CN111759794B - 一种治疗黑色素瘤的微针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗黑色素瘤的微针及其制备方法。本发明首先提供了一种茶多酚‑siBRAF纳米脂质体复合物，包括siBRAF纳米脂质体和茶多酚；所述siBRAF纳米脂质体和茶多酚的质量比为4～7：1。本发明将茶多酚和siBRAF纳米脂质体联合给药，两者具有协同增效的作用，制备得到的茶多酚‑siBRAF纳米脂质体复合物能够同时实现抑制黑色素瘤细胞恶性增殖和快速迁移的作用；将将此复合物载入可溶性微针制备得到的微针，能够促进该复合物在皮肤中的透过和滞留，更好地进入皮下黑色素瘤组织中，对于治疗黑色素瘤具有优良的增效作用；且该微针的黑色素瘤细胞靶向强、皮肤透过量高、成分简单、制备方便，治疗黑色素瘤的效果显著，应用前景良好。

Description

一种治疗黑色素瘤的微针及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种治疗黑色素瘤的微针及其制备方法。
背景技术
黑色素瘤是一种由黑色素细胞产生基因突变而发展形成的恶性皮肤肿瘤，通常发生于皮肤浅表，但也可原位或转移发生于人的口腔、肠道、眼部及脑部。在女性中多发生于腿部，男性中多发生于背部。大部分黑素瘤起源于皮肤表面痣，发生初期可见于皮肤表面痣的形态改变，如痣的变大、边缘形状不规则、颜色加深多变、发生瘙痒或皮损等这类容易辨别的特征。黑色素瘤的主要特点是致病机制复杂、高度远处转移性与预后困难。其中，远处转移性使得其可能在身体各部位发生，治疗难度增加，而临床上传统的化疗、放疗手段均难以控制肿瘤复发，使得患者的长期生存率降低，预后困难。
黑色素瘤的病因可分为环境因素、遗传因素及不明原因。紫外线是主要的环境因素，也是目前可确定的致癌因素，长期暴露于紫外线可导致基因突变。导致黑色素瘤的遗传因素是指一些家族性罕见基因突变，如导致红发的MC1R、多重抑癌因子CDKN2A等基因突变通常会增加黑素瘤易感性。恶性黑色素瘤突变的基因主要包括BRAF、NRAS、KIT等，BRAF基因位于染色体的7P34，在黑色素瘤、结肠直肠癌以及造血细胞中都存在高表达，研究发现约40％-60％的皮肤性黑色素瘤存在丝氨酸/苏氨酸激酶基因BRAF的突变，使得BRAF成为潜在研究靶点，其抑制剂作用于MAPK-ERK通路。促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号通路在黑色素瘤的细胞增殖与分化中是一种重要的调节通路，MAPKs是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调节各种细胞内活动，包括细胞增殖、分化、生长、死亡与传导。MAPK通路分为细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和P38通路；其中，BRAF-MEK-ERK信号通路主要影响细胞的增殖、存活、分化和转化；JNK通路通过激活细胞核内与核外一系列分子作用于细胞凋亡、增殖、迁移、存活、分化和炎症。
与传统的小分子抑制剂及抗体相比较，经过设计的RNA一旦传递进入特定的细胞或组织，就可以选择性的靶向单个基因；因此，可以很好的避免脱靶效应，并且可以通过最小化副反应的作用来促进治疗。RNA干扰(RNAi)已被广泛用于评估基因在不同细胞过程和疾病中的个体作用，并且开发基于RNA的疗法来纠正肝炎、病毒感染、癌症等疾病的研究愈加深入。
FDA批准的第一个植物药为茶多酚软膏，其中的茶多酚是其发挥作用的重要成分。茶多酚是一种天然混合物，含有表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素酸酯(GCG)等多种成分，其中EGCG研究尤为广泛。研究证明EGCG能够通过表观遗传、自噬等多种信号机制参与到细胞增殖、迁移和凋亡中，其中JNK通路是其作用的信号通路之一。现有专利CN111249272A公开了茶多酚在作为免疫检查点抑制剂及制备用于抗黑色素瘤的药物中的应用，但是，该专利是通过调节免疫细胞活性(免疫调节)达到对黑色素瘤细胞的抑制作用，仅能够抑制黑色素瘤细胞的生长，而难以起到同时抑制黑色素瘤细胞转移的效果。因此，研发一种能够同时抑制黑色素瘤增殖和迁移、抗黑色素瘤效果显著的方法具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有抗黑色素瘤的药物的缺陷和不足，提供一种治疗黑色素瘤的微针及其制备方法。
本发明的目的是提供一种茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物。
本发明另一目的是提供所述复合物的制备方法。
本发明另一目的是提供所述复合物或所述方法制备得到的复合物在制备治疗黑色素瘤的微针中的应用。
本发明另一目的是提供一种治疗黑色素瘤的微针。
本发明再一目的是提供所述微针的制备方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物，包括siBRAF纳米脂质体和茶多酚；所述siBRAF纳米脂质体和茶多酚的质量比为4～7：1。
优选地，所述siBRAF纳米脂质体和茶多酚的质量比为5.58：1。
本发明还提供了所述复合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将壳聚糖加入酸性溶液中室温搅拌4～6h后，得到A溶液，然后将用无水乙醇溶解的R8-C18、胆固醇和卵磷脂的混合溶液加入A溶液中，得到空白脂质体溶液；
S2.将siBRAF母液与步骤S1所得空白脂质体溶液混合，孵育，得到siBRAF纳米脂质体；
S3.按照所述质量比将步骤S2所得siBRAF纳米脂质体与茶多酚复配，即得所述茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物。
本发明设计了一种联合给药方案，将siBRAF纳米脂质体和茶多酚联合载入可溶性微针中，进行黑色素瘤的治疗；其中，siBRAF在脂质体的递送下成功进入黑色素瘤细胞内，实现沉默BRAF基因表达的作用，从而抑制BRAF-MEK-ERK通路，显著下调黑色素瘤的恶性增殖水平；茶多酚又能通过抑制JNK通路，下调黑色素瘤快速迁移的特性，达到全面遏制黑色素瘤发生、发展的疗效。
优选地，步骤S1所述壳聚糖、R8-C18、胆固醇和卵磷脂的质量比为7～8：1～2：1：19～20。
更优选地，步骤S1所述壳聚糖、R8-C18、胆固醇和卵磷脂的质量比为7.5：1.8：1：19.6。
优选地，步骤S1所述酸性溶液的浓度为0.05％～2％。
更优选地，步骤S1所述酸性溶液的浓度为0.1％。
优选地，步骤S1所述酸性溶液为乙酸溶液。
优选地，步骤S1所述搅拌的时间为4h。
优选地，步骤S1所述加入时的温度为50℃～60℃，加入的时间为1～3h。
更优选地，步骤S1所述加入时的温度为55℃，加入的时间为2h。
优选地，步骤S2所述siBRAF母液与空白脂质体溶液的混合体积比为5～20：4.4～17.6。
更优选地，步骤S2所述siBRAF母液与空白脂质体溶液的混合体积比为10：8.8。
优选地，步骤S2所述siBRAF的序列为：Sense：5'-AGAAUUGGAUCUGGAUCAU-3'；Antisense：5'-AUGAUCCAGAUCCAAUUCU-3'。
优选地，步骤S2所述siBRAF母液的浓度为20～40μM。
更优选地，步骤S2所述siBRAF母液的浓度为25μM。
优选地，步骤S2所述孵育的温度为20℃～30℃。
更优选地，步骤S2所述孵育的温度为25℃。
本发明通过以FAM-siRNA为模型药物进行细胞摄取实验，确定所制备的siBRAF纳米脂质体摄取能力强；通过对空白脂质体与lipo2000的细胞毒性比较，确定本发明所制备的空白脂质体具有细胞安全性；通过对siBRAF纳米脂质体处理后黑色素瘤细胞BRAF基因的mRNA表达水平测定，确定空白脂质体能够有效地递送siBRAF至细胞内并发挥药效；再将siBRAF纳米脂质体与茶多酚联合得到的茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物处理黑色素瘤细胞，对细胞增殖迁移的抑制效果俱佳；最后，将此复合物载入可溶性微针中，研究该微针的透皮行为，证明其透皮效果好；通过建立裸鼠黑色素瘤模型，给予微针处方，表明该微针能够显著下调黑色素瘤组织中BRAF基因的mRNA表达水平，抑制黑色素瘤的发生、发展，治疗黑色素瘤的效果显著。因此，所述复合物或所述方法制备得到的复合物在制备治疗黑色素瘤的微针中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种治疗黑色素瘤的微针，包括针尖部分和基座部分，所述针尖部分包括含有所述茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的针尖基质，所述基座部分包含基座基质。
所述微针的制备方法，包括以下步骤：
S11.将羟丙基-β-环糊精、透明质酸钠和所述茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物溶解于DEPC水中，混合均匀，得到针尖基质；
S12.将葡聚糖40、分子量为34KD的透明质酸钠和分子量200～400KD的透明质酸钠按照质量比为0.5～1.5：0.5～2：0.5～1.5溶解于DEPC水中，混合均匀，得到基座基质；
S13.将步骤S11所得针尖基质均匀充满微针的针尖部分后，将步骤S12所得基座基质铺平微针的基座部分，干燥，即得所述治疗黑色素瘤的微针。
优选地，步骤S11所述羟丙基-β-环糊精、透明质酸钠和茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的质量比为2～4：3～5：1～3。
更优选地，步骤S11所述羟丙基-β-环糊精、透明质酸钠和所述茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的质量比为3：4：2。
优选地，步骤S12所述葡聚糖40、分子量为34KD的透明质酸钠和分子量200～400KD的透明质酸钠的质量比为1：1：1。
优选地，步骤S13所述干燥的温度为0℃～6℃。
更优选地，步骤S13所述干燥的温度为4℃。
优选地，步骤S13所述干燥的时间为12～72h。
更优选地，步骤S13所述干燥的时间为24h。
本发明具有以下有益效果：
本发明首先制备了一种高效递送siBRAF的脂质体，该siBRAF纳米脂质体能够有效地保护siBRAF不被降解，并成功进入黑色素瘤细胞中实现基因沉默作用；另外，茶多酚作用于JNK通路，能够影响黑色素瘤细胞的迁移；将siBRAF纳米脂质体和茶多酚联合给药，两者具有协同增效的作用，制备得到的茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物能够同时实现抑制黑色素瘤细胞恶性增殖和快速迁移的作用。
本发明将此复合物载入可溶性微针，制备得到了一种治疗黑色素瘤的微针，利用微针在皮肤表面形成微型孔道，促进该复合物在皮肤中的透过和滞留，更好地进入皮下黑色素瘤组织中，对于治疗黑色素瘤具有优良的增效作用；且该微针的黑色素瘤细胞靶向强、皮肤透过量高、成分简单、制备方便，具有功能全面且抑制黑色素瘤生长效果显著等优点，在皮下黑色素瘤治疗中具有很好的应用前景。
附图说明
图1是A375细胞摄取FAM-siRNA的结果图。
图2是载体在A375细胞和HaCaT细胞上的安全性结果图；其中，(A)图是载体在A375细胞上的安全性结果；(B)图是载体在HaCaT细胞上的安全性结果；*表示与对照组相比，P<0.05。
图3是BRAF基因的mRNA表达水平结果图。其中，*表示与对照组相比，P<0.05。
图4是茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物抑制黑色素瘤细胞增殖结果图。其中，*表示与茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物组相比，P<0.05。
图5是茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物抑制黑色素瘤细胞迁移结果图。
图6是微针皮肤透过能力的考察结果图。
图7是载有茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的微针对黑色素瘤模型裸鼠的治疗效果图；其中，(A)图为黑色素瘤生长曲线；(B)图为给药后第九天黑色素瘤的形态；(C)图为黑色素瘤组织中BRAF基因的mRNA表达水平测定结果；*表示与对照组相比，P<0.05。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中的所有工具、器皿提前除去核酸酶，制备用水均采用DEPC水。
实施例1治疗黑色素瘤的微针的制备
1、茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的制备
一种茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将壳聚糖加入0.1％乙酸溶液中室温搅拌5h后，得到A溶液，然后将用无水乙醇溶解的R8-C18、胆固醇和卵磷脂的混合溶液55℃边搅拌2h边加入A溶液中，得到轻微乳白色均一稳定的空白脂质体溶液；
S2.将浓度为25μM的siBRAF母液与步骤S1所得空白脂质体溶液混合，25℃孵育，得到均一稳定的siBRAF纳米脂质体；
S3.按照质量比将步骤S2所得siBRAF纳米脂质体与茶多酚复配，即得茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物。
其中，步骤S1壳聚糖、R8-C18、胆固醇和卵磷脂的质量比为7.5：1.8：1：19.6；步骤S2 siBRAF母液与空白脂质体溶液的混合体积比为10：8.8；步骤S3siBRAF纳米脂质体和茶多酚的质量比为5.58：1。
2、治疗黑色素瘤的微针的制备
一种治疗黑色素瘤的微针，其制备方法包括以下步骤：
S11.取羟丙基-β-环糊精分散于DEPC水中，加入透明质酸钠(分子量34KD)，搅拌至充分溶解，再加入实施例1制备得到的茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物，搅拌至混合均匀，得到针尖基质；
S12.取葡聚糖40分散于DEPC水中，加热至80℃使其溶解，待葡聚糖40溶液冷却至室温，取分子量为34KD的透明质酸钠和分子量200～400KD的透明质酸钠加入葡聚糖40溶液中，搅拌溶解，得到基座基质；
S13.将步骤S11所得针尖基质注入微针模具中，通过离心并倒转6次使针尖基质均匀充满微针模具的针尖部分，然后加入步骤S12所得基座基质，离心使得基座基质铺平微针模具的基座部分，4℃干燥24h，即得治疗黑色素瘤的微针。
其中，步骤S11所述羟丙基-β-环糊精、透明质酸钠和茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的质量比为3：4：2；步骤S12所述葡聚糖40、分子量为34KD的透明质酸钠和分子量200～400KD的透明质酸钠的质量比为1：1：1。
实施例2治疗黑色素瘤的微针的制备
1、茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的制备
一种茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将壳聚糖加入0.05％乙酸溶液中室温搅拌4h后，得到A溶液，然后将用无水乙醇溶解的R8-C18、胆固醇和卵磷脂的混合溶液50℃边搅拌1h边加入A溶液中，得到轻微乳白色均一稳定的空白脂质体溶液；
S2.将浓度为40μM的siBRAF母液与步骤S1所得空白脂质体溶液混合，30℃孵育，得到均一稳定的siBRAF纳米脂质体；
S3.按照质量比将步骤S2所得siBRAF纳米脂质体与茶多酚复配，即得茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物。
其中，步骤S1壳聚糖、R8-C18、胆固醇和卵磷脂的质量比为7：1：1：19；步骤S2siBRAF母液与空白脂质体溶液的混合体积比为5：4.4；步骤S3 siBRAF纳米脂质体和茶多酚的质量比为4：1。
2、治疗黑色素瘤的微针的制备
一种治疗黑色素瘤的微针，其制备方法包括以下步骤：
S11.取羟丙基-β-环糊精分散于DEPC水中，加入透明质酸钠(分子量34KD)，搅拌至充分溶解，再加入实施例1制备得到的茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物，搅拌至混合均匀，得到针尖基质；
S12.取葡聚糖40分散于DEPC水中，加热至80℃使其溶解，待葡聚糖40溶液冷却至室温，取分子量为34KD的透明质酸钠和分子量200～400KD的透明质酸钠加入葡聚糖40溶液中，搅拌溶解，得到基座基质；
S13.将步骤S11所得针尖基质注入微针模具中，通过离心并倒转6次使针尖基质均匀充满微针模具的针尖部分，然后加入步骤S12所得基座基质，离心使得基座基质铺平微针模具的基座部分，6℃干燥72h，即得治疗黑色素瘤的微针。
其中，步骤S11所述羟丙基-β-环糊精、透明质酸钠和茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的质量比为2：3：1；步骤S12所述葡聚糖40、分子量为34KD的透明质酸钠和分子量200～400KD的透明质酸钠的质量比为0.5：0.5：0.5。
实施例3治疗黑色素瘤的微针的制备
1、茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的制备
一种茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将壳聚糖加入2％乙酸溶液中室温搅拌6h后，得到A溶液，然后将用无水乙醇溶解的R8-C18、胆固醇和卵磷脂的混合溶液60℃边搅拌3h边加入A溶液中，得到轻微乳白色均一稳定的空白脂质体溶液；
S2.将浓度为20μM的siBRAF母液与步骤S1所得空白脂质体溶液混合，20℃孵育，得到均一稳定的siBRAF纳米脂质体；
S3.按照质量比将步骤S2所得siBRAF纳米脂质体与茶多酚复配，即得茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物。
其中，步骤S1壳聚糖、R8-C18、胆固醇和卵磷脂的质量比为8：2：1：20；步骤S2siBRAF母液与空白脂质体溶液的混合体积比为20：17.6；步骤S3 siBRAF纳米脂质体和茶多酚的质量比为7：1。
2、治疗黑色素瘤的微针的制备
一种治疗黑色素瘤的微针，其制备方法包括以下步骤：
S11.取羟丙基-β-环糊精分散于DEPC水中，加入透明质酸钠(分子量34KD)，搅拌至充分溶解，再加入实施例1制备得到的茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物，搅拌至混合均匀，得到针尖基质；
S12.取葡聚糖40分散于DEPC水中，加热至80℃使其溶解，待葡聚糖40溶液冷却至室温，取分子量为34KD的透明质酸钠和分子量200～400KD的透明质酸钠加入葡聚糖40溶液中，搅拌溶解，得到基座基质；
S13.将步骤S11所得针尖基质注入微针模具中，通过离心并倒转6次使针尖基质均匀充满微针模具的针尖部分，然后加入步骤S12所得基座基质，离心使得基座基质铺平微针模具的基座部分，0℃干燥12h，即得治疗黑色素瘤的微针。
其中，步骤S11所述羟丙基-β-环糊精、透明质酸钠和茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的质量比为4：5：3；步骤S12所述葡聚糖40、分子量为34KD的透明质酸钠和分子量200～400KD的透明质酸钠的质量比为1.5：2：1.5。
实施例4治疗黑色素瘤的微针的制备
1、茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的制备
一种茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将壳聚糖加入2％乙酸溶液中室温搅拌6h后，得到A溶液，然后将用无水乙醇溶解的R8-C18、胆固醇和卵磷脂的混合溶液60℃边搅拌3h边加入A溶液中，得到轻微乳白色均一稳定的空白脂质体溶液；
S2.将浓度为40μM的siBRAF母液与步骤S1所得空白脂质体溶液混合，28℃孵育，得到均一稳定的siBRAF纳米脂质体；
S3.按照质量比将步骤S2所得siBRAF纳米脂质体与茶多酚复配，即得茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物。
其中，步骤S1壳聚糖、R8-C18、胆固醇和卵磷脂的质量比为7：1：1：19；步骤S2siBRAF母液与空白脂质体溶液的混合体积比为5：4.4；步骤S3 siBRAF纳米脂质体和茶多酚的质量比为4：1。
2、治疗黑色素瘤的微针的制备
一种治疗黑色素瘤的微针，其制备方法包括以下步骤：
S11.取羟丙基-β-环糊精分散于DEPC水中，加入透明质酸钠(分子量34KD)，搅拌至充分溶解，再加入实施例1制备得到的茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物，搅拌至混合均匀，得到针尖基质；
S12.取葡聚糖40分散于DEPC水中，加热至80℃使其溶解，待葡聚糖40溶液冷却至室温，取分子量为34KD的透明质酸钠和分子量200～400KD的透明质酸钠加入葡聚糖40溶液中，搅拌溶解，得到基座基质；
S13.将步骤S11所得针尖基质注入微针模具中，通过离心并倒转6次使针尖基质均匀充满微针模具的针尖部分，然后加入步骤S12所得基座基质，离心使得基座基质铺平微针模具的基座部分，0℃干燥12h，即得治疗黑色素瘤的微针。
其中，步骤S11所述羟丙基-β-环糊精、透明质酸钠和茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的质量比为2：3：1；步骤S12所述葡聚糖40、分子量为34KD的透明质酸钠和分子量200～400KD的透明质酸钠的质量比为0.5：0.5：0.5。
以下以实施例1为例，对本发明实施例1～4制备得到的siBRAF纳米脂质体递送siBRAF入胞的能力进行考察，并对茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物在细胞学和肿瘤学层面治疗黑色素瘤的疗效进行评价，具体的实验方法和结果如下：
应用例1 siBRAF纳米脂质体递送siBRAF入胞能力的考察
1、细胞摄取
(1)实验方法
采用人源黑色素瘤细胞A375作为模型细胞，使用激光共聚焦显微镜观察细胞对siBRAF的摄取，比较不同载体递送siBRAF入胞的情况。
由于siBRAF本身不带有荧光，不易观察，因此采用FAM-siRNA(显绿色荧光)作为模型药物。培养A375细胞至其处于对数生长期时，将细胞用胰酶消化后离心，加培养基重悬后进行计数，细胞以1×105/皿的密度接种在激光共聚焦皿中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h使其完全贴壁。24h后，弃去培养基，并用PBS洗三遍。然后分别加入1mL含有FAM-siRNA的无血清的DMEM作为空白对照(FAM-siRNA组)、1mL含有FAM-siRNA纳米脂质体组的无血清DMEM(FAM-siRNA纳米脂质体组)、1mL含有FAM-siRNA-lipo2000复合物组的无血清DMEM(FAM-siRNA-lipo2000复合物组)，置于培养箱中孵育6h。弃去含药的培养基，细胞用预冷PBS洗三次后，加入4％多聚甲醛溶液浸润15min固定细胞，最后加入4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI溶液)染色10min使细胞核染成蓝色，再用预冷PBS清洗三次。整个操作过程保持避光。最后用激光共聚焦显微镜观察并拍照。
(2)实验结果
A375细胞摄取FAM-siRNA的结果如图1所示，可以看出，FAM-siRNA组几乎未出现荧光，即FAM-siRNA不载入载体中几乎不能进入细胞中；FAM-siRNA纳米脂质体组细胞核附近出现明显的绿色荧光，说明FAM-siRNA在脂质体的帮助下可成功地被A375细胞摄取，且荧光强度显著强于FAM-siRNA-lipo2000复合物组。说明本发明制备得到的siBRAF纳米脂质体的细胞摄取情况显著优于市售经典转染试剂lipo2000，有利于siBRAF进入细胞并发挥作用。
2、载体安全性
(1)实验方法
目前市场上的基因载体的局限性之一在于较难实现高的siRNA递送效率和载体安全性。为了探究本发明脂质体的安全性，选择人类永生化表皮细胞HaCaT和人源黑色素瘤细胞A375作为模型细胞，进行MTT实验，比较本发明脂质体与市售经典转染试剂lipo2000的细胞毒性大小。
培养HaCaT细胞和A375细胞至其处于对数生长期时，分布将细胞用胰酶消化后离心，加培养基重悬后进行计数，HaCaT细胞以7000/孔的密度接种96孔板中，A375细胞以8000/孔的密度接种96孔板中，均置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h使其完全贴壁。24h后，弃去培养基。两种细胞模型均设置三个组别进行处理，每个组别六个重复孔。对照组每孔加入100μL无血清的DMEM，空白脂质体组每孔加入100μL含有脂质体的无血清DMEM，lipo2000组每孔加入100μL含有lipo2000的无血清DMEM。两种细胞均置于培养箱中孵育48h。48h后，弃去培养基，每孔细胞中加入120uLMTT溶液，置于培养箱避光孵育4h。4h后，弃去MTT溶液，每孔加入150uLDMSO，置于摇床10min，上机检测吸光度。
(2)实验结果
载体在A375细胞和HaCaT细胞上的安全性结果如图2所示，其中，(A)图是载体在A375细胞上的安全性结果；(B)图是载体在HaCaT细胞上的安全性结果；可以看出，空白脂质体组的A375细胞和HaCaT细胞存活率均在90％以上，而lipo2000组的A375细胞和HaCaT细胞存活率显著降低(仅为65％左右)。说明本发明脂质体作为载体是安全的，而市售经典转染试剂lipo2000具有一定的细胞毒性。
3、体外基因沉默
(1)实验方法
为了考察不同载体(对照组每孔加入1mL无血清的DMEM、siBRAF纳米脂质体组每孔加入1mL含有siBRAF纳米脂质体的无血清DMEM、siBRAF-lipo2000复合物组每孔加入1mL含有siBRAF-lipo2000复合物的无血清DMEM)递送siBRAF的效率，进行RT-qPCR实验，探究经siBRAF纳米脂质体处理后，人源黑色素瘤细胞A375中BRAF基因的mRNA表达水平。
(2)实验结果
BRAF基因的mRNA表达水平结果如图3所示，可以看出，与没有进行BRAF基因干扰的对照组相比，siBRAF纳米脂质体组、siBRAF-lipo2000复合物组A375细胞中BRAF基因的mRNA表达水平显著降低(约下调55％)，且两组之间无统计学差异。说明本发明siBRAF纳米脂质体与lipo2000在显著下调黑色素瘤细胞中BRAF基因表达水平上效果相当。
应用例2茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物抑制黑色素瘤细胞增殖、迁移能力的考察
1、茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物抑制黑色素瘤细胞增殖
(1)实验方法
选择人源黑色素瘤细胞A375作为模型细胞，进行MTT实验。培养A375细胞至其处于对数生长期时，将细胞用胰酶消化后离心，加培养基重悬后进行计数，A375细胞以8000/孔的密度接种96孔板中，均置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h使其完全贴壁。24h后，弃去培养基。设置四个组别进行处理，每个组别六个重复孔。对照组每孔加入100μL无血清的DMEM，茶多酚组每孔加入100μL含有茶多酚的无血清DMEM，siBRAF纳米脂质体组每孔加入100μL含有siBRAF纳米脂质体的无血清DMEM，茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物组每孔加入100μL实施例1制备得到的茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物。置于培养箱中孵育48h。48h后，弃去培养基，每孔细胞中加入120uLMTT溶液，置于培养箱避光孵育4h。4h后，弃去MTT溶液，每孔加入150uL DMSO，置于摇床10min，上机检测吸光度。
(2)实验结果
茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物抑制黑色素瘤细胞增殖结果如图4所示，可以看出，茶多酚组对A375细胞增殖的抑制效率约为35.1％，siBRAF纳米脂质体组对A375细胞增殖的抑制效率约为35.2％，而茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物组对A375细胞增殖的抑制效率高达57.6％，茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物组对A375细胞增殖的抑制效果显著优于茶多酚组和siBRAF纳米脂质体组。说明茶多酚与siBRAF纳米脂质体联合给药(茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物)对黑色素瘤细胞的增殖抑制作用具有协同效果。
2、茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物抑制黑色素瘤细胞迁移
(1)实验方法
采用人源黑色素瘤细胞A375作为模型细胞，进行划痕实验。培养A375细胞至其处于对数生长期时，将细胞用胰酶消化后离心，加培养基重悬后进行计数，以1×105/皿的密度接种6孔板中，均置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h使其完全贴壁。24h后，细胞融合度达到90％的时候，用灭菌枪头在六孔板上划垂直于水平线的细胞划痕，用PBS洗三次完全除去划痕脱落下来的细胞。设置四个组别进行处理，对照组每孔加入2mL无血清的DMEM，茶多酚组每孔加入2mL含有茶多酚的无血清DMEM，siBRAF纳米脂质体组每孔加入2mL含有siBRAF纳米脂质体的无血清DMEM，茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物组每孔加入2mL实施例1制备得到的茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物。继续孵育，以细胞0h，48h拍照，随机在各个时间点的每个孔的不同位置记录划痕宽度。
(2)实验结果
茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物抑制黑色素瘤细胞迁移结果如图5所示，可以看出，当划痕愈合时间达48h时，对照组的痕道明显变窄，A375细胞迁移最快；siBRAF纳米脂质体组、茶多酚组痕道也有一定程度愈合，但没有对照组明显，说明siBRAF纳米脂质体或茶多酚单独给药对A375细胞迁移有一定的抑制，但效果不理想；而茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物组A375细胞痕道宽度几乎与0h相近，基本未愈合，细胞迁移受到显著地抑制。说明茶多酚与siBRAF纳米脂质体联合给药(茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物)对黑色素瘤细胞迁移的抑制作用具有协同效果。
应用例3微针皮肤透过能力的考察
1、实验方法
因siBRAF纳米脂质体和茶多酚均是水溶性药物分子，因此选择水溶性荧光探针(罗丹明B)作为模型药物，采用激光共聚焦显微镜观察微针中罗丹明B在皮肤中的分布。
将BALB/c小鼠用20％乌拉坦麻醉，用电动剃毛器剃去腹部毛发后，使用脱毛膏进行脱毛，待皮肤修复24h后进行后续实验。用20％的乌拉坦麻醉小鼠，将其固定于鼠板上，设置两个组别。水溶液组用502胶水将扩散池的供给池(给药面积为3.14cm2)粘贴于小鼠腹部皮肤上，于避光处在供给池中给予500μL罗丹明B溶液，并使其均匀地分布在供给池中，用封口膜及锡纸封闭供给池上端，防止水分挥发；微针组于避光处通过手动按压的方式，将载有罗丹明B的微针扎于小鼠腹部皮肤上。两组同时进行6h的在体透皮行为探究。6h后，使用颈椎脱臼法处死小鼠，用沾有水和甲醇的棉球各擦拭3次，迅速取下皮肤。用手术剪将给药部位皮肤剪成约2mm×5mm的小块，用OCT冰冻切片包埋剂包埋后，在冰冻切片机上将皮肤纵切，切片厚度为20μm，将所得的皮肤切片样本粘附于载玻片上。冰冻皮肤切片样本，置于激光共聚焦显微镜下观察皮肤中罗丹明B的分布。
2、实验结果
微针皮肤透过能力的考察结果如图6所示，可以看出，水溶液组红色荧光仅停留在皮肤表面角质层部位，而微针组红色荧光分布于整个皮肤纵切面，罗丹明B通过微针的刺入能够递送至皮肤深层。说明微针递送罗丹明B的效率显著优于水溶液，微针有利于水溶性药物透过皮肤进入黑色素瘤组织内发挥药效。
应用例5载有茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的微针对黑色素瘤模型裸鼠的治疗效果
1、实验方法
(1)黑色素瘤裸鼠模型的建立
当在显微镜下观察人源黑色素瘤细胞A375铺满培养皿的70％-80％时，对细胞进行传代。得到细胞沉淀后，加入一定量的完全DMEM培养基稀释细胞质，吹打均匀后，从中取出10μL的细胞悬液，利用血细胞计数板进行计数，计数完成后，用PBS缓冲液重悬细胞，按2×105/100μL的细胞密度将细胞悬液分别置于小体积EP管中，将装有细胞的EP管置于冰上，备用。用1mL无菌胰岛素注射器将EP管里的细胞悬液，对裸鼠进行右侧腋下部位皮肤的皮下注射(2×105/100μL)，注射当天为造模方案的第1天。
(2)黑色素瘤裸鼠模型给药方案的建立
在黑色素瘤细胞接种后第十天，黑色素瘤体积约为60mm3，随机将裸鼠分为5组，每组4只，分别为模型组(不给药)，空白脂质体组(加入空白脂质体)，siBRAF纳米脂质体组(只加入siBRAF纳米脂质体)，茶多酚组(只加入茶多酚)和茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物组(加入茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物)。从接种后第十天，模型组不作任何处理，空白脂质体组，siBRAF纳米脂质体组，茶多酚组和茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物组连续注射给药9天，每天一次。给药第1，3，5，7，9天，利用游标卡尺分别测定黑色素瘤部位的长径和短径，代入公式中，计算即可得到黑色素瘤的体积。第九天后停止给药并观察一天，处死动物模型，取出黑色素瘤组织进行相关分析。黑色素瘤体积的具体计算公式如下：
黑色素瘤体积(mm3)＝π×length×width2/6；其中，length代表肿瘤较长的两点之间的距离，width代表肿瘤较短的两点之间的距离。
2、实验结果
载有茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的微针对黑色素瘤模型裸鼠的治疗效果如图7所示，其中，(A)图为黑色素瘤生长曲线；(B)图为给药后第九天黑色素瘤的形态；(C)图为黑色素瘤组织中BRAF基因的mRNA表达水平测定结果。从(A)图和(B)图可以看出，给药第九天，对照组黑色素瘤体积最大，空白脂质体组与对照组黑色素瘤体积相近，siBRAF纳米脂质体组和茶多酚组的黑色素瘤体积有一定程度减小，而茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物组的黑色素瘤体积显著低于siBRAF纳米脂质体组和茶多酚组。说明茶多酚与siBRAF纳米脂质体联合给药(茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物)对抑制黑色素瘤细胞的生长，进而治疗黑色素瘤具有协同效果。
从(C)图可以看出，siBRAF纳米脂质体组和茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物组黑色素瘤组织中BRAF基因的mRNA表达均下调至50％，且两组间没有统计学差异；而茶多酚组黑色素瘤组织中BRAF基因的mRNA表达水平与对照组无明显差异。说明茶多酚没有产生BRAF基因沉默的作用，而茶多酚对于黑色素瘤细胞的增殖、迁移都有明显的抑制作用，且茶多酚与siBRAF纳米脂质体联合给药(茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物)既有下调黑色素瘤细胞增殖作用，又能够抑制黑色素瘤细胞迁移，对遏制黑色素瘤有着重要的临床意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物，其特征在于，由siBRAF纳米脂质体和茶多酚组成；所述siBRAF纳米脂质体和茶多酚的质量比为4～7：1；
所述siBRAF纳米脂质体由siBRAF、R8-C18、胆固醇和卵磷脂制备得到；
所述复合物的制备方法包括以下步骤：
S1. 将壳聚糖加入酸性溶液中搅拌4～6 h后，得到A溶液，然后将用无水乙醇溶解的R8-C18、胆固醇和卵磷脂的混合溶液加入A溶液中，得到空白脂质体溶液；
S2. 将siBRAF母液与步骤S1所得空白脂质体溶液混合，孵育，得到siBRAF纳米脂质体；
S3. 按照质量比将步骤S2所得siBRAF纳米脂质体与茶多酚复配，即得所述茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物；
其中，步骤S1所述壳聚糖、R8-C18、胆固醇和卵磷脂的质量比为7～8：1～2 ：1 ：19～20；步骤S2所述siBRAF母液与空白脂质体溶液的混合体积比为5～20：4.4～17.6；步骤S2所述siBRAF的序列为：Sense：5'-AGAAUUGGAUCUGGA UCAU-3'；Antisense：5'-AUGAUCCAGAUCCAAUUCU-3'。
2. 根据权利要求1所述茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物，其特征在于，步骤S2所述siBRAF母液的浓度为20～40 μM。
3.根据权利要求1所述茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物，其特征在于，步骤S2所述孵育的温度为20℃～30℃。
4.权利要求1~3任一所述茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物在制备治疗黑色素瘤的微针中的应用。
5.一种治疗黑色素瘤的微针，其特征在于，包括针尖部分和基座部分，所述针尖部分包括含有权利要求1~3任一所述茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的针尖基质，所述基座部分包含基座基质。
6.权利要求5所述微针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11. 将羟丙基-β-环糊精、透明质酸钠和权利要求1~3任一所述茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物溶解于DEPC水中，混合均匀，得到针尖基质；
S12. 将葡聚糖40、分子量为34KD的透明质酸钠和分子量200～400KD的透明质酸钠按照质量比为0.5～1.5：0.5～2：0.5～1.5溶解于DEPC水中，混合均匀，得到基座基质；
S13. 将步骤S11所得针尖基质均匀充满微针的针尖部分后，将步骤S12所得基座基质铺平微针的基座部分，干燥，即得所述治疗黑色素瘤的微针；
其中，步骤S11所述羟丙基-β-环糊精、透明质酸钠和茶多酚-siBRAF纳米脂质体复合物的质量比为2～4：3～5：1～3。
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