CN114258404A - 抗IgE构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蛋白质构建体，所述蛋白质构建体包含：a)至少两个单体，每个单体均包含CD23的C型凝集素结构域，其中每个单体均可与IgE结合；和b)可与新生儿Fc受体(FcRn)结合的实体；其中所述蛋白质构建体包含接头，并且其中所述接头用于将包含CD23的C型凝集素结构域的所述单体连接至可与FcRn结合的所述实体。还提供了所述构建体例如在抗IgE疗法中或用于治疗或预防IgE相关疾病或病状的治疗用途。

Description

抗IgE构建体
本发明涉及一种新型蛋白质构建体，该蛋白质构建体具有与IgE结合并且也与FcRn结合的能力。此类构建体或分子将在抗IgE疗法中具有治疗用途并可能提供优于现有疗法的显著益处。
治疗性抗体领域已经对患者的生活产生变革作用，许多患者先前没有有效的临床选择。与传统药物相比，单克隆抗体治疗剂具有许多显著优势，包括突出的靶标特异性和在患者体内相对长的半衰期。然而，目前仍然存在大量的疾病、潜在靶标和治疗机会，无论是单克隆抗体还是新形式都无法解决，例如这是由于高靶标周转率或高水平表达的靶标。下一代基于抗体的治疗剂必须克服许多当前这些限制，以合理的成本实现并为患者所接受。
靶标介导的药物处置(TMDD)是抗体治疗剂在患者中的熟知特性。在健康受试者中，治疗性单克隆抗体的药代动力学行为与正常IgG非常相似，半衰期为21-23天(Lowe等人，Basic Clin Pharm Tox 106；195-209,2009)。在可溶性配体的存在下，治疗性单克隆抗体的半衰期向靶配体的半衰期转变。因此，对于半衰期短的可溶性靶配体，抗体-配体复合物相对快地从循环中清除(Lowe等人，同上)。这种现象给单克隆抗体带来问题。对于快速周转的靶配体(例如趋化因子、一些免疫球蛋白如IgE和细胞因子)，还有对于高水平表达的靶标，可用于快速螯合配体的单克隆抗体的量变得有限并且意味着单克隆抗体必须以相应高的量或以增加的频率施用以便维持适当的抗体与配体比率以达到所需效果。
对于抗体治疗剂，这尤其成问题，因为它们通常通过皮下或静脉注射施用。对于患者而言，需要施用的药物量可成为无法接受的负担并且对患者依从性和疗法持续性具有显著影响。在这方面，大多数单克隆抗体商业制剂的固有溶解度在100-150mg/mL之间，而皮下施用的每个注射部位的最大耐受注射量为约1mL。这些特性为不借助静脉输注的单克隆抗体药物施用剂量设定了自然极限。
然而，对于正常体重患者中甚至中等高水平或中等快速周转的靶配体，这可能意味着频繁间隔(例如每2至4周)多次高容量注射(例如多次1ml注射)以螯合靶配体达到功效所需的程度。这对患者和医疗保健系统来说变得非常繁重。
因此，治疗性抗体的最新趋势是开发非常高亲和力的抗体，以在接近1:1的抗体:配体比率下实现中和，作为实现优良功效和降低患者剂量的手段。然而，此类高亲和力抗体常常会遭受其他问题，诸如溶解度损失或其他物理化学特性降低。
因此，需要针对具有快速周转率的靶配体还有高水平表达的靶标所遇到的问题的替代解决方案。另外，对于所有靶标而言，可以减小剂量体积或施用频率的替代手段将代表本领域中受欢迎的进步并且可能对疗法产生变革作用。
如以上所提到的，IgE是这些困难靶标之一的一个实例。IgE在过敏中起关键作用，一般来说，过敏症发生在身体对其他无害物质做出应答时。诸如哮喘、鼻炎、湿疹和食物过敏等过敏性疾病在世界范围内变得越来越普遍并为医疗保健系统带来了重大负担。IgE在过敏中起核心作用并与两种受体相互作用；所谓的“高”亲和力受体FcεRI和所谓的“低”亲和力受体CD23(也称为FcεRII)。
高亲和力IgE受体FcεRI发现于诸如肥大细胞和嗜碱性粒细胞等细胞类型上(Sutton和Gould,2008,Nat.Rev.Immunol.,8,205；Sutton和Davies,2015,Immunol.Rev.268:222-235)。过敏原与FcεRI结合的IgE的交联导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱粒，以及炎症介质诸如组胺、细胞因子/趋化因子和蛋白酶的释放。
以低μM亲和力与游离IgE结合的低亲和力IgE受体CD23(FcεRII)发现于多种细胞类型上，包括B细胞、活化巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、树突细胞、血小板和内皮细胞。CD23具有C型凝集素“头部”结构域，通过“茎”结构域连接到细胞膜，接着在N端具有短的细胞内/细胞质“尾部”结构域。CD23的膜结合形式(也称为mCD23)是大约45kDa的II型跨膜糖蛋白并且通常以三聚体形式被发现，其中所述头部结构域中的三个通过三个单独的茎结构域连接到膜上，一起形成三聚α螺旋卷曲螺旋茎。据信CD23具有多种生物学作用，包括通过形成IgE免疫复合物使过敏原跨上皮细胞转胞吞中的作用。CD23还在抗原呈递以及经由CD21结合进行IgE应答调控中发挥作用。人CD23具有两个同种型：CD23a(胞吞作用)和CD23b(吞噬作用)，它们的细胞质结构域不同并且因此信号传导特性不同。
可溶性CD23(也称为sCD23)是通过从细胞表面裂解mCD23形成的。sCD23是一种易溶性蛋白质，它仍然可以参与生物过程和功能，例如配体结合，尤其是与IgE的结合。一系列易溶性CD23(sCD23)蛋白质是天然发现的，例如37kDa、33kDa、25kDa和16kDa的蛋白质，其全部结合IgE并具有细胞因子样活性。一种可造成CD23从细胞中释放的蛋白酶是金属蛋白酶ADAM10，它在人CD23中丙氨酸80(A80)的C端侧裂解以生成37kDa sCD23分子，或在精氨酸101(R101)的C端侧裂解以生成33kDa物质(Lemieux等人，J.Biol.Chem.,2007,282:14836-14844)。另一天然存在的sCD23片段是derCD23，它是通过屋尘螨Dermatophagoidespterronysinus粪便中发现的der p1蛋白酶的作用产生的。der p1蛋白酶在人CD23中的丝氨酸155(S155)和丝氨酸156(S156)之间以及谷氨酸298(E298)和丝氨酸299(S299)之间裂解，产生16kDa derCD23片段，该片段是单体而非三聚体(Schultz等人，1997,Eur.J.Immunol.27:584-588)。
FcεRI和CD23(FcεRII)在不同位点与IgE结合(Dhaliwal等人，2017,Sci.Rep.7,45533)。结合受变构调控，使得IgE不能同时结合两种类型的受体(Dhaliwal等人，2017，同上)。IgE的恒定区3(Cε3)是FcεRI和CD23与IgE结合的关键。在这方面，当Cε3结构域采用所谓的“开放”构象时，FcεRI与IgE结合，而当Cε3结构域采用所谓的“闭合”构象时，CD23与IgE结合。重要的是，CD23与IgE结合可以将IgE锁定呈闭合构象，从而防止IgE与FcεRI结合。一般而言，两个单独的CD23分子(例如两个CD23单体或两个CD23三聚体)与闭合构象的IgE结合；一个CD23分子与IgE Fc二聚体两条链中的每一条中的Cε3结构域结合。
在批准用于抗IgE疗法的药物方面的当前基准是奥马珠单抗(Omalizumab)(
Figure BDA0003490186210000031
Novartis)，奥马珠单抗是一种抗IgE单克隆IgG1抗体(Holgate等人，2005,J.Allergy Clin.Immunol.115,459-465)。奥马珠单抗通过与游离IgE结合并阻止其与FcεRI结合(即通过竞争性抑制)起作用，从而阻止肥大细胞脱粒和嗜碱性粒细胞活化。奥马珠单抗已被批准用于治疗严重的持续性过敏性哮喘和慢性特发性荨麻疹。它根据基于体重和血液中IgE基线水平的定量表施用。然而，其中等结合亲和力需要显著的药物过量才能实现对IgE的有效阻抑，从而导致复杂的给药和次优的临床结果。利格利珠单抗(Ligelizumab)是正处于后期开发并且已经因其与IgE的高亲和力结合而开发的另一抗IgE单克隆抗体。然而，作用机制与奥马珠单抗相同且高亲和力结合并未解决所有问题。例如，如上所述，高亲和力结合可能导致药物经由靶标介导的药物处置(TMDD)快速消耗，因此需要比预期更高和更频繁的剂量(Arm等人，2014,Clinical and Experimental Allergy,44:1371-1385)。造成IgE本身快速清除的机制知之甚少。可能IgE受体对IgE的摄取在其消耗以及内吞摄取和通过溶酶体降解途径的降解中起作用，因为IgE不具有FcRn结合(Lawrence等人，J.AllergyClin.Immunol.,2017,139(2):422-428)。
FcRn是一种1型膜糖蛋白，主要在酸性细胞内隔室(诸如内体)中表达(Sand等人，2015,Frontiers in Immunol.5,article 682；Grevys等人，2018,Nat.Commun.9:621-635)。FcRn的已知作用之一是在胞吞作用后使某些分子(诸如IgG或白蛋白)再循环回到血清中。例如，FcRn与IgG的Fc区在CH2-CH3结构域界面以2:1的化学计量相互作用(即一个IgG-Fc分子与两个FcRn分子结合)。再循环受IgG-Fc与FcRn的pH依赖性结合促进。在这方面，IgG-Fc在pH 6.0/6.5下以高亲和力结合FcRn，但在pH 7.4下不会。这样，FcRn在酸化内体中与IgG结合(经由IgG-Fc区)，但IgG然后在生理/中性pH下与FcRn解离，例如当含有FcRn-IgG复合物的再循环内体与细胞膜融合，从而将IgG释放回血清中时(Roopenian和Akilesh,2007,Nat.Rev.Immuno.7:715-725；Sand等人，2015，同上；Grevys等人，2018，同上)。
这样，诸如奥马珠单抗等治疗性抗体的IgG亚型在一定程度上再循环回到循环中。然而，如上所讨论的，当前抗IgE疗法存在某些需要解决的缺点。例如，尽管奥马珠单抗疗法有效，但抗体疗法昂贵并且需要高剂量的奥马珠单抗来靶向和阻断存在的所有游离IgE分子。尽管这个问题可以潜在地通过例如产生具有更高亲和力的抗体(诸如利格利珠单抗)稍微得到缓解，但过敏中游离IgE的量仍然是提出重大问题。另外，如上所讨论的，由于TMDD，许多治疗性抗IgE抗体被快速清除。因此，当药物从体内清除时，需要重复剂量的药物。尽管一些药物如上所述经由FcRn再循环，但一些再循环的药物可能仍与IgE靶标结合，导致血清中IgE-抗IgE复合物水平升高(Lawrence等人，2017，同上)，所以这并未缓解需要重复剂量的药物以维持游离药物水平的问题。
因此，显然需要替代和改进的抗IgE疗法。有利地，本发明提供了用于此类替代疗法的手段，该替代疗法另外具有优于现有疗法的明显优势。在这方面，本发明的蛋白质构建体将FcRn介导的蛋白质构建体(生物制剂)再循环与通过降解去除细胞内的IgE相结合。构建体(生物制剂)的再循环意味着该生物制剂返回到血清中，以便与其他IgE靶标分子结合。然而，重要的是，IgE另外通过在细胞内降解的方式从体内去除或“清理”而不是留在体内导致进一步疾病。因此本发明的构建体除内源性IgE清除机制之外还提供了一种用于破坏IgE的新型途径，例如在带有FcRn的组织和细胞中，其附加优势是生物构建体再循环而不是与IgE一起被破坏。
借助于本发明的蛋白质构建体实现再循环元件，所述蛋白质构建体包含可以与FcRn结合的实体，诸如IgG Fc区。IgE的降解令人惊讶地借助于本发明的蛋白质构建体实现，所述蛋白质构建体包含可溶性CD23(或其片段或变体)，尤其包含可溶性CD23(或其片段或变体)的C型凝集素头部结构域(CTLD)的至少一个分子，所述蛋白质构建体可在组织或血清中观察到的生理条件诸如高钙水平/高钙离子浓度(～2mM)或中性pH(例如～pH 7.4)下与IgE结合，但在内体条件，诸如低钙(3-30μM)或5.0至6.5左右的降低的(或低的)pH下显示出与IgE的结合显著降低。这意味着蛋白质构建体可以与血清中(或组织中)的IgE结合，但是然后当含IgE的复合物被内化或胞饮(例如微胞饮)或胞吞到细胞中并到达钙水平低且环境酸性更强的早期内体隔室时，IgE被释放，然后进入溶酶体途径，在那里它可以被降解。另一方面，构建体的FcRn结合部分可以在内体条件下，诸如降低的(低的)pH或降低的(低的)钙下与FcRn结合以允许空载生物制剂再循环回到血清(或组织)中以与更多的IgE靶标结合。
如本文别处将更详细地解释的，使用可溶性CD23(或其片段或变体)，尤其包含可溶性CD23(或其片段或变体)的C型凝集素头部结构域的至少一个分子还有利地提供了与抗IgE治疗剂(诸如奥马珠单抗和利格利珠单抗)不同的作用机制，因为它提供了对IgE与FcεRI结合的变构抑制，与阻断IgE与FcεRI和FcεRII两者结合的竞争性抑制完全不同。
可以看出，本发明的分子因此提供了优于现有抗IgE疗法的几个优点。第一，本发明的抗IgE构建体(生物制剂)在体内具有显著增加的有效寿命。换句话说，由于空载生物制剂再循环回血清，它具有显著增加的半衰期。这具有许多优势，包括可以施用较低剂量的药物和/或较低的药物施用频率，并为患者带来相应的积极和方便体验，诸如较小的注射量和较低频率访问保健专业人士。在这方面，IgE的释放和药物的再循环可用于克服TMDD的问题并维持高血清药物水平。
第二，与其他抗IgE疗法不同，本发明的蛋白质构建体实际上能够从体内去除大量IgE，例如通过促进在溶酶体中的降解。据信这将允许在可接受的剂量下完全消除IgE的可能性，并且还将允许治疗IgE水平对于现有治疗(诸如奥马珠单抗和利格利珠单抗)而言太高的受试者(换言之，潜在患者的IgE水平应该没有理论上限)。本发明的生物制剂对IgE与两种IgE受体即CD23和FcεRI的结合的有效阻滞，应允许其广泛用于治疗IgE介导的疾病，诸如慢性自发性荨麻疹、哮喘、过敏性鼻炎等。
第三，本发明的构建体通常显著小于全抗体诸如奥马珠单抗和利格利珠单抗，这在药品特性和组织分布方面产生优势。第四，存在潜在的安全益处，因为已经证实本发明的构建体不会诱导IgE敏化效应细胞的交联。相比之下，奥马珠单抗和利格利珠单抗具有高水平的循环IgE-抗IgE复合物，这增加了不良事件的风险。这些对于本发明的生物制剂来说应该不存在，因为可以快速破坏靶标。另外，如将在本文别处更详细地描述的，本发明的生物制剂允许变构抑制和阻断IgE与两种受体的结合，而与亲和力无关。相比之下，利格利珠单抗和奥马珠单抗两者都是IgE与其受体结合的药理竞争性抑制剂，使得需要将抗IgE浓度维持在最低阈值以上，超过血清游离IgE浓度，以便在患者治疗期间维持抑制。
因此，在最广义上讲本发明提供了一种蛋白质构建体，所述蛋白质构建体包含：
a)可溶性CD23或其片段或变体的至少一个分子，尤其包含可与IgE结合的可溶性CD23(或其片段或变体)的C型凝集素结构域(CTLD)的至少一个分子；和
b)可与新生儿Fc受体(FcRn)结合的实体。
因此，在一些实施方案中，构建体可含有可溶性CD23或其片段或变体的单个(一个)分子，尤其包含可与IgE结合的可溶性CD23(或其片段或变体)的C型凝集素结构域(CTLD)的至少一个分子。
在一些实施方案中，优选存在可溶性CD23(或其片段或变体)的至少两个分子，尤其包含可溶性CD23(或其片段或变体)的CTLD的至少一个分子。
在一些实施方案中，优选可溶性CD23(或其片段或变体)的至少两个分子，尤其包含可溶性CD23(或其片段或变体)的CTLD的至少一个分子或至少两个分子是单体。
可替代地看，在一些实施方案中，优选可溶性CD23(或其片段或变体)的分子，尤其包含可溶性CD23(或其片段或变体)的CTLD的至少一个分子不能够同源二聚或同源三聚或形成同源寡聚体。
因此，在优选实施方案中本发明提供了一种蛋白质构建体，所述蛋白质构建体包含：
a)至少两个单体，每个单体均包含CD23或其片段或变体的C型凝集素结构域(CTLD)，其中每个单体均可与IgE结合；和
b)可与新生儿Fc受体(FcRn)结合的实体。
据信尤其是在本发明的构建体的部分a)与部分b)之间，接头/接头分子的存在会在构建体的功能性方面赋予显著优势。因此，在其他优选实施方案中，构建体中存在此类接头，例如如本文别处更详细地描述的。
在优选实施方案中本发明提供了一种蛋白质构建体，所述蛋白质构建体包含：
a)至少两个单体，每个单体均包含CD23或其片段或变体的C型凝集素结构域(CTLD)，其中每个单体均可与IgE结合；和
b)可与新生儿Fc受体(FcRn)结合的实体；
其中所述蛋白质构建体包含接头，并且其中所述接头用于将包含CD23的C型凝集素结构域的所述单体连接至可与FcRn结合的所述实体。
CD23在人类中以两种同种型发现，CD23同种型a(CD23a，SEQ ID NO:1，NCBI NP_001207429.1，其长度为321个氨基酸)和CD23同种型b(CD23b，SEQ ID NO:2，NCBI NP_001193948.2，其长度为320个氨基酸)。
Figure BDA0003490186210000061
Figure BDA0003490186210000071
除了作为细胞质结构域的一部分的N端斜体显示的残基之外，这两种同工型在序列上是相同的。N端细胞质结构域的序列也可因物种而异。例如，在鼠和人CD23分子中序列不同。然而，CD23的物种差异可以在整个分子中发现，而不仅仅是胞质区，但总体上不同物种之间，例如在CTLD中存在显著同源性。
从N端到C端，CD23由胞质尾区、跨膜结构域、颈区、茎区和头区(包括凝集素头部结构域/C型凝集素头部结构域或C型凝集素结构域(CTLD)和含有CD21结合位点的C端尾)。人CD23中存在许多结构特征。例如，CD23含有MHC II类结合结构域、整联蛋白结合位点、CD21结合位点和IgE结合结构域。整合素结合位点、CD21结合位点和IgE结合结构域全部位于头区。另外，CD23含有蛋白酶的靶位点，在上面的SEQ ID NO:1中用下划线显示。序列位于A80、R101、S155和E298处。据信天然CD23中的A80和R101受ADAM家族中的蛋白酶，尤其是ADAM 10裂解。据信天然CD23中的S155和E298是在尘螨中发现的der p1蛋白酶的裂解位点。通常，蛋白酶裂解指定残基的C端侧。
尽管这些天然蛋白酶位点是形成可溶性CD23的优选裂解位点(并且通过在这些位点裂解产生或形成的可溶性CD23分子或与此类可溶性CD23分子相对应的CD23分子也优选用于本发明)，但如本文所定义的任何可溶性CD23分子(或CTLD分子)均可用于或产生本发明的蛋白质构建体。
如本文所用的关于CD23分子的术语“可溶性”是指CD23分子或CD23分子的形式，其不与细胞膜结合或以其他方式缔合，或者可以自由循环或易溶解。此类可溶性CD23分子因此包括CD23分子或其片段或变体的全部或部分细胞外结构域。
CD23可以从细胞表面裂解以产生一系列可溶性CD23(sCD23)蛋白质/分子，并且这些中的任何一种都可以用于本发明。然而，用于本发明的构建体中的可溶性CD23分子同样可以进行工程改造或重组产生。例如，用于本发明的构建体中的示例性可溶性CD23可以包含或对应于CD23或其片段或变体的整个细胞外结构域。例如，对于人CD23，示例性可溶性CD23分子包含或对应于SEQ ID NO:1，或其片段或变体(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的序列D48至S321(SEQ ID NO:3)。此类sCD23分子可能含有CD23的头部加茎结构域，或CD23的头部加茎加颈部结构域。
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用于本发明的构建体中的另一种示例性可溶性CD23可以包含或对应于CD23的A80片段，该片段通过在SEQ ID NO:1或其片段或变体的A80处裂解(例如通过ADAM10蛋白酶裂解)获得或可获得。例如，对于人CD23，示例性可溶性CD23分子包含或对应于SEQ ID NO:1，或其片段或变体(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的序列Q81至S321(SEQ ID NO:4)。
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用于本发明的构建体中的另一种示例性可溶性CD23可以包含或对应于CD23的R101片段，该片段通过在SEQ ID NO:1或其片段或变体的R101处裂解(例如通过ADAM10蛋白酶裂解)获得或可获得。例如，对于人CD23，示例性可溶性CD23分子包含或对应于SEQ IDNO:1，或其片段或变体(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的序列L102至S321(SEQ ID NO:5)。
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优选包含CD23的C型凝集素结构域(CTLD)或C型凝集素头部结构域的构建体，尤其是包含至少2个单体的构建体，所述单体包含CD23的C型凝集素结构域(CTLD)或C型凝集素头部结构域。
如本文提及的术语CD23的头部结构域(或C型凝集素头部结构域或C型凝集素结构域或CTLD)优选地是指SEQ ID NO:1，或其片段或变体(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的序列V159至P290(SEQ ID NO:6)。一种优选的CTLD是指SEQID NO:1或其片段或变体(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的序列C160-C288(SEQ ID NO:7)。另一种优选的CTLD是指SEQ ID NO:1或其片段或变体(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的序列F170-L277(SEQ IDNO:8)。
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用于本发明的构建体中的另一种示例性可溶性CD23或包含CD23的C型凝集素头部结构域的分子可以包含或对应于CD23的S155片段，该片段通过在SEQ ID NO:1或其片段或变体的S155处裂解(例如通过der p1蛋白酶裂解)获得或可获得。例如，对于人CD23，示例性的此类分子包含或对应于SEQ ID NO:1，或其片段或变体(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的序列S156至S321(SEQ ID NO:9)。
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此类构建体含有CD23的整个或部分头部结构域(或C型凝集素头部结构域或C型凝集素结构域或CTLD)并且优选含有整个头部结构域。优选的构建体不含或仅含CD23(例如茎结构域)的几个附加残基，例如CD23(例如茎结构域)的多达40、35、30、25、20、15或10个附加残基，例如CD23(例如茎结构域)的多达9、8、7、6、5、4、3、2或1个附加残基。此类附加残基通常将对应于CD23的定位到S156的N端侧(或之前)的多达40、35、30、25、20、15、10个及其他数目的附加残基，即在N端侧紧邻S156的多达10、15、20、25个及其他数目的残基。优选避开α-螺旋茎的残基，因为这些残基可导致自身缔合且优选单体。因此，优选的构建体未含足够的茎残基以允许自我缔合(例如二聚化或三聚化)。
含有茎结构域的一些附加残基的优选构建体具有SEQ ID NO:1(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的E133作为此类构建体中使用的第一个CD23残基(但是其他示例性构建体可以从SEQ ID NO:1的氨基酸134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154或155开始)。换言之，在一些实施方案中，构建体中不包括在SEQ ID NO:1(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的E133的N端(或在E133之前)，或在其他残基134、135等之前的附加CD23残基。换言之，E133(或E133之后的氨基酸)或相应的残基是此类构建体中使用的第一个CD23残基。
因此，对于人CD23，用于本发明的构建体中的另一种示例性可溶性CD23或包含CD23的C型凝集素头部结构域和一些茎结构域的分子可以包含或对应于SEQ ID NO:1或其片段或变体(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的序列E133至A292(SEQ ID NO:10)。
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tkqwvharya cddmegqlvs ihspeeqdfl tkhashtgsw iglrnldlkg efiwvdgshvdysnwapgep tsrsqgedcv mmrgsgrwnd afcdrklgaw vcdrlatctp pa (SEQ ID NO:10)
因此，对于人CD23，用于本发明的构建体中的另一种示例性可溶性CD23或包含CD23的C型凝集素头部结构域和一些茎结构域的分子包含或对应于SEQ ID NO:1或其片段或变体(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的序列E133至E298(SEQ ID NO:11)。
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tkqwvharya cddmegqlvs ihspeeqdfl tkhashtgsw iglrnldlkg efiwvdgshvdysnwapgep tsrsqgedcv mmrgsgrwnd afcdrklgaw vcdrlatctp pasegsae(SEQ ID NO:11)
因此，对于人CD23，用于本发明的构建体中的另一种示例性可溶性CD23或包含CD23的C型凝集素头部结构域和一些茎结构域的分子包含或对应于SEQ ID NO:1或其片段或变体(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的序列E133至S321(SEQ ID NO:12)。
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tkqwvharya cddmegqlvs ihspeeqdfl tkhashtgsw iglrnldlkg efiwvdgshvdysnwapgep tsrsqgedcv mmrgsgrwnd afcdrklgaw vcdrlatctp pasegsaesm gpdsrpdpdgrlptpsaplh s(SEQ ID NO:12)
在其他实施方案中，构建体中不包括在SEQ ID NO:1(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的S156的N端(或在S156之前)的附加CD23残基。换言之S156(或S156之后的氨基酸)或相应的残基是此类构建体中使用的第一个CD23残基。
用于本发明中的可溶性CD23或包含CD23的C型凝集素头部结构域的分子的优选的天然存在的形式包含或对应于derCD23片段，该片段通过在SEQ ID NO:1或其片段或变体的S155和E298处裂解(例如通过der p1蛋白酶裂解)获得或可获得。例如，对于人CD23，示例性的此类分子包含或对应于SEQ ID NO:1，或其片段或变体(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列)的序列S156至E298(SEQ ID NO:13)。derCD23片段在其天然型式中为单体并且如本文别处所述，此类单体片段是优选的。
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tkqwvharya cddmegqlvs ihspeeqdfl tkhashtgsw iglrnldlkg efiwvdgshvdysnwapgep tsrsqgedcv mmrgsgrwnd afcdrklgaw vcdrlatctp pasegsae (SEQ ID NO:13)
尽管此类天然存在的CD23片段是方便的并且在一些实施方案中优选用于本发明，但是在本发明的构建体中可以使用任何适当的可溶性CD23片段。
对于如本文所述的片段(及其变体)，尽管给出了优选的末端(C端)残基，但此类片段(或变体)可以结束于CD23分子中的任何适当的氨基酸处，例如可以结束于任何氨基酸处，包括或在L277、C288或P290之后。
对于如本文所述的片段(及其变体)，尽管给出了优选的起始(N端)残基，但此类片段(或变体)可以开始于CD23分子中的任何适当的氨基酸处，例如在优选实施方案中可以开始于任何氨基酸处，包括或在E133或S156之后。
如上所述，CD23是IgE的低亲和力受体，因此具有与IgE结合的能力，例如具有与IgE Fc区的Cε2-4部分，尤其是IgE Fc区的Cε3部分结合或相互作用的能力。任何适当形式的可溶性CD23或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子均可用于本发明的构建体中，条件是保留或存在与IgE结合的能力。因此，用于本发明的可溶性CD23分子或CD23(或其片段或变体)的CTLD的优选特征是存在IgE结合结构域。已经绘制了本领域已知的各种CD23分子中的IgE结合结构域图谱。例如，优选的IgE结合结构域位于如SEQ ID NO:1所示的人CD23a同种型中的氨基酸W184至A279之间。因此，优选的可溶性CD23分子或CD23或其片段或变体的CTLD，包含IgE结合结构域，例如包含含有或对应于位于SEQ ID NO:1的氨基酸W184至A279处的序列(SEQ ID NO:14)的IgE结合结构域，或其IgE结合片段或变体(或其他形式的CD23中的相应或等效序列)。
因此，优选的可溶性CD23分子或CD23的CTLD，包含这些残基(wvharya cddmegqlvsihspeeqdfl tkhashtgsw iglrnldlkg efiwvdgshv dysnwapgep tsrsqgedcv mmrgsgrwndafcdrklga,SEQ ID NO:14)或如其他形式的CD23中，例如其他(非人)物种的CD23或保留结合IgE的能力的其片段或突变(或变体)型式中发现的与这些残基相对应的残基。
SEQ ID NO:1的IgE结合结构域中用于IgE结合的特别关键的残基已被鉴定为W184、R188、Y189、A190、L198、H202、I221、G222、R224、N225、L226、W234、V235、A271、C273、D274、K276和A279。这些残基全部位于凝集素头部的连续表面上，形成IgE结合表面，因此保持足够的这些残基，使得结合表面保持功能可能很重要。因此，用于本发明的可溶性CD23或CD23的CTLD的任何片段、突变体或变体形式优选含有这些残基中的一种或多种，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17种或更多种，优选所有这些残基，或除SEQ ID NO:1以外的CD23序列中的等效残基，使得可溶性CD23分子可以结合IgE。
天然单体CD23，例如derCD23片段，可以以0.1-3μM左右的亲和力与IgE结合。因此，优选用于本发明的任何可溶性CD23分子或包含CD23的CTLD的分子(尤其是此类CD23分子的单体)可以(例如单独地)以相似或改善的亲和力，例如小于20μM，例如小于15μM、10μM、5μM、4μM、3μM、2μM或1μM的亲和力与IgE结合。还考虑了可以以更高亲和力，例如以小于500、400、300、200、100、50、40、30、20、10或1nM的亲和力与IgE结合的可溶性CD23的形式。例如，可以将如本文所述的可溶性CD23分子的突变或变体形式选择为对IgE具有此类改善的亲和力。
用于本发明的示例性可溶性CD23分子或包含CD23的CTLD的分子(尤其是此类CD23分子的单体)或其片段或变体可以以足够高的亲和力/亲合力与IgE结合以形成足够稳定的复合物阻止(或减少或显著减少)例如在生理条件下，诸如在血清中IgE与FcεRI的结合。在构建体中存在可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子的至少两种单体的实施方案中，优选观察到与单个单体的结合亲和力或单独单体的结合亲和力的总和相比，本发明的构建体与IgE的结合亲合力提高或增加至少(或最多)1.5倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍或1000倍。
在一些实施方案中，优选构建体的部分a)(例如构建体的基于CD23的部分)的分子(或单体)，以与天然单体CD23相似的亲和力(接近天然亲和力)，例如以0.1μM至20、15、10、5、4、3、2.5、2、1.5、1或0.5μM之间的亲和力，例如0.1-3μM或0.1-2或2.5μM的亲和力，或以0.5μM至20、15、10、5、4、3、2.5、2、1.5或1μM之间的亲和力，或以1μM至20、15、10、5、4、3、2.5或2μM之间的亲和力，或以2μM至20、15、10、5、4或3μM之间的亲和力，或以3或4μM至20、15、10或5或4μM之间的亲和力与IgE结合(例如单独地)。换言之，有时优选以μM亲和力(低亲和力)结合IgE的分子(或单体)。
可以使用任何适当的测定结合亲和力(KD)的方法。然而，可以方便地在表面等离子体共振(SPR)测定法(例如BIAcore测定法)中测定KD。此类测定法可以以任何适当的方式设计，例如其中将IgE-Fc捕获(或固定)到芯片(固体支持物)的测定法，例如经由Fc的抗体(例如抗Fc Fab，例如抗IgE Fc Fab)，并且添加各种浓度(例如稀释系列，例如加倍稀释系列)的相关形式的CD23以评估结合。因此，如上所述的结合亲和力(KD)值可以如SPR测定法中测定的那样，例如如上文或本文别处所述。在本文的实施例部分中描述了特别优选的方法。
另外，用于本发明的可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子应优选不仅能够与IgE结合，例如结合在IgE Fc区的Cε2-4部分中，尤其是Cε3部分中，或识别IgE Fc区的Cε2-4，尤其是Cε3部分中的CD23结合位点或与之相互作用，而且能够抑制，例如阻止或阻碍或减少IgE与其高亲和力受体FcεRI的结合。此类抑制可以通过任何机制，例如通过位阻进行。优选地，此类抑制牵涉诱导IgE的变构(构象)变化，使得当它与本发明的构建体中的可溶性CD23或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子结合时，它不能再与高亲和力受体FcεRI结合(例如，此类结合受到阻止或不存在或不可检测或不可测量)，或此类结合例如与不存在构建体时相比至少显著或可测量地减少或受抑制。因此，用于本发明的构建体中的优选可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子当它呈闭合构象时，能够与IgE(例如IgE Fc区的Cε3结构域)结合。然后此类结合可以优选地阻止或减少IgE开放构象的形成，或者换言之，可以将IgE锁定或维持呈闭合构象(Wurzburg等人，2000,Immunity,13(3):375-385)。正是IgE的开放构象(例如IgE Fc区的Cε3结构域的开放构象)允许与高亲和力受体FcεRI结合。因此，使用本发明的构建体的基于CD23的部分将IgE锁定或维持为其闭合构象可以阻止与FcεRI结合。可牵涉位阻和变构(或构象)变化。可替代地看，可以将IgE与FcεRI或FcεRII(CD23)的结合视为相互排斥的结合，即单个IgE分子不能同时与FcεRI和CD23(FcεRII)结合。
此类变构变化，例如抑制IgE与FcεRI的结合，可以由天然CD23分子诱导，包括可溶性CD23分子，因此优选在用于本发明的构建体中的可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子中保留或存在这种能力。还应当指出的是，在其游离形式中，IgE维持闭合构象，闭合构象易于被CD23，包括本发明的构建体中存在的基于CD23的分子结合。因此，可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子能够与游离(或游离形式或循环)IgE结合。
受CD23诱导并因此受本发明的构建体诱导的此类变构变化提供了与本领域其他抗IgE治疗剂相比的关键差异。例如，这些中的许多，诸如奥马珠单抗和利格利珠单抗，通过靶向IgE上的FcεRI结合位点，竞争性阻断IgE与CD23和高亲和力受体FcεRI两者的结合，而本发明的构建体靶向IgE上的CD23结合位点。
因此，可替代地看，用于本发明的优选可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子能够与IgE Fc上的天然CD23结合位点结合(或相互作用)。该结合位点在本领域中有描述(Borthakur等人，2012,J.Biol.Chem.287:31457-31461)并且包含来自三个不连续序列的残基(来自E-F螺旋的氨基酸405-407、409-411和413，来自C-D环的氨基酸377-380和来自C端区域的残基436，参见Uniprot P01854)。本领域技术人员可以测试基于CD23的分子(或片段或变体)与该位点结合的能力，例如通过重复Borthakur等人，2012，同上的NMR-HSQC作图研究，使用15N标记的IgE-Cε3结构域和未标记的CD23或通过使用HDX(氢-氘交换)质谱法进行测试。
可替代地看，当IgE已经与高亲和力受体FcεRI结合时，用于本发明的优选可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子不能结合IgE(或显示与IgE的结合不显著或不可检测)。这不仅从功效的角度来看很重要，而且从安全性的观点来看也很重要，因为如果本发明的蛋白质构建体在与其高亲和力受体FcεRI结合时保留与IgE结合的潜力，则可能存在交联已经与肥大细胞(或其他细胞类型)上的高亲和力受体FcεRI结合的IgE的潜力，从而引起高度促炎性脱粒反应。因此，本发明的蛋白质构建体(和本发明的蛋白质构建体的基于CD23的部分)应优选不能交联与IgE结合时的FcεRI(例如应该在它(IgE)与细胞上的FcεRI结合时不能交联IgE，或与IgE结合)。事实上，在所附实验实施例中由本发明的构建体证明了这种有利的特性。
在一些实施方案中，用于本发明的构建体中的可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子还包含或含有整联蛋白结合位点和/或CD21结合位点，例如一个或多个天然整联蛋白结合位点和/或CD21结合位点。换句话说，用于本发明的构建体中的可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子根据存在的结合位点能够与整联蛋白和/或CD21结合。对于人CD23，据信整联蛋白结合位点的必需氨基酸残基位于SEQ IDNO:1的残基172至174处并且具有序列RKC。然而，替代形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的等效或相应整联蛋白结合位点将容易由本领域的技术人员鉴定或确定。类似地，据信人CD23中的CD21结合位点位于SEQ ID NO:1的残基294至298或293至298处并且具有序列EGSAE(SEQ ID NO:30)或SEGSAE(SEQ ID NO:24)。然而，替代形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的等效或相应CD21结合位点将容易由本领域的技术人员鉴定或确定。
在其他实施方案中，用于本发明的构建体中的可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子将不包含或不含整联蛋白结合位点和/或CD21结合位点，例如将不含一个或多个天然整联蛋白结合位点和/或CD21结合位点。换句话说，用于本发明的构建体中的这些可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子将不能够与整联蛋白和/或CD21结合(例如将显示出不可检测或不显著的结合)。此类形式的CD23在一些情况下将是优选的，例如优选用以阻止不需要的结合相互作用。因此，本发明的构建体的优选部分a)组分不包含或不含CD21结合位点。本发明的构建体的其他优选部分a)组分不包含或不含整联蛋白结合位点。本发明的构建体的其他优选部分a)组分不包含或不含CD21结合位点或整联蛋白结合位点。
在一些实施方案中，用于本发明的构建体中的可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子还包含或含有CD23的整个或部分C端尾区。对于人CD23，除CD21结合位点/结合区以外，据信CD23的C端尾区还包含SEQ ID NO:1的残基S299至S321并且具有如SEQ ID NO:25所示的序列。然而，替代形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的等效或相应C端尾区将容易由本领域的技术人员鉴定或确定。可包括C端尾区的任何数目的氨基酸，例如可能包括至少1、2、3、4、5、10、15或22个氨基酸，例如SEQ ID NO:25的氨基酸。在其他实施方案中，用于本发明的构建体中的可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子将不含来自CD23的C端尾区的任何残基，例如将不含来自或对应于SEQ ID NO:25的任何残基。换言之，CD23的C端尾区不存在。
本领域技术人员可以容易地开发或设计不包含此类位点的可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子。例如，可以通过构成该位点的一个或多个残基的缺失或通过构成该位点的一个或多个残基的突变来去除所有或部分此类位点，使得生物学功能(视情况而定为整联蛋白结合或CD21结合)被破坏、降低或去除，优选不影响起始分子或母体分子的其他功能特性，诸如本文别处所讨论的各种所需特性。因此，此类分子将是变体或突变CD23分子或与天然可溶性CD23序列基本上同源的CD23分子的实例。
具体而言，对于CD21位点(或C端尾区)，产生用于本发明的构建体中的没有CD21位点(或C端尾区)的基于CD23的分子的一种方便方式是使用CD23的片段，该片段是或对应于已经在CD21位点(或C端尾区)之前被截短的CD23分子。例如，对于人CD23，基于CD23的分子可以在(并包括)S293或A292或P291或P290或C288处或之前被截短。在(并包括A292或C288)处截短有时是优选的。因此，优选的基于CD23的分子是或对应于SEQ ID NO:1的S156至A292(SEQ ID NO:15)。另一优选的基于CD23的分子是或对应于SEQ ID NO:1的S156至C288(SEQID NO:31)。如果结合CD21的能力被去除，则可以设想在CD21结合位点内同样截短。因此，对于人CD23，基于CD23的分子可以在(并包括)E294、G295、S296或A297处被截短。还考虑到了C端尾区内，例如介于人CD23的S299和S321之间，或对应于SEQ ID NO:25的序列内的任何位置的截短。
如在本发明的其他实施方案中那样，其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应或等效序列同样可以使用。例如，下面概述了对应于SEQ ID NO:1的S156至C288的犬科动物序列(SEQ ID NO:32)。因此，本发明的优选构建体可包含如本文别处所述的该犬科动物序列或其片段或变体，包括例如如本文别处所述与之具有至少70％序列同一性的氨基酸序列等。
NGSECNTCPEKWLNFQRKCYYFGEEPKKWIQARFACSKLQGRLASIHSQEEQDFLARYANKKGTWIGLRDLDREGEFIWMDENPLNYSNWRPGEPNNGGQGEDCVMMQGSGQWNDAFCGSSLDGWVCDRLATC(SEQ ID NO:32)
此类位点的去除是任选的并且此类位点甚至可能不存在于考虑用于本发明中的所有形式的CD23中。例如，鼠CD23不能与CD21结合并且不含与CD21结合所需的残基(不含CD21结合位点)。
如本文别处更详细描述的，CD23与IgE的结合是钙依赖性的/钙敏感的(Yuan等人，2013,J.Biol.Chem.288(30):21667-21677)。因此，CD23与IgE的结合(例如良好或稳定的结合)发生在高钙例如高生理钙条件下，例如在细胞外或间质中发现的钙水平下，例如在组织内或在血清或血液中。此类钙水平(或钙离子浓度)通常为2mM左右，例如1.0至2.5mM或1.0至2.0mM。相比之下，在低钙例如低生理钙条件下，例如在身体的酸性隔室诸如细胞内酸性隔室(诸如内体)中发现的水平下，CD23与IgE的结合大大减少或不存在或没有(例如基本上没有)。此类低钙水平(钙离子浓度)通常比高钙水平(钙离子浓度)低30至1000倍，例如3-30μM左右，但是已经报道了低至100或500nm的水平。因此，当与IgE结合的CD23(例如CD23-IgE的复合物)从高钙环境转至低钙环境时，例如当从血清或组织摄取到内体中时，IgE从CD23释放，例如快速释放。
CD23与IgE结合的这种钙依赖性是本发明背后非常重要和有利的特征。因此，用于本发明的构建体中的任何可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子应优选保留或具有结合钙的能力，并且还保留或具有在高钙或高生理钙的条件下，例如如上所述的血清钙水平下结合(例如稳定地结合)IgE的能力，并且在低钙或低生理钙的条件下，例如如上所述的内体钙水平下，显示出IgE结合较低，例如显著或可测量地较低，或没有结合或没有显著结合。本文提及钙的存在或钙水平，例如高钙水平或低钙水平等，还包括对钙离子的存在或钙离子浓度的提及。
因此，在本发明的一些蛋白质构建体中，构建体的部分a)与IgE的所述结合在内体钙水平下与血清钙水平相比减少。
在人CD23中，据信牵涉与IgE的钙依赖性结合的残基是环4中的Thr251、Ser252、Glu249、Asp270、Asn269及环1中的Asn225和Asp258。因此，在用于本发明的构建体中的任何基于CD23的变体分子中，优选保留或存在这些残基中的一个或多个，优选所有这些残基。
在用于本发明的构建体中的其他基于CD23的变体分子中，可以通过改变或突变钙结合位点并增加对IgE的结合亲和力来增加CD23对IgE的结合亲和力。然而，由于在一些实施方案中优选IgE和CD23之间的低亲和力或中等亲和力相互作用(单独的亲和力相互作用)，同样优选变体或突变CD23分子不显示增加的钙结合，例如增加的钙结合导致钙诱导的对IgE的亲和力增加。因此，一般而言，在一些实施方案中，在本发明的构建体中不使用具有对IgE增加的亲和力(例如高亲和力突变体或变体，例如与天然或野生型或起始分子相比)或增加的钙结合(例如与天然或野生型或起始分子相比)的基于CD23的突变或变体分子。例如，用于本发明的优选的基于CD23的分子在人CD23的残基258(或其他形式的CD23(例如其他物种的CD23)中的相应残基)处不含或不包含D到E的突变，认为该突变会增加钙结合并因此增加对IgE的亲和力)。用于本发明的优选的基于CD23的分子因此显示出与天然或野生型CD23分子相似的钙结合(例如，钙结合的水平没有显著差异)。用于本发明的其他优选的基于CD23的分子因此显示出与天然或野生型CD23分子相似的IgE结合(例如，IgE结合的水平没有显著差异)，例如具有与本文别处所述的亲和力水平。
构建体的其他优选特征可由本领域技术人员容易地构想到并且可能例如包括糖基化位点或经受翻译后修饰的其他位点的去除(或不包含在构建体中)，例如以提高在非哺乳动物宿主中的生产，并且还包括蛋白酶裂解位点的去除(或不包含在构建体中)，例如以避免在生产或施用构建体时对构建体进行不需要的裂解或加工(例如蛋白水解裂解或加工)。本领域技术人员可以使用标准技术容易地鉴定和去除此类位点。
本发明的优选蛋白质构建体包含或含有如本文别处更详细描述的以下特征中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种或全部：
i)无CD21结合位点；
ii)无整联蛋白结合位点；
iii)无糖基化位点；
iv)无蛋白酶裂解位点。
除本文别处描述的优选功能特征以外，构建体中还可存在这些特征，诸如构建体的部分a)与血清相对于内体中的IgE的钙敏感性结合，以及由构建体的部分b)介导的FcRn结合。
从以上可以看出，CD23分子的片段(功能片段)或变体(功能变体)也是用于本发明的适当的可溶性CD23分子或包含CD23的CTLD的分子。
用于本发明的适当片段或变体(适当的可溶性CD23分子或包含CD23的CTLD的分子)可以是任何长度，条件是保留如本文别处描述的所述适当功能特征中的一种或多种，例如IgE结合等。片段的长度通常比原始序列或母体序列短。示例性的长度/片段长度可为至少50、60、70、80、100、125、140、150、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225或250个氨基酸。可替代地看，示例性的长度/片段长度可长达60、70、80、100、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170,175、200、225、250、275、300或350个氨基酸。因此，示例性的长度/片段长度可为50、60、70、80、90、100、110、120、125或130个氨基酸至140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275或300或350个氨基酸长。从本文的其他公开内容可以清楚地看出，在本发明的构建体中不使用全长天然或野生型CD23分子(例如SEQ ID NO:1的分子)或其他物种中的等效物，例如CD23的胞外区通常优选用于本发明的构建体中。具体而言，CD23的胞质区和跨膜区是不期望包含在内的。全长茎区也是不期望的。然而，在一些实施方案中，优选使用与天然或野生型CD23中发现的序列相对应的CD23序列(例如CD23的片段)。
用于本发明的可溶性CD23分子或包含CD23的CTLD的分子的适当变体(功能变体)可以方便地通过序列同源性来定义，并且与本文所定义的CD23分子的各种序列基本上同源的CD23序列可以容易地用于本发明，条件是保留原始(或母体)CD23分子的适当功能特征。
适当的变体(或突变序列或基本上同源的序列)可包含与上面提到的CD23序列具有至少70％、75％或80％的序列同一性，诸如至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。这些变体序列应保留或具有如本文别处定义的CD23分子的适当功能特性。也可以使用这些序列(或这些同源序列)的功能截短或片段，条件是保留适当功能特性。突变或变体可溶性CD23分子或包含CD23的CTLD的分子的其他优选实例是在上述CD23序列中含有多达20个，例如多达18、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个改变的氨基酸的序列。
可以通过任何方便方法评估％同一性。然而，为了测定序列之间的同源性程度，对序列进行多重比对的计算机程序是有用的，例如Clustal W(Thompson等人，Nucleic AcidsRes.,22:4673-4680,1994)。计算两个氨基酸序列之间的百分比同一性的其他方法通常是本领域公认的并且包括例如Carillo和Lipton描述的那些(SIAM J.Applied Math.,48:1073,1988)。
通常，将采用计算机程序进行此类计算。比较和比对成对序列的程序，如ALIGN(Myers换热Miller,CABIOS,4:11-17,1988)、FASTA(Pearson,Methods in Enzymology,183:63-98,1990)和空位BLAST(Altschul等人，Nucleic Acids Res.,25:3389-3402,1997)或BLASTP(Devereux等人，Nucleic Acids Res.,12:387,1984)也可用于此目的。
通过提供参考点，可以使用具有默认参数的ALIGN程序(例如可在互联网上的GENESTREAM网络服务器上获得，IGH,Montpellier,France)来确定具有至少70％等同一性的根据本发明的序列。
在如本文所述的本发明的所有方面中，提及可溶性CD23分子或包含CD23的CTLD的分子，同样可以指如本文所述的可溶性CD23的片段或变体或包含CD23的CTLD的分子的片段或变体(视情况而定)。
本发明的蛋白质构建体的可溶性CD23组分(或其片段或变体)或包含CD23的CTLD的分子(或其片段或变体)提供了该构建体与IgE结合的能力。一个CD23分子(或其片段或变体)可以赋予这种能力，例如，如果对IgE的结合亲和力足够。在这方面，本领域已知单体CD23可以以在0.1-3μM范围内的亲和力(Kd)与IgE结合。因此，可以使用能够以约或小于20、15、10、5、4、3、2或1μM，或500、400、300、200、100、50、40、30、20、10或1nM的Kd结合IgE的单个(或单体)CD23分子，例如如本文别处所述。在其中使用CD23(或CD23的CTLD)的片段或变体，例如与CD23(或CTLD)具有某一序列同一性的序列的本发明的实施方案中，则天然可溶性CD23分子可以经修饰，使得它们具有提高的结合亲和力但保留内体敏感性(例如对钙的敏感性)。然而同样地，在一些实施方案中，天然(或接近天然，或低)结合亲和力是优选的，并且示例性的此类亲和力在本文别处有描述。
然而优选地，在本发明的构建体中提供两个或更多个，例如两个可溶性CD23分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子。更优选地，提供两个或更多个，例如两个单体，或多于两个单体(例如4、6、8或10个单体)。因此，优选的蛋白质构建体具有两个(或至少2个)IgE结合位点，优选由两个(或至少两个)单体提供。
在存在两个或更多个CD23分子(或单体)的情况下，通常且优选地将蛋白质构建体设计成使得单独的基于CD23的分子或单体是分开的，使得每个分子或单体可以与IgE结合，从而借助于亲合力效应允许对IgE的结合亲和力整体增加(例如在两个CD23分子或单体与一个IgE分子结合的情况下，例如通过一个CD23分子或单体与IgE Fc的一条链结合且另一个CD23分子或单体与同一IgE Fc的另一条链结合的方式，或者换句话说，在二个(或两个)CD23分子(或单体)或CD23头都可以接合来自单个IgE Fc的每条链的两个CD23结合结构域的情况下)，例如通过协作结合，引起结合亲合力提高。本发明的构建体与IgE分子之间的这种类型的相互作用在本文中也称为顺式结合。可替代地，其中存在两个或更多个CD23分子(或单体)的本发明的此类构建体可以允许一个以上的IgE分子与本发明的构建体结合，例如通过与两个单独的IgE分子结合的本发明的构建体。本发明的构建体与IgE分子之间的这种类型的相互作用在本文中也被称为反式结合，反式结合进而可以允许形成高级结构或复合物，诸如高级寡聚体。形成高级结构的此类相互作用也可以导致结合亲合力改善。优选的相互作用使构建体中的两个(在存在两个CD23分子的实施方案中)或所有CD23分子都与IgE结合。
替代或另外的协作结合模式可以包括>1个CD23单体结合IgE Fc(例如多个IgEFc/多个IgE分子)，使得IgE(或多个IgE)上的所有CD23结合位点作为高级形式(高级寡聚体)被占据，导致高亲合力相互作用，与IgE结合的表观亲和力(功能亲和力、相对亲和力或总亲和力)大于，优选显著大于单独的单体或结构中的单独单体的结合亲和力总和。例如，已知两个CD23分子(例如两个derCD23分子或CD23的其他CTLD)可以与单个IgE分子或同一IgE Fc结合(也参见图1示意图，该图说明了此类顺式-相互作用)，因此本发明的优选构建体可以复制这一点。
优选地，在存在两个或更多个CD23分子(优选单体)的情况下，这允许至少一个CD23分子与构成IgE Fc区的一条链结合且构建体中至少另一个CD23分子与构成同一IgEFc区的另一条链结合(例如经由顺式相互作用)，从而允许亲合力效应提高结合亲和力。本发明的优选构建体是二价的，因为它们含有两个CD23分子(优选单体)并且因此含有两个IgE结合位点。也可以发生上述简单的反式结合相互作用(例如本发明的一个构建体与两个单独的IgE分子结合)。然而，还考虑到高级结构或寡聚体并且也可以由含有两个CD23分子的结构形成，例如通过CD23单体与IgE Fc的协作结合，使得IgE上的所有CD23结合位点被占据。此类结构可以例如形成环状或闭合结构，其中在结构中存在的IgE分子中没有游离的CD23结合位点，因为它们全部与CD23结合。此类结构的形成也将导致高亲合力相互作用，与IgE结合的功能亲和力大于，优选显著大于单独的单体或结构中的单独单体的结合亲和力总和。例如，本发明的两个或三个蛋白质构建体(每个构建体具有2个CD23单体(或分子))，可以通过与IgE-Fc区结合而相互作用(连接)并且分别与两个或三个IgE分子形成环状结构。也可以形成更大的环状结构，其中通常将存在相等数目的本发明的构建体分子和IgE分子。
例如当本发明的构建体具有两个CD23分子(单体)并且IgE上的所有CD23结合位点都被占据时，可以形成此类结构。
在使用两个或更多个CD23分子(优选单体)的情况下，则优选它们是相同或同样的分子或单体(例如可以称为一“对”或多“对”，例如多“对”同样的分子或单体)。
因此，在本发明的优选构建体中，CD23分子，优选CD23单体，在空间上是分开的，使得它们各自可以结合同一(单个)IgE Fc二聚体的一条链，即一个分子(优选单体)与IgE Fc二聚体的一条链结合，而另一个分子(优选单体)与同一IgE Fc二聚体的另一条链结合。换句话说，观察到1:1的全分子化学计量。因此，优选地在使用两个CD23分子(优选单体)的情况下，本发明的构建体对IgE的总结合亲和力(亲合力)与在使用同一单个分子(或单体)时观察到的结合亲和力相比增加(或提高)，优选显著增加(或提高)。更优选地，在使用两个CD23分子(优选单体)的情况下，本发明的构建体对IgE的总结合亲和力(亲合力)与在使用同一单个分子(或单体)时观察到的结合亲和力总和相比增加(或提高)，优选显著增加(或提高)。总结合亲和力的类似增加也适用于使用两个以上CD23分子(优选单体)的构建体，例如当如本文别处所述形成高级结构或寡聚体时。
本发明的优选构建体使用单体形式的CD23。换言之，本发明的构建体优选不包含CD23的二聚体或三聚体或其他寡聚体(例如同源二聚体、同源三聚体或其他同源寡聚体或同源多聚体)。如本文所用，术语二聚体、三聚体、寡聚体等是指物理缔合或自我缔合的分子。因此，在使用CD23单体的本发明的优选构建体中，构建体中的单独CD23分子彼此不直接物理缔合或彼此不直接物理相互作用或不自我缔合，例如在二聚体或三聚体中，并且作为单独实体存在，所述实体各自自由与IgE结合，尤其是与单个IgE分子结合，使得构建体中的至少一个CD23单体与IgE Fc的两条链中的每一条链结合(例如通过顺式相互作用)，或与多个IgE分子结合(例如连接两个游离(或可溶性)IgE分子或形成其他高级构建体，例如通过反式相互作用)，使得如本文别处所公开的，构建体中的至少一个CD23单体与IgE Fc的一条链结合且构建体中的至少另一个CD23单体与不同IgE Fc的一条链结合。
因此可以将本发明的优选构建体视为双互补位的，因为当本发明的单个构建体具有两个或多个CD23单体(或分子)时，本发明的单个构建体可以结合单个IgE分子上的两个表位(通常是两个同样的表位，在单个IgE Fc的每条链上各一个)。其他优选的构建体可以允许二价结合，例如与两个单独的IgE分子结合，以容许形成高级结构或复合物，例如高级寡聚体。也可以形成这些形式的混合物，实际上也可以形成本文所述的任何其他形式。
因此，用本发明的优选蛋白质构建体，构建体中存在的一对CD23单体中的每个单独的CD23单体可以同时与同一IgE靶分子相互作用。虽然CD23与IgE之间的每个单个结合相互作用可能容易受到破坏(取决于相互作用的亲和力，例如当牵涉低亲和力(例如天然)相互作用时)，但是当该对的两个成员同时与IgE抗原相互作用时，总体效应是该对CD23单体与IgE的协同强结合，尤其是在生理条件下，例如生理pH下，或例如在血清中。另外，当单个结合相互作用受到破坏时，另一相互作用的存在意味着IgE靶分子不会扩散开，从而意味着受到破坏的结合相互作用可能会恢复(例如由于亲合力)。用如本文别处所述的高级结构也设想了类似相互作用。
因此，在单独的CD23单体(或分子)以低亲和力或中等亲和力与靶抗原(IgE)结合的本发明的实施方案中，尽管CD23单体与靶抗原(IgE)的单独相互作用是低亲和力或弱的，但事实上有一对CD23单体，其每个成员都以低亲和力或弱相互作用与靶抗原(IgE)相互作用(即在单个构建体中有多种单独的弱相互作用)，这意味着与单个靶IgE分子的总体相互作用具有高亲合力的重要优势特征，即高的总亲和力至亲合力，或者在抑制靶抗原的自然功能的能力，例如其结合配体的能力，例如IgE与其高亲和力受体FcεRI结合的能力方面具有高效力，即可以高效地抑制靶标-配体相互作用。如本文别处所述，还设想了具有高级结构的类似(高的总亲和力至亲合力)相互作用。
因此，在本发明的优选蛋白质构建体中(并且特别是在单独的CD23单体以低亲和力或中等亲和力，例如接近如本文别处所述的单体与IgE结合的天然亲和力与靶IgE结合的实施方案中)，当该对CD23单体的两个成员均与同一靶IgE分子结合时观察到对IgE的结合亲和力(亲合力)的总体增加或提高(或优选协同增加或提高)，与该对的单个成员(单个单体CD23)被结合完全不同。此类总体增加包括任何可测量的增加，优选显著增加，更优选统计学显著增加(例如概率值<0.05)。例如，与该对的单个单体被结合时相比(或与单独单体的结合亲和力的总和相比)，当单个构建体中的一对CD23单体中的两个CD23单体与同一靶IgE分子结合时，对IgE的总结合亲和力可以增加(或提高)超过一倍，例如至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍或1000倍，例如至少(或至多)5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍或1000倍。如本文别处所述，这些增加或提高应该在生理pH(例如，在pH 7.4或左右)和/或在生理钙水平下观察到。结合亲和力的这种总体增加(或提高)可以容易地使用其中存在CD23单体对的两个单体的构建体对比其中仅存在单个单体(即该对的一个成员)的构建体，并测量和比较对靶抗原的结合亲和力进行测试。协同增加或提高意指当一对CD23单体的两个成员同时与同一靶抗原结合时对抗原(IgE)的总(组合)结合亲和力大于该对的每个CD23单体对靶抗原的单独结合亲和力的总和。
从另一种角度看，协同增加或提高意指当一对CD23单体的两个成员与同一靶抗原(IgE)结合时与该对中的单个CD23单体结合时相比，对靶抗原(IgE)的总结合亲和力增加(或提高)大于1倍，例如至少1.5倍或2倍(例如具有如上所述的值)。用如本文别处所述的高级结构，例如含有本发明的构建体的至少两个分子和至少两个IgE分子(通常两者的数目相同(或相等))的高级结构，也设想了总结合亲和力(亲合力)的类似增加和提高，并且其中形成结构，例如环状结构，其中IgE上的所有CD23结合位点都被占据。
在本发明的其他优选的蛋白质构建体中，可以使用多于一对的CD23分子，优选单体。这些多对可以与第一对相同，或者可以是不同的对。因此，本发明的蛋白质构建体可以例如具有或包含四个、六个、八个或十个单独的CD23分子，优选单体。这些多对将适当地排列使得例如每对可以结合独立的IgE分子(例如单个IgE分子，例如通过顺式结合)，或者可以形成如本文别处所述的高级结构或寡聚体。例如，在使用四个(例如2对)单独的CD23分子，优选单体的实施方案中，两个(例如1对)单独的CD23分子，优选单体，可以存在于构建体的一个末端(例如N端)，而另外两个(例如第二对)单独的CD23分子，优选单体，可以存在于构建体的另一末端(例如C端)。可替代地，在使用四个(例如2对)单独的CD23分子，优选单体的其他实施方案中，两对单独的CD23分子，优选单体，可以例如在空间构型上存在于构建体的同一末端(例如N端或C端)(例如其中一对的两个成员在同一条多肽链上连接在一起，或其中一对的两个成员在不同的多肽链上)，这允许每对与单个IgE分子相互作用。此类构建体也可以形成高级结构或寡聚体，例如通过如本文别处所述的协作结合。
在本发明的优选实施方案中，sCD23或sCD23片段或变体的单独分子或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子中的至少一个经工程改造或选择，使得sCD23或sCD23片段或变体或包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子与靶抗原(IgE)的结合对内体条件(在细胞内体内发现的条件)敏感。“对内体条件敏感”意指CD23或CD23片段或变体的分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)与靶抗原(IgE)的结合可以在细胞内体中发现的条件下受到破坏或至少减弱或减少。下面的讨论侧重于钙敏感性，即分子在如本文别处所述的高钙或血清钙或生理钙条件下与IgE结合并且在如本文别处所述的内体钙条件或低钙下显示与IgE的结合减少。然而，可以使用对其他内体条件的敏感性，例如pH敏感性，并且适于构建体部分a)的分子可以是在如本文别处所述的生理pH条件(例如pH 7.4)下与IgE结合并且在如本文别处所述的内体pH条件(例如pH 6.0或6.5)下显示与IgE的结合减少的那些分子。
具体而言，CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)与IgE之间的相互作用可以对钙水平的变化敏感，例如在钙水平为～2mM的血清中相互作用强或稳定，但是当钙离子(Ca 2+)浓度下降到大大低于2mM的水平，例如降到通常在哺乳动物内体中发现的水平，例如介于3至30μM之间或介于30至300μM之间时相互作用不太稳定或被减弱或破坏或减少(例如可测量地减少或显著减少，例如概率值＜0.05)。换句话说，sCD23或sCD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)与IgE之间的相互作用一般在循环(血清)钙浓度或组织/间质钙浓度下强或稳定，但在低内体钙浓度下或在内体条件下一般不太稳定或背减弱或破坏或减少(例如可测量地减少或显著减少，例如概率值＜0.05)。
这种特征可以有利地允许本发明的蛋白质构建体通过内体再循环。在此类实施方案中，当CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)与IgE靶抗原结合时，负载的蛋白质构建体，即本发明的蛋白质构建体，进入或内化到内体途径中，之后与CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)结合的IgE在内体条件下从蛋白质构建体上释放或解离并且空载或空的蛋白质构建体再循环回到循环中以捕获更多的靶抗原(IgE)，从而大大增强蛋白质构建体的体内半衰期。
因此，在这些实施方案中，CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)与其靶抗原(IgE)之间的相互作用必须是当本发明的蛋白质构建体进入内体或内体途径时被充分减弱，使得至少一些靶抗原(IgE)可以释放或解离。可相应地选择用于此类蛋白质构建体中的CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)，例如通过测定在血清pH下，例如在pH 7.4或左右以及在血清中发现的正常钙水平(例如，如本文别处所述在2mM或1mM或左右)或在血清中发现的意识形态钙离子浓度下与IgE的结合，并将其与CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)在内体pH和/或钙浓度下(诸如本文别处所述的那些)与IgE的结合进行比较，并鉴定在较高钙浓度(或血清pH)下与靶抗原(IgE)的结合是可测量地高于(优选显著高于，概率值＜0.05)在内体钙浓度(或内体pH水平)下的结合的CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)。然而，在此类实施方案中优选使用在生理正常血清钙浓度下对靶抗原(IgE)具有低亲和力或中等亲和力的CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)，因为与靶抗原(IgE)的单独相互作用较弱且因此在内体条件，例如较低的钙水平(Ca2+离子)下更容易受到破坏或减弱。
因此，对于该实施方案，重要的是CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)在生理血清或间质组织钙浓度下可以以高亲合力(总亲和力、相对亲和力、功能亲和力)与靶抗原(IgE)结合，并且在通常在内体(例如哺乳动物内体)中发现的钙浓度下释放靶抗原(IgE)或与之解离。
因此，CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)与IgE之间的结合相互作用在如以上所讨论的血清钙浓度下必须足够稳定，但结合在如以上所讨论的内体钙浓度下必须显著或充分减弱，以允许释放结合的IgE或一定比例(优选可测量或显著比例)的结合的IgE。
CD23或CD23片段或变体的适当单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)将是例如在300μM或左右的钙浓度下，或在小于300μM而大于100μM的钙浓度下，或在小于100μM而大于10μM的钙浓度下，或在小于10μM而大于0.1μM的钙浓度下，与IgE的结合亲和力显著降低(例如概率值<0.05)的那些分子。优选地，当使用内体钙浓度(例如3至30μM)时，观察到结合完全丧失(或几乎没有结合能力或没有显著结合)。然而，更重要的是在较低钙浓度下与IgE结合的减少足以允许至少一些且优选相当大比例的靶抗原(IgE)从CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)解离，优选快速解离。
举例来说，CD23或CD23片段或变体的适当钙敏感性单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)可以是在低钙下CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)与靶抗原(IgE)的结合亲和力与在如本文别处所述的正常生理钙水平下(例如在2mM钙或左右)与靶抗原(IgE)的结合亲和力相比，降低至少(或至多)5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍或1000倍或更多的那些分子。理想地，CD23或CD23片段或变体的单独分子(或其成对或多个分子，其中两个或更多个分子，优选单体，存在于构建体中)对靶抗原(IgE)的Kd将在高μM或mM范围内，例如10至500μM，或500至1000μM，或1至100mM。
在优选的实施方案中，钙敏感性是可逆的，即一旦钙增加回生理条件(例如2mM钙左右)，结合亲和力就会恢复。
因此，在本发明的一些蛋白质构建体中，构建体的部分a)与IgE的所述结合在内体pH水平(例如在pH 6.0或6.5，或如本文别处所述的其他内体pH水平)或内体钙水平下与血清pH水平(例如pH 7.4)或血清钙水平下相比减少。在本发明的一些蛋白质构建体中，构建体的部分a)与IgE的所述结合在pH 6.0或6.5下与pH 7.4相比减少。
用于本发明的构建体中的CD23分子可以从任何来源或物种获得或者源自任何来源或物种或者可以对应于来自任何来源或物种的CD23，或者可以是其片段或变体。优选的来源是哺乳动物，并且可以使用任何适当的哺乳动物来源，例如人或任何家畜、家养动物或实验室动物。具体实例包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔、马、牛和非人类灵长类动物(例如食蟹猴)。因此，用于本发明的构建体中的CD23分子(例如CTLD)是或对应于哺乳动物CD23分子，诸如上文概述的那些，或者可以是其片段或变体。然而，优选地，哺乳动物是人。另一种优选的哺乳动物是犬科动物(例如狗)。来自不同物种的CD23的序列是本领域已知的，因此用于本发明的适当CD23分子可以通过标准技术例如重组技术容易地生成或产生。犬科动物(例如狗)CD23序列的片段在本文别处提供(SEQ ID NO:32)，因此本发明的优选构建体包含该序列或与之基本上同源的序列，例如如本文别处所述的与之具有至少70％、75％、80％等同一性的序列。
CD23的优选靶抗原(在这种情况下为IgE，尤其是IgE-Fc结构域)是来自与所选CD23分子从中获得或源自其中的或与之对应的物种或来源相同的物种或来源的IgE。因此，在所选CD23是人的情况下，则优选地，靶IgE是人IgE。然而在一些实施方案中，来自其他类型哺乳动物的IgE(其实例在本文别处有描述)也可以用作靶IgE，例如来自非人灵长类动物诸如食蟹猴的IgE蛋白是特别优选的。还优选犬科动物(例如狗)IgE。在一些实施方案中，期望构建体中使用的CD23分子(或片段或变体)在与靶抗原(IgE)结合时显示物种交叉反应性。例如，CD23分子(或片段或变体)可以与人和非人灵长类动物形式的IgE或与人和啮齿动物(例如小鼠或大鼠)或其他非人哺乳动物形式的IgE特异性结合。在一些实施方案中，CD23分子(或片段或变体)对不同物种的靶IgE的结合亲和力，或CD23分子(或片段或变体)在使用不同物种的靶IgE的功能测定中表现的能力优选彼此没有很大差别，例如彼此相差5倍或10倍以内。具体而言，对人IgE的结合亲和力(或功能活性)优选与对来自另一哺乳动物物种(例如非人类灵长类动物或啮齿动物)的IgE的结合亲和力(或功能活性)没有很大差别，例如在5倍或10倍以内。
本发明的蛋白质构建体的部分b)可以包括抗原结合或能够结合或靶向新生儿Fc受体(FcRn)的任何实体或分子。与FcRn的此类结合可以是直接的，即没有中间体，或者是间接的，例如经由中间实体。与FcRn的这种直接或间接结合然后可以通过内体实现再循环，条件是结合对内体条件敏感，例如在内体中观察到或发生结合，而不是在细胞外部或细胞外环境中，诸如在血清中或组织中。因此，部分b)的此类内体敏感性结合对于本发明的优选构建体而言很重要。
优选且方便地，此类相互作用或此类结合将是直接的。换言之，构成构建体的部分b)的实体或分子可以与FcRn直接结合或相互作用，例如可以包含可以与FcRn结合(例如特异性结合)的任何蛋白质、肽或多肽。此类分子的实例是本领域已知的并且可以使用这些中的任何分子。例如，可以与FcRn直接结合的分子(例如结合蛋白或肽)包括来自不同物种的白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。另外，抗体的适当Fc区，尤其是IgG-Fc区也可以与FcRn直接结合。因此，在本发明的构建体中方便地使用与FcRn结合的白蛋白(例如HSA)或其片段或变体(诸如经修饰的白蛋白分子，例如经修饰的HSA分子)，或与FcRn结合的IgG-Fc区，例如小鼠或人IgG-Fc区，优选人IgG-Fc区，或其片段或变体(诸如经修饰的IgG-Fc区，例如经修饰的人IgG-Fc区)。如本文别处所述，可与FcRn直接结合或相互作用的其他适当分子是FcRn抗体或其他FcRn结合蛋白或肽。此类分子在本文中也称为FcRn结合蛋白或实体。
此类FcRn结合蛋白(诸如白蛋白)和IgG-Fc区(包括其显示与FcRn的结合保留或改善的修饰型式)的序列是本领域中熟知和描述的，并且可以使用这些中的任何一种，条件是它们能够与FcRn结合，并且在本发明的上下文中，优选能够使构建体再循环回到细胞外环境，例如血清或组织中。
特别优选IgG-Fc区或其片段或变体。用于本发明的IgG-Fc区因此方便地源自或对应于IgG分子中存在的Fc区。
如本文所用，术语Fc区(或Fc片段)具有其本领域公认的含义并且包含或对应于能够与Fc受体相互作用的抗体部分。通常，所述Fc区(或Fc片段)由包含抗体的CH2和CH3结构域的两条同样的链构成(为二聚体)。
在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区(或Fc片段)由两条同样的链构成(为二聚体)，各自在每条多肽链中包含两个重链恒定结构域(CH2和CH3)。在IgM和IgE抗体同种型中，Fc区(或Fc片段)由两条同样的链构成(为二聚体)，在每条多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4)。在IgG-Fc内，两个CH3结构域彼此紧密结合，而两个CH2结构域彼此之间没有直接的蛋白质-蛋白质接触。正是CH3结构域的紧密结合使二聚体得以形成。因此，在包含IgG-Fc区(或其片段或变体)的本发明的构建体中，优选地所述区域的两条同样的链可以经由CH3结构域相互结合，从而在两条多肽之间提供连接，每条链都含有一条(或一半)Fc区，从而允许二聚体形成。如果使用其他类型的Fc区，则同样优选包括Fc区的允许二聚化的部分。
可以使用经截短、突变或修饰的Fc区(或Fc片段)，例如Fc区的片段或变体，尤其是IgG-Fc区，条件是例如与起始、非突变或野生型Fc区相比，与FcRn相互作用的能力得以维持或存在或改善(例如高或更高亲和力结合)。具有改善的结合的适当突变体是本领域中熟知和描述的，例如YTE或LS突变体，并且可以使用这些中的任何一种。具有(或赋予)改善或增加的半衰期的适当突变体是本领域中熟知和描述的，并且可以使用这些中的任何一种(参见例如，Wang和Brezski中描述的那些突变体，2018,Protein Cell 9(1):63-73，例如表1)。
本发明的构建体中使用的IgG-Fc区可以源自IgG抗体的任何亚型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，使用IgG1、IgG2或IgG3 Fc区，最优选IgG1。在其他实施方案中，不使用IgG4 Fc区。在一些实施方案中，Fc区可以经工程改造或修饰为包括附加或修改的特性，例如附加或修改的效应子功能，可包括诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)反应、补体依赖性细胞毒性(CDC)，或增加的半衰期或抗原和/或Fcγ受体增加的共同接合。也可以使用降低效应子功能的修饰，例如非糖基化或非岩藻糖基化形式，或表现出减少的Fcγ受体结合(Fc沉默)和/或减少的C1q结合的形式。具有(或赋予)这些特征的适当突变体是本领域中熟知和描述的，并且可以使用这些中的任何一种(参见例如，Wang和Brezski中描述的那些突变体，2018,Protein Cell 9(1):63-73，例如表1)。
如以上所提到的，用于本发明的构建体中的适当Fc区(IgG-Fc区)包含CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，可以包括CH4和/或CH1结构域。然而在其他实施方案中，CH2和CH3结构域(或其能够与FcRn相互作用，优选能够二聚化的片段或变体)是构建体中包括的IgG抗体的仅有部分。例如，在一些实施方案中，构建体的部分b)中将不包括轻链抗体结构域，尤其是轻链恒定结构域(CL结构域)。在优选的实施方案中，IgG-Fc区是人IgG-Fc区或犬科动物(例如狗)IgG-Fc区。Fc区的序列及CH1、CH2、CH3和CH4结构域的位置对技术人员来说是容易获得的(参见例如Wang和Brezski，2018，同上)。例如，在本文别处的序列表中提供了示例性的人全IgG Fc序列，从中可以推导出CH1、CH2、CH3和/或CH4结构域，优选CH2和CH3结构域的示例性序列以包含在结构体中。另外，在本文别处提供了示例性的犬科动物(例如狗)IgG Fc序列(包含CH2和CH3结构域)。
由于与FcRn的结合也可以是间接的，因此其他类型的分子，例如自身(或转而)与FcRn结合蛋白，诸如以上所述那些，例如IgG Fc或白蛋白结合蛋白结合的分子也可容易地使用。
例如，蛋白质构建体的部分b)可以介导与血清蛋白诸如白蛋白(例如HSA)结合，例如特异性结合，后者转而会与FcRn结合，或将介导与循环免疫球蛋白分子诸如IgG结合，例如特异性结合。因此，在其中蛋白质构建体的部分b)可以与白蛋白(例如HSA)结合或特异性结合，或与IgG结合或特异性结合的实施方案中，则本发明的构建体还可经由HSA或IgG与FcRn相互作用或结合。换句话说，蛋白质构建体的部分b)结合或靶向FcRn结合配偶体，或与FcRn受体相互作用的试剂。同样，蛋白质构建体的部分b)可以含有抗体片段(例如Fab或其他片段，诸如本文别处所述的sdAb)或可以直接与FcRn特异性结合的其他FcRn结合蛋白(或肽)，例如如本文别处所述的结合蛋白或单结构域结合蛋白。优选的分子将是抗体或基于抗体的分子，诸如那些含有移植到替代支架上的抗体CDR(例如1至6个抗体CDR)的分子。特别优选的分子将是抗体或抗体片段(例如具有1至6个抗体CDR)。优选的抗体片段将是Fab片段或单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，使用sdAb。在一些实施方案中，不使用Fab片段。
因此可以使用实体，例如与IgG结合并将IgG-Fc募集到构建体以便进而与FcRn结合的蛋白质实体，诸如多肽、肽、模拟肽。存在可用于此目的并且可与IgG结合的不同类型实体的许多实例，例如蛋白质实体。优选的分子将是IgG抗体或基于抗体的分子，诸如那些含有移植到替代支架上的抗体CDR(例如1至6个抗体CDR)的分子。特别优选的分子将是抗体或抗体片段(例如具有1至6个抗体CDR)。优选的抗体片段将是Fab片段或单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，使用sdAb。在一些实施方案中，不使用Fab片段。
同样可以使用实体，例如可与白蛋白结合，从而将白蛋白(例如人血清白蛋白)募集到构建体以便进而与FcRn结合的蛋白质实体，诸如多肽、肽、模拟肽。任何白蛋白结合蛋白均可用于该目的。优选的结合蛋白将是抗体或基于抗体的分子，诸如那些含有移植到替代支架上的抗体CDR(例如1至6个抗体CDR)的分子。特别优选的分子将是抗体或抗体片段(例如具有1至6个抗体CDR)。优选的抗白蛋白抗体片段将是Fab片段或单结构域抗体(sdAb)。在一些实施方案中，使用sdAb。在一些实施方案中，不使用Fab片段。
白蛋白(例如HSA)或可与FcRn结合的白蛋白片段或变体，是用于本发明的构建体(直接或间接)的特别优选的分子，因为与IgG-Fc一样，它显示出与FcRn的pH依赖性结合，在如细胞的细胞质或血清或组织(例如间质组织)中发现的生理pH下(pH 7.4左右)下没有结合或低亲和力结合，而在酸性或较低pH(例如内体pH，例如pH 6.5或更低，例如pH 5.0至6.5，或pH 6.0左右或更低的pH，例如pH 5.0至6.0，例如pH 6.0或pH 6.5)下有良好或高或更高亲和力的结合，以使得含有白蛋白的构建体能够从细胞内的内体隔室再循环回到血清中。
同样，可以使用任何其他展示出pH依赖性或内体依赖性FcRn结合的实体，诸如针对白蛋白或IgG-Fc描述的那些。有利地，这种pH依赖性或内体依赖性结合应允许蛋白质构建体(或生物治疗剂或生物制剂)经由再循环途径回收。因此，蛋白质构建体的部分b)优选通过提供与FcRn的相互作用来提供蛋白质构建体再循环的能力，所述相互作用在内体条件下诸如本文别处所述的低pH和/或低钙条件下是稳定的，而在生理或血清条件下诸如本文别处所述的pH 7.4和/或高钙条件下不太稳定或不存在。
在本发明的一些蛋白质构建体中，构建体的部分b)与FcRn的所述结合在内体钙水平下与血清钙水平相比增加，或在内体pH水平(例如在6.0或6.5，或如本文别处所述的其他内体pH水平下)与血清pH水平(例如pH 7.4)相比增加。在本发明的一些蛋白质构建体中，构建体的部分b)与FcRn的所述结合在pH 6.0或6.5下与pH 7.4相比增加。
用于本发明的构建体中的IgG或白蛋白结合蛋白(或FcRn结合蛋白)的方便和优选的实例是单结构域结合蛋白。如本文所用的术语“单结构域结合蛋白”(有时缩写为sdbp)是具有单个蛋白质结构域的单体蛋白，该蛋白质结构域可以单独地介导与特定靶抗原(例如白蛋白或IgG或FcRn)的结合，或者是足以与靶抗原发生特异性相互作用的单个蛋白质单元。换言之，单结构域结合蛋白可以单独与靶抗原(例如白蛋白或IgG或FcRn)特异性结合。因此用于本发明的单结构域结合蛋白是具有单个蛋白质结构域但含有抗原结合位点(例如白蛋白或IgG或FcRn的结合位点)的蛋白质。换言之，sdbp的抗原结合位点仅由单个结构域形成。可以存在任何适当的抗原结合位点。例如，此类单结构域结合蛋白常常将含有一个或多个互补决定区(CDR)以介导抗原结合。可存在三个CDR区，但是抗原结合也可以受甚至一个或两个CDR区介导，尤其是在仅需要低亲和力或中等亲和力结合时。因此，还包括含有一个或两个CDR的sdbp。适当的sdbp可以是天然产生的或源自天然来源，或者可以是工程化或重组分子/结合蛋白的形式。
用于本发明的构建体中的优选单结构域结合蛋白是单结构域抗体(sdAb)，其在本文和本领域中也称为纳米抗体或VHH抗体，或VH抗体或VL抗体。此类单结构域抗体仅包含单个可变抗体结构域，但与完整抗体一样，能够与特定抗原(例如白蛋白或IgG或FcRn)选择性地结合。由于此类单结构域抗体由单个单体可变抗体结构域组成，因此它们比常规抗体小得多，也比Fab或单链可变片段(scFv)或Fv小。
然而，在本发明的构建体中可以使用能够单独地与靶抗原(例如白蛋白或IgG或FcRn)上的表位特异性结合的任何sdbp。例如，除了通常包含CDR区(和任选地FR区或基于免疫球蛋白的支架)的基于免疫球蛋白的sdbp以外，在一些实施方案中，可以使用基于非免疫球蛋白的单结构域结合蛋白/支架蛋白，其可以针对凭其自身实力与特定靶抗原(例如白蛋白或IgG或FcRn)特异性结合的能力进行选择。此类分子也称为抗体模拟物(或模拟抗体)。适当的基于非免疫球蛋白的单结构域结合蛋白的实例是本领域已知和描述的并且包括纤连蛋白(或基于纤连蛋白的分子)，例如基于纤连蛋白III型结构域的第十模块，诸如Adnectin(例如来自Compound Therapeutics,Inc.,Waltham,MA)；affimer(例如来自Avacta)；锚蛋白重复蛋白(例如来自Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)；脂质运载蛋白，例如anticalin(例如来自Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)；人A结构域(例如Avimer)；葡萄球菌蛋白A(例如来自Affibody AG,Sweden)；硫氧还蛋白；和γ-B-晶体蛋白或基于泛素的分子，例如affilin(例如来自Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)。此类分子也可以用作支架，介导靶抗原结合的适当CDR可以移植到支架上。例如，适当的基于免疫球蛋白的sdbp(例如sdAb)的CDR，可以移植到适当的非免疫球蛋白支架上。
尽管用于本发明的构建体中的优选抗体片段是sdAb，但包含一个或多个、两个或更多个、或三个或更多个CDR的其他抗体片段，例如具有6个CDR的抗体片段同样可以使用，诸如scFv、Fab或Fab样分子。在一些实施方案中，不使用Fab或Fab样分子。
用于本发明的构建体中的FcRn结合实体例如白蛋白或IgG-Fc(或其他Fc)或白蛋白或IgG的结合蛋白(或肽)或FcRn可以获自或源自任何适当的来源或物种，或者可以对应于来自此类来源的FcRn结合实体或者可以是其片段或变体。优选的来源是哺乳动物，并且可以使用任何适当的哺乳动物来源，例如人或任何家畜、家养动物或实验室动物。具体实例包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔、马、牛和非人类灵长类动物(例如猴子，例如食蟹猴)。然而，优选地，哺乳动物是人并且序列是或对应于人序列或人源序列。其他优选的哺乳动物是犬科动物(例如狗)。来自不同物种的FcRn结合实体，例如白蛋白或IgG-Fc(或其他Fc)是本领域已知的，因此可以通过标准技术，例如重组技术容易地生成或产生此类FcRn结合实体。例如，下面提供了包含CH2和CH3结构域的犬科动物IgG-Fc序列的示例性序列(SEQ IDNO:33)，因此本发明的优选构建体(例如用于犬科动物中)包含该序列，或任何其他包含犬科动物CH2和CH3结构域的序列，或如本文别处所述与之基本上同源的序列，例如与之具有至少70％、75％、80％等同一性的序列。
KTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
(犬科动物IgG Fc，SEQ ID NO:33，源自基因库AAL 35302)。
同样，用于本发明的构建体中的FcRn结合实体，例如白蛋白或IgG-Fc或白蛋白或IgG的结合蛋白可以是合成分子或重组分子，例如通过文库筛选鉴定的分子。
蛋白质构建体的部分b)中FcRn结合实体的优选FcRn靶标可以是任何期望的物种，例如来自与所选FcRn结合实体获自或源自或对应的物种或来源相同的物种或来源。因此，在FcRn结合实体是人的情况下，则优选FcRn靶标是人FcRn。例如，在FcRn结合实体是犬科动物(例如狗)的时，则优选FcRn靶标是犬科动物(例如狗)FcRn。FcRn靶标的适当物种通常还将取决于要施用本发明的蛋白质构建体的物种(例如哺乳动物物种)。例如，在向人施用的情况下，则构建体的部分b)应能够与人FcRn等结合，这取决于物种。
然而在一些实施方案中，如上文对于构建体的部分a)所述，FcRn结合实体可以与来自其他类型的哺乳动物的FcRn蛋白交叉反应(即显示物种交叉反应性)，其他类型的哺乳动物的实例在本文别处有描述，例如特别优选与来自非人灵长类动物诸如食蟹猴的FcRn的交叉反应性。例如，FcRn结合实体可以与人和非人灵长类两种形式的FcRn特异性结合或与人和啮齿动物(例如小鼠或大鼠)两种形式的FcRn特异性结合。在一些实施方案中，FcRn结合实体对不同物种的靶FcRn的结合亲和力，或FcRn结合实体在使用不同物种的靶FcRn的功能测定中表现的能力优选彼此没有很大差别，例如彼此相差5倍或10倍以内。具体而言，对人FcRn的结合亲和力(或功能活性)优选与对来自另一哺乳动物物种(例如非人类灵长类动物或啮齿动物)的FcRn的结合亲和力(或功能活性)没有很大差别，例如在5倍或10倍以内。
本发明的蛋白质构建体可以以任何适当的方式制造或生成。例如，构建体的各种组分可以在单条多肽链或多条多肽链上编码，然后将各种组分联结或连接在一起。
本发明的蛋白质构建体的各种组分可以以任何适当的方式彼此附接或连接，使得每个部分可以执行它们的功能。在本发明的一些实施方案中，蛋白质构建体将含有介于构建体的不同部分之间，例如介于构建体的部分a)与部分b)之间的接头(物理接头或接头分子，例如至少一个物理接头或接头分子)。例如，所述接头可用于将构建体的CD23分子(或部分a)的CTLD)联结至部分b)的FcRn结合实体，例如，在优选实施方案中，将CD23(或CTLD)单体联结至构成Fc区(例如IgG-Fc区)的多肽链之一。可以使用本领域技术人员熟知的任何适当的接头分子。例如，可以视情况使用肽接头或化学接头或其他共价接头。
通常优选肽(蛋白质)接头。可以包含非天然或天然氨基酸的此类肽接头是本领域熟知的，因此技术人员可以容易地选择具有适当序列、长度和/或柔性/刚性的适当接头，以便允许本发明的蛋白质构建体的各种组分以稳定的方式附接在一起，但具有正确的空间取向或空间优化，使得单独的组分一旦彼此附接，上述所需的功能特性(即每种组分的功能特性)就得以保留。例如，在一对(两个)CD23分子(或片段或变体)的情况下，例如如图1的示意图所示，该对的两个成员(例如两个单体)优选需要适当靠近才能够结合单个靶IgE分子(一个CD23分子结合IgE Fc二聚体的每条链，在本文中也称为顺式结合)，与例如两个靶IgE分子(有时在本文中称为反式结合)完全不同，并且可以适当地设计肽接头，或其他附接手段。
然而，另外或可替代地，具有此类接头或其他适当接头的构建体也可以连接例如两个靶IgE分子(例如经由两个CD23分子，优选单体，一个CD23分子与每个单独的IgE分子结合)。此类连接也可以称为反式结合连接，其中本发明的一个优选的蛋白质构建体(例如包含至少两个CD23分子/单体)经由两个CD23分子(单体)连接到两个IgE靶分子。然后可以形成高级结构，例如如本文别处所述，例如牵涉本发明的多个蛋白质构建体和多个靶IgE分子。据信，最稳定的结构或高级结构(因此在一些实施方案中是优选的)是如本文别处所述，其中IgE分子上的所有CD23结合位点都被占据的那些结构。因此，允许形成此类构象和结构的接头是适当的。
尽管本发明的构建体不一定必须以融合蛋白的形式提供，其中例如连接形成构成部分a)和部分b)的多肽，但是优选其中部分a)和b)连接在一起成单条多肽或蛋白质链的一种基因融合物、多种基因融合物或构建体。出于这个原因，优选的接头是肽或蛋白质(多肽)接头。可以使用任何适当的肽接头，条件是该接头不干扰构建体的部分a)或部分b)的功能或实际上构建体的任何其他部分的功能。
因此，接头或间隔区可以帮助连接的蛋白质折叠，并且可以视情况调整间隔区或接头的长度和/或柔性/刚性，以实现每种组分最佳或令人满意的功能折叠。适当的长度可以由本领域技术人员容易地确定并且可以是任何适当数目的氨基酸。然而，示例性的长度可以是至少5、10、15、20、25、30、35、40或45个氨基酸长(例如至少6、7、8或9个氨基酸长，或至少11、12、13或14个氨基酸长)，或介于5或10至50个氨基酸之间，例如5或10至15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸，或15至20、25、30、35、40、45或50个氨基酸，或20至25、30、35、40、45或50个氨基酸，或25至30、35、40、45或50个氨基酸，或30至35、40、45或50个氨基酸。优选的接头可以是15至30个氨基酸长，例如可以是或长达15、20、25或30个氨基酸(或长达40或50个氨基酸)。示例性接头在本领域中有描述并且可以包括GS接头，诸如一个或多个G4S接头(GGGGS，SEQ ID NO:16)的重复序列。在所附实施例中使用的构建体中使用的接头具有序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:17)，即3个GGGGS重复序列。也使用具有4个重复序列的接头。因此该接头对于本发明的一些实施方案是优选的，例如当蛋白质构建体具有或能够形成如图1所示的构造时，但应理解也可以使用具有其他序列和长度的接头(间隔区)，例如其他GS接头或具有相同、相似或等效长度的其他适当接头。例如，还已证实具有4或6个重复序列的GGGGS接头是有效的并且是优选的。同样可以使用具有5或7个或更多个重复序列的接头，条件是保留了构建体的相关功能特性。
事实上，已经证实接头例如肽接头的存在会在功能性方面为本发明的构建体提供优势。因此，正如从实施例中的数据可以看出，已经证实与没有接头存在的构建体相比，在构建体的部分a)与b)之间，例如在包含CD23的部分与FcRn结合实体(例如构成Fc区的多肽链)之间存在接头引起抑制靶抗原IgE活性的能力提高(或增加)。具体地，与没有接头存在的构建体相比，抑制IgE与高亲和力受体FcεRI结合的能力提高(或增加)。另外，测试的最长的接头长度(此处为20个氨基酸)显示出最佳的功能特性。因此，用于本发明的适当接头可以是与没有接头存在(或存在例如具有少于五个氨基酸的短接头)的构建体相比，引起抑制靶抗原IgE活性的能力提高(或增加)的任何接头。具体地，与没有接头存在(或存在例如具有少于五个氨基酸的短接头)的构建体相比，引起抑制IgE与高亲和力受体FcεRI结合的能力提高(或增加)的任何接头都将是适当的。
选择接头的性质和其他特性，诸如适当的接头长度，例如以实现与对示例构建体中使用的接头所观察到的那些相同(或相似)的效果，将是本领域技术人员的标准和常规程序。例如，在本发明的某些实施方案中，例如在涉及具有或能够形成如图1所示的结构的蛋白质构建体(例如形成具有本文所述的顺式相互作用的结构)的情况下，可以选择适当的接头长度和/或结构/性质，允许两个(或一对)CD23分子与同一IgE Fc的每条链结合，从而优选地允许借助于亲合力效应提高总结合亲和力。对于蛋白质构建体中能够连接不同IgE分子并形成具有如本文所述的反式相互作用的结构，尤其是如本文所述的高级结构或寡聚体的接头，可以进行类似选择，从而还优选地允许借助于亲合力效应提高总结合亲和力。可以选择的适当接头的其他特征对于本领域技术人员将是熟知的并且可以容易地选择。例如，优选地接头将不是抗原性的或含有蛋白酶裂解位点。
使用肽接头的一个优点是它能够作为单个多肽产生(如上所述)。然而，也可以使用任何其他适当的附接手段，例如任何其他形式的接头，包括化学接头，条件组分一旦彼此附接，连接在一起的各种组分的功能特性(如本文别处所讨论的)就得以保留。
因此，可以将本发明的分子视为包含两个主要的分子组分或模块。通常，构建体的部分a)和b)是独立组分，它们通过任何适当的手段彼此附接或连接以保留所有组分的功能性。在提供单条多肽链并且存在单个CD23分子(或片段或变体)的实施方案中，则CD23分子(或片段或变体)可置于链的N端或C端，更优选置于N端。然后FcRn结合实体可以方便地置于多肽链的另一末端，优选置于C端。如本文别处所述，可以包括接头。当然可以设想替代构造，条件是所有组分都保留其生物学功能。
在提供单条多肽链并且存在两个CD23分子(或片段或变体)的实施方案中，则CD23分子(或片段或变体)可置于链的N端和C端(每个末端一个分子)，在中间有FcRn结合实体。如本文别处所述，可以包括接头。示例性的FcRn结合实体在本文别处有描述，但在这些方面优选的可能是单链(例如单结构域)抗体或单链(例如单结构域)结合蛋白。其他优选的FcRn结合实体可以是如本文别处所述的白蛋白分子。因此，示例性构建体可包含两个CD23分子(或片段或变体)和白蛋白，或两个CD23分子(或片段或变体)和对FcRn有特异性的单结构域抗体(或其他单结构域结合蛋白)。任选地且优选地，例如在CD23分子与FcRn结合实体之间可以存在接头。
当然可以设想替代构造，条件是所有组分都保留其生物学功能。因此，在具有两个CD23分子(或片段或变体)的此类单链实施方案中，两个CD23分子(或片段或变体)可以一起(串联或彼此相邻)存在于链的N端或C端一半(或末端)并且FcRn结合实体然后可以方便地置于多肽链的另一半(或末端)。示例性组分如上文和本文别处所述。因此，示例性构建体可包含彼此相邻的两个CD23分子(或片段或变体)和白蛋白，或彼此相邻的两个CD23分子(或片段或变体)和对FcRn有特异性的单结构域抗体(或其他单结构域结合蛋白)。任选地且优选地，接头可存在于例如两个单独的CD23分子之间和/或将两个CD23分子(一起存在)联结到FcRn结合实体。
方便地，在蛋白质构建体包含两条多肽链的本发明的实施方案中，CD23分子(或片段或变体)可置于两条链中每条链的N端或C端，更优选地置于N端。然后FcRn结合实体可以方便地置于多肽链的另一末端。在可与FcRn结合的实体(即构建体的部分b))本身由两条多肽链构成，例如是IgG-Fc结构域的实施方案中，特别优选具有两条多肽链的构建体。此类构建体的示例性结构如图1所示，其中构建体的第一条链(一条链)包含CD23(CD23的CTLD)和IgG-Fc的一条链并且构建体的第二条链(另一条链)包含第二CD23(CD23的CTLD)和IgG-Fc的另一条链。CD23分子通过适当的接头连接到单独的IgG-Fc链，并且两条多肽链经由IgG-Fc的两条链经由CH3结构域的自然缔合连接在一起。在优选的构建体中，基于CD23的分子可以置于N端，经由接头连接至C端的FcRn结合实体。类似的结构可以用于并且优选用于如本文别处所述的其他部分a)和部分b)的分子。同样，一些构建体可以含有四个单独的CD23分子并且方便地，在所述构建体中，CD23分子可以置于两条多肽链的N端和C端，FcRn结合实体介于每条链上的两个CD23分子之间。同样，一些构建体可以含有四个、八个或多个四个拷贝的线性排列的单独CD23分子并且方便地，在所述构建体中，CD23分子可以置于两条多肽链的N端和C端，FcRn结合实体介于每条链上的CD23分子之间。接头优选用于将两个CD23分子中的每一个连接到每条链上的FcRn结合实体。
术语“融合蛋白”、“融合物”等在本文中用于描述同一多肽序列或同一开放阅读框(ORF)中的两个或更多个蛋白质组分的功能性联结。此类融合蛋白的实例也可以描述为基因融合物，因为它们是由相同的核酸序列(有时称为“融合基因”或“融合核苷酸序列”)编码的。尽管在此类融合蛋白中两种(或更多种)蛋白质组分(或编码核酸序列)可以彼此直接相邻，但同样且优选地，这些组分可以通过适当的肽间隔区或接头联结。如本领域熟知的，间隔区或接头对于允许每种单独的蛋白质组分以功能方式表达可能很重要，例如允许它们形成适当的三维结构以执行或维持其天然或所需的功能。
因此，在本发明的蛋白质构建体中存在的融合蛋白中，通常在CD23分子(或片段或变体)，例如包含CD23(或片段或变体)的CTLD的分子，即构建体的部分a)与FcRn结合实体，即构建体的部分b)之间包括肽间隔区(或接头)。因此，此类构建体可含有至少一个接头。通常，在包括两个(或多个)包含可溶性CD23(或CD23的CTLD)的分子(或单体)的实施方案中，则包括两个(或多个)或至少两个接头，使得例如每个CD23单体(分子)单独地(经由接头)连接到可以与FcRn结合的实体(构建体的部分b))，但同样地，在两个或更多个CD23单体/分子一起，例如串联(或连续地)存在于构建体中的实施方案中，则CD23单体(或分子)中只有一个可以(经由接头)连接到可以与FcRn结合的实体((构建体的部分b))。因此，优选地每个CD23单体都具有接头。例如，当构建体中存在两个、四个或六个等CD23单体/分子时，则可以分别存在两个、四个或六个等独立接头(每个CD23单体/分子一个接头)。在其他实施方式中，不需要包括此类接头或间隔区，或者可以仅在一些组分之间包括。然而此类接头的存在是优选的，因为已经证实这导致构建体的功能性显著改善。
尽管该讨论侧重于构建体的部分a)与部分b)之间的接头或间隔区，但视情况在本发明的构建体中的其他地方，例如在可能存在的构建体的其他组分之间也可以包括接头序列。
可以使用本领域标准的方法产生或选择如本文所述的本发明的蛋白质构建体的部分a)和b)的各种组分，然后以任何适当的方式连接或附接在一起，使得所有组分保留其如本文所述的功能特性。因此，在优选实施方案中，CD23(或片段或变体)的单个或多个拷贝，例如包含识别一个或多个IgE分子的CD23(或片段或变体)的CTLD的分子的单个或多个拷贝，附接或连接到一个或多个可与FcRn结合的实体以形成蛋白质构建体，所述蛋白质构建体将在空间上定向sCD23分子(或片段或变体)，使得它们可以结合IgE并且在空间上定向FcRn结合实体，使得它们可以结合FcRn。
在使用可以与靶抗原(例如IgG、白蛋白或FcRn)结合的单结构域结合蛋白(sdbp)的实施方案中，这些可以通过本领域熟知和描述的方法适当地得到。例如，用于本发明方法中的sdAb可以通过本领域熟知和标准的方法产生，例如通过用所需抗原免疫骆驼科动物诸如单峰驼、骆驼、美洲驼或羊驼，或其他物种诸如大鼠或小鼠(例如以能够表达全功能人重链抗体的转基因动物的形式)，然后通过适当的方法筛选sdAb，例如通过从免疫动物的淋巴细胞制备和筛选基因文库，例如噬菌体展示文库，以得到对靶抗原具有所需亲和力的抗原特异性结合物。
可替代地，可以通过筛选从尚未免疫的适当动物制备的原初基因文库来生成或鉴定sdAb。可替代地，可以通过筛选可以结合靶抗原的单个VH或VL结构域，从常规抗体或抗体片段或合成文库制备sdAb。
在对靶抗原(例如IgG、白蛋白或FcRn)具有特异性的sdbp包含纤连蛋白(例如adnectin)、affimer、锚蛋白重复蛋白、脂质运载蛋白(例如anticalin)、人A-结构域(例如Avimer)、葡萄球菌蛋白A、硫氧还蛋白和γ-B-晶体蛋白或基于泛素的分子(例如affilin)的实施方案中，同样这些可以使用本领域所述方法生成或选择。
可以容易地选择以低亲和力、中等亲和力或高亲和力(根据需要)与靶抗原(例如IgG、白蛋白或FcRn)结合的单独sdbp(例如sdAb)，例如通过在适当的严格条件下进行选择。
在各种组分与靶抗原例如sdbp(例如sdAb或其他抗体分子或抗体片段)的结合对pH敏感(或内体敏感)的本发明的实施方案中，然后通过以下方式测试如上所述针对与靶抗原的单独低亲和力、中等亲和力或高亲和力结合选择的组分或分子的pH敏感性(例如内体pH敏感性)结合：测试在酸性pH例如pH 6.5或pH 6.0(或选定的较低pH)下它们结合靶抗原的能力并且选择在酸性pH例如pH 6.5或pH 6.0等下具有良好或高亲和力结合，但在中性pH例如pH 7.4下结合减少的分子。可以在如本文别处所述的低(内体)钙和高(生理)钙浓度条件下进行类似选择，以选择显示钙依赖性(或其他类型的内体依赖性)结合的分子。
示例性的高亲和力结合物可具有<1nM的Kd，中等亲和力结合物可具有≥1nM至<50nM的Kd，而低亲和力结合物可具有≥50nM的Kd。
可替代地，一种或多种单独的组分或分子，例如sdbp(例如sdAb或其他抗体分子或抗体片段)可以进行蛋白质工程改造，例如通过在如上所述的测试之前，修饰或突变CDR或其他氨基酸残基，以便产生显示pH敏感性或其他类型的内体敏感性结合的单独分子。产生pH敏感性分子的优选方法是对CDR或其他氨基酸残基进行组氨酸工程改造，如本领域熟知和描述的。
在本发明的蛋白质构建体包含抗原结合片段(抗体片段)诸如Fab片段的实施方案中，这些可以通过本领域熟知和描述的方法适当地得到，例如通过用目标靶实体免疫动物，接着制备和筛选抗体片段的适当文库，以得到与适当靶实体(例如例如HSA、IgG或FcRn)结合的片段。可替代地，可以筛选现有文库以得到对与靶实体结合的适当抗体片段，或者可以使用与所选靶实体结合的已知或已经描述的抗体片段。可替代地，适当的抗体片段可以从可以与适当的靶实体结合的常规完整抗体制成并且使它们进行适当的蛋白质工程改造或裂解。
如有必要，本发明的蛋白质构建体的一种或多种组分可以在人临床使用之前进行人源化，或者可以视情况修饰以与对任何待治疗的非人物种的施用相容。同样，这样做的适当方法和技术是本领域中是熟知和描述的。用于本发明的蛋白质构建体中的，例如用于结合靶抗原的本发明的蛋白质构建体的优选组分，将不含用于翻译后修饰的潜在位点，尤其是在CDR区或其他结合位点内。翻译后修饰的潜在位点可以通过本领域公认的标准定义的标准来确定。
虽然不希望受理论束缚，但据信，当使用本发明的构建体时，一个或多个IgE分子被捕获或结合到本发明的蛋白质构建体的部分a)，例如结合到可溶性CD23或其片段或变体，例如包含CD23(或其片段或变体)的CTLD的分子。蛋白质构建体与IgE之间的复合物(构建体-IgE复合物)被胞吞或胞饮，被内体摄取并进入胞吞途径。随着内体中的pH下降，本发明的蛋白质构建体的部分b)与FcRn结合并且再循环到细胞表面(构建体在中性pH例如7.4左右的血清pH下从FcRn释放或解离，并且因此自由结合更多的IgE靶标)，而内体中钙浓度(或pH)的下降导致IgE从构建体的部分a)(例如基于CD23的部分)释放或解离，然后IgE(未结合的或游离的IgE)进入溶酶体降解途径并且受到破坏。图2中示出了证明本发明构建体的作用模式的示意图。
事实上，本文的实验结果显示，使用本发明的构建体观察到IgE摄取的效率极高，例如细胞的IgE摄取高达100％且IgE保留或降解高达98％，没有可测量的IgE再循环。另外，还显示蛋白质构建体(生物制剂)经由FcRn结合再循环到血清中也效率极高，例如物制剂回收率高达98％。这与奥马珠单抗观察到的结果形成对比，其中也观察到高达100％的细胞IgE摄取，但高达55％的IgE再循环。
因此，本发明的优选构建体使得至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％捕获(或结合)的IgE在摄取后保留在细胞中和/或在细胞中降解。本发明的构建体这样做的能力可以通过任何适当的测定法来测量。方便地，这可以使用适当细胞通过体外测定法来评估，例如再循环和细胞摄取测定法，例如如实施例3中所述，或简单的IgE摄取或降解测定法。本发明的优选构建体显示出在细胞摄取后至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的再循环水平，尤其是空载构建体(即不再与IgE靶标结合的构建体)的再循环。本发明的构建体这样做的能力可以通过任何适当的测定法来测量。方便地，这可以使用适当细胞通过体外测定法来评估，例如再循环和细胞摄取测定法，例如如实施例3中所述。
高效空(空载)生物制剂再循环和IgE摄取/降解/细胞内保留的这两种特性相组合，可以有利地引起更深度的IgE阻抑、增强的药物作用持续时间(增加的半衰期)和更低的维持剂量。发明人因此相信本发明的构建体提供了一类用于靶向IgE的新型生物治疗剂(生物制剂)。
可以容易地操纵本发明的蛋白质构建体以根据需要包括其他组分或功能。例如，可以包括的组分可以赋予分子细胞杀伤活性的组分，或者可以修饰或调整构建体使得例如存在ADCC、CDC或ADCP活性。在此类情况下，本发明的构建体可用于例如经由构建体的部分a)，例如经由构建体的CD23部分靶向细胞表面上表达的膜IgE，然后可以杀伤在表面表达膜IgE的细胞。因此，这将允许直接靶向和杀伤表达IgE的细胞，例如B细胞，例如已受到刺激以表达膜IgE的B细胞/表达IgE的B细胞、浆母细胞或浆细胞。应该注意的是，在将会通过上述方法靶向的表达膜IgE的细胞与具有表面IgE，例如因为IgE已与细胞表面受体例如FcεRI结合，优选将不会被靶向的细胞之间存在区别。在这方面，表达IgE膜形式的细胞含有在可溶性IgE上(或在与例如FcεRI结合的IgE上)不存在的C端延伸，包括短的胞质尾和跨膜结构域，使其作为B细胞受体的一部分仅呈现在表达IgE的B细胞的细胞膜上。
在本发明的所有实施方案中，蛋白质构建体是人造构建体，因为它们不对应于天然存在的分子，但构建体的一些单独组分可对应于天然蛋白质或分子(或其部分)。换言之，本发明的蛋白质构建体是非天然的。此类蛋白质构建体因此可以被视为重组构建体或工程化构建体，例如通过本领域熟知的基因工程或重组工程技术制成。
尽管以上讨论侧重于描述本发明的蛋白质构建体，但方便地使用编码所有或部分此类蛋白质构建体的适当核酸分子来制备或产生所述蛋白质构建体。
因此，可以看出，包含编码如本文所定义的本发明的蛋白质构建体(优选重组蛋白质构建体)，或其部分(例如蛋白质构建体的单链或第一条链或第二条链)或片段的核苷酸序列的核酸分子，例如一个或多个核酸分子(例如，一组核酸分子)，形成本发明的更多方面。包含此类核酸分子，例如一个或多个核酸分子的表达载体，以及包含所述表达载体或核酸分子或蛋白质构建体的宿主细胞形成更多方面。
通常，将编码本发明的蛋白质构建体的所述一个或多个核酸片段并入一种或多种适当的表达载体中以便促进本发明的蛋白质构建体(例如重组蛋白质构建体)的产生。
因此本发明考虑了一种表达载体，例如一种或多种表达载体，例如一种或多种重组表达载体，所述表达载体含有或包含本发明的核酸分子，以及由本发明的核酸分子编码的蛋白质序列转录和翻译所必需的调控序列。所述载体还可以含有使抗生素抗性和载体复制成为可能的序列。合适的载体和调控序列将是本领域技术人员熟知的。
本发明的表达载体(例如重组表达载体)或本发明的核酸分子可以引入宿主细胞中以产生转化的宿主细胞。术语“用......转化”、“用......转染”、“转化”和“转染”旨在涵盖通过本领域已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体)引入细胞中。转化和转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等人，1989(Sambrook,Fritsch和Maniatis,MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,NY,1989)和其他实验室教科书中找到。
合适的宿主细胞包括多种真核宿主细胞和原核细胞。例如，本发明的分子可以在酵母细胞或哺乳动物细胞或原核细胞(诸如大肠杆菌(Escherichia coli)或毕赤酵母(Pichia pastoris))中表达。
本发明的另一方面提供了一种产生本发明的蛋白质构建体的方法，该方法包括培养本发明的宿主细胞的步骤。优选方法包括以下步骤：(i)在适于所编码的蛋白质构建体表达的条件下培养包含重组表达载体中的一种或多种或本发明的核酸序列中的一种或多种的宿主细胞；并且任选地(ii)从所述宿主细胞中或从生长培养基/上清液中分离或获得所表达的蛋白质构建体。此类生产方法还可包括纯化蛋白质产物和/或将蛋白质产物配制成包含至少一种附加组分诸如药学上可接受的载剂或赋形剂的组合物的步骤。
由于本发明的优选重组分子/蛋白质构建体由两条(或更多条)同样的多肽链构成(例如每条链含有通过肽接头连接至IgG-Fc链的CD23分子)，那么在此类实施方案中，单条适当的多肽链在宿主细胞中表达，使得本发明的完整蛋白质构建体可以在宿主细胞中组装并从中分离或纯化。
本发明的蛋白质构建体可以通过本领域技术人员熟知的标准方法产生、纯化或分离。然而，本发明的又一个方面包括使用IgE Fc(或其片段(例如功能片段)或变体)已经固定到其上(并且然后可用于捕获构建体中的CD23分子)的亲和基质(例如亲和柱或其他固相)进行此类纯化或分离步骤。因此，此类亲和基质也可以用于制造或生产蛋白质构建体的方法中。
在此类方法中，此类生产、纯化或分离可通过将IgE Fc已经固定到其上的亲和基质(例如亲和柱或其他固相)与本发明的构建体在使得构建体(尤其是构建体中的CD23分子)与亲和基质上的IgE Fc结合的条件下接触来进行。此类条件可以方便地且优选地是对应于如本文别处所述的血清(或生理)钙或pH水平(例如1至2mM的钙水平或pH 7.4或左右的pH)的那些条件。此类结合步骤之后可以是在使得构建体(尤其是构建体中的CD23分子)不再与亲和基质上的IgE Fc结合(或从亲和基质上的IgE Fc释放)的条件下进行的洗脱步骤(即从亲和基质上洗脱构建体的步骤)。此类条件可以方便地且优选地是对应于如本文别处所述的内体钙或pH水平(例如3-30μM的钙水平或为或约pH 5.0至6.5的pH，例如6.0或6.5的pH)的那些条件。此类洗脱步骤转而使得本发明的蛋白质构建体的分离、纯化、生产或制造成为可能。
包含本发明的蛋白质构建体(或本发明的核酸分子或表达载体)的组合物构成了本发明的更多方面。包含与合适的稀释剂、载剂或赋形剂混合的本发明的一种或多种蛋白质构建体(或核酸或表达载体)的制剂(组合物)构成本发明的优选实施方案。此类制剂可以用于药物用途(是药物组合物)并且因此本发明的组合物优选是药学上可接受的。合适的稀释剂、赋形剂和载剂是技术人员已知的。
根据本发明的组合物可以例如以适于口服、鼻腔、肠胃外、静脉内、局部或直肠施用的形式呈现。除非另有说明，否则施用通常通过肠胃外途径，优选通过皮下、肌内、囊内、鞘内、腹膜内、肿瘤内、经皮或静脉内注射。在一些实施方案中，优选皮下施用。
本文定义的本发明的蛋白质构建体可以以常规药理学施用形式呈现，诸如包衣片剂、鼻腔或肺喷雾剂、溶液、脂质体、粉剂、胶囊或缓释形式。可以采用常规的药物赋形剂以及普通的生产方法来制备这些形式。
例如，注射液可以以常规手段生产，诸如通过添加合适的防腐剂或稳定剂。然后将溶液填装到注射小瓶或安瓿中。
鼻喷雾剂可以类似地在水溶液中配制并包装到喷雾容器中，所述喷雾容器具有气溶胶推进剂或提供有手动压缩装置。
肠胃外施用可以借助于注射器，任选笔-样注射器通过皮下、肌内或静脉内注射进行。可替代地，可以借助于输注泵进行肠胃外施用。另一选择是可以是粉末或液体的组合物，用于以鼻喷雾剂或肺喷雾剂的形式施用所述分子或蛋白质构建体。作为更进一步的选择，本发明的分子或蛋白质构建体也可以经皮施用，例如从贴剂，任选地离子电渗贴剂经皮施用，或经粘膜，例如经颊施用。
合适的剂量单位可由本领域技术人员确定。
在联合施用方案的背景下，药物组合物可以另外包含其他活性成分。
如本文所定义的本发明的蛋白质构建体可用作体外或体内应用和测定的分子工具。因此，本发明的其他方面提供了包含如本文所定义的本发明的分子或蛋白质构建体的试剂以及此类分子或蛋白质构建体例如在体外或体内测定中作为分子工具的用途。
本发明的蛋白质构建体(例如重组蛋白质构建体)具有明确的治疗用途。例如，本发明的蛋白质构建体(例如重组蛋白质构建体)可用于治疗或预防将受益于用可与IgE结合的治疗性分子的治疗的任何疾病，即可用于任何抗IgE疗法。由于本发明的分子靶向并优选消除IgE，因此用本发明的构建体治疗的优选疾病是由高或异常的IgE水平介导或与之相关或以之为特征的那些疾病或病状，所述高或异常的IgE水平例如在循环或组织中以高或异常(例如异常高或非常高或病理性)的浓度，例如对于用常规抗IgE抗体进行有效治疗而言太高的浓度存在的高或异常的游离或可溶性IgE水平。如本文别处所述，本发明的蛋白质构建体还可用于靶向和消除或杀伤表达膜IgE的细胞，例如表达膜IgE的B细胞、浆母细胞或浆细胞。在此类实施方案中，方便地组分，例如附加组分，可以包括在构建体中，或附接至构建体中，所述组分可以赋予分子或构建体细胞杀伤活性，例如通过使用有效载荷或毒素使得ADCC活性或其他类型的细胞杀伤成为可能。因此，本发明的蛋白质构建体可用于治疗或预防将受益于表达膜IgE的此类细胞的减少、去除或杀伤的任何疾病。
因此本发明进一步提供了用于疗法中的本发明的蛋白质构建体，优选重组蛋白质构建体。
因此本发明进一步提供了本发明的蛋白质构建体，优选重组蛋白质构建体，用于治疗或预防任何IgE相关疾病或病状，例如用于治疗或预防将受益于降低IgE水平的任何疾病或病状，或治疗或预防与IgE水平或表达膜IgE的细胞水平升高或异常(例如异常增加)相关或以之为特征的任何疾病或病状。可以使用本发明的蛋白质构建体治疗或预防的特定疾病或病状的实例包括过敏性疾病和哮喘(包括过敏性和非过敏性哮喘)。
术语“过敏性疾病”应根据其在医学领域中的含义来理解。具体而言，本发明含义内的过敏性疾病包括特征在于对抗原的过敏和/或特应性免疫反应，从而在患有过敏性疾病的患者中产生过敏和/或特应性症状的疾病。术语“过敏性疾病”尤其包括特征在于循环IgE水平升高的疾病。过敏性疾病通常特征在于产生抗原特异性IgE和所产生的IgE抗体效应。如本领域熟知的，IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE受体结合。在随后暴露于被IgE识别的抗原时，抗原与肥大细胞和嗜碱性粒细胞上的IgE交联，导致这些细胞脱粒。
过敏性疾病的优选实例是过敏性哮喘、过敏性鼻炎(诸如季节性过敏性鼻炎和常年性过敏性鼻炎)和特应性皮炎。
过敏性和非过敏性哮喘是特征在于以下的临床病症：气道炎症；可逆性的气道阻塞；和增加的敏感性，称为高反应性。气流阻塞是通过一秒内用力呼气量(FEV I)的减少来衡量的，该减少是通过与基线肺活量测定法比较获得的。气道的高反应性是通过FEVI响应于极低水平的组胺或乙酰甲胆碱的降低来识别的。气道暴露于过敏原可加剧高反应性。过敏性测试可有助于鉴定持续性哮喘患者的过敏原。常见过敏原包括宠物毛屑、尘螨、蟑螂过敏原、霉菌和花粉。常见呼吸道刺激物包括烟草烟雾、污染物以及燃烧木材或气体产生的烟气。
过敏性鼻炎是一种以鼻塞、流涕、打喷嚏和瘙痒为特征的临床病症。这些症状的严重程度每年可有所不同，偶尔会自发缓解。因此，过敏性鼻炎根据症状是发生在某些季节(SAR或季节性过敏性鼻炎)还是全年(PAR或常年性过敏性鼻炎)进行分类。季节性变化通常是由依赖风进行异花授粉的植物诸如草、树木、杂草和霉菌孢子的花粉引起的。如果过敏性鼻炎不治疗或治疗不足，可发生严重的并发症，诸如鼻息肉、复发性鼻窦炎、复发性耳部感染和听力损失。社会心理影响可包括经常缺勤或旷课、表现不佳、食欲不振、不适和慢性疲劳。
特应性皮炎是一种皮肤病症，牵涉皮肤内的超敏反应，其特征在于炎症、瘙痒和脱屑。特应性皮炎可以以婴儿或成人形式发生。通常有哮喘、枯草热、湿疹、银屑病或其他过敏性疾病或过敏相关病症的家族史。在成人中，它通常是一种慢性病状。神经性皮炎也是特应性皮炎的一种形式并且可以治疗。其特征在于自我延续的抓痒循环。尽管症状在有应力时会增加，但是也存在神经纤维的生理变化。皮肤会发生超敏反应，导致慢性炎症。
适于治疗的其他疾病包括其他高IgE综合征、过敏性支气管肺曲霉病和其他曲霉病相关病状、特发性过敏反应、过敏反应、大疱性类天疱疮、寻常型天疱疮、荨麻疹(例如慢性荨麻疹)、鼻息肉病、慢性鼻窦炎、肥大细胞增多症和其他肥大细胞病症、特应性角膜结膜炎、胃肠道嗜酸性粒细胞疾病(包括嗜酸性粒细胞胃肠炎、溃疡性结肠炎、炎症性肠病、乳糜泻和克罗恩病)。
除了对非食物相关物质(包括昆虫、黄蜂、蜜蜂或蜘蛛的毒液)、治疗药物(包括抗生素和化学治疗剂)、放射剂、乳胶、橡胶和其他潜在过敏材料的IgE相关过敏敏感性外，还可以治疗对食品的过敏(食物过敏)，所述食品包括但不限于花生、牛奶、小麦、大豆、鸡蛋、桃子、猕猴桃、芝麻、海鲜、鱼等。
也可以治疗IgE可以起作用的自身免疫和炎症性适应症，包括但不限于狼疮性肾炎、SLE、多发性硬化、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺病、类风湿性关节炎、神经炎性病症。因此这些疾病也适合用本发明的构建体治疗。
本发明还提供了本发明的蛋白质构建体(优选重组蛋白质构建体)在制造用于疗法中或用于治疗或预防上面提到的任何疾病或病状的药物或组合物中的用途。
本发明还提供了一种治疗或预防上面提到的任何疾病或病状的方法，其中所述方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的蛋白质构建体(优选重组蛋白质构建体)的步骤。
本发明的核酸分子或表达载体同样可用于本文所述的治疗方法中。
如本文所述的体内方法和用途通常在哺乳动物中进行。可以治疗任何哺乳动物，例如人和任何家畜、家养动物或实验室动物。具体实例包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔、马、牛和猴子(例如食蟹猴)。然而，优选地，哺乳动物是人。另一种优选的哺乳动物是犬科动物(例如狗)。
因此，如本文所用的术语“患者”或“受试者”包括如上所述的任何哺乳动物，例如人和任何家畜、家养动物或实验室动物。然而，优选地，患者是人类受试者。因此，根据本发明治疗的受试者或患者将优选为人。另一优选的受试者或患者是犬科动物(例如狗)。
治疗有效量将基于临床评估确定并且可以容易地监测。
本发明的组合物及方法和用途可以与其他治疗剂和诊断剂组合使用。
本发明还包括试剂盒，所述试剂盒包含本发明的一种或多种蛋白质构建体或组合物，或编码本发明的蛋白质构建体的一种或多种核酸分子，或包含本发明的核酸分子的一种或多种表达载体(例如重组表达载体)，或包含本发明的表达载体(例如重组表达载体)或核酸分子的一种或多种宿主细胞。优选地，所述试剂盒用于如本文所述的方法和用途中，例如，用于如本文所述的治疗方法中，或用于如本文所述的体外测定或方法中。优选地所述试剂盒包含试剂盒组分的使用说明书。优选地所述试剂盒用于治疗或预防如本文别处所述的疾病，并且任选地包含使用试剂盒组分治疗或预防此类疾病的说明书。
如整个申请中所用，术语“一”和“一个(种)”在某种意义上使用，它们意指所引用的组分或步骤中的“至少一个(种)”、“至少第一个(种)”、“一个(种)或多个(种)”或“多个(种)”组件或步骤，除了其中在其后明确规定了上限的情况以外。
另外，在本文使用术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“具有(has)”或“具有(having)”或其他等效术语的情况下，则在一些更具体的实施方案中，这些术语包括术语“由......组成”或“基本上由......组成”或其他等效术语。
如本文所讨论的“由”各种组分和特征“组成”的列表也可以指“包含”各种组分和特征的列表。
如本文所用，术语“亲合力”描述蛋白质之间多键相互作用的组合强度。因此亲合力与亲和力不同，亲和力描述单键强度。因而，亲合力是键亲和力的组合协同(协作)强度，而不是键的总和，有时称为功能亲和力或相对亲和力或总亲和力。
如本文所用，术语“约”或“左右”是指数值变化，数值变化例如可根据所使用的方法，通过测量或测定这些值时的典型实验误差而发生。在一些实施方案中，术语“约”或“左右”意指在报告数值的10％以内，优选在报告数值的5％或2％以内。
如本文所用，术语蛋白质或多肽是指由任何类型的氨基酸组成或包含任何类型的氨基酸的任何分子。因此包括含有天然和/或非天然或经修饰或合成的氨基酸的分子。类似地，如本文所用的术语核酸分子或核酸是指由任何类型的核苷酸组成或包含任何类型的核苷酸的任何分子。因此包括含有天然和/或非天然或经修饰或合成的核苷酸的分子。
如本文所提到的术语“降低”或“减少”(或等效术语)包括与适当对照相比时的任何可测量的降低或减少。优选地此类降低或减少(和实际上如本文别处所提到的其他降低、减少或负效应)是与适当的对照水平或值相比时，显著的减少，优选临床上显著或统计上显著的减少，例如概率值<0.05。适当的对照将由本领域技术人员容易地鉴定，并且可以包括例如在不存在本发明的构建体时与存在所述构建体相比(例如与未处理的样品相比)，或在不存在(或存在)本发明的构建体的特定特征时与存在(或不存在)所述特征相比(视情况而定)观察到的参数或功能特性的水平。
如本文所提到的术语“增加”或“增强”(或等效术语)包括与适当对照相比时的任何可测量的增加或增强或改善。优选地此类增加(和实际上如本文别处所提到的其他改善或正效应)是与适当的对照水平或值相比时，显著的增加，优选临床上显著或统计上显著的增加，例如概率值<0.05。适当的对照将由本领域技术人员容易地鉴定，并且可以包括例如在不存在本发明的构建体时与存在所述构建体相比(例如与未处理的样品相比)，或在不存在(或存在)本发明的构建体的特定特征时与存在(或不存在)所述特征相比(视情况而定)观察到的参数或功能特性的水平。
如本文用于各种分子或实体的术语“与......结合”、“可与......结合”和等效术语包括与相关靶标特异性结合的能力。
根据本发明对疾病或病状的治疗(例如对预先存在的疾病的治疗)包括所述疾病或病状的治愈，或疾病的任何减轻或缓解(例如疾病严重程度的减轻)或疾病症状的任何减轻或缓解。
从本文别处的公开内容可以清楚，本发明的方法和用途适于疾病的预防以及疾病的积极治疗(例如，预先存在的疾病的治疗)。因此，本发明也涵盖预防性治疗。出于这个原因，在本发明的方法和用途中，治疗还包括适当的防治或预防。
此类预防(或保护)方面可以方便地对健康或正常或处于风险中的受试者进行，并且可以包括完全预防和显著预防。类似地，显著预防可以包括与不给予治疗时预期的严重程度或症状相比疾病严重程度或疾病症状减轻(例如，可测量地或显著减轻)的情形。
本文提到的一些序列连同相关标识符汇总在下表中。
Figure BDA0003490186210000471
Figure BDA0003490186210000481
Figure BDA0003490186210000491
Figure BDA0003490186210000501
该表和本文别处的所有序列均以N端残基到C端残基或5'到3'的方向叙述，符合本技术领域的惯例。上述序列或其片段或变体，例如本文别处所述的与之具有至少70％、75％、80％等的同一性的序列中的一个或多个或任何一个，可用于本发明的构建体中。例如，SEQ ID NO:19至26连同SEQ ID NO:17的接头和具有4x G4S重复序列(即GGGGS x4)的接头一起用于示例的构建体中。
将参考以下非限制性实施例并参考以下附图进一步描述本发明，其中：
图1：“生物制剂”的描述连同与IgE结合的模式的模式，该“生物制剂”包含两个sCD23单体，它们经由接头附接至来自IgG的结合FcRn的Fc片段。
图2：该示意图描绘了生物制剂的预测作用机制。它展示通过胞吞作用或微胞饮作用摄取与IgE复合的生物制剂。在早期内体内，内体内钙和pH降低。钙浓度从血清中发现的高水平变化到内体中发现的低得多的水平，引起生物制剂释放IgE。内体内的pH变为酸性会增加IgG-Fc对FcRn的亲和力，使得生物制剂结合FcRn。与FcRn结合容许生物制剂进入再循环途径返回血清。同时，IgE货物进入溶酶体降解途径被降解。
图3：评估生物制剂(抗IgE3)加强预先负载有IgE并且受IgE敏化的嗜碱性粒细胞脱粒的倾向的测定法。添加多克隆抗IgE抗体以结合和交联表面FcεRI结合的IgE引起脱粒，如通过随着交联IgE量的增加而增加的β-氨基己糖苷酶释放量所测量的。在存在0.01nM至4mM之间递增浓度的生物制剂时，如通过β-氨基己糖苷酶的释放量所测量的，没有嗜碱性粒细胞脱粒的迹象。使用完全溶解嗜碱性粒细胞的Triton X-100对照指示β-氨基己糖苷酶的最大可能释放量(100％)。该图显示，即使在最高浓度下，生物制剂也不会诱导脱粒。
图4：评估生物制剂(抗IgE3)抑制IgE介导的嗜碱性RBL-SX38细胞脱粒的潜力的测定法。在存在一定剂量范围的生物制剂的情况下，将细胞在1nM IgE的存在下孵育过夜或长达24小时。第二天，添加多克隆抗IgE以便交联与FcεRI结合的表面IgE并加强β-氨基己糖苷酶的释放量，其释放量随后作为量化细胞脱粒水平的手段来测量。在大于或等于1nM IgE的生物制剂浓度下，RBL-SX38细胞释放的β-氨基己糖苷酶的量呈剂量依赖性减少。添加多克隆抗IgE抗体以结合和交联表面FcεRI结合的IgE引起脱粒，如通过随着交联IgE量的增加而增加的β-氨基己糖苷酶释放量所测量的。使用完全溶解细胞的Triton X-100对照指示β-氨基己糖苷酶的最大可能释放量(100％)。该图显示，随着生物制剂浓度的增加，IgE与FcεRI的结合受到阻止，并且嗜碱性粒细胞的敏化作用受到抑制。
图5：数据显示了生物制剂(抗IgE3)阻断IgE与表达FcεRI的RBL-SX38细胞结合的能力。在存在或不存在0.05至2000nM之间递增浓度的生物制剂的情况下，将细胞与1nM经AF-488标记的IgE一起孵育1小时。RBL-SX38嗜碱性细胞表面存在的AF-488标记的IgE的量通过FACS进行量化并作为平均荧光指数呈现。该图显示，随着生物制剂浓度的增加，IgE与FcεRI的结合受到阻止，并且嗜碱性粒细胞的敏化作用受到抑制。
图6：数据显示了当细胞已经用FcεRI结合的IgE预敏化时，生物制剂(抗IgE3)阻断多克隆抗IgE诱导的RBL-SX38嗜碱性细胞脱粒的能力。第2天添加IgE之前，将RBL-SX38细胞接种在适当的培养基中并使其生长，然后放置24小时。第3天，再将递增量的生物制剂添加到细胞中并与细胞一起孵育1小时，然后添加固定量的交联多克隆抗IgE以诱导脱粒，如通过β-氨基己糖苷酶的释放量所测量的。添加多克隆抗IgE抗体以结合和交联表面Fc RI结合的IgE引起脱粒，如通过随着交联IgE量的增加而增加的β-氨基己糖苷酶释放量所测量的。使用完全溶解细胞的Triton X-100对照指示β-氨基己糖苷酶的最大可能释放量。该图显示在高浓度的生物制剂下，在预敏化嗜碱性粒细胞中脱粒受到抑制。
图7：该示意图描述了从Grevy等人2018修改而来的再循环和降解测定法的设计。简言之，将用FcRn和β2微球蛋白转染的HEK293细胞接种并使其生长，直到建立融合的完整单层。在添加试验抗体和蛋白质(IgE、生物制剂或生物制剂+蛋白质)之前使细胞短暂饥饿，然后在温热的HBSS中孵育4小时。该研究是并行设置的。到一半时，在孵育期后，去除上清液并通过ELISA评估残留IgE或生物制剂的量。然后溶解这些孔中的细胞，并通过ELISA评估IgE和生物制剂的细胞内摄取。在研究的另一半，在另一4小时孵育期之前彻底洗涤细胞，以允许配体释放回上清液中。通过ELISA测量上清液样品中的生物制剂或IgE，以及裂解细胞以评估细胞内内化的量。该测定法允许评估抗体-配体复合物的摄取以及那些复合物再循环或进入溶酶体降解途径的倾向。
图8：上图显示了表面等离子体共振实验的实验设置的示意图。示意图下方是展示derCD23单体与IgE-Fc的结合的传感图，该传感图包括实验的五个不同阶段的突出显示。插图对应于上图所示的SPR结合图谱的第4阶段，并展示了derCD23在不同起始浓度范围内的结合图谱。derCD23的缔合和解离快速，并且在注射derCD23的几秒钟内相互作用即达到稳态。derCD23与α-Cε4Fab捕获的IgE-Fc结合的双重参考空白减除数据。对derCD23与1:1α-Cε4Fab/IgE-Fc复合物之间的相互作用进行稳态结合曲线分析。数据与0-4μM浓度范围内的一对一结合模型良好拟合，表明IgE上仅一个derCD23结合位点被占据，估计KD为1.82x10-6M。
图9a：上图显示了表面等离子体共振实验的实验设置的示意图。SPR传感器表面通过经由胺偶联(第1阶段)共价缀合α-Cε4Fab制备。将大约80nM的IgE-Fc注射到α-Cε4Fab表面上，形成1:1α-Cε4Fab/IgE-Fc复合物(第2阶段)。在短暂的缓冲液注射后，诱导短暂的解离阶段，使两倍稀释系列中一系列浓度的抗IgE0、抗IgE3和抗IgE4流过IgE-Fc，最高浓度为4μM。最后，使大约800s的缓冲液流过表面，诱导解离阶段。SPR传感图描绘了抗IgE分子与1:1α-Cε4Fab捕获的IgE-Fc复合物的结合和解离(第4和5阶段)。(A)抗IgE0、(B)抗IgE3和(C)抗IgE4分子与1:1α-Cε4Fab/IgE-Fc复合物结合的空白减除传感图。
图9b：对IgE-Fc固定并增加分子间间距时的抗IgE分子的解离阶段比较通过表面等离子体共振来证明。每种生物构建体的分子模型：IgE0、IgE3和IgE4是使用模型构建程序Coot(Emsley等人，2010)构建的。描述每种抗IgE生物制剂的近似结构(和CTLD间分离)的图像是用PyMOL生成的。IgE-Fc以40pM的浓度固定，根据接种密度计算，该浓度产生110nm的平均分子间距。类似地，经计算80nM和160pM的固定浓度会分别产生40nm和80nm的平均分子间距。在短暂的缓冲液注射后，诱导短暂的解离阶段，使两倍稀释系列中一系列浓度的抗IgE0、抗IgE3和抗IgE4流过IgE-Fc，最高浓度为4μM。最后，使大约800秒的缓冲液流过表面，诱导解离阶段。描绘了每种构建体的解离阶段的比较，表明接头长度是IgE-Fc结合特性的决定因素。
图10：在图的顶部示意性地描绘了实验大纲。将IgE-Fc用Alexa-488(A488)进行荧光标记并与RBL SX-38细胞一起孵育。使用流式细胞术测量单活细胞的A488荧光。观察到的仅与1nM IgE-Fc-A488结合的A488荧光强度定义为100％结合。将与A488标记的阴性对照和4000nM的三种抗IgE分子一起孵育的单个RBL SX-38细胞的A488荧光强度用于定义0％结合。将抗IgE分子IgE0、IgE3和IgE4与IgE-Fc-A488和RBL SX-38细胞在不同浓度(0-4000nM)下一起孵育，并且使用流式细胞术测量它们对与IgE-Fc-A488结合的单活细胞的A488荧光强度的影响。该研究证明了接头长度在决定抗IgE生物制剂的功能特性中的重要性。
实施例
实施例1：生物抗IgE构建体的克隆、表达和纯化
将小鼠κ前导序列-CD23-(GGGGS)3-Fc克隆到pcDNA5-FRT中的方法
以下序列由整合DNA技术公司(IDT)作为双链gBlock DNA片段合成：atgagtgtgcccactcaggtcctggggttgctgctgctgtggcttacagatgccagatgtgatggcgccgaagcttccgacctgctggaacggctgcgggaggaagtgaccaagctgcggatggaactgcaggtgtccagcggcttcgtgtgcaacacctgccccgagaagtggatcaacttccagcggaagtgctactacttcggcaagggcaccaagcagtgggtgcacgccagatacgcctgcgacgacatggaaggccagctggtgtccatccacagccccgaggaacaggacttcctgaccaagcacgccagccacaccggcagctggatcggcctgcggaacctggacctgaagggcgagttcatctgggtggacggcagccacgtggactacagcaactgggcccctggcgagcccacctccagaagccagggcgaggactgcgtgatgatgcggggcagcggccggtggaacgacgccttctgcgaccggaagctgggcgcctgggtgtgcgaccggctggccacctgcaccccccctgccagcgagggcagcgccgagagcatgggccccgacagcaggcccgaccccgacggcagactgcccacccccagcgcccctctgcacagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgccagcatatcggccatggttagatctcccagagggcccacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcgagggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggcgttcgcatgcgcggtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtaaatga(SEQ ID NO:34)
然后通过PIPE克隆将这克隆到pcDNA5-FRT(ThermoFisher)中。简言之，使用引物gtctgtgtgtgatcagtgtgaggctg(SEQ ID NO:35)和taagataaacctgcctccctccctcccagggctccatccagctgtg(SEQ ID NO:36)通过PCR(Pfu，Promega)将载体线性化，通过凝胶提取纯化并用DpnI(ThermoFisher)处理以去除原始质粒。使用具有与载体末端同源的突出端的引物tgatcacacacagacatgagtgtgcccactca(SEQ ID NO:37)和gagggaggcaggtttatcttatcatttacccggagtccgggaga(SEQ ID NO:38)通过PCR(Phusion Flash,ThermoFisher)从gBlock扩增插入片段，然后通过凝胶提取纯化。将产物以1:1、2:1或1:2的比率混合，在室温下孵育30分钟，然后用于转化NEB10β感受态大肠杆菌(NEB)。使菌落在LB-amp中生长并微量制备质粒DNA(Monarch试剂盒，NEB)，然后进行完全测序(Eurofins)。
翻译的蛋白质序列如下所示并且包括标记为“小鼠κ前导序列”的分泌信号肽，该分泌信号肽在用于蛋白质表达的哺乳动物HEK293细胞中在加工期间被裂解。
Figure BDA0003490186210000541
小鼠κ前导序列(加粗)、sCD23、(GGGGS)3接头(加粗斜体)、mIgG-2AFc(加下划线斜 体)
pcDNA5/FRT/CD23-IgGFc载体和pOG44 Flp重组酶载体的共转染
正如FuGene(Promega)推荐的那样，简单地说：在转染前一天，将一半的24孔板(扁平圆孔，组织培养24孔NuncTM板，ThermoFisher)以8x104个细胞/孔的密度接种FlpInHEK293细胞，而第二半在500μl完全生长培养基(DMEM+10％胎牛血清)中以4x104个细胞/孔的密度接种。对于一式两份的单一蛋白质转染，将0.11ug的pcDNA5-FRT载体和0.99ug的pOG44 DNA(ThermoFisher)添加到合并总体积为52μl的无菌去离子水中。使用3:1的Fugene与DNA比率，小心地添加3.3μl的FuGene。这是通过避免微量离心管的侧面与移液管尖端接触来实现的。将溶液涡旋20秒并且离心以回收微量离心管底部的所有溶液。在室温下孵育10分钟后，每孔FlpIn HEK293细胞(一个细胞密度较高，一个细胞密度较低)添加25μl复合物并充分混合。将细胞放回37℃5％CO2加湿培养箱中并在48小时后将细胞分到含有完全培养基和50μg/ml潮霉素(PBS中的ThermoFisher潮霉素B)的6孔板中进行选择。一个月后，成功转染的细胞在孔中形成集落，通常可以将这些集落扩增到1L旋转瓶或5L WAVE生物反应器中，并于两周后收集培养物上清液。
蛋白-G亲和纯化
收集细胞上清液并以4000x g离心15分钟以去除细胞碎片。使上清液通过0.45μm过滤器(Sartorius)并与0.1％叠氮化钠(Sigma)一起在4℃下储存至纯化。将CD23-IgGFc融合蛋白使用
Figure BDA0003490186210000551
Prime系统(GE Healthcare)，用5ml HiTrap蛋白-G HP柱(GEHealthcare)通过亲和色谱法进行纯化。该柱用5个柱体积(CV)的洗涤缓冲液(PBS，pH 7.4)平衡。将经过滤的上清液以2ml/min的流速上样到柱上，并用10CV洗涤缓冲液洗涤该柱。用0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.5)洗脱CD23-IgGFc融合蛋白并将2.5ml级分收集到含有0.5ml1MTris–HCl(pH 8.6)的管中进行中和。
亲和纯化的CD23-IgGFc融合蛋白的尺寸排阻色谱法
在Gilson HPLC系统上使用SuperdexTM 200 10/300 GL柱(GE Healthcare)以0.75ml/min的流速在PBS(pH 7.4)中进行尺寸排阻色谱法。尺寸排阻色谱分析显示没有聚集并证实亲和柱纯化的产物由预期大小(～100KDa)的单分散分子组成。
实施例2：评估生物抗IgE对嗜碱性粒细胞脱粒的影响
使用脱粒测定法评估IgE敏感效应细胞(诸如嗜碱性粒细胞和肥大细胞)释放细胞质内部颗粒内容纳的细胞内介质的倾向。当效应细胞表面的过敏原特异性IgE遇到环境中其特异性过敏原时，它容许高亲和力IgE受体FcεRI之间交联以激活下游信号传导事件。这导致含有炎症介质的细胞内颗粒释放到局部环境中，导致典型的过敏反应。在一系列改良的嗜碱性粒细胞脱粒测定中评价抗IgE生物制剂抑制或加强这种应答的潜力。
材料和方法
嗜碱性粒细胞脱粒测定
使稳定表达人四聚体(αβγ2)高亲和力IgE受体FcεRI的大鼠嗜碱性白血病细胞系RBL-SX38细胞[Dibbern,DA等人，J Immunol Methods 2003；274:37–45]，(来自马萨诸塞州波士顿哈佛大学J-P.Kinet教授的善意礼物)受到各种IgE介导的触发因素刺激，以评估脱粒，如通过β-氨基己糖苷酶的释放量所测量的。使用的方法基本上是Rudman等人Clin ExpAllergy 2011,41(10):1400-1413和Weigand等人1996,J.Immunol,157:221-230中描述的方法，在此简要描述。
作为对照，使用未受刺激的细胞。为了量化总β-氨基己糖苷酶细胞含量，将细胞与0.5％Triton X-100+1％牛血清白蛋白(BSA)在合适的缓冲液中孵育以在量化β-氨基己糖苷酶(100％释放)之前完成溶解。作为阴性对照，将未受刺激的细胞与在HBSS中的1％BSA(+/-在与试验品同等的浓度下使用的对照IgG)(0％基线)孵育。还包括无细胞对照。
将RBL-SX38嗜碱性细胞以1x104个细胞/孔的密度接种在96孔板的培养基(DMEM、10％FCS、1.2mg/mL遗传霉素G418(Invitrogen))中过夜，然后添加200ng/mL IgE(NIP IgE，AbD Serotec，Kidlington，Oxford)、同种型对照或仅培养基进行敏化并进一步孵育过夜。将细胞在刺激缓冲液(HBSS+1％BSA)中洗涤3次，然后在37℃下用对照抗体或用于交联表面结合的IgE(Dako)的兔多克隆抗IgE刺激1小时。从50μL培养物上清液中量化β-氨基己糖苷酶，然后在刺激缓冲液中1:1稀释，之后转移到黑色96孔板中。板上的每个孔已经含有50μL荧光底物(在0.1％DMSO、0.1％Triton X100、200mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)中的1mM 4-甲基伞形酮N-乙酰-b-D-氨基葡糖苷)。将样品在黑暗中孵育2小时，之后用100μL 0.5M Tris淬灭。用Fluostar Omega酶标仪(350nm激发，450nm发射)(BMG Labtech,Offenburg,Germany)对板读数。将脱粒表示为Triton X-100释放量的百分比并与未受刺激的细胞进行比较。
评估抗IgE生物制剂单独诱导嗜碱性粒细胞脱粒的倾向
测试生物构建体加强通过已经与FcεRI IgE受体结合的IgE的交联引起的IgE介导的脱粒事件的能力。
材料和方法
如上述材料和方法(嗜碱性粒细胞脱粒测定)部分所述，制备RBL-SX38嗜碱性细胞并在48小时内负载IgE。向负载有IgE的细胞中，添加在4μM至0.016nM之间的连续稀释范围内的生物制剂，孵育1小时。然后取上清液样品并如所述进行处理以评估作为细胞脱颗粒信号释放的β-氨基己糖苷酶的浓度。
结果与讨论
在与对照交联抗IgE一起孵育1小时后，RBL-SX38嗜碱性细胞受到刺激以剂量依赖性应答释放β-氨基己糖苷酶。相比之下，在存在递增浓度的生物制剂时(使用相同的实验条件)，没有任何β-氨基己糖苷酶释放的迹象，表明该生物制剂无法孤立地加强嗜碱性粒细胞的活化或脱粒(图3)。
评估抗IgE生物制剂在竞争研究中阻断IgE结合FcεRI和阻止嗜碱性细胞系脱粒的倾向
这些研究探索了抗IgE生物制剂结合IgE并阻止其与高亲和力IgE受体FcεRI结合，从而阻止嗜碱性粒细胞系RBL-SX38的IgE依赖性脱粒的潜力。
材料和方法
如上所述接种RBL-SX38嗜碱性细胞并放置孵育过夜。第二天，用递增浓度的生物抗IgE构建体制备包含设定标准浓度200ng/mL(1nM)IgE的预混溶液。然后立即将预混溶液添加到细胞中并放置孵育过夜，之后用多克隆抗IgE进行刺激方案，如上文脱粒测定部分所述。
结果与讨论
图4所示的数据证明，抗IgE生物制剂能够以剂量依赖性方式抑制IgE介导的脱粒，并且与其阻断IgE与高亲和力IgE受体FcεRI结合一致。
证明生物抗IgE阻止IgE与高亲和力受体FcεRI结合
这些研究探索了抗IgE生物制剂结合IgE并阻止其与高亲和力IgE受体FcεRI结合的潜力。
材料和方法
如上所述接种RBL-SX38嗜碱性细胞并放置孵育过夜。第二天，用递增浓度的生物抗IgE构建体制备包含设定标准浓度200ng/mL AlexaFluor-488标记的IgE(1nM)的预混溶液。然后立即将预混溶液添加到细胞中并放置孵育1小时，之后洗涤两次并重悬于1mL FACS缓冲液中进行分析。在Attune NxT声学聚焦细胞计数仪(激光：BRVX)(ThermoFisher)上分析细胞并在FlowJo 10.2版中分析数据。
结果与讨论
图5所示的数据证明，在竞争结合研究中，抗IgE生物制剂能够结合IgE并剂量依赖性地阻止IgE与RBL-SX38细胞上的高亲和力IgE受体FcεRI结合。随着生物抗IgE浓度的增加，越来越少的IgE分子能够结合表面FcεRI，所以证明这些分子能够抑制IgE与其高亲和力受体结合。
证明生物抗IgE阻止已经受与高亲和力受体FcεRI结合的IgE预敏化的嗜碱性粒细胞脱粒
IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的FcεRI结合。在多价过敏原的存在下，FcεRI结合的IgE交联受体，通过脱粒应答加强细胞活化和炎症细胞介质的释放。测试生物抗IgE阻止已经预敏化的嗜碱性细胞的脱粒应答的能力。
材料和方法
如上所述接种RBL-SX38嗜碱性细胞并放置孵育过夜，然后按照上述方案添加200ng/mL IgE(1nM)并且再孵育24小时。然后将递增浓度的生物抗IgE构建体添加到含有细胞的孔中并孵育1小时，之后用5000ng/mL多克隆抗IgE进行刺激方案，如上文脱粒测定部分所述。
结果与讨论
图6所示的数据证明，抗IgE生物制剂能够剂量依赖性地阻止IgE介导的脱粒，如适度过量(>1nM)时在1小时内迅速地通过β-氨基己糖苷酶释放量所测量的。孵育时间的进一步增加不会进一步改变用构建体观察到的脱粒抑制水平(数据未示出)。
实施例3：再循环和摄取细胞测定
材料和方法：
HEK-mFcRn/β2m和HEK-hFcRn/β2m细胞的制备
HEK293F(ThermoFisher)细胞是人胚肾细胞系。将细胞维持在DMEM+10％胎牛血清中，并按照实施例1，使用Fugene(ThermoFisher)转染试剂，用小鼠或人FcRn和β2m瞬时转染并于～48小时后即可使用。其他细胞系诸如HUVEC、HepG2、CACO2和HMEC1也可以用这种方式成功转染(未示出)。
用于小鼠(mFcRnFix-pEGFP-N1&mB2-M-PCB7)和人(hFcRnWT-pEGFP-N1&hB2-M-PCB7)的FcRn和β2m表达载体是来自E.S.Ward教授的礼物并且FcRn载体含有另外对于FACS和荧光显微镜检查(未描述)也很有用的细胞质GFP。
参考：
mFcRnFix-pEGFP-N1和mB2-M-PCB7
工程改造免疫球蛋白G的Fc区以调节体内抗体水平
Carlos Vaccaro,Jinchun Zhou,Raimund J Ober&E Sally Ward,Nat.Biotechnol.,23(10):1283-1288.2005.
hFcRnWT-pEGFP-N1和hB2-M-PCB7
可视化MHC I类相关受体FcRn进行IgG挽救的位点和动力学
R.J.Ober,C.Martinez,C.Vacarro,E.S.Ward,J.Immunol.,vol.172,pp.2021-2029,2004.
细胞再循环测定方案：
图7中描绘了该测定方案。
a.接种HEK293-FcRn/β2m细胞并使其生长直至融合(95-100％融合)-向24孔板(Costar)中每孔接种7.5×105个并在生长培养基中培养2天。
b.去除培养基，并将细胞洗涤两次并在汉克平衡盐溶液(HBSS)缓冲液(pH 7.4)中饥饿1小时。
c.将目标蛋白质在HBSS(pH 7.4或6.0)中稀释并添加到细胞中并孵育4小时以允许摄取抗体。
d.去除培养基+并将细胞用冰冷的HBSS(pH 7.4)洗涤四次，之后添加新鲜温热的HBSS(pH 7.4)或不含FBS并补充有MEM非必需氨基酸的生长培养基(ThermoFisher)。
e.将样品与新鲜温热的HBSS(pH 7.4)一起孵育并在4小时或过夜(孵育4小时)时收集，这允许配体释放++。
f.将细胞用冰冷的HBSS(pH 7.4)彻底洗涤并溶解+++。
g.将收集的样品在对IgG或IgE有特异性的ELISA中进行分析。
+取出培养基并读取溶液中剩余的构建体
++抽吸培养基并通过ELISA读数，确定释放回溶液/培养基中的构建体(配体)的量
+++经由ELISA分析细胞溶解物中细胞内内化的构建体水平。
总蛋白溶解物的制备
使用提供有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)或完整蛋白酶抑制剂片剂(Roche)的CelLytic M细胞溶解试剂(Sigma-Aldrich)或RIPA溶解缓冲液(ThermoFisher)获得总蛋白溶解物。将混合物与细胞在冰上和振荡器上孵育10分钟，接着以10,000×g离心15分钟以去除细胞碎片。如下所述，通过ELISA进行溶解物中存在的IgG或IgE量的量化。
使用生物制剂和IgE的再循环和残留量的导出值计算再循环的量和保留在细胞内的量。
总IgG-Fc(抗小鼠)ELISA
使用以下方法通过ELISA测定细胞培养物上清液中的IgG-Fc浓度。
a.首先，将捕获抗体，即山羊抗小鼠IgG(Sigma)，在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中稀释至最终浓度为1μg/mL。
b.接下来，将100μL这种包被溶液添加到MaxisorpTM 96孔板上的每个孔中并在4℃下孵育过夜。
c.孵育过夜后，从孔中去除包被溶液并将200μL封闭缓冲液、2％脱脂乳/PBS+0.5％
Figure BDA0003490186210000591
20(PBS-T)添加到每个孔中。将板孵育2小时，然后用250μL的PBS-T将孔洗涤两次。
d.接下来，将IgG标准品在50％培养基(与细胞培养基相同)和50％PBS-T/1％脱脂乳(测定缓冲液)中稀释到400ng/mL，并在孔板中以1:2连续稀释到0.78ng/mL，一式两份，使得每个孔的最终体积为50μL。
e.剩余孔给予25μL测定缓冲液和25μL源自细胞培养物的上清液或经稀释的上清液。
f.将标准品和样品孵育2小时，之后用250μL的PBS-T将孔洗涤四次。
g.接下来，将二抗即山羊抗小鼠IgG-HRP(ThermoFisher)在测定缓冲液中按1:1000稀释并将50μL该溶液添加到每个孔中。两小时孵育期后，将孔用250μL的PBS-T洗涤四次。
h.接下来向每个孔中添加50μL底物，该底物是通过将5mg的OPD稀释到10mL 1x稳定过氧化酶底物缓冲液中制备的。将底物孵育15分钟并通过向每个孔中添加50μL的1M HCl来终止反应。
i.使用Flurostar Omega(BMG Labtech)分光光度计，使用492nm的吸光度和650nm的参考波长减除测定每个孔的吸光度。使用GraphPad
Figure BDA0003490186210000601
软件进行标准曲线拟合，使用标准曲线上最少6个点进行4参数曲线拟合，没有加权(Findlay和Dillard 2007)。
总IgE检测ELISA
试剂和缓冲液
多克隆兔抗人IgE(Dako，A0094)
过氧化酶缀合的山羊抗人IgE(Sigma，A9667)
IgE标准品(WHO 75/502)(原液浓度1mg/ml，储存在-20℃下)
TMB‘底物试剂包’(R&D，DY999，4℃)
碳酸盐缓冲液，pH 9.2(4ml 0.2M碳酸钠(2.2g/100ml)+46ml碳酸氢钠(1.68g/100ml)，用H2O补充至200ml)
1％BSA/PBS
洗涤缓冲液(0.05％吐温20/PBS)
方案
1)将板包被
a.将抗人IgE包被抗体在碳酸盐缓冲液中1:7000稀释
b.任选：将抗原在碳酸盐缓冲液中稀释到5μg/ml
c.添加100μl/孔经稀释的包被抗体(和抗原，若适用)
d.将板密封并在4℃下孵育过夜
2)洗涤并封闭孔
a.弹出包衣抗体
b.每孔添加200μL洗涤缓冲液
c.弹出并在薄纸上吸干以去除过量的洗涤缓冲液
d.再重复b和c四次
e.添加100μl/孔的1％BSA/PBS
f.用盖将板盖上并在室温下孵育1小时
3)洗涤并添加上清液和标准品
a.如步骤2b-2d所述将板洗涤五次
b.将标准品稀释到800ng/ml(15μl原液+210μl 1％BSA/PBS)
c.将50μl 1％BSA/PBS添加到标准品行的孔2-12
d.将50μl的标准品添加到标准品行的孔1和2
e.将孔混合并依次转移50μl以产生两倍稀释(留下最后一个孔作为空白)
f.添加50μl/孔的样品(包括+ve和–ve对照)，一式两份
g.将板密封并且在振荡平台上在4℃下孵育过夜或在室温下孵育2小时
4)洗涤并添加检测剂
a.如步骤2b-2d所述将板洗涤五次
b.将过氧化酶缀合的检测抗体在1％BSA/PBS中稀释到1:500
c.添加100μl/孔
d.将板密封并且在振荡平台上在室温下孵育1小时
5)底物溶液
a.如步骤2b-2d所述将板洗涤五次
b.混合等体积的显色试剂A与显色试剂B
c.添加50μl/孔
d.在黑暗中孵育5-10分钟左右
e.用50μl/孔的3M硫酸终止反应
6)读板
a.显影后立即读板
b.参考滤波450nm
结果与讨论
单独的IgE被细胞摄取并经历溶酶体降解的能力，或经由FcRn或潜在等效的再循环和回收途径再循环的能力在从Grevy等人2018公开的测定法修改的测定法中进行了评估。
Grevys A,Nilsen J,Sand KMK,Daba MB,
Figure BDA0003490186210000612
I,Bern M,McAdam MB,FossS,Schlothauer T,Michaelsen TE,Christianson GJ,Roopenian DC,Blumberg RS,Sandlie I,Andersen JT.A human endothelial cell-based recycling assay forscreening of FcRn targeted molecules.Nat Commun.2018 Feb 12；9(1):621
表1：单独的IgE的再循环潜力的评估
Figure BDA0003490186210000611
Figure BDA0003490186210000621
表示出了每个位置IgE的百分比
表2：生物抗IgE捕获IgE的再循环潜力及其内化IgE的能力和生物制剂再循环的效力的评估
单独的生物制剂
Figure BDA0003490186210000622
表示出了每个位置剩余的生物制剂的百分比
生物制剂+1nM IgE
Figure BDA0003490186210000631
表示出了每个位置IgE的百分比
表3：抗IgE奥马珠单抗捕获IgE的再循环潜力及其内化IgE的能力和抗体再循环的效力的评估
仅奥马珠单抗
Figure BDA0003490186210000632
Figure BDA0003490186210000641
表示出了每个位置奥马珠单抗的百分比
奥马珠单抗+1nM IgE
Figure BDA0003490186210000642
Figure BDA0003490186210000651
表示出了每个位置IgE的百分比
表1中描述的数据证明，在不存在生物抗IgE(实施例1)的情况下，在洗涤细胞前与细胞孵育4小时后，IgE留在HEK293-mFcRn细胞培养物的上清液中，细胞摄取极少。洗涤后，没有IgE再循环或保留在细胞内的证据。
评估生物抗IgE对IgE摄取、细胞保留和再循环的影响
表2显示在HEK293-mFcRn/β2m再循环测定对递增浓度的单独的生物抗IgE(无IgE)进行了评估。该构建体展示通过FcRn内吞转运机制快速摄取，使得在0.01-5.00nM的生物制剂浓度下，经转染的HEK293细胞在4小时孵育期内从培养基中摄取>93％的生物制剂。在1nMIgE的存在下，当在1-2000nM的生物抗IgE的存在下时，在4小时孵育窗口内IgE从细胞培养基中完全去除。在低于1nM的浓度下，当IgE超过生物抗IgE时，分别与0.01nM、0.05nM和0.5nM的生物抗IgE孵育4小时时，剩余8％、5％和1％的IgE(表2)。
在摄取的IgE中，大部分IgE留在细胞内，4小时后在再循环的级分中没有发现IgE。未检测到的IgE级分，既未在细胞孵育培养基中也未在细胞溶解物中回收，据信被降解。
评估抗IgE奥马珠单抗对IgE摄取、细胞保留和再循环的影响
表3中的数据证明奥马珠单抗被HEK293-hFcRn/β2m转染的细胞有效摄取，使得添加后4小时上清液中几乎没有残留。更换缓冲液并且进一步孵育4小时后，细胞培养基中回收50％至84％的奥马珠单抗，剩余部分留在细胞内。
当在1nM IgE加上递增浓度的奥马珠单抗的存在下孵育时，孵育4小时后，在细胞外上清液中未检测到IgE。
在更换缓冲液并用缓冲液洗涤细胞后，如以上材料和方法中所述，将温热的培养基添加到HEK293细胞中。孵育4小时后，去除细胞外上清液并测量IgE的存在，同时溶解HEK293-hFcRn/β2m细胞并在合适的ELISA测定法中定量细胞内IgE的量。从研究中，可以观察到根据测试的奥马珠单抗的浓度，在细胞外上清液中回收了42-55％的IgE。人们认为，这可能是稳定的IgE-奥马珠单抗复合物通过内体再循环途径再循环的结果，这可以解释在用奥马珠单抗治疗的患者中观察到的IgE-抗IgE复合物的长寿命。在剩余的IgE中，可以在细胞溶解物中检测到23-30％，剩余部分(16-34％未检测到，可能已被降解)(表3)。
研究证明生物抗IgE是一种比奥马珠单抗更有效的去除IgE的试剂。虽然生物抗IgE有效结合IgE并容许HEK293-hFcRn细胞的细胞摄取，但在洗涤和孵育方案后在细胞外上清液中没有可检测到的IgE，表明IgE并未离开细胞，正如细胞溶解和细胞内IgE水平的测量所证实的那样。相比之下，奥马珠单抗无法有效地释放内体内的IgE，因此IgE-奥马珠单抗复合物得以再循环回到循环中，当奥马珠单抗以摩尔过量给药时，少于50％的IgE留在细胞内。这些数据表明，生物抗IgE内固有的钙敏感性结合机制是一种释放结合的靶标(IgE)的高效机制，同时仍容许生物抗IgE本身的再循环，正如使得IgE大量摩尔过量给药时，生物抗IgE的效率所证明的那样(表2)。
实施例4：使用BIACore通过表面等离子体共振评价生物抗IgE与IgE的结合
方法和材料：
BIACore研究：一般表面等离子体共振方案：
通过将胺直接偶联到羧甲基化传感器芯片表面(CM5芯片，GE Healthcare)进行固定。每个CM5芯片的羧甲基化葡聚糖表面通过注射420秒在去离子水中1:1比率的0.1M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.4M 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)得以活化。NHS/EDC溶液与芯片上存在的游离羧基反应并且引起反应性琥珀酰亚胺酯的生成，琥珀酰亚胺酯可与蛋白质表面暴露的赖氨酸残基反应，从而将它们固定在表面上。将蛋白质在10mM醋酸钠(pH 5.0)中以10μg/ml的浓度以60-300秒的脉冲注射到NHS/EDC活化表面上，直至达到所需的固定水平。所有剩余的活性羧甲基化基团被在芯片上注射600秒的1M乙醇胺(pH8.5)封闭。使用相同程序制备参考细胞，除了将缓冲液而不是蛋白质注射到表面上以外。所有固定均在25℃下以20μl/min的流速进行。
BIACore结合研究：derCD23与IgE-Fc的结合
进行SPR实验以确定derCD23对IgE-Fc与α-Cε4Fab之间的相互作用的影响，并采用稳态分析在KD和Bmax方面量化这些影响。使用胺偶联制备α-Cε4Fab CM5传感器表面并且将模拟胺偶联表面用作参考减除对照。然后注射80nM IgE-Fc以生成固定的1:1α-Cε4Fab/IgE-Fc复合物。在α-Cε4Fab偶联表面上短暂注射SPR缓冲液以引发短暂解离阶段后，在1:1α-Cε4Fab/IgE-Fc复合物上注射derCD23的两倍连续滴定液(4000nM至31nM)。然后derCD23注射之后是解离阶段，并以及α-Cε4Fab捕获的IgE-Fc表面的再生(图8)。在10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、4mM CaCl2和0.005％(v/v)表面活性剂P-20(GE Healthcare)的运行缓冲液中以25μl.min-1的流速进行注射。所有实验均一式两份运行并且使用BIACore T200仪器(GE Healthcare)给出高度可重复的结果，单相动力学拟合产生1.8x10-6M的KD。
BIACore结合研究：抗IgE生物构建体与IgE-Fc的结合
评估了CD23与α-Cε4Fab捕获的IgE-Fc结合的相互作用，以及三种抗IgE生物制剂与α-Cε4Fab捕获的IgE-Fc之间相互作用的结合曲线。本实验中的试验品是生物抗IgE分子，这些分子包含一对CD23单体，但其中IgE结合组分(CD23单体)与FcRn结合组分(IgGFc)之间的接头长度在没有接头(抗IgE0)与有3个(抗IgE3)或4个(抗IgE4)重复(G4S)接头序列的情况之间有所不同。1:1α-Cε4Fab/IgE-Fc复合物固定在CM5传感器表面。将抗IgE分子的两倍连续滴定液(从4000nM至31nM)注射到α-Cε4Fab捕获的IgE-Fc上，接着是解离阶段(图9a A-C)和表面再生。然后使用SPR应答的变化来测量α-Cε4Fab捕获的IgE-Fc结合抗IgE分子的能力。使用双相动力学模型的数据拟合产生两个KD值，即KD1 1-2x10-6M和KD2 1-4x10-8M，在每种情况下，接头越长产生的浓度KD越低。
BIACore结合研究：不同IgE-Fc固定水平对抗IgE分子结合特征的影响
配体密度可以影响SPR实验测量固有或功能亲和力的程度。在高配体密度下，多价分析物可同时结合两个或更多个配体。如果相互作用位点的动力学相同且独立，则第一相互作用将取决于位点的固有亲和力。由于分析物的局部浓度高，有利于后续位点的缔合。在进行这组实验时，通过以确保IgE-Fc和α-Cε4Fab之间形成1:1复合物的密度将α-Cε4Fab共价固定在芯片表面上来制备传感器芯片表面。将三种不同浓度的IgE-Fc(80nM、160pM和40pM)注射到固定的α-Cε4Fab捕获分子上，分别产生40nm、80nm和110nm的平均分子间距。平均分子间距测量值的选择基于以下假设：在较低的固定IgE-Fc水平下，抗IgE分子表现出二价较少，并且有利于单相相互作用。将不同浓度的抗IgE分子(4000nM-31nM)注射到α-Cε4Fab/IgE-Fc表面。
使用SPR应答(共振单位)测量抗IgE生物制剂与α-Cε4Fab捕获的IgE-Fc的特异性结合。每次注射后，有一个800秒的解离阶段，然后通过三个60秒的10mM甘氨酸(pH 2.5)脉冲和一个5mM NaOH脉冲再生α-Cε4Fab捕获的IgE-Fc以再生用于下一循环的表面。在10mMHEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、4mM CaCl2和0.005％(v/v)表面活性剂P-20的运行缓冲液中以25μl.min-1的流速进行注射。这些实验结合测量是在25℃下进行的。在所有情况下，均使用标准双参考数据减除方法，并使用Origin软件(OriginLab)进行动力学拟合。
结果与讨论
图8中的数据清楚地证明CD23单体能够以相对低的亲和力结合IgE。图9a中的数据证明与单个单体相比，成对排列的CD23单体能够以改善的亲和力结合IgE，并且在CD23单体组分与FcRn结合组分之间引入接头显示出改善的结合。图9b所示的图显示，对于每个抗IgE分子，固定的IgE分子之间较大的间隔导致通过与IgE结合形成的复合物更快解离，并且增加抗IgE生物制剂的接头长度会减少这种效应。
实施例5：评价具有不同接头长度的抗IgE生物制剂抑制IgE介导的嗜碱性粒细胞脱粒的能力
公认的是，在过敏原的存在下，IgE与高亲和力受体FcεRI的结合以及由此引起的结合的IgE的交联引起效应细胞(诸如肥大细胞和嗜碱性粒细胞)的活化，从而触发炎症介质(包括组胺)的释放以引起过敏应答。该研究调查了引入接头改变成对组织的结合IgE的CD23单体的空间范围，结合IgE和阻止IgE介导的嗜碱性效应细胞的活化和脱粒的潜在影响。
方法和材料：
嗜碱性粒细胞脱粒测定
嗜碱性粒细胞脱粒测定的测定方法和材料如实施例2中所述。本实施例中的试验品是生物抗IgE分子，这些分子包含一对CD23单体，但其中IgE结合组分(CD23单体)与FcRn结合组分(IgGFc)之间的接头长度在没有接头(抗IgE0)与有3个(抗IgE3)或4个(抗IgE4)重复(G4S)接头序列的情况之间有所不同。这具有扩展IgE结合组分的空间范围的效果。
结果与讨论：
测试的每种生物抗IgE都能够通过有效阻断IgE与在RBL-SX38人嗜碱性细胞系表面表达的高亲和力IgE受体Fc RI之间的相互作用而抑制IgE介导的脱粒。每种抗IgE生物制剂的效力和功效有所不同。包含一对CD23单体，但在IgE结合组分(CD23单体)与FcRn结合组分(IgGFc)之间没有接头的生物抗IgE0，能够部分抑制IgE介导的嗜碱性粒细胞脱粒，但仅有最大50％的功效。在CD23单体与IgG-Fc之间引入接头序列明显提高了功效和效力，当接头包含3个G4S接头重复序列时达到～90％的功效，并且当接头长度增加到(G4S)4重复序列时达到100％的功效。因此，观察到的IC50展示出随着接头长度增加而增加的效力，从抗IgE0>300nM降低到添加接头时的10-30nM。
SEQUENCE LISTING
<110> 康美健生物科技有限公司
伦敦国王学院
<120> 抗IgE构建体
<130> P21119239WP
<150> GB 1908108.2
<151> 2019-06-06
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His Ser
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Ser
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Cys
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Linker (x6 repeats)
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
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<223> whole secreted sequence of hCD23-G4S3-mIgG2a Fc (signal peptide
removed)
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145 150 155 160
Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro
165 170 175
Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro Ser Ala Pro Leu His Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ile Ser
195 200 205
Ala Met Val Arg Ser Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln
260 265 270
Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu
290 295 300
Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Ala Phe Ala Cys Ala
305 310 315 320
Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro
340 345 350
Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr
355 360 365
Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys
370 375 380
Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val
405 410 415
Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn
420 425 430
His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 20
<211> 23
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 20
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Gly Ala
20
<210> 21
<211> 468
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> whole ORF sequence of hCD23-G4S3-mIgG2a Fc (including secretory
signal peptide)
<400> 21
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys Asp Gly Ala Glu Ala Ser Asp Leu Leu Glu Arg Leu
20 25 30
Arg Glu Glu Val Thr Lys Leu Arg Met Glu Leu Gln Val Ser Ser Gly
35 40 45
Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu Lys Trp Ile Asn Phe Gln Arg Lys
50 55 60
Cys Tyr Tyr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Gln Trp Val His Ala Arg Tyr
65 70 75 80
Ala Cys Asp Asp Met Glu Gly Gln Leu Val Ser Ile His Ser Pro Glu
85 90 95
Glu Gln Asp Phe Leu Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile
100 105 110
Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Val Asp Gly
115 120 125
Ser His Val Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg
130 135 140
Ser Gln Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn
145 150 155 160
Asp Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg Leu
165 170 175
Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met Gly
180 185 190
Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro Ser Ala
195 200 205
Pro Leu His Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Ile Ser Ala Met Val Arg Ser Pro Arg Gly Pro
225 230 235 240
Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
260 265 270
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
290 295 300
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
325 330 335
Gly Lys Ala Phe Ala Cys Ala Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
370 375 380
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
385 390 395 400
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
420 425 430
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
435 440 445
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
450 455 460
Thr Pro Gly Lys
465
<210> 22
<211> 23
<212> PRT
<213> Human
<400> 22
Glu Ala Ser Asp Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu Glu Val Thr Lys Leu
1 5 10 15
Arg Met Glu Leu Gln Val Ser
20
<210> 23
<211> 137
<212> PRT
<213> Human
<400> 23
Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu Lys Trp Ile Asn Phe Gln
1 5 10 15
Arg Lys Cys Tyr Tyr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Gln Trp Val His Ala
20 25 30
Arg Tyr Ala Cys Asp Asp Met Glu Gly Gln Leu Val Ser Ile His Ser
35 40 45
Pro Glu Glu Gln Asp Phe Leu Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser
50 55 60
Trp Ile Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Val
65 70 75 80
Asp Gly Ser His Val Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr
85 90 95
Ser Arg Ser Gln Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg Gly Ser Gly Arg
100 105 110
Trp Asn Asp Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Val Cys Asp
115 120 125
Arg Leu Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala
130 135
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> Human
<400> 24
Ser Glu Gly Ser Ala Glu
1 5
<210> 25
<211> 23
<212> PRT
<213> Human
<400> 25
Ser Met Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr
1 5 10 15
Pro Ser Ala Pro Leu His Ser
20
<210> 26
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> mutant mouse IgG2a Fc
<400> 26
Ala Ser Ile Ser Ala Met Val Arg Ser Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
1 5 10 15
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro
20 25 30
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
35 40 45
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
50 55 60
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
65 70 75 80
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
85 90 95
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Ala
100 105 110
Phe Ala Cys Ala Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
115 120 125
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
130 135 140
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
145 150 155 160
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
165 170 175
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
180 185 190
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
195 200 205
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
210 215 220
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
225 230 235 240
Lys
<210> 27
<211> 330
<212> PRT
<213> Human
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 28
<211> 326
<212> PRT
<213> Human
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 29
<211> 377
<212> PRT
<213> Human
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Human
<400> 30
Glu Gly Ser Ala Glu
1 5
<210> 31
<211> 133
<212> PRT
<213> Human
<400> 31
Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu Lys Trp Ile Asn Phe Gln
1 5 10 15
Arg Lys Cys Tyr Tyr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Gln Trp Val His Ala
20 25 30
Arg Tyr Ala Cys Asp Asp Met Glu Gly Gln Leu Val Ser Ile His Ser
35 40 45
Pro Glu Glu Gln Asp Phe Leu Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser
50 55 60
Trp Ile Gly Leu Arg Asn Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Val
65 70 75 80
Asp Gly Ser His Val Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr
85 90 95
Ser Arg Ser Gln Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg Gly Ser Gly Arg
100 105 110
Trp Asn Asp Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Val Cys Asp
115 120 125
Arg Leu Ala Thr Cys
130
<210> 32
<211> 133
<212> PRT
<213> Canine
<400> 32
Asn Gly Ser Glu Cys Asn Thr Cys Pro Glu Lys Trp Leu Asn Phe Gln
1 5 10 15
Arg Lys Cys Tyr Tyr Phe Gly Glu Glu Pro Lys Lys Trp Ile Gln Ala
20 25 30
Arg Phe Ala Cys Ser Lys Leu Gln Gly Arg Leu Ala Ser Ile His Ser
35 40 45
Gln Glu Glu Gln Asp Phe Leu Ala Arg Tyr Ala Asn Lys Lys Gly Thr
50 55 60
Trp Ile Gly Leu Arg Asp Leu Asp Arg Glu Gly Glu Phe Ile Trp Met
65 70 75 80
Asp Glu Asn Pro Leu Asn Tyr Ser Asn Trp Arg Pro Gly Glu Pro Asn
85 90 95
Asn Gly Gly Gln Gly Glu Asp Cys Val Met Met Gln Gly Ser Gly Gln
100 105 110
Trp Asn Asp Ala Phe Cys Gly Ser Ser Leu Asp Gly Trp Val Cys Asp
115 120 125
Arg Leu Ala Thr Cys
130
<210> 33
<211> 245
<212> PRT
<213> Canine
<400> 33
Lys Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val
1 5 10 15
Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Met Leu Gly
20 25 30
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu
35 40 45
Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro
50 55 60
Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met
65 70 75 80
Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr
85 90 95
Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly
100 105 110
Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile
115 120 125
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Ala His Gln Pro Ser Val
130 135 140
Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys Asn Thr Val Ser
145 150 155 160
Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu
165 170 175
Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys Tyr Arg Thr Thr
180 185 190
Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
195 200 205
Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Ile Cys Ala
210 215 220
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser
225 230 235 240
His Ser Pro Gly Lys
245
<210> 34
<211> 1407
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 34
atgagtgtgc ccactcaggt cctggggttg ctgctgctgt ggcttacaga tgccagatgt 60
gatggcgccg aagcttccga cctgctggaa cggctgcggg aggaagtgac caagctgcgg 120
atggaactgc aggtgtccag cggcttcgtg tgcaacacct gccccgagaa gtggatcaac 180
ttccagcgga agtgctacta cttcggcaag ggcaccaagc agtgggtgca cgccagatac 240
gcctgcgacg acatggaagg ccagctggtg tccatccaca gccccgagga acaggacttc 300
ctgaccaagc acgccagcca caccggcagc tggatcggcc tgcggaacct ggacctgaag 360
ggcgagttca tctgggtgga cggcagccac gtggactaca gcaactgggc ccctggcgag 420
cccacctcca gaagccaggg cgaggactgc gtgatgatgc ggggcagcgg ccggtggaac 480
gacgccttct gcgaccggaa gctgggcgcc tgggtgtgcg accggctggc cacctgcacc 540
ccccctgcca gcgagggcag cgccgagagc atgggccccg acagcaggcc cgaccccgac 600
ggcagactgc ccacccccag cgcccctctg cacagcggcg gcggcggcag cggcggcggc 660
ggcagcggcg gcggcggcag cgccagcata tcggccatgg ttagatctcc cagagggccc 720
acaatcaagc cctgtcctcc atgcaaatgc ccagcaccta acctcgaggg tggaccatcc 780
gtcttcatct tccctccaaa gatcaaggat gtactcatga tctccctgag ccccatagtc 840
acatgtgtgg tggtggatgt gagcgaggat gacccagatg tccagatcag ctggtttgtg 900
aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca caaacccata gagaggatta caacagtact 960
ctccgggtgg tcagtgccct ccccatccag caccaggact ggatgagtgg caaggcgttc 1020
gcatgcgcgg tcaacaacaa agacctccca gcgcccatcg agagaaccat ctcaaaaccc 1080
aaagggtcag taagagctcc acaggtatat gtcttgcctc caccagaaga agagatgact 1140
aagaaacagg tcactctgac ctgcatggtc acagacttca tgcctgaaga catttacgtg 1200
gagtggacca acaacgggaa aacagagcta aactacaaga acactgaacc agtcctggac 1260
tctgatggtt cttacttcat gtacagcaag ctgagagtgg aaaagaagaa ctgggtggaa 1320
agaaatagct actcctgttc agtggtccac gagggtctgc acaatcacca cacgactaag 1380
agcttctccc ggactccggg taaatga 1407
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 35
gtctgtgtgt gatcagtgtg aggctg 26
<210> 36
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 36
taagataaac ctgcctccct ccctcccagg gctccatcca gctgtg 46
<210> 37
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 37
tgatcacaca cagacatgag tgtgcccact ca 32
<210> 38
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 38
gagggaggca ggtttatctt atcatttacc cggagtccgg gaga 44

Claims (23)

1.一种蛋白质构建体，所述蛋白质构建体包含：
a)至少两个单体，每个单体均包含CD23的C型凝集素结构域，其中每个单体均可与IgE结合；和
b)可与新生儿Fc受体(FcRn)结合的实体；
其中所述蛋白质构建体包含接头，并且其中所述接头用于将包含CD23的C型凝集素结构域的所述单体连接至可与FcRn结合的所述实体。
2.根据权利要求1所述的蛋白质构建体，其中所述构建体含有两个单体，或多于两个单体，优选4个或6个单体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的蛋白质构建体，其中所述CD23的C型凝集素结构域包含或对应于SEQ ID NO:1的V159-P290(SEQ ID NO:6)或SEQ ID NO:1的C160-C288(SEQID NO:7)或SEQ ID NO:1的F170-L277(SEQ ID NO:8)，或与之具有至少80％同一性的序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质构建体，其中所述CD23的C型凝集素结构域包含或对应于SEQ ID NO:1的S156至A292(SEQ ID NO:15)，优选SEQ ID NO:1的E133至A292(SEQ ID NO:10)，或包含或对应于SEQ ID NO:1的S156至C288(SEQ ID NO:31)，或其片段，或与之具有至少80％同一性的序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质构建体，其中所述CD23的C型凝集素结构域包含或对应于SEQ ID NO:1的S156至E298(SEQ ID NO:13)，优选SEQ ID NO:1的E133至E298(SEQ ID NO:11)，或其片段，或与之具有至少80％同一性的序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白质构建体，其中所述CD23的C型凝集素结构域包含或对应于SEQ ID NO:1的S156至S321(SEQ ID NO:9)，优选SEQ ID NO:1的E133至S321(SEQ ID NO:12)，或其片段，或与之具有至少80％同一性的序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的蛋白质构建体，其中每个单体以0.1–3μM的亲和力与IgE结合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质构建体，其中可与FcRn结合的所述实体包含Fc区，优选IgG-Fc区，或其片段或变体，或白蛋白或其片段或变体，或IgG抗体或白蛋白的结合蛋白，或FcRn的结合蛋白。
9.根据权利要求8所述的蛋白质构建体，其中可与FcRn结合的所述实体包含IgG1-Fc区或其片段或变体，或人血清白蛋白或其片段或变体，或IgG1抗体或人血清白蛋白的结合蛋白。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的蛋白质构建体，其中所述结合蛋白包含抗体或抗体片段，优选sdAb，或包含基于非免疫球蛋白的单结构域结合蛋白，优选纤连蛋白或基于纤连蛋白的分子、affimer、锚蛋白重复蛋白、脂质运载蛋白、人A结构域、葡萄球菌蛋白A、硫氧还蛋白、γ-B-晶体蛋白或基于泛素的分子。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的蛋白质构建体，其中所述接头是肽接头。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的蛋白质构建体，其中所述构建体的部分a)的每个单体与IgE的所述结合和/或所述构建体的部分b)与FcRn的所述结合对内体条件敏感。
13.根据权利要求12所述的蛋白质构建体，其中所述构建体的部分a)与IgE的所述结合在pH 6.0或6.5下与pH 7.4相比减少，或在内体钙水平下与血清钙水平相比减少。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的蛋白质构建体，其中所述构建体的部分b)与FcRn的所述结合在pH 6.0或6.5下与pH 7.4相比增加，或在内体钙水平下与血清钙水平相比增加。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的蛋白质构建体，其中所述至少两个单体引起与所述单个单体的结合亲和力总和相比，与IgE结合的亲合力增加。
16.一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含编码根据权利要求1至15中任一项所述的蛋白质构建体的核苷酸序列；或
一种或多种包含此类核酸分子的表达载体；或一种或多种包含所述表达载体、核酸分子或根据权利要求1至15中任一项所述的蛋白质构建体的宿主细胞。
17.一种产生根据权利要求1至15中任一项所述的蛋白质构建体的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在适于所述编码的蛋白质构建体表达的条件下培养包含如权利要求16中定义的所述表达载体中的一种或多种或所述核酸序列中的一种或多种的宿主细胞；并且任选地(ii)从所述宿主细胞中或从生长培养基/上清液中分离或获得所述表达的蛋白质构建体。
18.一种产生根据权利要求1至15中任一项所述的蛋白质构建体的方法，所述方法包括以下步骤：(i)使IgE Fc已经固定到其上的亲和基质与根据权利要求1至15中任一项所述的构建体在使得所述构建体与所述亲和基质上的所述IgE Fc结合的条件下接触；并且在使得所述构建体不再与所述亲和基质上的所述IgE Fc结合的条件下，从所述亲和基质上洗脱所述构建体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在步骤(i)中此类条件是对应于血清钙或pH水平的那些条件，优选钙水平为1至2mM，或pH为或约pH 7.4；和/或在步骤(ii)中此类条件是对应于内体钙或pH水平的那些条件，优选钙水平为3-30μM或pH为或约pH5.0至6.5。
20.一种组合物，优选药学上可接受的组合物，所述组合物包含根据权利要求1至15中任一项所述的蛋白质构建体，或根据权利要求16所述的一种或多种核酸分子或表达载体。
21.根据权利要求1至15中任一项所述的蛋白质构建体或根据权利要求16所述的一种或多种核酸分子或表达载体，所述蛋白质构建体或所述核酸分子或表达载体用于疗法中，优选用于抗IgE疗法中或用于治疗或预防IgE相关疾病或病状。
22.根据权利要求1至15中任一项所述的蛋白质构建体或根据权利要求16所述的一种或多种核酸分子或表达载体在制造用于抗IgE疗法中或用于治疗或预防IgE相关疾病或病状的药物或组合物中的用途。
23.一种治疗或预防IgE相关疾病或病状的方法，其中所述方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1至15中任一项所述的蛋白质构建体或根据权利要求16所述的一种或多种核酸分子或表达载体的步骤。
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