JP7206524B2 - Idsを含む融合タンパク質及びその使用 - Google Patents
Idsを含む融合タンパク質及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7206524B2 JP7206524B2 JP2021517964A JP2021517964A JP7206524B2 JP 7206524 B2 JP7206524 B2 JP 7206524B2 JP 2021517964 A JP2021517964 A JP 2021517964A JP 2021517964 A JP2021517964 A JP 2021517964A JP 7206524 B2 JP7206524 B2 JP 7206524B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- amino acid
- acid sequence
- fusion protein
- disease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
- A61K47/6815—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
- C12Y301/06013—Iduronate-2-sulfatase (3.1.6.13)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
ヒト合成scFvライブラリー(MIDAS、MOGAM)を用いて、抗IR抗体を作製した。MIDASのファージライブラリーを5μg/mlの濃度のヒトIRでコーティングしたチューブに入れ、処理を37℃で2時間行った。0.05% Tween 20を添加したPBS緩衝液で洗浄を4回行った。次いで、1% BSA/0.1Mグリシン(pH2.0)緩衝液での処理を室温で10分間行って、IRに結合したファージを溶出した。溶出したファージを、70μlの2M Tris-HCl(pH9.0)で中和し、これを用いて事前に培養した9mlの大腸菌(E.coli)(XL1-Blue)を30分間感染させた。ファージ感染XL1-Blueに、SB(super broth)培地、テトラサイクリン及びカルベニシリンを添加し、培養を37℃で1時間行った。次いで、培養物にヘルパーファージを添加した。培養をさらに1時間行った。培養物に培地を最大100ml添加し、培養を37℃で一晩行った。
ランダム変異誘発を用いて、LCDR3のAsn-Asn配列及びHCDR3のSer-Tyr-Gly-Thr-Val-Asn-His配列に変異を導入した(図2)。変異を導入するために、IR739の遺伝子を、対応する配列のコドンをNNK縮重コドン(N=A、T、G又はC、及びK=G又はT)に置き換えることにより得られたプライマーを用いたPCRに供して、変異体scFv DNA断片を作製した。エレクトロポレーションにより、変異体scFv DNA断片のそれぞれをライゲーションした1μgのpCIwベクター(Promega)を、100μlのXL1-Blueに形質転換した。次いで、生成物を10mlのSB(super broth)培地に入れ、培養を37℃で1時間行った。
1つのFabがIDSに置き換えられているIDS融合タンパク質のそれぞれ(IDS-IR739、IDS-H031、IDS-HL009及びIDS-8D3)を作製するために、ノブインホールをイムノグロブリンの重鎖に導入した。ノブを導入した重鎖において、Lys409をTrp409に置き換え、ホールを導入した重鎖において、Asp399及びPhe405をそれぞれ、Val399及びThr405に置き換えた。クローニングにより、IR739、HL009及び8D3のVHを、ホールを導入した重鎖のVHに置き換え、IDSのC末端を、ノブを導入した重鎖のCH2のN末端に融合した。トランスフェリン受容体に対する抗体である8D3を対照として用いた。
ヒトIR、サルIR及びマウスIRのそれぞれを過剰発現させたそれぞれのExpi-293細胞を回収し、5×106細胞/mlでそれぞれのチューブに入れた。次いで、チューブを、MIDASヒトscFvライブラリーのスクリーニングにより得られた1μg/mlの抗体それぞれで処理した。培養を4℃で30分間行い、次いで、冷PBSによる洗浄を、遠心分離機を用いて3回行った。培養物に3% BSA/PBS緩衝液中の蛍光色素標識した抗ヒト抗体(FITC-結合抗ヒトIgG)を添加し、培養を4℃で30分間、暗所で行った。3% BSA/1% アジ化ナトリウム/PBSの冷緩衝液による洗浄を、遠心分離機を用いて3回行った。分析は、FACS機器を用いて行った。結果として、抗体IR739は、ヒトIR、サルIR及びマウスIRの全てに結合することが特定された(図4)。
実験例2.1.IR739の結合親和性の評価
IR739のIRに対する結合親和性を、表面プラズモン共鳴(SPR)により分析した。1μg/mlのヒトIR又はマウスIRをCM5センサーチップ上にアセテート(pH4.0)を用いて固定化した。IR739を、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM又は1.563nMの濃度で、ヒトIR又はマウスIRを固定化したCM5センサーチップ上に流し、同時にその結合及び解離を測定した。測定条件については、流速を30μl/分に設定し、結合時間及び解離時間を、それぞれ120秒及び600秒に設定した。再生のために、10mMグリシン-HCl(pH1.5)を30秒間流した。IR739のヒトIR及びマウスIRに対する結合親和性の結果を下記表2に示す。
ELISAを行って、IR739及びそのバリアントのIRに対する結合親和性を比較した。5μg/mlの濃度で、IRでコーティングしたELISAプレートを3%スキムミルクで1時間ブロッキングし、次いで、それぞれのウェルを種々の濃度のIR739及びそのバリアントで処理した。処理を37℃で1時間行い、次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行った。IR739及びそのバリアントを検出するために、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトFc IgGによる処理を行い、インキュベーションを37℃で1時間行った。次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行った。発色をテトラメチルベンジジン(TMB)ELISA溶液を用いて行い、450nmにおける吸光度を分析した。結果として、H031及びHL009は、ヒトIR及びマウスIRに対して、IR739よりも高い結合親和性を有し、L016及びH118は、IR739よりも低い結合親和性を有していた。L113は、IR739と同等の結合親和性を示した(図5)。
ELISAを行って、IDS-HL009のIRに対する結合親和性を特定した。5μg/mlの濃度で、IRでコーティングしたELISAプレートを3%スキムミルクで1時間ブロッキングし、次いで、それぞれのウェルを種々の濃度のIR739、IDS-IR739、IDS-HL009又はIDS-H031で処理した。処理を37℃で1時間行い、次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行った。IR-739、IDS-IR739、IDS-HL009及びIDS-H031を検出するために、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトFc IgGによる処理を行い、インキュベーションを37℃で1時間行った。次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行った。発色をTMB ELISA溶液を用いて行い、450nmにおける吸光度を分析した。結果として、IDS-IR739、IDS-H031及びIDS-HL009は、ヒトIR及びマウスIRに対して、IR739よりも低い結合親和性を有しており、これは、かかる抗体において、1つのFabのIDSによる置き換えにより、アビディティ効果が除かれたためである(図6)。
IRに対するIR739とインスリンとの間の相互作用を特定するために、競合ELISAを行った。5μg/mlの濃度で、IRでコーティングしたELISAプレートを3%スキムミルクで1時間ブロッキングした。次いで、それぞれのウェルに、種々の濃度のIR739とビオチン化インスリンとの混合物を添加した。インキュベーションを37℃で1時間行い、次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行った。IR739を検出するために、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトFc IgGによる処理を行い、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンによる処理を行って、ビオチン化インスリンを検出した。
実験例4.1.マウス血液中のIR739の薬物動態の評価
マウス血液中のIR739の安定性を分析するために、5mg/kgのIR739、又は対照である8D3抗体(抗TfR抗体)を各マウスの尾静脈に投与した。投与後、30分、1時間、2時間、6時間及び24時間のそれぞれにおいて、50μlの血液を眼出血により収集した。血液を遠心分離し、上清中の抗体濃度をELISAにより分析した。ELISA用に、ELISAプレートを1μg/mlの抗ヒトFab IgGでコーティングし、3%スキムミルクでブロッキングし、次いで、1/10希釈した50μlの上清で処理した。インキュベーションを37℃で1時間行い、次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトFc IgGによる処理を行った。処理を37℃で1時間行った。次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行い、検出をTMB ELISA溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、10,000ng/ml~4.5ng/ml(10,000ng/ml、3,333ng/ml、1,111ng/ml、370ng/ml、123ng/ml、41.2ng/ml、13.7ng/ml、4.5ng/ml)のIR739でELISAを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。IR739は、約24時間の半減期を有することが特定された(図9)。
マウス血液中のIDS-HL009の安定性を分析するために、5mg/kgのIDS、IR739、IDS-HL009又はIDS-8D3を各マウスの尾静脈に投与した。投与後、30分、1時間、2時間、6時間及び24時間のそれぞれにおいて、50μlの血液を眼出血により収集した。血液を遠心分離し、上清中の抗体濃度をELISAにより分析した。ELISA用に、ELISAプレートを1μg/mlの抗ヒトFab IgGでコーティングし、3%スキムミルクでブロッキングし、次いで、1/10希釈した50μlの上清で処理した。
実験例5.1.IR739の脳取り込み効率の評価
IR739の脳取り込み効率を分析するために、陰性対照IgG(抗メソテリン(MSLN)IgG)、8D3又はIR739を5mg/kgで各マウスの尾静脈に注入した。ここで、抗メソテリンIgGを陰性対照として使用し、8D3を陽性対照として使用した。1時間及び24時間後に、各物質について3匹のマウスのそれぞれを灌流し、次いで、脳をそこから取り出した。脳100mg当たり1mlの溶解緩衝液を添加し、粉砕を行った。次いで、13,000rpmで遠心分離を行った。ELISAプレートを1μg/mlの抗ヒトFab IgGでコーティングし、3%スキムミルクでブロッキングし、次いで、50μlの上清で処理した。インキュベーションを37℃で1時間行い、次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトFc IgGによる処理を行った。インキュベーションを37℃で1時間行った。次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行い、検出をTMB ELISA溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、1,000ng/ml~0.45ng/ml(1,000ng/ml、333ng/ml、111ng/ml、37.0ng/ml、12.3ng/ml、4.12ng/ml、1.37ng/ml、0.45ng/ml)の抗MSLN IgG、8D3及びIR739でELISAを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。IR739は、8D3よりも低い脳取り込み効率を示し、一方、抗MSLN IgGよりも高い脳取り込み効率を示した(図11)。
IR739のバリアントの脳取り込み効率を分析するために、抗MSLN IgG、8D3、IR739、H031、HL009、L113又はH118を5mg/kgで各マウスの尾静脈に注入した。1時間及び24時間後に、各物質について3匹のマウスのそれぞれを灌流し、次いで、脳をそこから取り出した。脳100mg当たり1mlの溶解緩衝液を添加し、粉砕を行った。次いで、13,000rpmで遠心分離を行った。ELISAプレートを1μg/mlの抗ヒトFab IgGでコートし、3%スキムミルクでブロッキングし、次いで、50μlの上清で処理した。インキュベーションを37℃で1時間行、次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトFc IgGによる処理を行った。インキュベーションを37℃で1時間行った。次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行い、検出をTMB ELISA溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、1,000ng/ml~0.45ng/ml(1,000ng/ml、333ng/ml、111ng/ml、37.0ng/ml、12.3ng/ml、4.12ng/ml、1.37ng/ml、0.45ng/ml)の抗MSLN IgG、8D3、IR739、H031、HL009、L113及びH118でELISAを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。分析の結果として、バリアントの中で、HL009は、IR739よりも高い脳取り込み効率を示し、一方、H031、L113及びH118は、IR739よりも低い脳取り込み効率を示した(図12)。
IDS-HL009の脳取り込み効率を分析するために、IDS-HL009を5mg/kgで各マウスの尾静脈に注入した。1時間及び24時間後に、各物質について3匹のマウスのそれぞれを灌流し、次いで、脳をそこから取り出した。脳100mg当たり1mlの溶解緩衝液を添加し、粉砕を行った。次いで、13,000rpmで遠心分離を行った。ELISAプレートを1μg/mlの抗ヒトFab IgGでコーティングし、3%スキムミルクでブロッキングし、次いで、50μlの上清で処理した。インキュベーションを37℃で1時間行、次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行った。ペルオキシダーゼ結合抗ヒトFc IgGによる処理を行った。インキュベーションを37℃で1時間行った。次いで、0.05% Tween 20/PBS溶液による洗浄を3回行い、検出をTMB ELISA溶液を用いて行った。上述と同様の方法で、1,000ng/ml~0.45ng/ml(1,000ng/ml、333ng/ml、111ng/ml、37.0ng/ml、12.3ng/ml、4.12ng/ml、1.37ng/ml、0.45ng/ml)のIDS-HL009でELISAを行うことによって得られた結果を標準として用いて、濃度を算出した。IDS-HL009は、IDS、IDS-IR739及びIDS-H031よりも高い脳取り込み効率を示した(図13)。
IDS及びIDS-HL009の特徴を分析するために、10ng/mlのIDS又は10μlのIDS-HL009及び0μlの100mM 4-メチルウンベリフェリルα-L-イドピラノースイズロン酸-2-スルフェート(4MU-α-IdopyraA-2)を96ウェルプレート(黒色)に入れ、インキュベーションを37℃で4時間行った。20μlのPi/Ci溶液(pH4.5)の添加により反応を停止し、反応物に10μlの25μg/ml組換えヒトα-L-イズロニダーゼを添加した。インキュベーションを37℃で24時間行った。次いで、反応物に200μlの0.25M炭酸/炭酸水素ナトリウム(pH10.0)を添加し、蛍光を測定した(吸光355nm/発光460nm)。4-メチルウンベリフェロンを標準として用いて活性を分析し、結果を下記表3に示す。
Claims (18)
- インスリン受容体に結合する抗体の断片を含む第1のドメインと、
イズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)活性を有するタンパク質を含む第2のドメインと、を含み、
前記第1のドメインが、
(i)配列番号1のアミノ酸配列を有するH-CDR1、配列番号3のアミノ酸配列を有するH-CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を有するH-CDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号2のアミノ酸配列を有するL-CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を有するL-CDR2、並びに配列番号6、10及び11のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか1つを有するL-CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含むか、
(ii)配列番号1のアミノ酸配列を有するH-CDR1、配列番号3のアミノ酸配列を有するH-CDR2、及び配列番号7のアミノ酸配列を有するH-CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号2のアミノ酸配列を有するL-CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を有するL-CDR2、及び配列番号6又は8のアミノ酸配列を有するL-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含むか、又は
(iii)配列番号1のアミノ酸配列を有するH-CDR1、配列番号3のアミノ酸配列を有するH-CDR2、及び配列番号9のアミノ酸配列を有するH-CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号2のアミノ酸配列を有するL-CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を有するL-CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有するL-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む、
融合タンパク質。 - Fc領域をさらに含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記Fc領域がヘテロダイマーである、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 前記第1のドメインが、インスリン受容体に結合する抗体のFab又はscFv領域である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記Fc領域が、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4の重鎖定常領域(CH)由来である、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 前記ヘテロダイマーFcの一方がノブ構造を有し、他方がホール構造を有する、請求項3に記載の融合タンパク質。
- 前記第1のドメインのC末端が前記Fc領域のN末端に結合している、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 前記第2のドメインのC末端が前記Fc領域のN末端に結合している、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 前記第2のドメインが配列番号21のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
- インスリン受容体とインスリンとの間の結合を阻害しない、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 中枢神経系(CNS)疾患を予防又は治療するための医薬組成物であって、請求項1~10のいずれか一項に記載の融合タンパク質を有効成分として含む、医薬組成物。
- 前記中枢神経系疾患が、リソソーム蓄積症(LSD)、ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、大脳皮質基底核変性症(CBD)、大脳皮質基底核神経節変性症(CBGD)、前頭側頭型認知症(FTD)、多系統萎縮症(MSA)、進行性核上性麻痺(PSP)及び脳がんからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記リソソーム蓄積症が、ハンター症候群、テイ・サックス病、ニーマン・ピック病、ポンペ病、クラッベ病、ゴーシェ病、ファブリー病、ウォルマン病、モルキオ症候群、メンケス症候群、ガラクトシアリドーシス、糖原病、ファンコニ・ビッケル症候群、レッシュ・ナイハン症候群及びツェルウェーガー症候群からなる群から選択されるいずれか1つである、請求項12に記載の医薬組成物。
- 融合タンパク質を作製するための方法であって、
インスリン受容体に結合する抗体の断片をFc領域に結合させて、第1のモノマーを作製するステップと、
イズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)をヘテロダイマーFc領域に結合させて、第2のモノマーを作製するステップと、
前記第1のモノマーを前記第2のモノマーと混合するステップと、を含み、
前記抗体断片が、
(i)配列番号1のアミノ酸配列を有するH-CDR1、配列番号3のアミノ酸配列を有するH-CDR2、及び配列番号5のアミノ酸配列を有するH-CDR3を含む重鎖可変領域(VH)と、配列番号2のアミノ酸配列を有するL-CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を有するL-CDR2、並びに配列番号6、10及び11のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか1つを有するL-CDR3を含む軽鎖可変領域(VL)とを含むか、
(ii)配列番号1のアミノ酸配列を有するH-CDR1、配列番号3のアミノ酸配列を有するH-CDR2、及び配列番号7のアミノ酸配列を有するH-CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号2のアミノ酸配列を有するL-CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を有するL-CDR2、及び配列番号6又は8のアミノ酸配列を有するL-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含むか、又は
(iii)配列番号1のアミノ酸配列を有するH-CDR1、配列番号3のアミノ酸配列を有するH-CDR2、及び配列番号9のアミノ酸配列を有するH-CDR3を含む重鎖可変領域と、配列番号2のアミノ酸配列を有するL-CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を有するL-CDR2、及び配列番号6のアミノ酸配列を有するL-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む、
方法。 - 前記第1のモノマーの前記Fc領域のCH3がノブ構造を有する場合、前記第2のモノマーのCH3がホール構造を有するか、又は、
前記第1のモノマーの前記Fc領域のCH3がホール構造を有する場合、前記第2のモノマーのCH3がノブ構造を有する、請求項14に記載の方法。 - 前記IDSが配列番号21のアミノ酸配列を有する、請求項14に記載の方法。
- 前記第1のモノマーが、
(i)配列番号12又は16のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号13、18及び19のアミノ酸配列からなる群から選択されるいずれか1つを有する軽鎖とを含むか、
(ii)配列番号14のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号13又は15のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含むか、又は
(iii)配列番号17のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号13のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含み、
前記第2のモノマーが、配列番号20のアミノ酸配列を有する、請求項14に記載の方法。 - 中枢神経系疾患を予防又は治療するための医薬の製造のための、請求項1~10のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020180129201A KR20200047937A (ko) | 2018-10-26 | 2018-10-26 | Ids를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 |
KR10-2018-0129201 | 2018-10-26 | ||
PCT/KR2019/013730 WO2020085721A1 (ko) | 2018-10-26 | 2019-10-18 | Ids를 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022512575A JP2022512575A (ja) | 2022-02-07 |
JP7206524B2 true JP7206524B2 (ja) | 2023-01-18 |
Family
ID=70331645
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021517964A Active JP7206524B2 (ja) | 2018-10-26 | 2019-10-18 | Idsを含む融合タンパク質及びその使用 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210324094A1 (ja) |
EP (1) | EP3875483A4 (ja) |
JP (1) | JP7206524B2 (ja) |
KR (1) | KR20200047937A (ja) |
CN (1) | CN112912404A (ja) |
WO (1) | WO2020085721A1 (ja) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013507131A (ja) | 2009-10-09 | 2013-03-04 | アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッド | Cnsにおけるイズロン酸2−スルファターゼ活性を増加させるための方法および組成物 |
JP2015537034A (ja) | 2012-11-21 | 2015-12-24 | ウーハン ワイゼットワイ バイオファルマ カンパニー リミテッドWuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. | 二重特異性抗体 |
US20160152719A1 (en) | 2013-07-19 | 2016-06-02 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods related to structures that cross the blood brain barrier |
WO2018038243A1 (ja) | 2016-08-25 | 2018-03-01 | Jcrファーマ株式会社 | 抗体融合蛋白質の製造方法 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
EP2072527A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Altonabiotec AG | Fusion polypeptides comprising a SHBG dimerization component and uses thereof |
ES2754234T3 (es) * | 2010-06-25 | 2020-04-16 | Shire Human Genetic Therapies | Métodos y composiciones para la administración SNC de iduronato-2-sulfatasa |
EP3208282A1 (en) * | 2010-11-30 | 2017-08-23 | F. Hoffmann-La Roche AG | Low affinity anti transferrin receptor and their use to transfer therapeutic scfv across the blood brain barrier |
CA2879496C (en) | 2012-08-29 | 2024-01-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Blood brain barrier shuttle |
MX2015015970A (es) | 2013-05-20 | 2016-09-08 | Genentech Inc | Anticuerpos receptores de antitransferina y metodos de uso. |
AU2016283343B2 (en) * | 2015-06-24 | 2022-05-19 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Anti-human transferrin receptor antibody permeating blood-brain barrier |
CN110382529B (zh) * | 2017-03-02 | 2024-03-08 | 诺华股份有限公司 | 工程化的异源二聚体蛋白质 |
-
2018
- 2018-10-26 KR KR1020180129201A patent/KR20200047937A/ko not_active Application Discontinuation
-
2019
- 2019-10-18 CN CN201980070257.5A patent/CN112912404A/zh active Pending
- 2019-10-18 EP EP19877066.1A patent/EP3875483A4/en active Pending
- 2019-10-18 JP JP2021517964A patent/JP7206524B2/ja active Active
- 2019-10-18 US US17/285,367 patent/US20210324094A1/en active Pending
- 2019-10-18 WO PCT/KR2019/013730 patent/WO2020085721A1/ko unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013507131A (ja) | 2009-10-09 | 2013-03-04 | アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッド | Cnsにおけるイズロン酸2−スルファターゼ活性を増加させるための方法および組成物 |
JP2015537034A (ja) | 2012-11-21 | 2015-12-24 | ウーハン ワイゼットワイ バイオファルマ カンパニー リミテッドWuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. | 二重特異性抗体 |
US20160152719A1 (en) | 2013-07-19 | 2016-06-02 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods related to structures that cross the blood brain barrier |
WO2018038243A1 (ja) | 2016-08-25 | 2018-03-01 | Jcrファーマ株式会社 | 抗体融合蛋白質の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112912404A (zh) | 2021-06-04 |
JP2022512575A (ja) | 2022-02-07 |
WO2020085721A1 (ko) | 2020-04-30 |
EP3875483A4 (en) | 2022-08-03 |
EP3875483A1 (en) | 2021-09-08 |
US20210324094A1 (en) | 2021-10-21 |
KR20200047937A (ko) | 2020-05-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210403558A1 (en) | Anti-tim-3 antibodies, compositions comprising anti-tim-3 antibodies and methods of making and using anti-tim-3 antibodies | |
JP5735476B2 (ja) | 肝細胞成長因子(hgf)結合蛋白質 | |
JP5528246B2 (ja) | 肝細胞成長因子(hgf)結合蛋白質 | |
US20190330336A1 (en) | Anti-lag3 antibodies, compositions comprising anti-lag3 antibodies and methods of making and using anti-lag3 antibodies | |
JP2020508054A (ja) | 抗タウ抗体及びその使用方法 | |
JP2009539347A5 (ja) | ||
US20220380458A1 (en) | Binding molecules specific for fcgamma riia and uses thereof | |
US11780916B2 (en) | GIPR antibody and GLP-1 fusion protein thereof, and pharmaceutical composition and application thereof | |
US20220411520A1 (en) | Gipr antibody and fusion protein between same and glp-1, and pharmaceutical composition and application thereof | |
JP2015502915A (ja) | CD1dに対する抗体 | |
KR20230048439A (ko) | 항-par-2 항체 및 이의 사용 방법 | |
JP2023179442A (ja) | α-syn/IGF1Rに対する二重特異抗体およびその用途 | |
KR20100105587A (ko) | 항-인자 b 항체 및 이들의 용도 | |
KR20230132511A (ko) | Cd73에 결합하는 단백질 및 이의 용도 | |
JP7206524B2 (ja) | Idsを含む融合タンパク質及びその使用 | |
EP4302778A1 (en) | Pharmaceutical composition containing anti-tslp antibody | |
EP4183802A1 (en) | Anti-ang-2 antibody and use thereof | |
EP4023677A1 (en) | Monoclonal antibody which targets tfpi | |
KR20210145187A (ko) | Il-5에 대한 항체를 함유하는 약학적 조성물 및 이의 용도 | |
CN114258404A (zh) | 抗IgE构建体 | |
WO2018064603A1 (en) | Compositions and methods for crosslinking fc receptors | |
WO2023025309A1 (zh) | 一种cdc平台抗体 | |
US20220380446A1 (en) | Antibodies for treating alpha-synucleinopathies | |
WO2023016516A1 (zh) | 抗vegf a和vegf c双特异性抗体及其用途 | |
CN112601551A (zh) | 抗海蟾蜍毒素抗体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210525 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20210331 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210525 |
|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20210331 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220426 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220725 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220830 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221116 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221206 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221212 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7206524 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |