JP2015502915A - CD1dに対する抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2011年10月14日に出願された豪州特許出願第2011904190号および2011年10月14日に出願された米国特許出願第61/547,307号と関連し、その優先権を主張し、これらの出願の各々の全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
複数のCD1d結合タンパク質を、配列番号116のアミノ酸位置87〜93および141〜143がこれらの位置の対応するマウスアミノ酸で置換されたヒトCD1d突然変異タンパク質と、CD1d結合タンパク質が突然変異タンパク質に結合してCD1d結合タンパク質-ヒトCD1d突然変異タンパク質複合体およびヒトCD1d突然変異タンパク質に結合しない減弱した複数のCD1d結合タンパク質を形成するのを可能にするのに十分な条件下で接触させるステップと、
減弱した複数のCD1d結合タンパク質から、ヒトCD1d突然変異タンパク質に結合しないCD1d結合タンパク質を回収するステップと
を含み、回収されたCD1d結合タンパク質が、ヒトCD1dに特異的に結合し、401.11、402.8および401.11.158からなる群から選択される少なくとも1つの抗体と、CD1dへの結合について競合する、前記方法を提供する。
複数のCD1d結合タンパク質を、ヒトCD1d(配列番号116)の位置87〜93および141〜143に位置するアミノ酸が、これらの位置の対応するマウス配列で置き換えられたhCD1dmu(配列番号119)と、CD1d結合タンパク質がhCD1dmuに結合してCD1d結合タンパク質-hCD1dmu複合体およびhCD1dmuに結合しない減弱した複数のCD1d結合タンパク質を形成するのを可能にするのに十分な条件下で接触させるステップと、
減弱した複数のCD1d結合タンパク質から、hCD1dmuに結合しないCD1d結合タンパク質を回収するステップと
を含み、回収されたCD1d結合タンパク質がヒトCD1d(配列番号116)またはmCD1dmu(配列番号118)に特異的に結合する、前記方法を提供する。
複数のCD1d結合タンパク質を、配列番号116のアミノ酸位置87〜93および141〜143がこれらの位置の対応するマウスアミノ酸で置換されたヒトCD1d突然変異タンパク質と、CD1d結合タンパク質が突然変異タンパク質に結合してCD1d結合タンパク質-ヒトCD1d突然変異タンパク質複合体およびヒトCD1d突然変異タンパク質に結合しない減弱した複数のCD1d結合タンパク質を形成するのを可能にするのに十分な条件下で接触させるステップと、減弱した複数のCD1d結合タンパク質から、ヒトCD1d突然変異タンパク質に結合しないCD1d結合タンパク質を回収するステップと
を含み、回収されたCD1d結合タンパク質が、ヒトCD1dに特異的に結合し、401.11、402.8および401.11.158からなる群から選択される少なくとも1つの抗体と、CD1dへの結合について競合する、前記方法を提供する。
複数のCD1d結合タンパク質を、ヒトCD1d(配列番号116)の位置87〜93および141〜143に位置するアミノ酸が、この位置の対応するマウス配列で置き換えられたhCD1dmu(配列番号119)と、CD1d結合タンパク質がhCD1dmuに結合してCD1d結合タンパク質-hCD1dmu複合体およびhCD1dmuに結合しない減弱した複数のCD1d結合タンパク質を形成するのを可能にするのに十分な条件下で接触させるステップと、減弱した複数のCD1d結合タンパク質から、hCD1dmuに結合しないCD1d結合タンパク質を回収するステップと
を含み、回収されたCD1d結合タンパク質がヒトCD1d(配列番号116)またはmCD1dmu(配列番号118)に特異的に結合する、前記方法を提供する。
MGCLLFLLLWALLQAWGSAEVPQRLFPLRCLQISSFANSSWTRTDGLAWLGELQTHSWSNDSDTVRSLKPWSQGTFSDQQWETLQHIFRVYRSSFTRDVKEFAKMLRLSYPLELQVSAGCEVHPGNASNNFFHVAFQGKDILSFQGTSWEPTQEAPLWVNLAIQVLNQDKWTRETVQWLLNGTCPQFVSGLLESGKSELKKQVKPKAWLSRGPSPGPGRLLLVCHVSGFYPKPVWVKWMRGEQEQQGTQPGDILPNADETWYLRATLDVVAGEAAGLSCRVKHSSLEGQDIVLYWGGSYTSMGLIALAVLACLLFLLIVGFTSRFKRQTSYQGVL(配列番号157)
であってもよい。ヒトCD1dのUniProt受託番号は、P15813である。
ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号158)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号159)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(配列番号160)
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号161)
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(配列番号162)
一般的方法
HEK293/pTT5発現系
HEK293E/pTT5発現系を含む全てのトランスフェクションについて、HEK293E細胞を、完全細胞増殖培地(1LのF17培地(Invitrogen)、9mLのプルロニックF68(Invitrogen)、20%(w/v)トリプトンNI(Organotechnie)を含有する2mMのグルタミン、50μL/100mL培養物でゲネチシン(50mg/mL、Invitrogen)を含む)中で培養した。トランスフェクションの前日に、細胞を遠心分離により収穫し、ゲネチシンを含まない新鮮な培地中に再懸濁した。次の日、DNAを市販のトランスフェクション試薬と混合し、DNAトランスフェクション混合物を培養物に滴下しながら添加した。培養物を、ゲネチシンを用いずに37℃で一晩、5%CO2および120rpmでインキュベートした。次の日、培養物500mLあたり12.5mLのトリプトンおよび250μLのゲネチシンを添加した。培養物を7日間、37℃、5%CO2および120rpmでインキュベートした後、上清を収穫し、精製した。
C末端に位置するHISタグを含むCD1dの細胞外ドメインをコードするDNA発現構築物(配列番号19)、β2M(配列番号20)をコードするDNA発現構築物で同時トランスフェクトされたDNA発現構築物を用いて、ヒトCD1d/β2Mを哺乳動物HEK293E/pTT5発現系中で生成させた。分泌されたCD1d/β2Mタンパク質を含有する培養上清を、2000gで10minの遠心分離により収穫して、細胞を除去した。HisTrapTM HPカラム(GE Healthcare)を用いるHis8親和性タグにより、上清からCD1d/β2Mタンパク質複合体を精製した。溶出したタンパク質を、HiLoad 16/60 Superdex 200 prep gradeカラム(GE Healthcare)を用いてPBS中でバッファー交換し、約50kDaの画分を、HiLoad 26/60 Superdex 200 prep gradeカラム(GE Healthcare)上でのゲル濾過により分離した。ヒトβ2Mのみを生成し、同様の様式で精製した。同様の精製方法を、他種のCD1d(例えば、マウスCD1d)およびCD1dの合成構築物(hCD1dmuおよびmCD1dmuなど)の精製のために採用した。
F1 - GTGCCTGCTGTTTCTGCTG(配列番号120)
R1 - TGCCCTGATAGGAAGTTTGC(配列番号121)
VHアミノ酸鎖を、ヒト定常領域(ヒトIgG4重鎖CH1、ヒンジ、CH2およびCH3ドメイン(S228Pに置換を有するNCBI受託番号P01861など))と共に発現させた。これを、アミノ酸配列からDNA配列への戻し翻訳、次いで、de novo合成および合成オリゴヌクレオチドの集合により達成した。遺伝子合成の後、全配列を、pTT5重鎖ベクターのマルチクローニング部位にサブクローニングした(Durocher, Y.ら、2002、Nucleic Acids Res、30、E9)。VLアミノ酸鎖を、pTT5軽鎖ベクターのマルチクローニング部位に配列をサブクローニングすることにより、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常領域(NCBI受託番号AAI10395およびC6KXN3など)と共に発現させた。
重鎖および軽鎖DNAベクターを、HEK293/pTT5発現系中に同時トランスフェクトし、7日間培養した。これらのトランスフェクションから誘導された上清を、pH7.4に調整した後、HiTrap Protein Aカラム(5mL、GE Healthcare)上に充填した。カラムを、50mLの1×PBS(pH7.4)を用いて洗浄した。溶出を、0.1Mクエン酸pH2.5を用いて実施した。溶出した抗体を、1×PBS(pH7.4)中でZeda Desaltingカラム(Pierce)を用いて脱塩した。抗体を、SDS-PAGEを用いて分析した。抗体の濃度を、BCAアッセイキット(Pierce)を用いて決定した。
抗CD1d抗体の作製
ファージ展示
ヒトおよびカニクイザルCD1d/β2Mの両方に結合するFAbを、ナイーブなファージミドライブラリーから単離した。
それぞれ個々の大腸菌コロニーを用いて、FAbを発現させ、CD1d/β2M結合活性についてスクリーニングした。コロニーを96穴ディープウェルプレート(Costar)中、1mLのYT開始培養物(100μg/mLカルベニシリンおよび2%グルコースを添加した)中に接種し、650rpmで振とうしながら30℃で一晩インキュベートした。これらの開始培養物を、1mL発現培養物(100μg/mLカルベニシリンのみを添加したYT)中で1:50に希釈し、600nmで0.8〜1.0の光密度まで増殖させた。FAb発現を、1mMの最終濃度でイソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシドを添加することにより誘導した。培養物を20℃で16hインキュベートした。
単一濃度分析物通過アッセイにおいて、BIAcore 4000 Biosensor(GE Healthcare)を用いて、SPRスクリーニングを行った。約10,000RUの抗V5抗体(Invitrogenカタログ番号R960CUS)を、未改変の4つのフローセル脱離スポット3のそれぞれのスポット1、2、4および5上のpH5.5での標準的なアミンカップリング化学を用いて、CM5 Series S Sensorチップ上に固定した。用いたランニングバッファーはHBS-EP+(GE Healthcare)であり、全ての相互作用を25℃で測定し、データ収集速度を10Hzに設定した。V5タグ付FAbの粗ペリプラズム調製物を、ランニングバッファー中で2倍に希釈した後、それぞれのフローセルのスポット1または5上で10μL/minの流速で100sec捕捉した(典型的には、約200RUのFAbを捕捉した)。短い安定化期間の後、ヒトまたはカニクイザルCD1d/β2Mを、30μL/minの流速で100sec、同時に4つ全部のフローセルの全スポット上を通過させた。相互作用の解離を100sec測定した後、30secのパルスの100mMリン酸を用いて抗V5抗体に再生し戻した。作製されたセンサーグラムを、それぞれのフローセルについて隣接する抗V5抗体スポットに対して参照し、1:1のLangmuir式を用いて適合させ、ka、kdおよびKDを決定した。
4400個を超えるクローンを、SPRアッセイによりヒトおよびカニクイザルのCD1d/β2Mへの結合についてスクリーニングした。合計51個のFAbが、ヒトおよびカニクイザルのCD1dに対する高い選択性を有することがわかった。
CD1dへのIgG結合の確認
ヒト-カニクイザルCD1d反応性FAbを、IgG4形式に変換し、一般的方法に記載のように発現させ、精製した。実施例1に記載のアッセイの改変型を用いてELISAおよびSPRによりヒトおよびカニクイザルCD1dへの結合について、精製された抗体を試験した。簡単に述べると、ELISAアッセイのためにMaxisorp ELISAプレート(Nunc)を、1μg/mLの適切な抗原で被覆した。次いで、プレートを洗浄し、精製されたIgG試料を、ELISAプレート上の個々のウェルに添加した。IgGを、室温で1時間、捕捉されたCD1d/β2Mに結合させた後、PBS-Tで3回およびPBSで3回洗浄した。結合したIgGを、ヒトFc(Sigma)に対するHRPコンジュゲート化抗体を用いて検出した。検出抗体を室温で30分間インキュベートした。プレートを洗浄して、未結合の抗体を除去し、50μLの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(KPL)と共にインキュベートすることによりアッセイシグナルを生じさせ、50μLの1M HClでクエンチした。マイクロプレートリーダー(Bio-Tek)を用いてA450nmでアッセイシグナルを読み取った。結果を生のA450nm値として表し、平均アッセイバックグラウンドよりも2倍多いシグナルを「陽性」として定義した。
細胞に基づくCD1d四量体阻害効力アッセイ
安定なNKTCRを発現する細胞系の作出
抗CD1d抗体の生物学的効力を特性評価するための細胞に基づくアッセイを開発するために、NKT細胞受容体(NKTCR)を発現する安定な細胞系が必要であった。細胞系J.RT3-T3.5 (ATCC: TIB-153)を、安定なNKT細胞受容体発現細胞系の作出のために選択した。J.RT3-T3.5は、T細胞抗原受容体のβ鎖を欠くJurkat (ATCC: TIB152)のE6-1クローンに由来する。この細胞は、その表面上にCD3もT細胞受容体αβヘテロ二量体も発現しない。J.RT3-T3.5細胞を、一方はJ3N.5 NKTCRのα鎖(配列番号21)を含み、他方はJ3N.5NKTCRのβ鎖(配列番号22)を含む2つのベクターを用いて同時にエレクトロポレーションを行った(Brigl, M.ら、2006 J Immunol 176: 3625〜34頁)。このNKT細胞受容体は、糖脂質抗原α-GalCerと反応する。NKTCRのαおよびβ鎖をコードするこれらのベクターは、それぞれゲネチシンおよびブラスチシジンに対する耐性遺伝子も発現する。これらのベクターの安定な組み込みを、所定の濃度のゲネチシンおよびブラスチシジンを含有する培養培地中でのこれらの細胞の増殖により達成した。
抗CD1d抗体の効力を特性評価するための細胞に基づくアッセイは、フローサイトメトリーに基づくCD1d四量体阻害アッセイにおいて、上記のクローンNKT細胞系を用いた。このアッセイは、J.RT3-T3.5細胞中に安定にトランスフェクトされたNKTCRに結合する、α-GalCerを充填したCD1d四量体の能力に依っていた。抗CD1d抗体の効力を、安定にトランスフェクトされたJ.RT3-T3.5系上に存在するNKTCRに結合するCD1d四量体を阻害する抗体の能力により決定した。阻害抗体は、CD1d四量体と、J.RT3-T3.5細胞上に安定にトランスフェクトされたNKTCRとの相互作用を防止する四量体内のCD1d分子上の特異的エピトープに結合する。アッセイの読み取りは、フルオロクロムコンジュゲート化CD1d四量体の平均蛍光強度(MFI)の低下であった。CD1四量体濃度を一定に保ちながら、抗CD1d抗体の滴定により、およそのEC50値を生成した。アッセイの再現性および信頼性を確保するために、様々なCD1d四量体濃度での最適化実験を行って、最良の動的範囲を決定した。CD1d四量体の最適濃度は、1:1000希釈率であると決定されたが、これは約10nMに相当する。
NKT細胞系IL-2放出アッセイ
細胞系に基づく機能的効力アッセイを用いて、抗CD1d抗体をさらに特性評価した。U-937細胞系(ATCC: CRL 1593.2)は、CD1d陽性である骨髄単球系である。αGalCerを充填したU-937細胞は、実施例3に記載された安定なNKTCR細胞系によるIL-2の生成を誘導することができる。阻害的抗CD1d抗体は、これらのαGalCer充填U-937細胞に応答してNKTCR細胞系によるIL-2の放出を低下させる。IL-2レベルは、標準的なELISA技術(R&D Systems)により測定した。
一次PBMCへの抗CD1d抗体の結合の試験
一次ヒト体細胞上に展示されるCD1dに結合する能力について、抗CD1d抗体を特性評価した。抗CD1d抗体402.8、401.11.158および無関係の特異性の陰性対照抗体を、2mg/mLの濃度に調整し、製造業者の説明書に従って蛍光色素Pacific Blue(Invitrogen)にコンジュゲートさせた。
一次NKT細胞に基づくアッセイにおける抗CD1d抗体の効果の試験
ヒトNKT細胞は、CD1dの文脈で提示される脂質または糖脂質抗原に応答して迅速なエフェクター機能を惹起することができる。この迅速なエフェクター機能を、IFN-γ、IL-4、IL-5、およびIL-13などのサイトカインの放出により実証することができる。阻害的抗CD1d抗体は、細胞上に存在するCD1dに結合し、NKT細胞と、CD1dと糖脂質とのその同族複合体との相互作用を防止することにより、これらのNKT細胞の機能を阻害することができる。好適な抗原提示細胞としては、不死化骨髄細胞系または一次ヒト樹状細胞が挙げられる。ヒトドナーの末梢血内のNKT細胞の希少性を考慮すると、アッセイの成功には、最初の例におけるそのような一次NKT細胞の単離および拡張が必要である。
PBMCを、lymphoprep(Nycomed)勾配上で軟膜から単離した。次いで、NKT細胞を、標準的な磁気関連細胞選別(MACS)法(Exleyら、2010 Curr Protoc Immunol、Chapter 14、Unit 14:11)により富化した。簡単に述べると、NKT細胞を、Vα24-Jα18 iNKTマーカー(Miltenyi Biotec)に対するMACSマイクロビーズと共にインキュベートした。冷PBS中で細胞懸濁液を2回洗浄することにより、過剰のマイクロビーズを除去した。次いで、細胞懸濁液をMACSカラムに通過させ、富化されたNKT細胞を含有する陽性画分を保持した。陰性画分からの細胞は、単球および樹状細胞などのCD1d陽性細胞を含有してもよく、富化されたNKT細胞を刺激するための供給体として用いることができる。最初に、供給細胞を、有糸分裂の阻害剤であるマイトマイシンCで、37℃で30min処理した。次いで、これらの細胞を組織培養培地で数回洗浄した後、100ng/mLの最終濃度でα-GalCerを充填し、96穴丸底プレート中、1×104個のNKT細胞/ウェルと共に1:1の比で同時培養した。37℃および5%CO2で16時間インキュベートした後、IL-2を10ng/mLの最終濃度で培地に添加した。細胞を約14日間培養させた。NKT細胞集団の純度を、蛍光色素コンジュゲート化CD1d四量体(ProImmune)、蛍光色素コンジュゲート化抗Vα24Jα18(Miltenyi Biotec)および蛍光色素コンジュゲート化抗CD3(BD Biosciences)を用いる、多パラメータフローサイトメトリーにより決定した。細胞に基づくアッセイにおける使用のための好適なNKT集団の純度は、常法に従って、フローサイトメトリー分析により70%を超えるNKT細胞であった。
別途記述しない限り、全ての一次細胞に基づくアッセイを、37℃および5%CO2で行った。THP-1細胞を、2×104細胞/ウェルの濃度で96穴平底プレート中に分配した。10分後、α-GalCerを、100ng/mLの最終濃度で細胞上に充填した。α-GalCerの添加後45分で、抗CD1d阻害抗体を、10μg/mLから減少する濃度で添加した。次いで、抗体の添加の30分後、NKT細胞をウェルあたり2×104個の細胞で添加した。無細胞培養上清を、インキュベーション後24時間で回収した。ヒトサイトカインに関するELISAを、培養上清上で実施した:ヒトIFN-γ、IL-4、IL-5およびIL-13(全てR%D Systems)。
抗CD1d抗体401.1、401.9、401.11、401.12、401.14および402.8を、このアッセイにおいて試験した。無関係の特異性の陰性対照抗体(ヒトIgG1)を、陰性対照として用いた。抗体42および51.1を、陽性対照として用いた。実施例4に記載のIL-2細胞系アッセイの結果と同様、抗体401.11および402.8のみが、細胞CD1dの文脈で一次ヒトNKT細胞による糖脂質抗原に誘導されたサイトカイン放出の強力な阻害を示した(図4およびTable 4(表4);IFN-γアッセイのEC50値を参照されたい)。比較により、陰性対照抗体は、無視できる程度の阻害を示した。抗体42は、高用量(10μg/mL)でNKT細胞によるサイトカイン放出の阻害を示したが、この効果は、より低濃度では持続しなかった(図4)。抗体42は、in vitroではNKT細胞活性の強力な中和因子であると考えられ、そのようなものとして広く公開されている(Exley, M.ら、1997、J. Exp. Med. 186:109〜120頁;WO03/092615)。抗体42と比較して、抗体401.11および402.8は、それぞれ最大で114倍および最大で180倍改善された効力を示した。
401.11 VH 配列番号1
401.11 VL 配列番号2
402.8 VH 配列番号3
402.8 VL 配列番号4
402.8および401.11はCD1d上の共通のエピトープを共有する
上記の結果に示されるように、ファージ展示キャンペーンは、先行技術の抗CD1d抗体と比較して優れた生物学的効力を示す抗CD1d抗体401.11および402.8を作製した。この有意に改善された効力は、抗CD1d抗体が結合すると、CD1d分子と、その同族受容体、例えば、NKT細胞上に存在するNKT細胞受容体との相互作用を防止する非常に中和的なエピトープの認識に起因するものであると仮定された。従って、CD1dとのこの相互作用の遮断は、NKT細胞の活性化および前炎症性サイトカインの放出などの下流の生物学的効果を阻害するのに必要十分であった。作製された非常に強力な抗CD1d抗体が、中和的抗CD1d抗体と比較して異なるエピトープ特異性を有するかどうかを調査するために、競合結合ELISAを開発した。
抗CD1d抗体402.8を、3:1の比のビオチン:402.8でEZ-link Sulfo-NHS-LC-ビオチンキット(Pierce)を用いてビオチン化した。PBSを用いる複数回の洗浄および30kDaカットオフを有する遠心分離フィルターユニット(Millipore)を介する遠心分離(3000rpm)による濃縮により、タンパク質調製物から遊離ビオチンを除去した。Maxisorp ELISAプレート(Nunc)を、0.5μg/mLヒトCD1dで被覆し、4℃で一晩インキュベートさせた。次いで、0.1%Tween20を含有するPBS中で3回、プレートを洗浄した後、プレートを室温で1h、1%BSA中で遮断した。次いで、ビオチン化された402.8を、1:1の比で非ビオチン化抗CD1d抗体(402.8、401.11、42および51.1)と5分間同時平衡化させた。これらの抗体を、50μg/mLから減少する濃度で(すなわち、0.1μg/mLのビオチン化された402.8と比較して最大で500倍過剰)、室温で1h、プレートに添加した。次いで、0.1%Tween20を含有するPBS中で3回、プレートを洗浄した。暗室中、室温で1h、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(BD Biosciences)をプレートに添加した。プレートを洗浄して、未結合のストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを除去した。50μLの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(KPL)と共にインキュベートすることによりアッセイシグナルを生じさせ、50μLの1M HClでクエンチした。マイクロプレートリーダー(FluoStar Galaxy)を用いてA450nmでアッセイシグナルを読み取った。結果を、生のA450nm値として表し、生データから、0パーセントの阻害に対応する読み取り値を差し引くことにより競合度(パーセンテージ)の値に変換した。
カニクイザルCD1dとの交差反応性
抗CD1d抗体401.11および402.8を、実施例1に記載のアッセイの改変型を用いるELISAによりカニクイザルCD1dへの結合について試験した。Maxisorp ELISAプレート(Nunc)を、1μg/mLのヒトまたはカニクイザルCD1dで被覆し、4℃で一晩インキュベートさせた。次いで、プレートを、0.1%Tween20を含有するPBS中で3回洗浄した後、室温で1h、1%BSA中でプレートを遮断した。次いで、プレートを、0.1%Tween20を含有するPBS中で3回洗浄した。次いで、抗CD1d抗体を、10μg/mLから減少する濃度で添加した。次いで、プレートを、0.1%Tween20を含有するPBS中で3回洗浄した。結合した抗体の検出を、HRPコンジュゲート化Fc特異的抗体(Sigma)を用いて可能にした。次いで、プレートを、0.1%Tween20を含有するPBS中で3回洗浄して、未結合の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化抗Fcを除去した。50μLの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(KPL)と共にインキュベートすることによりアッセイシグナルを生じさせ、50μLの1M HClでクエンチした。マイクロプレートリーダー(FluoStar Galaxy)を用いてA450nmでアッセイシグナルを読み取った。その結果は、抗体401.11および402.8が、ヒトCD1dに結合し(図7A)、またカニクイザルCD1dと交差反応する(図7B)ことを示している。非ヒト霊長類CD1dとの交差反応性は、ヒト疾患の非ヒト霊長類モデルにおける試験を可能にするために望ましい。
カニクイザルCD1dとの細胞に基づく交差反応性
細胞に基づく形式で非ヒト霊長類CD1dとの交差反応性を実証するために、ヒトおよびカニクイザルのPBMCを、交差反応性抗CD1d抗体402.8を用いて染色した。この抗体を、実施例8に記載のように3:1倍の比のビオチンとIgGでビオチン化した。陰性対照抗体(ヒトIgG1)を同様の様式でビオチン化した。結合したビオチン化抗CD1d抗体の検出を、細胞をフィコエリトリンコンジュゲート化ストレプトアビジンと共にインキュベートすることにより達成した。抗CD1d抗体は、ヒト(図3)およびカニクイザル種(図8)の両方においてCD1d陽性一次単球由来DCに結合した。これらの結果は、402.8が細胞に基づく文脈におけるヒトおよびカニクイザルの交差反応性を示し、ヒト疾患の非ヒト霊長類モデルにおける試験にとって重要であることを示している。
カニクイザルCD1d媒介性一次NKT機能の細胞に基づく機能的阻害
細胞に基づく効力アッセイのために、カニクイザルPBMCに、0日目でαGalCer(100ng/mL)を、抗CD1d抗体と共に、またはそれを用いずに充填した。培養物を、37℃、5%CO2で加湿インキュベータ中、24穴プレート中で調製した。7日目に、IL-2(10U/mL)を7日目に添加し、培養物を、さらに96時間、37℃、5%CO2でインキュベートさせた。最終的な読み取りは、抗CD3および抗T細胞受容体Vα24抗体(BD Biosciences)を用いるNKT細胞の列挙であった。抗CD1d抗体の非存在下で、またはアイソタイプ対照抗体を添加して、NKT細胞はαGalCerの存在下で約10倍拡張した。抗CD1d抗体401.11および402.8は、抗体を用いないか、またはヒトIgG陰性対照抗体を用いる培養物の処理と比較して、CD1d拘束性カニクイザルNKT細胞のαGalCerにより媒介される拡張を強力に阻害した(図9)。
401.11および402.8の最適化変異体
401.11および402.8抗体を、その効力に対する無視できる程度または正の影響を有しながら、抗体の生物物理学的特性に対する正の効果を得ることを目的として抗体の配列に対する変更を介してさらに最適化することができる。第1に、抗体の発現レベルを増強し、同時に生成レベルを増加させる変更が望ましい。第2に、アミノ酸置換による、溶媒に露出したシステイン残基またはN結合グリコシル化部位などの潜在的に望ましくない配列特性の除去は、潜在的な生成物異種性を低下させ、これらの抗体をさらに増強することができる。第3に、精製または保存の間の酸化または異性化により抗体の安定性に影響する可能性を有するアミノ酸残基の置換を、そのような転移を受けないアミノ酸と置き換えて(Wangら、2007 Journal of Pharmaceutical Sciences 96:1〜26頁)、これらの抗体をさらに改善することができる。最後に、免疫原性に潜在的に寄与し得る稀な、または非生殖系列401.11および402.8のアミノ酸残基を、予測される免疫原性を低下させることを目的として他のアミノ酸と置換し、これらの抗体をさらに改善することができる。以下は、抗体401.11および402.8に関するこれらの最適化戦略の実施を記載する。
401.11の可変重鎖および軽鎖配列を、MegAlign(DNAstar)により対応するヒト生殖系列配列と比較した。最も相同な生殖系列重鎖可変領域(IGHV3-9*01)は、7つのフレームワークアミノ酸で401.11と異なっていた。IGKV1-12*01は、401.11の軽鎖と最も高い配列相同性を共有し、2つのフレームワークアミノ酸で異なっていた(図12)。この情報を用いて、対応する生殖系列フレームワーク残基で置換されたフレームワーク残基を含有する401.11変異体のパネルを作製した(図12)。
402.8の可変重鎖および軽鎖配列のアミノ酸分析により、重鎖中に存在する酸化、異性化または脱アミド化(deamindation)を受ける可能性があるいくつかのアミノ酸が同定された(Wangら、2007 Journal of Pharmaceutical Sciences 96:1〜26頁)。これらのものは、重鎖中のN(100B)に潜在的な脱アミド化部位、D101に潜在的な異性化部位ならびにW(100A)およびM(100E)に潜在的な酸化部位を含む。重鎖中のN52で潜在的なN結合グリコシル化部位が同定された。潜在的な脱アミド化、酸化および異性化部位を除去するために、アミノ酸置換: W(100A)Y、N(100B)K、M(100E)L、D(101)Eを作製した。N結合グリコシル化モチーフNX(S/T)(式中、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である)を破壊するN54Aを導入することにより、潜在的なN結合グリコシル化部位を除去した。図15に示される可変重鎖中でのこれらのアミノ酸置換の組合せを用いて抗体を作製した。それぞれの抗体重鎖を、HEK-293E細胞中に402.8軽鎖(配列番号4)で同時トランスフェクトし、プロテインAクロマトグラフィーにより精製し、SPRを用いてそれぞれの抗体の親和性を測定した(Table 17(表17))。次いで、これらの抗体を、一次ヒト単球由来樹状細胞および自己αGalCer拡張NKT細胞を用いて細胞に基づく効力アッセイにおいて試験した(Table 18(表18)およびTable 19(表19))。
α-ガラクトシルセラミドに対する代替抗原を用いる一次NKT細胞に基づくアッセイにおける抗CD1d抗体の効果の試験
実施例6に記載の細胞に基づく効力アッセイは、糖脂質抗原としてαGalCerを用いた。抗CD1d抗体がαGalCerに対する代替的な糖脂質抗原の文脈における阻害活性を有することを実証することは、そのような非常に強力な中和抗CD1d抗体が、脂質および/または糖脂質を提示することができる領域から遠い位置でCD1dに結合するという概念を支持する。天然に見出されるCD1d拘束性脂質および糖脂質抗原は、化学的構造に関してαGalCerとは異なっていてもよく、結果として、本発明で記載される抗CD1d抗体が異なる化学構造を有する糖脂質抗原の文脈における阻害活性を保持することを実証することが有用であり得る。さらに、潜在的な自己抗原、すなわち、哺乳動物の文脈で見出されるものの阻害活性を特性評価することが有用である。
β-D-グルコピラノシルセラミドのC24:1 N-アシル変異体(Avanti;D-グルコシル-β-1,1'N-(15Z-テトラコセノイル)-D-エリスロ-スフィンゴシンN-(15Z-テトラコセノイル)-1-β-グルコシル-スフィンガ-4エン)を、37℃で2時間、5mg/mLでDMSO中に溶解した後、小アリコート中で保存した。
402.8および401.11から誘導された抗体は、抗CD1d抗体によっては共有されないCD1d上の共通のエピトープを共有する
402.8および401.11の変異体、ならびに商業的に供給される抗CD1d抗体を、実施例7に基づいて競合に基づくELISAにおいて試験した。第1に、ビオチン化型の402.8は非ビオチン化抗体401.11と競合するが、抗体42および51.1とは競合しないことが示された。この研究は以下に記載される。
3:1の比のビオチン:402.8でEZ-link Sulfo-NHS-LC-ビオチンキット(Pierce)を用いて、抗CD1d抗体402.8をビオチン化した。PBSを用いる複数回の洗浄および30kDaカットオフを有する遠心分離フィルターユニット(Millipore)を介する遠心分離(3000rpm)による濃縮により、タンパク質調製物から遊離ビオチンを除去した。Maxisorp ELISAプレート(Nunc)を、1.0μg/mLのヒトCD1dで被覆し、4℃で一晩インキュベートした。次いで、0.1%Tween20を含有するPBS中で3回、プレートを洗浄した後、室温で1h、1%BSA中でプレートを遮断した。次いで、ビオチン化された402.8を、非ビオチン化抗CD1d抗体と共に1:1の比で5分間同時平衡化させた。これらの抗体を、40μg/mLから2倍減少濃度で(すなわち、0.2μg/mLのビオチン化された402.8と比較して最大で200倍過剰)、室温で1h、プレートに添加し、空のウェルには最終希釈液を添加した(すなわち、ビオチン化された402.8抗体のみを含有する)。次いで、0.1%Tween20を含有するPBS中で3回、プレートを洗浄した。ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(BD Biosciences)を、暗室中、室温で1h、プレートに添加した。プレートを洗浄して、未結合のストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを除去した。50μLの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(KPL)と共にインキュベートすることによりアッセイシグナルを生じさせ、50μLの1M HClでクエンチした。マイクロプレートリーダー(FluoStar Galaxy)を用いてA450nmでアッセイシグナルを読み取った。結果を生のA450nm値として表し、生データから、0パーセントの阻害に対応する読み取り値を差し引くことにより競合度(パーセンテージ)の値に変換した。
402.8または401.11から誘導された抗体が他の抗CD1d抗体と競合するかどうかを調査するために、合計23の商業的に供給される抗CD1d抗体を試験した。これらの抗体は、抗ヒトCD1dモノクローナル抗体、抗マウスCD1dモノクローナル抗体、およびポリクローナル抗ヒトCD1d抗体を含んでいた。これらの抗体の詳細は、Table 21(表21)に記載されている。ラット抗マウス抗体ハイブリドーマHB-321、HB-322、HB-323、HB-326およびHB-327は、American Type Culture Collectionから供給されたものであり、供給業者の説明書に従って継代した。これらの細胞系から誘導された抗体を、プロテインGアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、マウスCD1dへの結合について検証した(示さず)。
3:1の比のビオチン:401.11.158でEZ-link Sulfo-NHS-LC-ビオチンキット(Pierce)を用いて、抗CD1d抗体401.11.158をビオチン化した。PBSを用いる複数回の洗浄および30kDaカットオフを有する遠心分離フィルターユニット(Millipore)を介する遠心分離(3000rpm)による濃縮により、タンパク質調製物から遊離ビオチンを除去した。抗CD1d抗体Maxisorp ELISAプレート(Nunc)を、1.0μg/mLのヒトCD1dで被覆し、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、0.1%Tween20を含有するPBS中で3回洗浄した後、室温で1h、1%BSA中で遮断した。次いで、ビオチン化された401.11.158を、非ビオチン化抗CD1d抗体(401.11.158、402.8、401.11、42および51.1)と1:1の比で5分間同時平衡化させた。これらの抗体を、40μg/mLから減少する濃度(すなわち、0.2μg/mLのビオチン化された401.11.158と比較して最大で200倍過剰)で室温で1時間、プレートに添加した。次いで、プレートを、0.1%Tween20を含有するPBS中で3回洗浄した。ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲート(BD Biosciences)を、暗室中、室温で1時間プレートに添加した。プレートを除去して、未結合のストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼを除去した。50μLの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(KPL)と共にインキュベートすることによりアッセイシグナルを生じさせ、50μLの1M HClでクエンチした。マイクロプレートリーダー(FluoStar Galaxy)を用いてA450nmでアッセイシグナルを読み取った。結果を生のA450nm値として表し、生データから、0パーセントの阻害に対応する読み取り値を差し引くことにより競合度(パーセンテージ)の値に変換した。
エピトープマッピング実験
方法
FAbの調製
製造業者の説明書に従ってFAb調製キット(Pierce)を用いて、パパイン消化により抗CD1d抗体402.8および401.11.165のFAbを調製した。リン酸緩衝生理食塩水(1×PBS)pH7.0で平衡化させたプロテインAカラム上で試料を泳動させ、流出液を回収することにより、Fc(結晶性断片)を含有するタンパク質から、無傷のFAbを除去した。次いで、TSKゲルG3000SWx1カラム(TOSOH)を0.5ml/minで使用し、泳動バッファーとして1×PBSを用いるサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により、FAbを分析した。その結果は、FAbが95%を超えて純粋であることを示していた。
ヒトCD1dへのFAbの結合を確認するために、ヒトCD1dをMaxisorpプレート(NUNC)上でPBS中の1μg/mLで4℃で一晩被覆するELISAを実施した。次いで、0.05%Tween-20(Sigma)を含む1×PBSを用いて個別に3回、ウェルを洗浄した。室温で1時間、PBS中の1%BSAでウェルを遮断した。次いで、上記のように1×PBSでウェルを洗浄した。次いで、FAbまたは完全長抗体の滴定を、10μg/mLの濃度から出発して実施し、プレートにわたって1:4で希釈を実施した。PBSのみの対照を含有させた。プレートを室温で1時間インキュベートした後、以前に記載のようにウェルを洗浄した。ウェルあたり100μLの二次抗体(ヤギ抗ヒトカッパF+B HRPOコンジュゲート、Invitrogen)を、1×PBS中1:2000の希釈率で添加し、室温で1時間インキュベートした後、以前に記載のようにウェルを洗浄した。50μLのTMB(Sigma)を添加し、発色するまでプレートをインキュベートした。各ウェルに50μLの1M HClを添加することにより反応を停止させた。吸光度を450nmで読み取った(620nmで参照した)。
ヒトCD1dを、1×PBS(pH7)中で12.8μMの濃度に希釈した。次いで、それを14.1μMの濃度の402.8または401.11.165のFAb断片と混合した。14μLのこの溶液を、D2O(Dは重水素である)中の26μLの50mMリン酸pH7と混合した。別の溶液を調製し、23℃で30、100、300または1000sインキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、20μLの2M尿素、1M TCEP pH3.0を各溶液に添加した。次いで、試料を、H2O中の0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)中で200μL/minで固定化ペプシンカラム上に通過させた。ペプシン断片を逆相捕捉カラム上に充填し、H2O中の0.05%TFAで3min脱塩した。95%アセトニトリル、5%H2O、0.0025%TFAを含む13%〜35%のバッファーの線状勾配を用いて23minにわたってC18カラムによりペプチドを分離した。次いで、プロフィールモードでの質量分析により、ペプチドを分析した。32.2μLの0.615mg/mLのCD1dと、59.8μLの100mM TCEPとをD2O中で混合することにより、完全に重水素化された対照試料を調製し、60℃で3時間インキュベートした。
全ての溶液を50μL/ウェルで添加した。CD1d(野生型)および関連構築物(突然変異タンパク質またはアミノ酸置換を有するCD1dなど)を、PBS中の1μg/mLで4℃で一晩、96穴Maxisorp ELISAプレート(NUNC)上に被覆した。次いで、ウェルを洗浄バッファー(PBS + 0.05%Tween-20)で3回洗浄した。プレートをブロッキングバッファー(PBS + 1%BSA)中、室温で1h遮断した後、3回洗浄した。抗体希釈液(PBS + 1%BSA + 0.05%Tween-20)中の抗体を、10μg/mlから出発する半対数滴定においてウェルに添加し、陰性対照として抗体を含有させなかった(0μg/mL)。次いで、プレートを室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートを上記のように洗浄した。二次抗体(HRP-ヤギ抗ヒトIgG(H+L)、Invitrogen)を、抗体希釈液中の1:2000希釈率で添加し、室温で1時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、50μLのTMB(Sigma)を各ウェルに添加した。50μLの1M HClを添加した後、発色させて反応を停止させた。プレートの各ウェルの吸光度を、450nmで読み取った(620nmで参照した)。
402.8および401.11.165のFAbの生成
パパイン消化を用いて、402.8および401.11.165のFAbを単離した。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により測定した場合、構築物は95%を超える純度を有していた。ELISAにおいて試験した場合、FAbはヒトCD1dへの結合を保持していた(図25)。
上記のH/D交換のための方法を用いて、FAbとしての抗体402.8および401.11.165をヒトCD1dと複合体化させた後、D2O中でインキュベートした。これは、抗体がCD1dに結合し、D2Oが接近しない位置を除いて、CD1d分子上の水素を重水素に交換する。別に、ヒトCD1dを抗体の非存在下でD2Oと共にインキュベートした。両試料に由来するCD1dはトリプシン消化を受け、次いで、質量分析により分析した。FAb 402.8および401.11.165を含む、および含まない交換実験上でのCD1dの各セグメントにおける重水素化レベルの差異を、以下のTable 22(表22)およびTable 23(表23)にそれぞれ示す。これらの実験において用いられたCD1dの細胞外ドメインの配列を、以下に列挙する:
EVPQRLFPLRCLQISSFANSSWTRTDGLAWLGELQTHSWSNDSDTVRSLKPWSQGTFSDQQWETLQHIFRVYRSSFTRDVKEFAKMLRLSYPLELQVSAGCEVHPGNASNNFFHVAFQGKDILSFQGTSWEPTQEAPLWVNLAIQVLNQDKWTRETVQWLLNGTCPQFVSGLLESGKSELKKQVKPKAWLSRGPSPGPGRLLLVCHVSGFYPKPVWVKWMRGEQEQQGTQPGDILPNADETWYLRATLDVVAGEAAGLSCRVKHSSLEGQDIVLYWGGSYTSGSLVPRGSGSKRVHHHHHHHH(配列番号19)
配列番号116の89〜95-LSYPLEL
配列番号116の141〜142-NL
であった。
配列番号116の89〜94-LSYPLE
配列番号116の126〜142-QGTSWEPTQEAPLWVNL
であった。
- hCD1dmu(配列番号119)-位置87〜93(LRLSYPL)と141〜143(NLA)との間に位置するアミノ酸が、ヒトCD1d(配列番号116)に従って番号付けられた位置を有するマウスCD1d配列(それぞれ、MSPKEDYPIおよびDLP)で置き換えられたヒトCD1d。
- mCD1dhu(配列番号118)-位置85〜93(MSPKEDYPI)と141〜143(DLP)との間に位置するアミノ酸が、マウスCD1d(配列番号117)に従って番号付けられた位置を有するヒトCD1d配列(それぞれ、LRLSYPLおよびNLA)で置き換えられたマウスCD1d。
カニクイザルにおける喘息のブタ回虫(Ascaris suum)モデル
抗CD1d抗体の効果を、喘息のカニクイザルモデルにおいて試験する。このプロトコルでは、寄生線虫であるブタ回虫に対して感作された動物を、エアロゾル化されたブタ回虫抽出物でチャレンジして、ヒトにおける急性喘息増悪の原因を密接に模倣する様式で急性気管支収縮、次いで、肺好酸球性炎症および気道過活動を誘導する。そのようなプロトコルは記載されている(Hart, T.ら(2001) J Allergy Clin Immunol 108:250〜257頁)。このモデルは、粘液細胞過形成、上皮下線維症、基底細胞膜肥厚、およびメトコリンに対する持続的ベースライン過敏などの、慢性ヒト喘息の多くの特徴を特徴とする。抗体処置を与えた後、ブタ回虫抽出物でチャレンジし、気道抵抗およびコンプライアンスに対する処置の効果、PC50、PCO2およびO2レベル、血清IgEおよび気管支肺胞洗浄(BAL)測定値、例えば、IL-4、IL-5およびIL-13濃度ならびに白血球サブセット、例えば、好中球、好酸球、脂肪細胞、好塩基球およびリンパ球の相対頻度を評価することができる。
肺炎症の代替的動物モデル
気道過敏症のアカゲザルモデル
抗CD1d抗体の効果および安全性を、気道過敏症のモデルにおいて試験することができる。例えば、イエダニ抗原(デルマトファゴイデス・ファルニナエ(Dermatophagoides farninae)由来)を用いる連続チャレンジにより、気道過敏症をアカゲザル(マカカ・ムラッタ(Macaca mulatta))において誘導することができる(Seshasayee, D.ら、2007 J Clin Invest 117、3868〜78頁)。咳、速く浅い呼吸および気道抵抗の増加を特徴とする喘息増悪は、イエダニ抽出物を用いるチャレンジにより誘導される。アルブテロールエアロゾル処置などの薬学的介入により、症状を逆転させることができる。メトコリンチャレンジに応答する肺機能、例えば、気道抵抗および動的コンプライアンスを測定することができる。抗体処置を与えた後、イエダニ抗原で再チャレンジし、メトコリンチャレンジにより決定される肺機能を評価する。
抗CD1d抗体の効果および安全性を、気道過敏症の開示されたカニクイザルモデルを用いて試験することができる(Matangkasombut, P.ら、2008 J Allergy Clin Immunol、121、1287〜9頁)。このモデルにおいて、ブタ回虫に対して感作されたカニクイザルに、肺ネブライザーにより、特異的NKT細胞アゴニストであるα-ガラクトシルセラミド(α-GalCer)を投与する。α-GalCer処置は、上記のメトコリンチャレンジにより決定した場合、気道過敏症を誘導する。
NKT細胞により誘導された炎症の代替的動物モデル
潰瘍性大腸炎
抗CD1d抗体の効果および安全性を、様々な開示されたヒト炎症性腸疾患のモデルにおいて試験する(Wirtzら、Nat Protoc 2: 541〜546頁、2007)。例えば、オキサゾロンの直腸内投与は、ヒト潰瘍性大腸炎と組織学的に類似し、また下痢、潜血、体重減少および時には直腸脱も特徴とする局所潰瘍形成および炎症を誘導する。オキサゾロン誘導性大腸炎の病理は、NKT細胞により、特に、IL-13のNKT細胞に誘導される分泌を介して媒介され、かくして、抗CD1d抗体を用いる処置によって疾患を改善することができる(Heller, F.ら、2002 Immunity 17、629〜638頁)。このモデルにおいて、大腸炎誘導の開始時に抗体処置を開始し、体重、便の硬さ、潜血および大腸構造に対する効果を評価する。
例えば、Takahashiら(2012) World Journal of Gastroenterology 18(19): 2300〜2308頁に記載された、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)のげっ歯類モデルにおいて、抗CD1d抗体をさらに試験する。例えば、C57BL/6マウスにおいては、肝毒性化合物であるストレプトゾトシン(STZ)の新生児送達、次いで、高脂肪食は、NASHの主要な特徴の発達をもたらす。別の例として、C57BL/6またはob/obマウスにおける高脂肪食の提供は、NASHの誘導および維持をもたらし得る。さらに別の例においては、高脂肪食と、反復的および間欠的低酸素ストレスとにより、NASHをラットにおいて生成させることができる。これらのモデルの1つまたはいくつかにおいて、処置されたげっ歯類における抗CD1d抗体の効果を、総肝臓重量、血清アミノトランスフェラーゼレベル、血清トリグリセリドレベル、血中グルコースレベル、肝臓組織病理の改善および遺伝子発現パターンの変化に対する効果により決定する。
抗CD1d抗体を、自己免疫性肝疾患の動物モデルにおいてさらに試験する。例えば、マウスにおいては、コンカナバリンA(conA)の静脈内注射により誘導された肝炎が記載されている(Takeda, K.ら(2000) PNAS 97(10):5498〜5503頁)。ConAを、尾静脈を介してマウスに注射する。血清試料を、ConA注射の20h後に取得する。標準的な測光技術を用いて、血清アミノトランスフェラーゼ[アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)]レベルを測定する。さらに、肝臓形態の巨視的および顕微鏡的検査により、肝臓病理を評価する。血清ALTおよびASTに対する効果、ならびに肝臓組織病理について、抗体を評価する。
結合タンパク質を作製する方法
402.8または401.11抗体を用いる抗体ライブラリーからの選択
以前に記載されたような約100pmolの抗原密度(すなわち、ビオチン化されたCD1d)およびTEAに基づく溶出ステップを用いて1回目のパンニングラウンドを行うファージ展示プロトコルを用いる。2回目および3回目のラウンドは、低下した抗原密度(例えば、約50pmol)を用いる。10倍モル過剰量で402.8または401.11(または関連抗体)IgGを添加し、反応物を室温で2、5、10または20minインキュベートすることにより、ファージを溶出させる。IgGは、402.8/401.11エピトープに結合したFAbを発現するファージを特異的に置き換え、溶出すると予想される。非特異的結合剤およびCD1d表面上の他の領域に結合したファージは、これらの条件下ではあまり溶出しないと考えられる。
ファージ展示のためのパンニング試薬としてhCD1dmuまたはmCD1dhuなどの合成CD1d構築物を用いて、402.8および401.11のものと類似するエピトープを認識する抗体を取得することができる。ファージ展示ライブラリーから、hCD1dmu(配列番号119)などの構築物を含むCD1d(エピトープを含む重要なアミノ酸を、その対応するマウスアミノ酸により置き換えたヒトCD1d)を認識する抗体を減少させることができる。次いで、ライブラリーをヒトCD1dに対してパンニングすることができる。得られた単離された抗体は、ヒトCD1d(配列番号16)の89〜94と141〜142との間のアミノ酸に結合する可能性がある。
CD1d上の402.8/401.11抗体エピトープのペプチドまたはタンパク質模倣体を、ライブラリー展示技術または免疫化/ハイブリドーマ手法においてCD1dの代わりの抗原として用いる。例えば、さもなければマウスCD1d(例えば、mCD1dhu(配列番号118))であるフレームワーク中にヒトCD1dの402.8/401.11エピトープを含むように、キメラCD1d分子を構築する。そのような構築物をマウスにおける免疫原として用いる場合、免疫応答は、非マウス配列に焦点を向けると予想される。
Claims (42)
- ヒトCD1dに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、401.11および402.8からなる群から選択される少なくとも1つの抗体と、CD1dへの結合について競合する、単離された抗体またはその抗原結合部分。
- 抗体401.11.158と、CD1dへの結合について競合する、請求項1に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- ヒトCD1dに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、401.11および402.8からなる群から選択される少なくとも1つの抗体が結合したものと同じCD1dのエピトープに結合する、単離された抗体またはその抗原結合部分。
- エピトープが配列番号116の残基141〜143を含む、請求項3に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- エピトープが配列番号116の残基87〜93および141〜143を含む、請求項3または4に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- ヒトCD1dに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号1、3、5、7、8、9、24、25、26、30、33、36、40、41、42、43、44および45からなる群から選択される配列ならびにそれと少なくとも95%同一である配列を有するVHドメインを含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。
- VHドメインの配列が配列番号148または配列番号150である、請求項6に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- ヒトCD1dに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、配列番号2、4、6、46、49および62からなる群から選択される配列ならびにそれと少なくとも95%同一である配列を有するVLドメインを含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。
- VLドメインの配列が配列番号149または配列番号4である、請求項8に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- ヒトCD1dに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、ヒトFR1、FR2、FR3およびFR4フレームワーク配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVHドメインを含み、CDR1の配列がDYAMH(配列番号124)またはGYYWS(配列番号125)である、単離された抗体またはその抗原結合部分。
- CDR3の配列が、DMCSSSGCPDGYFDS(配列番号126)、DLCSSGGCPEGYFDS(配列番号152)、DMCSSGGCPDGYFDS(配列番号153)、DMCSSGGCPEGYFDS(配列番号154)、GEIYDFWNSYMDV(配列番号127)、GEIYDFWKSYMDV(配列番号128)、GEIYDFYKSYLDV(配列番号155)、GEIYDFYKSYMDV(配列番号156)、GEIYDFWKSYLDV(配列番号129)またはGEIYDFYNSYMDV(配列番号130)である、請求項10に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- CDR2の配列が、TIIWNSAIIGYADSVKG(配列番号131)、EINHSGSTNYNPSLKS(配列番号132)、EINPSGSTNYNPSLKS(配列番号133)またはEINHAGSTNYNPSLKS(配列番号134)である、請求項10または11に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- ヒトCD1dに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、ヒトFR1、FR2、FR3およびFR4フレームワーク配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVHドメインを含み、CDR1の配列がGFTFDDY(配列番号135)またはGGSFSGY(配列番号136)である、単離された抗体またはその抗原結合部分。
- CDR3の配列が、DMCSSSGCPDGYFDS(配列番号126)、DLCSSGGCPEGYFDS(配列番号152)、DMCSSGGCPDGYFDS(配列番号153)、DMCSSGGCPEGYFDS(配列番号154)、GEIYDFWNSYMDV(配列番号127)、GEIYDFWKSYMDV(配列番号128)、GEIYDFYKSYLDV(配列番号155)、GEIYDFYKSYMDV(配列番号156)、GEIYDFWKSYLDV(配列番号129)またはGEIYDFYNSYMDV(配列番号130)である、請求項13に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- CDR2の配列がIWNSAI(配列番号137)、NHSGS(配列番号138)、NPSGS(配列番号139)またはNHAGS(配列番号140)である、請求項13または14に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- ヒトCD1dに結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、ヒトFR1、FR2、FR3およびFR4フレームワーク配列ならびにCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むVLドメインを含み、CDR1の配列がRASQHISSWLA(配列番号141)またはASSSGAVSSGNFPN(配列番号142)である、単離された抗体またはその抗原結合部分。
- CDR3の配列がQQANRFPLT(配列番号143)またはLLYFGDTQLGV(配列番号144)である、請求項16に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- CDR2の配列がAASSLQS(配列番号145)またはSASNKHS(配列番号146)である、請求項16または17に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- 配列番号1および配列番号2、配列番号23および配列番号46、配列番号24および配列番号47、配列番号5および配列番号6、配列番号25および配列番号48、配列番号26および配列番号49、配列番号27および配列番号50、配列番号28および配列番号51、配列番号29および配列番号52、配列番号30および配列番号53、配列番号31および配列番号54、配列番号32および配列番号55、配列番号33および配列番号56、配列番号34および配列番号57、配列番号35および配列番号58、配列番号36および配列番号59、配列番号37および配列番号60、配列番号38および配列番号61、配列番号40および配列番号62、配列番号41および配列番号63、配列番号42および配列番号64、配列番号3および配列番号4、配列番号7および配列番号4、配列番号8および配列番号4、配列番号9および配列番号4、配列番号43および配列番号65、配列番号44および配列番号66、ならびに配列番号45および配列番号67からなる群から選択されるVHおよびVL配列対を含む、請求項6から18のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- 細胞に基づく効力アッセイを用いて測定された0.5ng/ml〜20ng/mlのEC50でCD1dに結合する、請求項1から19のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- ヒトカッパ鎖定常領域を含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- ヒトラムダ鎖定常領域を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- IgG1またはIgG4定常領域を含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- S228P突然変異を含むIgG4定常領域を含む、請求項23に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- 抗体である、請求項1から24のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- Fab、F(ab)2、scFvまたはドメイン抗体である、請求項1から24のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- 抗体依存性細胞傷害、補体依存性細胞傷害、血清半減期、生体内分布およびFc受容体への結合からなる群から選択される機能的特徴を調節するように改変される、請求項1から26のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分をコードする単離されたDNA分子。
- DNA分子の配列が、配列番号10〜18および68〜115、またはそれと少なくとも95%同一である配列もしくは中程度から高度のストリンジェンシー条件下でそれにハイブリダイズする配列からなる群から選択される、請求項29に記載の単離されたDNA分子。
- 請求項1から26のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を生成する形質転換された細胞。
- 請求項29または30に記載のDNA分子で形質転換された、請求項31に記載の形質転換された細胞。
- ヒト対象におけるNKT細胞エフェクター機能が関与する状態を処置する方法であって、対象に、請求項1から27のいずれか一項に記載の単離された抗体もしくはその抗原結合部分または請求項28に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 状態が乾癬、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、アテローム性動脈硬化症、非アルコール性脂肪性肝炎、自己免疫性肝炎、虚血再かん流傷害、鎌状赤血球病に伴う肺の炎症または機能障害、および喘息からなる群から選択される、請求項33に記載の方法。
- NKT細胞エフェクター機能が関与する状態の処置のための薬剤の調製における、請求項1から27のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分の使用。
- 試料中のヒトまたはカニクイザルCD1dの存在を検出する方法であって、CD1dを含有することが疑われる試料を、請求項1から27のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分と、抗体またはその抗原結合部分がCD1dに結合して複合体を形成するのを可能にする条件下で接触させるステップと、試料中の複合体の存在を検出するステップとを含む、方法。
- 試料中のCD1dが細胞膜に結合したCD1dである、請求項36に記載の方法。
- NKT細胞エフェクター機能が関与する状態の処置における使用のための請求項1から27のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
- 細胞試料中のヒトCD1d陽性細胞の存在を検出する方法であって、細胞の集団を、請求項1から27のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分と接触させて、抗体またはその抗原結合部分がCD1d陽性細胞に結合して複合体を形成するのを可能にするステップと、抗体またはその抗原結合部分-細胞複合体の存在を検出するステップとを含む、方法。
- 細胞試料が末梢血試料または細胞系試料である、請求項39に記載の方法。
- 複数のCD1d結合タンパク質から、ヒトCD1dに特異的に結合し、401.11、402.8および401.11.158からなる群から選択される少なくとも1つの抗体と、CD1dへの結合について競合するCD1d結合タンパク質を選択する方法であって、
複数のCD1d結合タンパク質を、配列番号116の位置87〜93および141〜143に位置するアミノ酸がこれらの位置の対応するマウスアミノ酸で置換されたヒトCD1d突然変異タンパク質と、CD1d結合タンパク質が突然変異タンパク質に結合してCD1d結合タンパク質-ヒトCD1d突然変異タンパク質複合体およびヒトCD1d突然変異タンパク質に結合しない減弱した複数のCD1d結合タンパク質を形成するのを可能にするのに十分な条件下で接触させるステップと、減弱した複数のCD1d結合タンパク質から、ヒトCD1d突然変異タンパク質に結合しないCD1d結合タンパク質を回収するステップと
を含み、回収されたCD1d結合タンパク質が、ヒトCD1dに特異的に結合し、401.11、402.8および401.11.158からなる群から選択される少なくとも1つの抗体と、CD1dへの結合について競合する、方法。 - 複数のCD1d結合タンパク質から、ヒトCD1dに特異的に結合するCD1d結合タンパク質を選択する方法であって、
複数のCD1d結合タンパク質を、ヒトCD1d(配列番号116)の位置87〜93および141〜143に位置するアミノ酸が、これらの位置の対応するマウス配列で置き換えられたhCD1dmu(配列番号119)と、CD1d結合タンパク質がhCD1dmuに結合してCD1d結合タンパク質-hCD1dmu複合体およびhCD1dmuに結合しない減弱した複数のCD1d結合タンパク質を形成するのを可能にするのに十分な条件下で接触させるステップと、減弱した複数のCD1d結合タンパク質から、hCD1dmuに結合しないCD1d結合タンパク質を回収するステップと
を含み、回収されたCD1d結合タンパク質がヒトCD1d(配列番号116)またはmCD1dmu(配列番号118)に特異的に結合する、方法。
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Cited By (1)
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Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003092615A2 (en) * | 2002-05-01 | 2003-11-13 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Use of anti-cd1 antibodies for the modulation of immune responses |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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AU4837499A (en) * | 1998-07-09 | 2000-02-01 | Brian J. Nickoloff | Method of treating disorders by modulating the interaction of natural killer receptors on t cells with their respective ligands |
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003092615A2 (en) * | 2002-05-01 | 2003-11-13 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Use of anti-cd1 antibodies for the modulation of immune responses |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
J.MASS.SPECTROM.SOC.JPN, vol. 45, no. 3, JPN6016046412, 1997, pages 355 - 366 * |
ドージンニュース, vol. no.109, JPN6016046410, 2004, pages 1 - 7 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2022511062A (ja) * | 2018-12-07 | 2022-01-28 | ライフアーク | ヒト化抗il17br抗体 |
Also Published As
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