CN114259483A

CN114259483A - 一种用于治疗肝细胞癌的药物组合物及其应用

Info

Publication number: CN114259483A
Application number: CN202010973451.9A
Authority: CN
Inventors: 韩睿
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2022-04-01

Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种用于治疗肝细胞癌的药物组合物及其应用。本发明的药物组合物为包覆缬草酸的脂质体纳米颗粒，包括缬草酸和脂质体，缬草酸包覆于脂质体中。缬草酸具有显著抑制HDAC活性的能力，具有显著抗肝癌作用的同时还具有更低的细胞毒性。缬草酸被包覆在脂质体纳米颗粒中，使得缬草酸具有了肝癌病灶的靶向性，对缬草酸治疗肝细胞癌起到了增效减毒的作用。

Description

一种用于治疗肝细胞癌的药物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种用于治疗肝细胞癌的药物组合物及其应用。

背景技术

原发性肝癌是全球第六大常见恶性肿瘤疾病，也是癌症相关死亡第二大诱因，每年导致全球近80万人死亡。在过去的20年，该病在亚太地区发病率显著升高，且已成为中国第四大最常见的恶性肿瘤，亦是与肿瘤相关的第三大死亡原因。肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)作为临床最常见的肝癌组织学类型，占原发性肝癌发病的85％–90％，是全球癌症相关死亡的第四大最常见原因，也是美国发病率增长最快的癌症类型(过去20年中，增长近两倍)。另外，超过80％的HCC病例发生在资源欠发达地区(包括东亚以及南非地区)。早期HCC可以通过局部消融、手术切除或肝移植等进行治疗，但高复发率仍是根治术面临的严峻挑战，五年生存率仅约为35％；半数以上的HCC患者在诊断时已是晚期，而针对晚期患者的治疗选择则更为有限(如化疗，放疗，靶向药物和免疫检查点抑制剂)。尽管广泛的临床试验被来探索更优化的用药方案，但sorafenib，lenvatinib甚至Pembrolizumab等药物的临床获益仍不乐观。因此，寻找肝癌的有效的新型治疗手段仍然是一项重要挑战且势在必行。

组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(Histone Deacetylase inhibitor,HDACi)作为新型抗肿瘤制剂和国际研究热点,已被美国FDA批准用于肺癌、食道癌等恶性肿瘤的治疗，近期临床试验还显示出其显著的抗肝细胞癌作用，被认为无论单药还是联合治疗，其在肝癌治疗中都具有巨大的运用前景和价值。但是现有的、已在美国上市的HDAC抑制剂如SAHA(Vorinostat)、TSA(Trichostatin A)因为药物缺乏靶向性，给药后药物周身浓度高，使得它们在肝细胞癌治疗中表现出较高的毒副作用，使部分病人难以耐受。

发明内容

针对以上技术问题，本发明提供一种具有良好的靶向性和较强的抗肿瘤作用的用于治疗肝细胞癌的药物组合物。

本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供缬草酸在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的应用。

另一方面，本发明还提供一种用于治疗肝细胞癌的药物组合物，该药物组合物为包覆缬草酸的脂质体纳米颗粒，包括缬草酸和脂质体，缬草酸包覆于脂质体中。

进一步的，草酸和脂质体纳米颗粒按等体积混合、离心、浓缩、静置后得到包覆缬草酸的脂质体纳米颗粒。

进一步的，脂质体纳米颗粒的原料组分包括1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷、L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇和胆固醇-聚乙二醇(聚氧乙基胆固醇基癸二酸酯)。

进一步的，1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷、L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇和胆固醇-聚乙二醇(聚氧乙基胆固醇基癸二酸酯)的摩尔比为(9-10):(3-4):(7-8):(1-2)。优选的，摩尔比为9:3:7:1。

进一步的，将1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷、磷脂酰胆碱、胆固醇和胆固醇-聚乙二醇(聚氧乙基胆固醇基癸二酸酯)分别在60℃水浴环境下溶解成酒精溶液，并按(9-10):(3-4):(7-8):(1-2)的摩尔比例混合，再缓慢滴入快速搅拌的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液中，得到含有35％酒精浓度的混合液体，再将混合溶液中酒精透析去除、过滤得到脂质体纳米材料溶液。

进一步的，以20mM HEPES作为透析液，透析过程中每2小时换透析液一次，透析8-12h。

进一步的，药物组合物用于治疗肝癌细胞为Hep3B，SNU-449，HepG2的肝细胞癌细胞。

本发明还提供上述药物组合物在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的应用。

缬草作为中国及欧洲传统医学共有的植物药，已分别通过我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》和美国FDA认证达到食品安全标准和GRAS标准。其以“蜘蛛香”的名称被收入2015版《中国药典》，认为其归肝经，中国医药出版社《贵州中药资源》认为其可“清热解毒,排脓生肌”、治“疮疡肿毒”及“积聚”等；国内文献亦有报道其肿瘤治疗的有效临床经验，缬草提取物被证据具有抗肿瘤活性。缬草酸作为缬草提取物中成分之一，本发明通过大量实验验证及筛选后发现缬草酸具有有效的抗肝细胞癌作用。

本发明制备的脂质体纳米颗粒(LNP-DP1)具有更高包裹、递送效率、更佳的安全性和经济性且更易获得等特点。脂质体纳米颗粒可给所包裹药物提供病灶的“靶向性”，其具有双层、球型的脂质体结构，对药物具有很好的包封、装载效率和稳定性，具有较强的“增强的穿透和滞留”(enhanced penetration and retention，EPR)效应，静脉注射后可优先在肝脏肿瘤部位滞留且进入瘤细胞，致使可携带的药物优先积聚到肿瘤组织并释放，同时保证肿瘤组织外周身其他组织中药物的低浓度，对所运载药物具有增效减毒的作用。脂质体纳米颗粒(LNP-DP1)为缬草酸(Valeric Acid，简称VA)肝癌治疗的递送系统提供了理想选择。

本发明提供一种用于治疗肝细胞癌的药物组合物，将缬草酸包覆在脂质体中。缬草酸具有显著抑制HDAC活性的能力，具有显著抗肝癌作用的同时还具有更低的细胞毒性。缬草酸被包覆在脂质体纳米颗粒中，使得缬草酸具有了肝癌病灶的靶向性，对缬草酸治疗肝细胞癌起到了增效减毒的作用。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1为本发明中包覆缬草酸的脂质体纳米颗粒结构示意图；

图2为本发明中缬草酸对Hep3B细胞的HDAC活性影响结果示意图；

图3为本发明中缬草酸对SHU-449细胞的HDAC活性影响结果示意图；

图4为本发明中缬草酸对HepG2细胞的HDAC活性影响结果示意图；

图5为本发明中缬草酸对所测细胞系在72小时的IC50值；

图6为本发明中VA(缬草酸)、LV(缬草酸纳米颗粒复合物)对各个细胞72h的抑制率结果示意图；

图7为本发明中LV对Hep3B细胞迁移能力的影响结果示意图；

图8为本发明中LV对SNU-449细胞迁移能力的影响结果示意图；

图9为本发明中LV对肝癌细胞集落克隆能力的抑制作用结果示意图；

图10为本发明中LV对肝癌细胞侵袭能力的影响结果示意图；

图11为本发明中LV对肝癌细胞三维类器官形成能力的影响结果示意图；

图12A和B分别为本发明中LNP-DP1-VA在小鼠及人血样本中免疫刺激性测试结果示意图；

图13为本发明中LV、SAHA、TSA对肝细胞癌细胞及正常肝细胞的抑制率结果示意图；

图14为本发明中SNU-449肝癌移植瘤小鼠生物荧光信号图像；

图15为本发明中SNU-449肝癌移植瘤小鼠生物荧光信号变化曲线图；

图16为本发明中Hep3B肝癌移植瘤小鼠生物荧光信号图像；

图17为本发明中Hep3B肝癌移植瘤小鼠生物荧光信号变化曲线图；

图18为本发明中SNU-449肝癌移植瘤小鼠生存曲线；

图19为本发明中Hep3B肝癌移植瘤小鼠生存曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1：脂质体纳米颗粒(LNP-DP1)的配制

本实施例中脂质体纳米颗粒(LNP-DP1)所用原料组分及用量等参数如表1所示。

表1脂质体纳米颗粒(LNP-DP1)配制原料

脂质体纳米颗粒(LNP-DP1)的制备方法如下：

第一天：水浴锅中预热浓度100％的酒精至60℃，按摩尔比率将表1中所有液体成分称量并按要求加入预热酒精中并充分溶解。按四种液体成分按比例溶解成酒精溶液(DODMA/EggPC/Chol/PEG-liqid＝45:15:35:5)(60℃水浴环境下进行溶解)，将混合溶液用注射器缓慢滴入快速搅拌的HEPES溶液中(20mM，pH7.4)，至溶液为含有35％酒精浓度的新混合液体。使用MWCO 10,000Dalton Float-A-Lyzer(加拿大Spectrum Laboratories公司)置入搅拌器旋转将溶液中酒精透析去除，20mM HEPES作为透析液，透析过程中每2小时换透析液一次，透析8-12h。

第二天：用0.22um规格syringe filter滤过透析完成的混合液，滤过后的纳米材料溶液保存于4℃环境下，即为LNP-DP1。

具体的，本实施例中所用试剂来源如下：

DODMA：Dimethylamino-1,2-dioleyloxy-propane，C₄₁H₈₁NO₂，购于美国Sigma-Aldrich公司；

Cholesterol：胆固醇，C₂₇H₄₆O，购于美国Sigma-Aldrich公司；

Egg PC：L-α-phosphatidylcholine[95％]，购于美国Sigma-Aldrich公司；

PEG-Chol：Cholesterol–PEG 600，购于美国Sigma-Aldrich公司；

ETOH：乙醇溶液，购于美国ATCC公司；

HEPES：HEPES缓冲液，购于美国Sigma-Aldrich公司。

实施例2：包覆缬草酸的脂质体纳米颗粒的制备

在离心管中加入等体积的LNP-DP1及缬草酸(体积比1：1混合)，在2100g、20min条件下离心，将纳米颗粒缬草酸复合物离心并浓缩至200μl离心后静置20min后使用。按所需浓度稀释使用加药，每次使用前，新鲜配制。包覆缬草酸的脂质体纳米颗粒(LNP-DP1-缬草酸，简称LV)复合物如图1所示。

实施例3：药性学研究

缬草酸(VA)对肝癌细胞HDAC活性影响的研究

使用HDAC Activity Colorimetric试剂盒(美国BioVision公司)检测缬草酸(VA)及包覆缬草酸的脂质体纳米颗粒(LV)对M待测细胞HDAC活性的影响。将待测样品(50-200μg细胞裂解物)以双蒸水稀释到85μl(最终量)每孔。往每孔中加入10μl 10X HDAC分析缓冲液。往每孔加入5μl HDAC比色基底(colorimetric substrate)，并使溶液完全混合。将待测板放在37℃孵育相中1小时(孵育时间可酌情延长)。每孔加入10μl Lysine Developer并均匀混合以停止反应。将待测板继续放入37℃孵育箱30分钟。使用Epoch微孔板分光光度计(美国Bio-Tek公司)，在405nm吸光度下测定样品OD值。信号在室温下可保持稳定数小时。HDAC活性可由相对O.D.值/每μg蛋白样品表示。结果如图2-4所示。

由图2-4可知，I类HDAC酶活性测试提示VA在24h、48h和72h对Hep3B，SHU-449以及HepG2细胞的HDAC活性有显著的抑制作用(P<0.05)，同时LNP-DP1可以显著提升VA的HDAC酶抑制作用，且LV的HDAC抑制作用在24h时显著优于等量SAHA(SNU-449)，在48h时显著优于SAHA(Hep3B)，在48h时显著优于SAHA(HepG2)；LV与TSA的HDAC抑制作用未见统计学差异(注：与对照组比较，*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；NS：non-significant差异无统计学意义)。

实施例4：药效学研究

4.1细胞株的购买及培养方法

4.1.1细胞株

人肝细胞癌细胞系Hep3B(美国ATCC公司)；人肝细胞癌细胞系SNU-449(美国ATCC公司)；人肝细胞癌细胞系HepG2(美国ATCC公司)；人正常肝细胞系THLE-3(美国ATCC公司)；人乳腺癌细胞系MCF-7(美国ATCC公司)；人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231(美国ATCC公司)；人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A(美国ATCC公司)；人脑恶性胶质瘤细胞系A-172(美国ATCC公司)；人脑恶性胶质瘤细胞系U-87(美国ATCC公司)；人肺癌细胞系A549(美国ATCC公司)；人宫颈癌细胞系HeLa(美国ATCC公司)；人前列腺癌细胞系DU145(美国ATCC公司)；人非霍奇金淋巴瘤细胞系Farage(美国ATCC公司)；人急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60(美国ATCC公司)。

4.1.2细胞的鉴定

所有细胞系均应用STR分析以鉴定细胞系种类。

4.1.3细胞系的培养方法

人肝癌细胞Hep3B及HepG2均以EMEM培养基混合10％胎牛血清及1％青霉素、链霉素进行培养；SNU-449细胞以RPMI-1640培养基+10％胎牛血清及1％青霉素、链霉素进行培养；THLE-3则以BEGM Bullet Kit(美国ATCC公司)所配制的BEGM培养基(去庆大霉素/两性霉素及肾上腺素、加5ng/mL上表皮生长因素、70ng/mL磷酸乙醇胺，10％胎牛血清)进行培养。MCF-7与MDA-MB-231细胞以DMEM加10％胎牛血清和1％青霉素、链霉素进行培养；MCF-10A细胞则培养于含100ng/mL霍乱毒素的MEBM培养基中；U-87以10％胎牛血清+1％青霉素、链霉素的EMEM培养基培养；A-172细胞用DMEM加10％胎牛血清和1％青霉素、链霉素进行培养；A549用含10％胎牛血清的F12K培养基培养；10％胎牛血清+1％青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基用于培养HeLa、Farage细胞；Du145细胞的培养基由EMEM培养液混合10％胎牛血清和1％青霉素、链霉素的完全培养基进行培养；HL-60细胞则培养于合20％胎牛血清的IMDM培养基。所有细胞均培养于37℃、5％CO₂、饱和湿度的细胞孵育箱内，每周换液2-3次；贴壁细胞用含0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化，非肿瘤正常细胞MCF-10A及THLE-3使用含0.02％EDTA的0.05％胰蛋白酶消化传代。

4.1.3.1细胞的复苏

提前将水浴锅预热至37℃，再将存有细胞的冻存管从液氮罐中取出并迅速将冻存管至于已预热完成的水浴锅中，在保持冻存管管口始终处于液面以上的条件下，在水中轻微晃动冻存管以加速溶解，使溶解过程不超过2分钟。随后，将解冻完成的细胞吸出并加入4-6mL完全培养基，125g，5-10分钟离心，弃上清液。以4-6mL完全培养基重悬细胞，轻微吹打混匀后，将细胞混悬液移至培养皿中培养，培养条件：37℃，5％CO₂孵育箱。次日换液后每周换液2次。

4.1.3.2贴壁细胞的传代方法

将装有培养的贴壁细胞的培养瓶从孵育箱取出(贴壁的面积达到大约90％)，滴管吸出并丢弃培养瓶中陈旧培养液，用2-3mL 1X PBS液体轻轻洗涤细胞表面并弃去废液，再向75cm²细胞培养瓶中加入2-3mL胰蛋白酶-EDTA，并将培养瓶重新放置回37℃孵育箱(5-10分钟)，待倒置显微镜下能见细胞重悬脱离瓶壁后加入4-6mL完全培养基终止消化并将混合液置于离心管中离心(125g，5-10min)。弃上清，加入4-6mL完全培养基反复吹打细胞使其重悬，再将重悬液移至新培养瓶中继续培养，传代比率一般为1:3-1:5。培养条件：37℃，5％CO₂。

4.1.3.3悬浮细胞的传代方法

将装有细胞的培养瓶从培养箱中取出，消化并转移细胞至离心管内，放入离心机300g离心5min，谨慎弃掉上清液，再加入完全培养基，移液枪在页面下轻轻吹打溶液至沉淀的细胞均匀重悬，制成单细胞颗粒悬液，在完成细胞计数后，将细胞悬液按适宜浓度接种至新的

T-75培养瓶中，传代细胞数量控制在1×10⁵cells/mL至1×10⁶cells/mL以内。保证培养瓶中含有足够量培养液，并培养于37℃，5％CO₂的孵育箱中，每周换液2-3次。

4.2主要试剂和仪器

EMEM培养液(美国ATCC公司)

DMEM培养液(美国ATCC公司)

RPMI-1640培养液(美国ATCC公司)

BEGM Bullet Kit(美国ATCC公司)

BEGM培养液(美国ATCC公司)

MEBM培养液(美国GIBCO公司)

IMDM培养液(美国ATCC公司)

F12K培养液(美国GIBCO公司)

1X PBS缓冲液(美国GIBCO公司)

胎牛血清(美国GIBCO公司)

链霉素、青霉素(美国life Technologies公司)

MTS(美国Sigma公司)

胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(美国life Technologies公司)

大豆胰蛋白酶抑制剂(美国life Technologies公司)

缬草酸(制药纯度标准，pharmaceutical impurity standard)(Lot Number：44344)(美国sigma公司)

DODMA，2,3-Dioleyloxy-1-(dimethylamino)propane(美国Sigma公司)

胆固醇(美国Sigma公司)

Egg PC(美国Sigma公司)

PEG-Chol(美国Sigma公司)

HEPES溶液(美国SigmaAldrich公司)

Slide-A-Lyzer^TM透析盒(Slide-A-Lyzer^TMDialysis Cassettes)(美国ThermoFisher公司)

Epoch微孔板分光光度计(美国Bio-Tek公司)

Thermo Scientific Sorvall Legend T Benchtop离心机(德国Kendro公司)

Vistavision microscope倒置显微镜

BB5060型5％CO₂恒温细胞培养箱(德国Heraeus公司)

MINI vortex旋涡混合器(美国Fisher Scientific公司)

A/B3型超净工作台(美国Spectra lab公司)

E12130电子天平(美国Ohaus公司)

General Purpose Series低温冰箱(美国Fisher Scientific公司)

加热磁力搅拌器/电炉(美国Fisher Scientific公司)

Digital-Control水浴锅(美国Fisher Scientific公司)

4.3方法

4.3.1MTS法检测缬草酸、LNP-DP1-缬草酸复合物、LNP-DP1分别对各种肿瘤及普通细胞系的增殖抑制作用并计算半数致死量

将处于对数生长期的Hep3B、SNU-449、HepG2、THLE-3、MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A、U-87、A-172、A549、HeLa、DU145、Farage、HL-60收集后离心，并用各自的完全培养基重悬，调整细胞密度为2-4k/100μL，接种于96孔板上，每孔100μL细胞混悬液，置于37℃，5％CO₂孵育箱内培养，24h后更换培养基，并按分组往每孔中加入干预溶液(治疗组加入不同浓度缬草酸，对照组加入相应等量1％双蒸水)，每个测试浓度及不同观测时间设3个复孔，共观测4个时间点(24h，48h，72h，96h)。于每个时间点往待测孔中加入20μl MTS溶液，置于37℃，5％CO₂培养箱内避光保存2h，在波长490nm条件下，用酶标仪测定每组各孔相应吸光度OD值，计算细胞存活率及抑制率以计算伴宿致死量。

4.3.2实验分组

测定缬草酸对Hep3B、SNU-449、HepG2、THLE-3、MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A、U-87、A-172、A549、HeLa、DU145、Farage、HL-60的抑制作用，计算相应IC50，作为治疗干预组；测定在相应同等浓度双蒸水下，Hep3B、SNU-449、HepG2、THLE-3、MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A、U-87、A-172、A549、HeLa、DU145、Farage、HL-60的生长情况，作为对照组。

同时测定样品LNP-DP1-缬草酸复合物对Hep3B、SNU-449、HepG2、THLE-3、MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A、U-87、A-172、A549、HeLa、DU145、Farage、HL-60的抑制作用，作为治疗干预组；测定在等量LNP下，Hep3B、SNU-449、HepG2、THLE-3、MCF-7、MDA-MB-231、MCF-10A、U-87、A-172、A549、HeLa、DU145、Farage、HL-60的生长情况，作为Mock组；另增设空白对照组。

3.3计算方法

根据MTS实验所测OD值，计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率，公式为：

细胞抑制率＝100％-细胞存活率

由Graphpad Prism 8软件计算药物对细胞的半数抑制浓度(IC50)

4.3.4统计学方法

采用SPSS16.0软件处理数据，进行方差分析。各分组所得计量数据采用均数±标准差

表示，组间均数比较用t检验。检验水准α＝0.05，p<0.05有统计学意义。

缬草酸对所测细胞系在72小时IC50进行比较，如表2和图5所示。

表2缬草酸对所测细胞系于72小时的IC50值

细胞系	IC50(mM)
		Hep3B	1.439
SNU-449	1.612
		HepG2	0.948
THLE-3	3.097
		MCF-7	3.804
MDA-MB-231	4.227
		MCF-10A	3.422
U-87	2.799
		A-172	3.471
A549	5.589
		HeLa	2.465
DU145	1.872
		Farage	0.89
HL-60	2.03

VA(缬草酸)、LV(LNP-DP1缬草酸复合物)及LNP(LNP-PD1)分别对各所测细胞72h抑制率的比较如表3和图6所示。可知在所有14种测试细胞中，仅在Hep3B，SNU-449及HepG2三种肝细胞癌细胞中，在使用LNP包裹VA后，药物的抑瘤作用增加，其余来源肿瘤细胞和普通细胞VA的抑制率均在LNP包裹后下降或维持原有水平。

表3 VA及LV对各个细胞72h的抑制率

实施例5：LV(LNP-DP1-缬草酸复合物)对肝癌细胞迁移能力、集落克隆能力、侵袭能力及类器官形成能力影响的研究

5.1试剂及细胞系

EMEM培养液(美国ATCC公司)；

DMEM培养液(美国ATCC公司)；

RPMI-1640培养液(美国ATCC公司)；

1×PBS缓冲液(美国GIBCO公司)；

胎牛血清(美国GIBCO公司)；

链霉素、青霉素(美国life Technologies公司)；

HDAC Activity Colorimetric Assay试剂盒(美国BioVision公司)；

人肝癌细胞系Hep3B(美国ATCC公司)；

人肝癌细胞系SNU-449(美国ATCC公司)；

人人肝细胞癌细胞系HepG2(美国ATCC公司)；

缬草酸(制药纯度标准，pharmaceutical impurity standard)(Lot Number：44344)(美国sigma公司)。

5.2仪器和试剂

Epoch微孔板分光光度计(美国BioTek公司)；

Thermo Scientific Sorvall Legend T Benchtop离心机(德国Kendro公司)；

Vistavision microscope倒置显微镜(美国VWR公司)；

荧光显微镜(日本Olympus公司)；

BB5060型5％CO2恒温细胞培养箱(德国Heraeus公司)；

MINI vortex旋涡混合器(美国Fisher Scientific公司)；

A/B3型超净工作台(美国spectra lab公司)；

E12130电子天平(美国Ohaus公司)；

6孔板(美国Falcon公司)；

4％paraformaldehyde(美国sigma公司)；

General Purpose Series低温冰箱(美国Fisher Scientific公司)；

加热磁力搅拌器/电炉(美国Fisher Scientific公司)；

Digital-Control水浴锅(美国Fisher Scientific公司)；

可调式移液器(芬兰百得公司)；

结晶紫染色剂(美国sigma公司)；

3.0μm孔径transwell小室系统(美国Falcon公司)；

Matrigel(美国Corning公司)；

4％paraformaldehyde(美国sigma公司)；

ImageJ 1.52a version(美国NHI公共资源)。

5.3实验方法

5.3.1细胞培养

人肝癌细胞Hep3B以EMEM培养基混合10％胎牛血清及1％青霉素、链霉素进行培养；SNU-449细胞以RPMI-1640培养基+10％胎牛血清及1％青霉素、链霉素进行培养。

5.3.2实验用药配制

与上述实施例1、2一致。

5.3.3LV对肝癌细胞迁移能力影响的研究

Hep3B，SNU-449细胞被用于瘢痕愈合实验。近1×10⁶细胞被分别铺与6孔板内，培养于37℃，5％CO₂孵育箱。24h后待细胞长满底壁，以100μl枪头在孔中轻轻划线，并在镜下记录图像，此时治疗组以LV(850μM)干预，对照组加入等量双蒸水，所有细胞均以含0.1％FBS的2mL培养基培养。继续培养并观察，记录图像。

5.3.4LV对肝癌细胞集落克隆能力影响的研究

Hep3B，SNU-449细胞，各数2000个细胞，种于6孔板中，加入2ml完全培养基，轻轻晃动以使得细胞均匀平铺。治疗组接受LV(850μM)干预，对照组接受等量双蒸水。各组细胞培养在37℃，5％CO₂孵育箱10天，每2-3d换新鲜培养基。待细胞集落形成，以1X PBS水轻轻冲洗，再以4％paraformaldehyde固定，以结晶紫染色，含30个细胞数量以上的集落被计算在内。

5.3.5LV对肝癌细胞侵袭能力影响的研究

带3.0μm孔径的Transwell小室系统用于本次研究。将Hep3B，SNU-449细胞分别消化计数，1×10⁴细胞被种于小室上层，上层加入100μl培养基含10％Matrigel和0.1％FBS。小室下层加入600μl含10％FBS的完全培养基。治疗组接受LV(850μM)干预，对照组接受等量双蒸水；Hep3B，SNU-449培养48h。取出膜，用棉签将上室面细胞轻轻擦掉，固定穿过膜至下室面的细胞。以4％paraformaldehyde固定，以结晶紫染色。显微镜下不同视野细胞量被计算用于分析。

5.3.6LV对肝细胞癌细胞类器官三维形成(Cell line-derived 3D organoid)能力影响的研究

培养稳定的荧光素酶表达细胞株用于本次三维球状形成实验。将750个细胞倒置悬于30μL溶液中(Phenol-red free matrigel[Corning,USA]+EMEM或PRMI-1640完全培养基)，分为LNP-DP1-VA(50μM)组与NC组(等量LNP-DP1-PBS)，一组实验连续培养记录图像96个小时并以Imagej程序(版本1.52a；https://imagej.nih.gov/ij/)测定3D模型截面面积。另一实验组，取悬滴细胞并加入D-luciferin(150μL/mL)(PerkinElmer,USA)，以GloMaxTM96Microplate Luminometer(美国Promega公司)测定生物荧光信号(bioluminescencesignal)进行记录并计算抑制率，各条件下每个时间点设复孔3个(24、48、72、96和120小时)。

5.4实验结果

5.4.1LV对肝癌细胞迁移能力的抑制作用

LV对Hep3B细胞迁移能力的影响如表4和图7所示，LV作用细胞后，可见24h及48h瘢痕宽度对起始宽度的占比逐渐减少。与NC组相比，LV细胞瘢痕愈合较慢，24h为87.22±1.91％，比NC组67.49±2.38％大(P<0.001)。48h LV组瘢痕占比为70.79±1.83％，而NC组仅为初始宽度的37.92±1.68％(P<0.001)。

表4 LV对Hep3B迁移能力的影响

LV对SNU-449细胞迁移能力的影响如表5和图8所示，两组细胞瘢痕随时间延长而逐渐愈合。与NC组相比，LV细胞瘢痕愈合速度较慢。24h时LV组的瘢痕宽度占初始宽度的72.03±3.09％，比NC组58.56±9.22％大(P<0.001)。48h LV组瘢痕占比为62.32±3.59％，而NC组则已经愈合至初始宽度的38.41±3.7％(P<0.001)。

表5 LV对SNU-449迁移能力的影响

5.4.2 2.LV对肝癌细胞集落克隆能力的抑制作用

Hep3B，SNU-449细胞在10天后的克隆形成如图9所示(P＜0.001)。由表6可知，Hep3B细胞LV组细胞集落数与NC相比为38.01±2.51(P＜0.001)，SNU-449细胞LV组细胞集落数与NC相比为36.44±2.11(P＜0.001)。

表6 3种细胞的相对克隆形成效率

	NC	LV
			Hep3B相对克隆形成效率(％)	100	38.01±2.51
SNU-449相对克隆形成效率(％)	100	36.44±2.11

5.4.2.3LV对肝癌细胞侵袭能力的影响

如图10和表7所示，Hep3B细胞在48h后固定，每个视野在膜上可见细胞数为156.67±12.04(LV)与334±9.2(NC)(P＜0.001)；SNU-449细胞在48h固定，每个视野在膜上可见细胞数为188.33±10.27(VA)与288.33±9.81(NC)(P＜0.001)。

表7 transwell小室每视野细胞个数

	NC	VA
			Hep3B视野细胞量	334±9.2	156.67±12.04
SNU-449视野细胞量	288.33±9.81	188.33±10.27

5.4.2.4LV对肝癌细胞三维类器官形成能力的影响

如图11所示，在SNU-449及Hep3B细胞中，LNP-DP1-VA组较对照组3D球状细胞团块横截面面积更小，相对横截面面积形成率更低(P<0.001)，LNP-DP1-VA对SNU-449及Hep3B细胞在96h后的3D球状细胞形成的抑制率均达到50％以上(注：与对照组比较，*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；NS：non-significant差异无统计学意义)。

实施例6：LV安全性研究

6.1以Fluorokine Multianalyte profiling多因子分型试剂盒测定小鼠细胞因子水平评估LNP-DP1-VA的免疫诱导性

将适当饲养7至8周大的雌性Balb/C小鼠(Charles River,USA)，随机分为干预组(LNP-DP1-VA)和对照组(等量PBS)，每组三只。用LNP-DP1-VA或PBS分别予小鼠尾静脉注射。注射后30min和200min后分别通过眼眶后窦抽血从小鼠收集血液。将血液样品添加到血清收集管中，以随后通过离心分离血清。使用小鼠Fluorokine Multianalyte分析套件(R&DSystems)和Luminex100IS仪器确定血清细胞因子水平(IL6、IL8及TNFα)。结果如图12A所示。

6.2以ELISA分析LNP-DP1-VA的人全血免疫刺激试验

为确定配制的LNP-DP1-VA是否诱导人细胞因子应答，将配制的LNP-DP1-VA、PBS以及阳性对照脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)在从四名健康男性志愿者收集的全血中孵育24小时。将肝素添加到全血中以防止凝血，并且最终以600nmol/L的浓度存在被配制的miRNA。孵育后，通过离心分离血浆，并通过ELISA(R&D Systems)分析IL6，IL8和TNFα。结果如图12B所示。

6.3以MTS细胞增殖抑制实验比较LV、TSA、SAHA对正常肝细胞的毒性

以MTS法分别测定相同浓度LV、TSA、SAHA对THLE-3的增殖抑制率，在波长490nm条件下，用酶标仪测定每组各孔相应吸光度OD值，以计算细胞存活率及抑制率。结果如图13所示。

由图12A可知，小鼠经LNP-DP1-VA干预30min和300min后，分别与各对照组(PBS)比较，IL6、IL8、TNFα相对表达量的变化均无统计学差异；由图12B可知，在人血样品中，LPS组IL6、IL8及TNFα与PBS及LNP-DP1-34a组分别对比均显著增高(P<0.001)，而LNP-DP1-34a组与PBS组所测细胞因子差异均无统计学意义(注：与对照组比较，*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；NS：non-significant差异无统计学意义)。由图13可知，等量SAHA仅在48和72h时的Hep3B细胞中抑制率显著优于LV，但LV在对普通细胞抑制率在72h和96h时显著低于SAHA和TSA。

实施例7：动物实验

阳离子脂质体纳米颗粒包裹缬草酸抗裸鼠肝癌原位移植瘤的研究

7.1实验动物：SPF级，Athymic nude小鼠，雄性，4周龄，18～20g，共16只。

仪器和耗材：

Epoch微孔板分光光度计(美国Bio-Tek公司)

Thermo Scientific Sorvall Legend T Benchtop离心机(德国Kendro公司)

vistavision microscope倒置显微镜(美国VWR公司)

BB5060型5％CO2恒温细胞培养箱(德国Heraeus公司)

MINI vortex旋涡混合器(美国Fisher Scientific公司)

A/B3型超净工作台(美国Spectralab公司)

E12130电子天平(美国Ohaus公司)

General Purpose Series低温冰箱(美国Fisher Scientific公司)

CMV-Firefly luciferase-IRES-Puro lentivirus及转染试剂盒(美国CellomicsTechnology公司)

IVIS Lumina LT小动物活体光学成像系统(美国Xenogen Corp./Caliper lifeScience公司)

Living

4.3.1Software(美国Caliper Life Science公司)

MWCO 10，000Dalton Float-A-Lyzer(加拿大Spectrum Laboratories公司)

0.22um syringe filter(美国Falcon公司)

Isoflurane(美国Sigma-Aldrich公司)

小鼠麻醉用玻璃罐(美国Falcon公司)

小鼠固定器(美国Falcon公司)

Procreate software IOS version(美国Corel公司)

96Microplate Luminometer(美国Promega公司)

7.2实验方法

7.2.1细胞培养

7.2.1.1细胞慢病毒的转染

将生长于对数期的SNU-449和Hep3B细胞用于荧光慢病毒的转染细胞系的构建。转染前，将1×10⁵个细胞/2ml培养基培养于6孔板中12到18h。将polybrene按6μg/ml加入完全培养基中继续培养细胞。将冻存的慢病毒样品在冰上缓慢解冻，用移液管轻轻吹打慢病毒样品，并将其移至转染培养基中(RPMI-1640或EMEM培养基+10％热灭活FBS)，MOI(multiplicity of infection)单位为5。8小时后以新鲜完全培养基取代转染用培养基，继续在37℃，5％CO₂孵育箱培养细胞。

7.2.1.2稳定细胞系筛选

转染后的细胞，以puromycin筛选(1μl/ml每三日一次)，培养至少14天。14天后以D-luciferin(150μl/ml)与细胞混合，运用96Microplate Luminometer测量细胞发光度，发光度维持高值则说明转染细胞系稳定。

7.2.2建立动物模型

购买小鼠后，于耶鲁动物房饲养1周以适应环境。

首先将Matrigel由-20℃置于4℃冰箱以待溶解。待慢病毒成功转染荧光酶基因的SNU-449，Hep3BMCF-7细胞系稳定，取对数生长期的细胞，500g离心5min，弃上清，计数5×105个细胞为单只小鼠注射量。将计数好的5×10⁵个细胞混于50ul培养基(10％FBS EMEM或RPMI-1640培养基含)，并再用50ul Matrigel与其混合，混合式注意避免吹打，用旋涡混合器混合细胞溶液，避免产生气泡，再用1.5ml针管配合30g针头将细胞溶液吸出并置于4℃环境中(整个配制过程在4℃房中进行)。

细胞溶液注射完成后放入冰盒中备用，将小鼠放入麻醉用玻璃罐，加入2mlIsoflurane使其麻醉，麻醉后定位穿刺部位(小鼠剑突与左肋缘夹角下方2mm处，以15至30°角向小鼠右侧进针，进针深度5-10mm，手下突破感后缓慢推针，推送完毕后静止10-20s待matrigel凝固后出针，针管头部见血说明注射成功)。

7.2.3分组与给药

接种后第15天，将16只裸小鼠转移至IVIS成像系统和实验室为每一只裸鼠腹腔注射D-lucferin，等待15-30min，成像并记录。小鼠成瘤后，按照随机数字表将16只裸小鼠随机分成4组，分别为：SNU-449LV模型对照组，SNU-449LV组，Hep3B模型对照组，Hep3B LV组。其中，模型对照组以等量LNP包裹等量双蒸水静脉注射，每周2次，共3周，LV组组按100mg/kg尾静脉注射(灌胃半数致死量的1/6[650mg/kg]，尾静脉注射半数致死量的约1/9[939mg/kg])，每周1次。共给药4次，每周测荧光图像一次。

7.2.4生物性发光分析实验

准备15mg/ml新鲜的Luciferin试剂的DPBS溶液，再滤过0.2um的滤过器。注射量以每只小鼠接受150mg luciferin/kg体重。Luciferin溶液由腹腔注射给药。等待10-15min后可用IVIS成像。

7.3观察指标及结果

7.3.1小鼠一般状况观察

16只裸小鼠均成瘤，至最后一次疗程结束第一次复查图像，无一只裸小鼠死亡。各组小鼠觅食、饮水均无异常，活动自如，体重无明显变化。

7.3.2各组肿瘤动态生长情况及生存情况比较

动态测量小鼠荷瘤生长状况，并用Prism 8程序绘制肿瘤荧光信号动态曲线。各组所得计量数据采用均数±标准差

表示，用SPSS16.0软件处理，多组数据比较采用单因素方差检验，组间均数比较用t检验。检验水准α＝0.05，p＜0.05被认为有统计学意义。

如表8-9和图14-17所示，两个细胞系中，对照组肿瘤信号均增长较快，与各治疗组相比，自给药第21天瘤体荧光值出现显著差异(P＜0.05)。两组细胞系LV组肿瘤生长缓慢，瘤体甚至可随时长缩小。由图14可见，SNU-449治疗组小鼠从治疗一周后，瘤体荧光信号呈逐步缓慢下降趋势，而对照组小鼠瘤体影响信号则呈稳定上升趋势；其中由图15可见，LV组有一只小鼠信号持续较强，但在7至21天信号稳定。由图16-17可见，Hep3B LV组小鼠从给药第一周，瘤体信号及呈现下降趋势，但在第21天信号有稍许增长，组内无明显差异；而NC组型号则显著增加，并且稳步上升。

表8 SNU-449肝癌移植瘤裸鼠生物荧光值

生物荧光值(×10<sup>7</sup>)	0day	7day	14day	21day
					LV	9.23±2.31	11±2.75	8.03±2.01	6.76±1.69
NC	5.8±1.45	15.57±3.89	30.6±7.65	48.24±12.06

表9 Hep3B肝癌移植瘤裸鼠生物荧光值

图18-19可见，SNU-449肝癌小鼠NC组在第给药第27d、36d、49d、50d分别死亡，而LV组小鼠39天发现死亡1只，其余存活均超过60d；Hep3B肝癌小鼠NC组在第24d严重腹水死亡一只、37d死亡两只、剩余一只则在第46d死亡；相比干预组，一只死于第42d，另一只死于第54d，其余两只则均存活超过60d。

以上借助具体实施例对本发明做了进一步描述，但是应该理解的是，这里具体的描述，不应理解为对本发明的实质和范围的限定，本领域内的普通技术人员在阅读本说明书后对上述实施例做出的各种修改，都属于本发明所保护的范围。

Claims

1.缬草酸在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的应用。

2.一种用于治疗肝细胞癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为包覆缬草酸的脂质体纳米颗粒，包括缬草酸和脂质体，所述缬草酸包覆于所述脂质体中。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述缬草酸和脂质体纳米颗粒按等体积混合、离心、浓缩、静置后得到包覆缬草酸的脂质体纳米颗粒。

4.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其特征在于，所述脂质体纳米颗粒的原料组分包括1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷、L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇和胆固醇-聚乙二醇。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷、L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇和胆固醇-聚乙二醇的摩尔比为(9-10):(3-4):(7-8):(1-2)。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，将1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷、L-α-磷脂酰胆碱、胆固醇和胆固醇-聚乙二醇分别在60℃水浴环境下溶解成酒精溶液，并按(9-10):(3-4):(7-8):(1-2)的摩尔比率混合，再缓慢滴入快速搅拌的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液中，得到含有35％酒精浓度的混合液体，再将混合溶液中酒精透析去除、过滤得到脂质体纳米材料溶液。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，以20mM HEPES作为透析液，透析过程中每2小时换透析液一次，透析8-12h。

8.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗肝癌细胞为Hep3B，SNU-449，HepG2的肝细胞癌细胞。

9.权利要求2-8中任一项所述药物组合物在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的应用。