变形菌门丰度。与现有技术相比，本发明石斛组合物具有更好的降低变形菌门丰 度的功效。

石斛组合物干预12周之后，尤其是中、高剂量口服液，2型糖尿病小鼠肠道菌群门水平 的群落组成发生明显改变。由图可知，MD组小鼠厚壁菌门占78.10％，HD小鼠组厚壁菌门 占59.94％，与MC组小鼠相比均呈下降的趋势；MD组小鼠拟杆菌门占11.73％，HD组小鼠拟杆菌门占17.76％，与MC组小鼠相比均显著上升(p＜0.001)。以上结果表明，中、高剂量石斛组合物可以改善2型糖尿病小鼠肠道菌群门水平群落组成紊乱的现象。

b)科(Family)分类学水平上的差异

各组小鼠肠道菌群科水平的群落组成如图20所示，NC组小鼠的优势菌群为Muribaculaceae(48.14％)、毛螺旋菌科Lachnospiraceae(15.34％)、乳杆菌科Lactobacilaceae (11.80％)、韦荣球菌科Erysipelotrichaceae(6.25％)和双歧杆菌科Bifidobacteriaceae(4.32％)。 而MC组的优势菌群为韦荣球菌科Erysipelotrichaceae(44.13％)、消化链球菌科 Peptostreptococcaceae(24.47％)、梭菌科Clostridiaceae(11.75％)、双歧杆菌科Bifidobacteriaceae (5.90％)和毛螺旋菌科Lachnospiraceae(4.04％)。与NC组相比，MC组小鼠肠道中 Muribaculaceae、毛螺旋菌科和乳杆菌科所占的比例明显下降，韦荣球菌科、消化链球菌科和 梭菌科所占的比例明显上升。

石斛组合物干预12周之后，MD和HD组小鼠肠道中Muribaculaceae、毛螺旋菌科和乳 杆菌科所占的比例上升，消化链球菌科和梭菌科所占的比例下降，说明中、高剂量口服液改 善了2型糖尿病小鼠肠道菌群科水平群落组成紊乱的现象。

与NC组相比，MC组中Muribaculaceae所占比例从48.14下降为0.44％(p＜0.001)。Muribaculaceae，即拟杆菌门S24-7菌科，在肠道菌群中广泛存在，小鼠也是其最常见的宿主， 一般为小鼠肠道菌群的优势菌群。Muribaculaceae可以预防肥胖诱导的胰岛素抵抗，Muribaculaceae的变化也与SCFAs和肠粘膜屏障的改变呈正相关的关系，Muribaculaceae的丰 度增加还会使TNF-α和IL-6等炎症因子的水平降低。石斛组合物干预之后，与MC组相比， MD和HD组小鼠Muribaculaceae所占比例明显上升，说明中、高剂量石斛组合物可能通过 增加小鼠肠道中Muribaculaceae的丰度改善2型糖尿病。

c)属(Genus)分类水平上的差异

各组小鼠肠道菌群属水平的群落组成如图21所示，NC组小鼠肠道菌群中 norank_Muribaculaceae属(即S24-7菌属，47.34％)和乳杆菌属Lactobacillus(11.80％)具有 最高的丰度。而MC组小鼠中，S24-7属和乳杆菌属的丰度均明显下降，分别下降为0.44％和1.75％，此时MC组小鼠肠道中占主导地位的是粪棒状菌属Faecalibaculum(38.72％)、罗姆布茨菌属Romboutsia(23.77％)和梭菌属Clostridium(11.75％)。其中，S24-7菌属下降最为 明显，从47.34％下降为0.44％，与科水平中的变化结果一致，S24-7菌属属于拟杆菌门，目 前正在研究阶段，是潜在的产SCFAs细菌。乳杆菌属是有益菌，可以调节全身免疫系统，参 与能量代谢，并改善胰岛素敏感性。Clostridium是条件致病菌，会引起肠道感染。它们的显 著变化也表明2型糖尿病小鼠肠道菌群属水平的群落组成出现了严重紊乱。

石斛组合物干预12周之后，尤其是MD和HD组小鼠，Faecalibaculum、Romboutsia和Clostridium菌属的比例明显下降；有益菌方面，S24-7菌属比例均明显上升，且HD组小鼠乳酸菌的丰度也明显增加。同时发现HD组小鼠肠道中双歧杆菌属Bifidobacterium(15.58％)的丰度明显增加；文章(张家林.石斛合剂对糖尿病大鼠认知功能及肠道菌群的影响[D].福建 中医药大学,2020.)公开了与正常组比较，糖尿病组大鼠双歧杆菌属丰度降低，占1.92％，石 斛合剂干预后，双歧杆菌属丰度明显增加占9.23％。与现有技术相比，本发明石斛组合物具 有更好的增加双歧杆菌属丰度的作用。双歧杆菌是一种有益菌，可以粘附在肠道黏膜表明， 形成一道生物屏障，阻止致病菌的侵袭，双歧杆菌还能促进致病菌和内毒素的排出，进而调 节肠道微生态的平衡。因此，属水平的群落组成进一步说明了石斛组合物可以改善2型糖尿 病小鼠肠道菌群紊乱的现象，中剂量和高剂量口服液效果更好。

(4)干预对小鼠肠道整体菌群结构的影响(Beta多样性分析)

a)基于UniFrac的PCoA分析

干预对各组小鼠肠道菌群群落组成的影响在门、科、属分类学水平上均出现差异，进一 步通过PCoA分析来评估干预是否对小鼠肠道整体菌群的结构产生影响。PCoA分析(Principal co-ordinates analysis)，即主坐标分析，是基于所选距离矩阵进行作图，是一种非约束性的数 据降维分析方法，可以用来研究样本群落组成的相似性或差异性。PCoA分析，首先对一系 列特征值和特征向量进行排序，然后选择排在前几位的最主要特征值，并将其表现在坐标系 中，两点距离越近，表明二者的群落相似度越高。

如图22A所示，是以两个权重最高的主成分PC1(33.75％)和PC2(11.15％)绘制的PCoA 分析图。NC组小鼠的肠道菌群与MC组在图中明显分开，说明2型糖尿病小鼠与正常小鼠 相比，肠道菌群整体上发生了明显改变，出现了严重的紊乱，与前面的分析结果一致。而通 过药物干预之后，发现PC组并未明显分开，不同剂量口服液干预组与MC组在图中分开来， 尤其是HD组，更加接近于NC组。

PC1轴的贡献率为33.75％，是权重最高的特征向量，图22B进一步反映了各组在PC1 轴上的分布离散情况。由图可知，在PC1轴上，NC组(红色)和MC组(蓝色)明显离散 分开，不同剂量口服液干预之后，LD、MD和HD组均与MC组分开，向NC组接近，其中 MD和HD组最为明显。

以上结果说明，通过高脂高糖饮食联合STZ诱导的2型糖尿病小鼠与正常小鼠相比，肠 道菌群整体组成结构出现了明显的差异。不同剂量石斛组合物干预之后，2型糖尿病小鼠的 肠道菌群发生明显改变，中剂量和高剂量口服液最为明显，这也与前面中、高剂量口服液存 在降血糖作用的结果一致。

b)基于Beta多样性距离的非度量多维尺度分析(NMDS)

NMDS分析(Non-metric multidimensional scaling analysis)，即非度量多维尺度分析，是 根据样本中包含的物种信息，以点的形式反映在多维空间上，而对不同样本间的差异程度， 则是通过点与点间的距离体现。如图23所示，NC组小鼠(红色)聚集在左边，而MC组(蓝 色)聚集在右边，离散明显。不同剂量石斛组合物干预之后，LD、MD和HD组均与MC组在图上分开来，更加接近NC组。NMDS分析的结果整体上与PCoA的结果相似，进一步说 明了石斛组合物改变了2型糖尿病小鼠的肠道菌群，证明中、高剂量石斛组合物发挥降血糖 的作用可能与改变小鼠的肠道菌群有关。

(5)对石斛组合物干预起响应的关键菌群类型

通过以上分析得到石斛组合物可以在门、科、属以及整体水平上对2型糖尿病小鼠的肠 道菌群产生影响，现根据Heatmap图对其中的关键菌群类型进行深入分析，如图25所示。由 图可知，中剂量口服液(MD组)干预之后，Akkermansia菌属、瘤胃球菌Ruminococcaceae (包括unclassified_f_Ruminococcaceae和norank_f_Ruminococcaceae)和 Prevotellaceae_UCG-001的丰度明显上升。高剂量口服液(HD组)干预之后，2型糖尿病小 鼠肠道中除了Akkermansia菌属、Ruminococcaceae和Prevotellaceae_UCG-001的丰度上升外， 拟普雷沃菌属Alloprevotella的丰度也明显增加。

Akkermansia菌属是一种以肠道黏蛋白为基质的厌氧菌，定殖于回肠末端和结肠盲肠肠道 黏液的外层，其含量与糖尿病、肥胖以及其他一些疾病的发生呈负相关的关系。Akkermansia 菌属可以改善糖尿病和肥胖患者的炎症反应、胰岛素抵抗以及糖耐量受损等症状，还与宿主 黏液层的健康存在联系。近几年对Akkermansia菌的研究较多，发现口服Akkermansia菌可 以治疗高脂饮食导致的小鼠代谢综合症，也有研究表明二甲双胍治疗2型糖尿病小鼠后肠道 菌群中Akkermansia菌属的丰度增加，且用Akkermansia菌属干预小鼠，可以改善小鼠的葡 萄糖耐受能力，这也与本实验中PC组小鼠相比MC组小鼠肠道菌群中Akkermansia菌属丰度 增加的结果一致。石斛组合物干预之后，MD和HD组小鼠肠道中Akkermansia菌属的丰度明 显增加，且比二甲双胍干预的效果更加明显，说明中、高剂量石斛组合物的降血糖作用可能 与Akkermansia菌丰度的增加有关。

Ruminococcaceae属于瘤胃球菌科，是专性厌氧菌，可以分解消化道中的多糖，如淀粉、 木聚糖和纤维素等，进而产生SCFAs。Ruminococcaceae在正常个体中的含量比肥胖、糖尿病 患者中更高，且与炎症标志物的含量呈负相关的关系。Donaldson等发现Ruminococcaceae在 双歧杆菌增加丁酸盐含量的过程中，发挥重要的作用。Prevotellaceae_UCG-001是与黏膜相关 的主要菌群，在免疫系统疾病和代谢紊乱的患者肠道中，Prevotellaceae的丰度降低，这也与 糖耐量受损存在一定的相关性。而中、高剂量口服液干预明显增加了2型糖尿病小鼠肠道中 Ruminococcaceae和Prevotellaceae菌属的丰度，说明石斛组合物有利于肠道菌群的调节。

高剂量石斛组合物还能增加2型糖尿病小鼠肠道中Alloprevotella菌属的丰度。Alloprevotella是健康个体的优势菌群，属于产生SCFAs的细菌，SCFAs是微生物发酵无法消 化的膳食成分的产物，可以增加肠道的血液供应，影响肝脏脂类和碳水化合物的调节，有利 于提高体内葡萄糖的平衡和胰岛素敏感性，其丰度与糖尿病和肥胖的发生呈负相关的关系。

试验例4：石斛组合物的网络药理学探讨

1、材料与方法

1.1数据库及分析软件

表5数据库及分析软件

1.2石斛组合物活性成分的筛选

基于TCMSP数据库和文献调研，对石斛组合物中的4味药材：黄芪、太子参、铁皮 石斛、枸杞的活性成分进行收集，随后对收集得到的活性成分进行ADME筛选。ADME表 示机体对外源化学物质的吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)及排 泄(excretion)的过程。石斛组合物口服液采用口服的方式，因此选择口服生物利用度(OB)和药物类药性(DL)这两个参数作为筛选的条件。

基于TCMSP数据库，将满足口服生物利用度(OB)≥30％，药物类药性(DL)≥0.18的活性成分纳入分析。活性成分口服生物利用度(OB)≥30％，表明经口服后机体的吸收和利用效果较好，药物类药性(DL)表示活性成分与药物的相似程度，在Drugbank数据库中， 药物的平均类药性为0.18，DL≥0.18的活性物质则被认为具有较高的类药性。

1.3潜在作用靶点预测及标准化

将筛选得到的活性物质输入TCMSP与STITCH数据库中进行蛋白靶点预测，并将预测得到的蛋白靶点名称输入UniProt数据库中进行标准化处理，选择已被验证的人类基因，删去无靶点的活性成分以及没有对应人类基因的蛋白靶点。

1.4构建“活性成分-靶点”网络图

将筛选得到的石斛组合物活性物质与潜在靶点进行整合，导入Cytoscape软件中，构建 “活性成分-靶点”网络图。利用Cytoscape自带的分析工具network analysis对“活性成分-靶 点”网络图进行网络拓扑学分析，得到网络图的度(Degree)值，度值表示活性成分与靶点之 间的连接线数，度值越大，则该活性成分作用的靶点数越多。将活性成分根据度值由大到小 进行排序，得到石斛组合物中的关键活性物质。

1.5 2型糖尿病靶点的收集

在GeneCards数据库中输入“Type 2diabetes mellitus”进行检索，得到与2型糖尿病相关 的靶点基因。GeneCards数据库根据靶点基因与疾病的相关程度，对得到的基因进行评分， 即Relevance score，以Relevance score中位数为筛选标准，得到与2型糖尿病相关度较高的 靶点基因。

1.6石斛组合物-2型糖尿病靶点交集

将石斛组合物对应的潜在靶点基因进行去重，随后与2型糖尿病相关靶点基因导入 Draw Venn Diagram在线工具，得到石斛组合物-2型糖尿病交集基因，这些基因即为石斛组 合物改善2型糖尿病的潜在靶点，并绘制Venn图。

1.7关键作用靶点获取-PPI分析

将石斛组合物-2型糖尿病交集基因导入String数据库中，进行靶点蛋白之间的相互作 用分析。相关参数设置如下：研究物种选择“Homo Spaiens”，最低相互作用评分设置为最高 置信度(0.9)，隐藏独立节点，得到石斛组合物-2型糖尿病交集基因的PPI网络图。

将PPI网络图导入Cytoscape软件中，通过network analysis分析，以靶点蛋白度值 (Degree值)≥2倍Degree值中位数作为筛选标准，得到石斛组合物作用于2型糖尿病的关键潜在靶点，并将其从PPI网络图中提取出来，单独进行绘制，以节点的Degree值反应 靶点的大小与颜色，节点的Degree值越大，则节点越大，颜色越深，以combined score反 应边的粗细，combined score值越大，则边越粗。

1.8 GO注释分析

基于Metascape数据库，将石斛组合物-2型糖尿病的交集基因进行GO注释分析。GO(Gene Ontology)可分为细胞组成、分子功能和生物过程三个部分，通过GO注释分析可以获得石斛组合物潜在靶点在机体内参与的生物过程、细胞组成以及分子功能。

Metascape数据库相关参数设定如下：研究物种选择“Homo Spaiens”；MinOverlap：3； PValue Cutoff：0.01；Min Enrichment：1.5。随后将得到的分析结果根据显著性(log10(P) 值)由小到大进行排序，将排名前20的条目纳入分析，并通过RStudio软件进行可视化分 析。

1.9 KEGG富集分析

基于Metascape数据库，将石斛组合物-2型糖尿病的交集基因进行KEGG富集分析。通过KEGG富集分析，可得到石斛组合物作用于2型糖尿病的潜在信号通路，分析石斛组 合物可能的降糖机制。

Metascape数据库相关参数设定如下：研究物种选择“Homo Spaiens”；MinOverlap：3； PValue Cutoff：0.01；Min Enrichment：1.5。随后将得到的分析结果根据显著性(Log10(P)) 由小到大进行排序，将排名前20的通路纳入分析，并通过RStudio软件进行可视化分析。

2.结果与讨论

2.1石斛组合物活性成分筛选及靶点预测结果

通过TCMSP数据库检索以及文献收集，经过ADME筛选，得到符合条件的黄芪活性成分22种，太子参活性成分9种，铁皮石斛活性成分35种，枸杞活性成分44种，此外， 通过查阅文献，一些重要的化学成分即使ADME筛选不符合标准，但与2型糖尿病相关或 为重要的活性成分，也应纳入分析。例如黄芪甲苷IV和毛蕊异黄酮葡萄糖苷为《中国药典》 中规定的黄芪的重要化学物质，且黄芪甲苷IV也被文献证明具有降血糖作用，甜菜碱为《中 国药典》规定的枸杞的重要活性成分，虽然这些化学成分ADME筛选不符合标准，也被纳 入分析，最终得到黄芪活性成分24种，太子参活性成分9种，铁皮石斛活性成分35种， 枸杞活性成分45种。其中，黄芪与枸杞共有活性成分1个，为槲皮素(quercetin)，太子 参与枸杞共有活性成分1个，为β-谷甾醇(β-sitosterol)。

将收集得到的各中药的活性成分输入TCMSP数据库、STITCH数据库进行潜在靶点预 测，随后通过Uniprot数据库将预测得到的蛋白名转化为基因名，进行标准化，去掉无对应 靶点的活性物质以及无对应的已验证的人类基因的蛋白靶点，得到黄芪活性成分18种，靶点 数目415个，太子参活性物质5种，靶点数目113个，铁皮石斛活性物质6种，靶点数目36种，枸杞活性物质35种，靶点数目330个。可见，石斛组合物中共有有效活性物质64种， 其中，黄芪与枸杞共有活性成分1个，为槲皮素(quercetin)，太子参与枸杞共有活性成分1个，为β-谷甾醇(β-sitosterol)，总共对应894个靶点基因。将收集得到的各药材的活性成分 进行编号，整理如表6。

表6石斛组合物活性成分表

2.2石斛组合物“活性成分-靶点”网络图的构建

石斛组合物“活性成分-靶点”网络图如图25所示。图中绿色菱形节点代表潜在靶点，八 边形代表每种药材的活性成分，分别填充以不同的颜色，与各自所属的中药材相连。HG分 别与HQ与GQ节点相连，表示黄芪与枸杞共有的活性成分，TG分别与TZS与GQ节点 相连，表示太子参与枸杞的共有成分。由图中可以看出，一种活性成分可能对应多个靶点， 而一个靶点也可能对应多种活性成分，说明了石斛组合物具有“多成分、多靶点”的优点。

通过Cytoscape软件对石斛组合物“活性成分-靶点”网络图进行networkanalysis可知， 该网络图包含320个节点(node)，782条边(edge)。Degree值表示节点与节点之前的连接 线数，节点的Degree值越大，表示由该节点发出的连接线越多。图中节点的大小与节点的 Degree值成正相关，节点的Degree值越大，则节点越大，表示该节点越重要。根据节点的 Degree值对石斛组合物活性成分节点进行排序，筛选出复方中重要的20种活性成分，如表 7。

表7石斛组合物重要活性成分表

由表7可知，石斛组合物口服液中度(degree)值排名靠前的活性物质为槲皮素、山奈 酚、木犀草素、7-O-methylisomucronulatol、β-谷甾醇等。其中，槲皮素对应的靶点数目最多， 为143个。这些成分可能为石斛组合物发挥作用的关键物质。

2.3 2型糖尿病靶点的收集及筛选

在GeneCards数据库中检索2型糖尿病，共得到9215个靶点基因，Relevance score表 示靶点与疾病的相关程度，通过Relevance score对检索得到的靶点基因进行筛选，首先去掉 Relevance score为0的靶点基因，选取中位数作为筛选标准，根据中位数≥24.04进行筛选， 得到1153个与2型糖尿病相关的靶点基因。

2.4石斛组合物-疾病靶点基因交集

图26中Disease代表2型糖尿病，Drug代表石斛组合物，可知石斛组合物口服液与2型 糖尿病共有146个交集基因，说明石斛组合物对2型糖尿病具有一的治疗作用，这146个靶点可能是石斛组合物治疗2型糖尿病的潜在作用靶点。

2.5 PPI网络构建及核心靶点筛选

基于String数据库，得到石斛组合物作用于2型糖尿病的PPI网络图。PPI(protein-protein interaction)是寻找靶点蛋白之间相互作用关系的重要途径，能够反映靶点之 间的相互作用关系，寻找关键靶点。将PPI网络图(图28)导入Cytoscape软件中，进行 network analysis可知，该网络图包含了131个节点(node)，580条边(edge)，说明石斛 组合物作用于2型糖尿病的146个靶点基因中有131个靶点之间存在相互作用。

计算PPI网络图的Degree值，以≥2倍中位数作为筛选标准，筛选得到25个关键靶点基因，则这25个基因可能是石斛组合物作用于2型糖尿病的关键靶点。将这25个靶点 基因从PPI网络图中提取出来，重新构建网络图，如图28。

图中，每个圆圈代表一个靶点基因，靶点基因的Degree值越大，则圆圈越大，颜色越 深，说明靶点蛋白的相互作用越强。由图可知，石斛组合物作用于2型糖尿病的潜在核心靶 点主要包括：TP53、AKT1、JUN、MAPK1、TNF、RELA、MAPK8、IL6、MAPK14、EGFR、 VEGFA、MYC、ESR1、RB1、FOS、CXCL8、APP、IL1B、CCND1、CASP8、EGF、STAT1、 NR3C1、IL4、IL2。其中，TNF、IL6、CXCL8、IL1B、IL4、IL2、RELA参与炎症反应， CASP8参与细胞凋亡，MAPK1、MAPK8、MAPK14同属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 家族，参与细胞的多种生物过程，如增值、分化、转录调节和发育等。JUN、FOS、MYC为 原癌基因，在特定的条件下会转变为癌症基因，诱发癌症。TP53、RB1为抗癌基因，与原癌 基因相互制约，维持机体的平衡。AKT1为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1、AKT2、AKT3) 之一，参与PI3k-Akt信号途径，将胞外信号转移至胞内，调节细胞的各项生理功能。VEGFA 参与血管增生，促进血管内皮增殖和新生血管分化，雌激素受体(ESR1)参与神经内分泌。 可以看出，石斛组合物可能通过控制炎症反应、调节细胞生长、增殖、凋亡、血管增生、氧 化应激等生理过程来改善2型糖尿病。

表8石斛组合物关键靶点

2.6 GO基因注释富集结果

基于MetaScape分析，将得到的结果以Log10(P)值从小到大进行排序，可筛选出显著性较高的条目，分别取细胞组分、生物过程、分子功能中前20个条目进行分析，通过RStudio进行可视化分析，如图29-31。

图中，横轴Count表示石斛组合物潜在靶点富集于某个条目的基因数目，Log10(P)值 越小，表示该条目越显著，则颜色越红。由结果可知，石斛组合物作用于2型糖尿病的146个靶点基因主要富集在了细胞膜以及蛋白激酶复合物、转录因子复合物、丝氨酸/苏氨酸蛋白 激酶复合物等细胞组分，主要参与了凋亡信号通路、细胞因子介导的信号通路、抗氧化反应、 细胞氧化应激、细胞迁移正调控、细胞损伤、细胞运动正调控等生物过程，可能执行蛋白激 酶结合、转录因子结合、细胞因子受体结合、细胞因子活性、激酶活性、RNA聚合酶II转 录因子结合，血红素结合等生物功能。

2.7 KEGG富集分析结果

基于Metascape分析，石斛组合物作用于2型糖尿病的146个靶点共富集得到170条通路，随后根据log10(P)值对分析结果进行由小到大排序，筛选出显著性较高的通路，将排名前20的通路纳入分析，根据KEGG数据库(京都基因与基因组百科全书数据库)将 得到的20条通路进行分类，同时通过RStudio进行可视化分析。

表9石斛组合物KEGG富集分析结果表

由表4-5可知，石斛组合物作用于2型糖尿病的146个靶点基因主要参与癌症、感染性 疾病、耐药性、内分泌代谢疾病以及心血管疾病的发病过程，参与PI3K-Akt、肿瘤坏死因子(TNF、) 缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号转导途径，白细胞介素-17(IL-17、)Toll-like受体信号通路等免疫应 答通路，参与细胞凋亡(Apoptosis)通路。

将上述分析的结果结合文献进行分析，排除无关通路。可知，交集基因参与了前列腺癌、 胰腺癌、膀胱癌、乙型肝炎、心血管疾病、内分泌代谢疾病等的发病过程。

研究表明，糖尿病可增加多种癌症的患病风险。抗p53抗体是已知的癌症标志物，文章 (Sauriasari R,Sekar A P,Aisyah N,Syahdi R R,Matsuura E.Sera Anti-P53Antibody provides new information which explains the link between diabetesand cancer[J].Diabetes Metabolic Syndrome Obesity,2020,13:325-331.)报导2型糖尿病患者血清中抗p53抗体相对于健康受 试者升高了8.3倍，说明2型糖尿病患者患癌症的风险较高。同时，文章赵志国,聂春燕,赵 春霞.胰腺癌与糖尿病及肥胖的流行病学相关性[J].中国肿瘤临床与康复, 2019,26(02):181-183.)和文章(Rachel D,Paolo B,BalicerR D,Keinan B L,Maya S,Alla B, Liraz O,Margalit G,Freedman L S.Time-dependentrisk ofcancer after a diabetes diagnosis in a cohort of2.3 million adults[J].American Journal ofEpidemiology,2016(12):12.)研究表明，糖 尿病可增加患者患胰腺癌、膀胱癌等癌症的风险。糖尿病患者之所以会易患癌症，可能是由于 两种疾病有着共同的高危因素(如衰老、肥胖、不良的饮食习惯、缺乏运动)及分子机制，这 也在KEGG富集分析结果中得以证实，石斛组合物作用于2型糖尿病的靶点也存在于多种 癌症疾病的发病过程中。

流行病学研究表明，2型糖尿病人群慢性乙型肝炎的发病率显著高于普通人群，其可能 的因素是由于肝炎病毒导致机体的肝功能受损以及诱导产生自身免疫反应，导致机体的糖代谢紊 乱以及胰岛功能障碍。

糖尿病也会造成一系列的并发症，包括肾脏疾病、眼部疾病、心血管疾病以及周围神经病 变等。石斛组合物作用于糖尿病合并症中晚期糖基化终产物及其受体通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)，说明石斛组合物可能对糖尿病的并发症具有一定的改 善作用。

图32中横坐标Gene Ratio(％)表示分析的146个基因靶点中的基因占某条通路基因总数的比例，某一个通路的Gene Ratio比例越高，则表明分析的146个基因富集到该 通路的基因数越多。纵坐标表示筛选得到的重要的20条通路，hsa+编号表示该通路在京 都基因与基因组百科全书数据库中的编号。Log10(P)值越小，表示该通路越显著，则气 泡颜色越红，Gene Numbers表示分析的146个基因富集到某通路的基因个数，富集的基 因数越多，则气泡越大。因此，图中的气泡越靠右，气泡的面积越大，颜色越红，则表明 该气泡代表的通路越显著。

由气泡图可知，石斛组合物作用于2型糖尿病的靶点基因主要富集在癌症通路(Pathway in cancer)、PI3K-AKT信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化通路(Fluidshear stress and atherosclerosis)、糖尿病合并症中晚期糖基化终产物及其受体通路(AGE-RAGE signalingpathway in diabetic complications)等。

由结果可知，石斛组合物可能通过PI3K-Akt、TNF、HIF-1、IL-17，Toll-like 受体、细胞凋亡信号通路治疗2型糖尿病。以上通路涉及炎症反应、细胞凋亡、信号转导、 氧化应激等，可以发现，石斛组合物可能通过作用于多条通路改善2型糖尿病，同时可 能对糖尿病的并发症具有一定的改善作用。

2.8石斛组合物改善2型糖尿病的可能机制

2.8.1石斛组合物通过“多成分-多靶点-多通路”改善2型糖尿病

通过网络药理学分析，石斛组合物改善2型糖尿病的活性成分有64种，潜在 作用靶点有146种，其中关键潜在靶点有25种，可能作用的通路包括PI3K-Akt信号 通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、IL-17信号通路，Toll-like受体信号通路、细胞 凋亡信号通路等。说明石斛组合物改善2型糖尿病是通过“多成分、多靶点、多 通路”协同作用。

2.8.2石斛组合物可能调节炎症反应和氧化应激改善2型糖尿病

石斛组合物潜在靶点富集得到的通路中，TNF信号通路、IL-17信号通路，Toll-like受 体信号通路，HIF-1信号通路等参与机体的炎症反应。PPI蛋白互作分析得到的25个关 键靶点中，也包含多个与炎症相关的靶点：TNF、IL6、CXCL8、IL1B、IL4、IL2、RELA。 2型糖尿病的发病与慢性炎症有关，其机制较为复杂，涉及多个环节。炎症可干扰胰岛素 信号的传导，使胞外的胰岛素信号无法转移至胞内，使各个组织无法响应胰岛素信号，产 生胰岛素抵抗，同时，炎症也可能产生氧化应激，造成胰岛β细胞凋亡，导致胰岛素分泌 不足，引发2型糖尿病。

TNF参与全身的炎症反应，且能够激发多条途径，如NF-κB和MAPK途径。TNF-α 为促炎性细胞因子，参与细胞应对损伤、感染、血管生成、凋亡等生理过程。TNF-α与胰 岛素抵抗有关，其可通过干扰胰岛素信号，进而造成胰岛素抵抗。IL-17为促炎症性细胞 因子，代莉等(代莉,谭春萍,李洪,李顺品.血清IL-17水平与2型糖尿病及血管病变的关 系[J].中华临床医师杂志(电子版),2012,6(20):6363-6365.)发现，2型糖尿病和2型糖尿 病伴血管病变患者体内的IL-17水平均高于健康人群，且2型糖尿病伴血管病变患者体 内的IL-17水平高于2型糖尿病患者，说明IL-17的水平与2型糖尿病及血管病变密切 相关。Sumarac-Dumanovic M等(Sumarac-Dumanovic M,Stevanovic D,Ljubic A,Jorga J, Simic M,Stamenkovic-Pejkovic D,Starcevic V,Trajkovic V,Micic D.Increased activity ofinterleukin-23/interleukin-17proinflammatory axis in obese women[J].International Journal of Obesity,2009,33(1):151-156.)研究发现，肥胖(2型糖尿病高危因素)妇女血清中的IL-17 含量增加。TLR4为Toll样受体家族中的一员，TLR4激活后可使细胞内的炎症通路上 调，引起炎症反应，进而阻碍胰岛素信号蛋白表达，引起胰岛抵抗，产生高胰岛素血症。

HIF-1α是关键的炎症反应调节因子，在细胞面临缺氧时起重要作用。当发生炎症时， 免疫细胞周围会出现缺氧。当细胞缺氧时，HIF-α诱导基因转录，促进血管增生及红细胞 生成，防止细胞造成缺氧损伤。石斛组合物关键靶点中VEGFA参与血管增生，IL-1B可 促进HIF-1β提高转录水平。HIF-1信号通路可能参与糖尿病的发病包括损伤β细胞功能， 产生胰岛素抵抗、脂肪细胞功能紊乱以及炎症反应等。

2.8.3石斛组合物可基于PI3K-AKT信号通路改善2型糖尿病

胰岛素主要通过PI3K-Akt信号通路将胞外的信号传递到胞内，调节机体的血糖水平。

人体在进食后血糖升高，胰腺会分泌胰岛素以降低血糖水平，胰岛素可通过胰岛素受体(IR)和胰岛素受体底物(IRS)从胞外传递到胞内，随后激活PI3K生成磷 脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)，进一步激活Akt，Akt可激活下游信号分子，如糖 原合酶激酶-3(GSK-3)、Forkhead转录因子(FoxO1)等，调节糖脂代谢，维持血糖 平衡。PI3K-Akt信号通路在肥胖和胰岛素抵抗中发挥着重要的作用，PI3K-Akt信号 通路损伤可导致肥胖和胰岛素抵抗，继而引发2型糖尿病，同时，胰岛素抵抗也会损 伤PI3K-Akt信号通路，形成一个恶性循环。

PI3K-Akt信号通路为机体中重要的信号转导通路，可影响多个信号通路，石斛组合 物可能通过作用于PI3K-Akt信号通路，改善胰岛素抵抗水平，或激活下游的糖脂代谢相关通路，从而改善2型糖尿病。

2.8.4石斛组合物可调节细胞凋亡改善2型糖尿病

KEGG通路分析表明，石斛组合物可能通过作用细胞凋亡通路改善2型糖尿病。石斛组合物作用的关键靶点基因中，CASP8参与细胞凋亡。

胰岛β细胞的凋亡是导致2型糖尿病病情加重的重要因素，在2型糖尿病中，胰岛素抵抗合 并内脏肥胖导致葡萄糖毒性效应，加速了胰岛β细胞的凋亡。2型糖尿病的胰腺β细胞中 caspase-3和caspase-8呈高表达状态，从而诱导细胞凋亡。胞外诱导细胞凋亡的信号有炎症 因子，包括白细胞介素(IL)和肿瘤坏死因子(TNF)等，TNF能够通过促进炎症因子的释 放来诱导细胞凋亡。石斛组合物作用于细胞凋亡通路，可能通过改善胰岛β细胞凋亡，进而改 善2型糖尿病。

Claims (9)

1.一种石斛组合物，其特征在于，所述石斛组合物包括以下重量份数的原料：铁皮石斛1.0份、黄芪1.2-2.0份、太子参1.0-2.5份、枸杞0.2-0.6份。

2.根据权利要求1所述的石斛组合物，其特征在于，所述石斛组合物通过包括以下步骤的制备方法制备：

(1)铁皮石斛、黄芪、太子参与枸杞混合，将湿原料按一定料液比加入提取溶剂煎煮提取，得提取液；所述湿原料为铁皮石斛、黄芪、太子参与枸杞混合原料浸水所得；

(2)过滤步骤(1)所得提取液；

(3)减压浓缩，得浓缩液；

(4)灭菌。

3.根据权利要求2所述的石斛组合物，其特征在于，所述步骤(1)中湿原料吸水量为60.2％-87.7％。

4.根据权利要求2或3所述的石斛组合物，其特征在于，所述步骤(1)中料液比为1:8-1:12(m/m)，提取溶剂为水，提取时间为30-90min，提取次数为1-3次。

5.根据权利要求2-4任意一项所述的石斛组合物，其特征在于，所述步骤(2)中减压浓缩温度为60℃-65℃。

6.一种石斛组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)称取铁皮石斛1.0份、黄芪1.2-2.0份、太子参1.0-2.5份、枸杞0.2-0.6份混合，所述铁皮石斛、黄芪、太子参与枸杞混合原料浸泡吸水量为60.2％-87.7％，得湿原料；

(2)湿原料与水按1:8-1:12(m/m)料液混合煎煮30-90min，煎煮1-3次，得提取液；

(3)过滤步骤(2)所得提取液；

(4)60℃-65℃温度下减压浓缩滤液，得浓缩液；

(5)灭菌。

7.权利要求1-5任意一项所述石斛组合物或权利要求6所述制备方法制备的石斛组合物在制备具有降血糖和/或降血脂和/或改善高血糖症状和/或促进肝糖原合成和/或调节糖脂代谢的产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述石斛组合物在制备具有保护肝脏和/或改善肾脏、脾脏和胰腺损伤的产品中的应用。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述石斛组合物在制备具有调节肠道菌群失调的功效的产品中的应用。

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