CN114231636A - 用于尿路上皮癌靶基因拷贝数qPCR定量检测的特异性引物、探针组合及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于尿路上皮癌靶基因拷贝数qPCR定量检测的特异性引物、探针组合及应用。本发明利用多重实时荧光定量PCR法，检测尿沉淀DNA中与尿路上皮癌相关的CDKN2A、NUMA1、FOSL2、BECN1四个基因的扩增Ct值，以CFTR1和POP1两个基因作为内参，采用2‑ΔΔCt法(Livak法)，分别计算四个基因的拷贝数。并利用50例尿路上皮癌患者和30例正常人的尿沉淀DNA，建立尿路上皮癌辅助诊断的预测模型。

Description

用于尿路上皮癌靶基因拷贝数qPCR定量检测的特异性引物、 探针组合及应用
技术领域
本发明涉及用于尿路上皮癌靶基因拷贝数qPCR定量检测的特异性引物、探针组合及应用。属于基因检测技术领域。
背景技术
尿路上皮癌是起源于尿路上皮的一种多源性的恶性肿瘤，包括肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌以及尿道癌，这些发生在尿路上皮的癌症，恶性程度往往较高，大多数是致死性癌症，是常见的恶性肿瘤之一。利用qPCR方法检测尿液中的核酸与尿路上皮癌相关靶标，常见的有检测与尿路上皮癌相关的突变基因，甲基化基因靶标，以及突变基因和甲基化靶标联合检测等，但目前极少用qPCR相对定量方法对与尿路上皮癌相关的基因的拷贝数变异进行检测。
目前已有大量研究证明基因拷贝数异常与尿路上皮癌相关，相关的尿液DNA基因拷贝数异常肿瘤标志物检测方法主要还是荧光原位杂交(FISH)，比如UroVysion Kit是FDA批准的通过检测尿液沉淀细胞的3、7、17号染色体异常和9p21缺失来辅助诊断膀胱尿路上皮癌，类似的还有CYTOTEST公司的CDKN2A/CCP9 FISH Probe Kit，国内的达安基因的膀胱癌细胞染色体及基因异常检测试剂盒(荧光原位杂交法)(国械注准20153402098)，FISH检测操作时间较长，需要有经验的检测人员对结果进行判读。
随着高通量测序技术(NGS)的广泛应用，目前，已经有不少基于NGS检测尿路上皮癌染色体异常的方法，比如宏远生物的基于联合探针锚定聚合测序法的尿路上皮癌染色体异常检测试剂盒，长海医院的许传亮团队基于低覆盖率全基因组测序分析尿液脱落细胞DNA拷贝数变异的UroCAD(Urine Exfoliated Cells Copy Number Aberration Detector)检测方法，相对于FISH、NGS技术能够发现许多新的拷贝数变异标志物，并且能够覆盖整个基因组，但是NGS测序需要专门的NGS测序仪和配套试剂，成本较高，并且需要专门的生信分析人员对结果进行分析解读，这对普通医院和检验中心是不友好的。
专利申请CN202110598817.3公开了利用3D数字PCR技术联合尿液中CEP63、FOSL2的DNA拷贝数变异构建膀胱尿路上皮癌的诊断模型，但是该模型只检测位于2号和3号染色体上的两个基因，该模型的特异性为73.8％，阳性预测值为75.6％，说明该模型抗干扰能力较差，容易出现假阳性，并且需要用到专门的3D数字PCR，仪器和试剂成本较高，普通市县级医院和一般的检验机构不具备使用条件。
目前，已经有很多利用qPCR相对定量法对基因拷贝数进行检测的应用，专利CN202011447747.3，利用多重实时荧光PCR法对人DMD基因拷贝数进行相对定量，检测与杜氏/贝氏肌营养不良症相关的外显子拷贝数，说明利用qPCR相对定量法对基因拷贝数进行检测是可靠的。专利CN201910044288.5公布了YTHDF2基因的表达量可以作为尿路上皮癌诊断的标志物，专利CN201810926958.1公布了FRS2基因的拷贝数在膀胱癌中会增加，专利CN201410212369.9公布了DHFR基因的拷贝数可以作为膀胱癌检测的标记物，但是，这些研究都只做了膀胱癌组织和正常组织中这些基因的表达存在差异的研究，并没有对这些基因的特异性做进一步研究，我们知道一个癌症的发生会伴随很多基因的表达异常，并且一个基因的表达异常可能和很多癌症相关，可能是一个泛癌基因，其表达异常并不能确定一定是由某一个癌种引起的，与癌症相关的基因表达异常一般在多个癌种中都会表达异常。
综上，现有检测方法普遍存在操作复杂、检测时间长、检测成本较高，需要专门的分析人员和专门的检测仪器设备，及部分相对简单检测方法的特异性差等问题。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种用于尿路上皮癌靶基因拷贝数qPCR定量检测的特异性引物、探针组合及应用。并且，基于相关靶基因拷贝数定量结果，运用专门的预测模型，对尿路上皮癌进行辅助诊断或早筛。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
1、用于尿路上皮癌靶基因拷贝数qPCR定量检测的特异性引物、探针组合，包括：
(1)CDKN2A基因的特异性引物及探针：
正向引物：5’-TCCCAGTCTGCAGTTAAGGG-3’，如SEQ ID NO.1所示；
反向引物：5’-GGAGGGTCACCAAGAACCTG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
探针：5’-CCTCTGGTGCCAAAGGGCGG-3’，如SEQ ID NO.3所示；
(2)NUMA1基因的特异性引物及探针：
正向引物：5’-AAGACTGAAATCCTAACAGGGCAG-3’，如SEQ ID NO.4所示；
反向引物：5’-CAGGTCAACGGGGTGAGTCAG-3’，如SEQ ID NO.5所示；
探针：5’-GTGTGGGTGTGGCTTGGCAGT-3’，如SEQ ID NO.6所示；
(3)FOSL2基因的特异性引物及探针：
正向引物：5’-CCTGGAGGGAAGTCAGACCG-3’，如SEQ ID NO.7所示；
反向引物：5’-TTCCTAGCACTGGTTTCCTGTC-3’，如SEQ ID NO.8所示；
探针：5’-CCCAGGATGTGAGCGGAGGC-3’，如SEQ ID NO.9所示；
(4)BECN1基因的特异性引物及探针：
正向引物：5’-AGGTGAGGGTGGTGATGAGA-3’，如SEQ ID NO.10所示；
反向引物：5’-CTGGGTCTCTCCTGGTTTCG-3’，如SEQ ID NO.11所示；
探针：5’-CCCATACTTTCAGATGCCCTCCTGC-3’，如SEQ ID NO.12所示。
优选的，CDKN2A基因、NUMA1基因、FOSL2基因、BECN1基因的探针5端修饰FAM荧光基团，3端修饰MGB淬灭基团。
优选的，所述组合还包括内参基因CFTR1基因的特异性引物及探针：
正向引物：5’-ACAGGTGTAGCCTGTAAGAG-3’，如SEQ ID NO.13所示；
反向引物：5’-CTTTCCTCAAAATTGGTCTGGT-3’，如SEQ ID NO.14所示；
探针：5’-TCCAAATCTGTATGGAGACCAAATC-3’，如SEQ ID NO.15所示。
进一步优选的，内参基因CFTR1基因的检测探针5端修饰VIC荧光基团，3端修饰MGB淬灭基团。
优选的，所述组合还包括内参基因POP1基因的特异性引物及探针序列：
正向引物：5’-GGTCAATGTTGCCACCCAAC-3’，如SEQ ID NO.16所示；
反向引物：5’-GGTCAATGTTGCCACCCAAC-3’，如SEQ ID NO.17所示；
探针：5’-TCCTGGAACTTCACGACAGCGG-3’，如SEQ ID NO.18所示。
进一步优选的，内参基因POP1基因的检测探针5端修饰CY3荧光基团，3端修饰MGB淬灭基团。
2、上述特异性引物、探针组合在制备用于尿路上皮癌靶基因拷贝数qPCR定量检测的试剂盒中的应用。
3、用于尿路上皮癌qPCR定量检测的试剂盒，包含前述的特异性引物、探针组合。
优选的，所述试剂盒包含CDKN2A反应液、NUMA1反应液、FOSL2反应液、BECN1反应液、主反应混合液、阴性参考品、阳性参考品和空白对照品。
进一步优选的，CDKN2A、NUMA1、FOSL2、BECN1四个基因的反应液中，正向引物、反向引物浓度均为0.1～100μM，更进一步优选为20μM；探针的浓度均为0.01～20μM，更进一步优选为5μM；内参基因CFTR1和内参基因POP1两个基因正向引物、反向引物浓度均为0.05～50μM，更进一步优选为5μM；内参基因探针的浓度均为0.01～10μM，更进一步优选为1μM。
进一步优选的，所述主反应混合液包含热启动Taq聚合酶、UDG酶、PCR反应缓冲溶液、dNTPs/dUTP、Mg2+、ROX荧光参比染料。
进一步优选的，阳性参考品为分别包含CDKN2A基因、NUMA1基因、FOSL2基因、BECN1基因、CFTR1基因和POP1基因部分序列的6种质粒DNA按摩尔量1：4：4：4：2：2混合组成的混合溶液；阴性参考品为正常人基因组DNA溶液；空白对照为无核酸酶的无菌去离子水。
4、用于辅助诊断或早筛尿路上皮癌的预测模型，如公式Ⅰ所示：
K＝0.4*2ΔΔCt(CDKN2A)+0.1*2-ΔΔCt(NUMA1)+0.3*2-ΔΔCt(FOSL2)+0.2*2-ΔΔCt(BECN1)(公
式Ⅰ)；
其中，K为模型检验分值，2ΔΔCt(CDKN2A)、2-ΔΔCt(NUMA1)、2-ΔΔCt(FOSL2)、2-ΔΔCt(BECN1)分别表示CDKN2A基因、NUMA1基因、FOSL2基因、BECN1基因采用△△Ct值法相对定量方式计算得到的2-ΔΔCt值的倒数。
优选的，当K>1.2时，可以判断为尿路上皮癌高风险；当1.2>K>1时，检测灰区，需要重新检测；当K<1时，检测结果为阴性。
优选的，采用2-ΔΔCt法(Livak法)相对定量方式可以计算CDKN2A、NUMA1、FOSL2、BECN1四个基因的拷贝数；具体计算方法如下：
(A)计算阴性参考品与同一反应孔内参基因CFTR1基因、POP1基因的△Ct值，然后取根据两个内参基因计算的△Ct值的平均值，记为△CtR；
(B)分别计算靶基因与同一反应孔内参基因CFTR1基因、POP1基因的△Ct值，然后取根据两个内参基因计算的△Ct值的平均值，记为△CtT；
(C)靶基因△△Ct＝△CtT-△CtR，靶基因的相对拷贝数＝靶基因的相对表达量＝2-ΔΔCt。
本发明的有益效果：
本发明利用多重实时荧光定量PCR法，检测尿沉淀DNA中与尿路上皮癌相关的CDKN2A、NUMA1、FOSL2、BECN1四个基因的扩增Ct值，以CFTR1和POP1两个基因作为内参，采用2-ΔΔCt法(Livak法)，分别计算四个基因的拷贝数。并利用50例尿路上皮癌患者和30例正常人的尿沉淀DNA，建立尿路上皮癌辅助诊断的预测模型。
本发明根据4个特异性靶基因的相对定量结果，利用预测模型对尿路上皮癌进行预测和判断，使检测灵敏度、特异性和准确率远高于通过单个靶基因的表达量和拷贝数来检测尿路上皮癌的方法。运用本发明的试剂盒和预测模型，用30例尿路上皮癌患者和30例正常人的尿沉淀DNA进行独立性能验证，检测灵敏度86.67％，特异性88.88％，准确率83.33％，表明本发明的试剂盒和预测模型能够作为一种利用各医院及检验机构最常见的荧光定量PCR仪，就可以辅助诊断和筛查尿路上皮癌的可靠方法。
附图说明
图1为各靶标相对内参基因CFTR1的△Ct值标准曲线；
图2为各靶标相对内参基因POP1的△Ct值标准曲线；
图3为ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
评估靶基因和内参基因引物扩增效率
CDKN2A基因的特异性引物及探针序列见表1：
表1
名称 序列(5’->3’) 序号
正向引物 TCCCAGTCTGCAGTTAAGGG SEQ ID NO.1
反向引物 GGAGGGTCACCAAGAACCTG SEQ ID NO.2
检测探针 CCTCTGGTGCCAAAGGGCGG SEQ ID NO.3
NUMA1基因的特异性引物及探针序列见表2：
表2
名称 序列(5’->3’) 序号
正向引物 AAGACTGAAATCCTAACAGGGCAG SEQ ID NO.4
反向引物 CAGGTCAACGGGGTGAGTCAG SEQ ID NO.5
检测探针 GTGTGGGTGTGGCTTGGCAGT SEQ ID NO.6
FOSL2基因的特异性引物及探针序列见表3：
表3
名称 序列(5’->3’) 序号
正向引物 CCTGGAGGGAAGTCAGACCG SEQ ID NO.7
反向引物 TTCCTAGCACTGGTTTCCTGTC SEQ ID NO.8
检测探针 CCCAGGATGTGAGCGGAGGC SEQ ID NO.9
BECN1基因的特异性引物及探针序列见表4：
表4
名称 序列(5’->3’) 序号
正向引物 AGGTGAGGGTGGTGATGAGA SEQ ID NO.10
反向引物 CTGGGTCTCTCCTGGTTTCG SEQ ID NO.11
检测探针 CCCATACTTTCAGATGCCCTCCTGC SEQ ID NO.12
内参基因CFTR1的特异性引物及探针序列见表5：
表5
名称 序列(5’->3’) 序号
正向引物 ACAGGTGTAGCCTGTAAGAG SEQ ID NO.13
反向引物 CTTTCCTCAAAATTGGTCTGGT SEQ ID NO.14
检测探针 TCCAAATCTGTATGGAGACCAAATC SEQ ID NO.15
内参基因POP1的特异性引物及探针序列见表6：
表6
名称 序列(5’->3’) 序号
正向引物 GGTCAATGTTGCCACCCAAC SEQ ID NO.16
反向引物 TGGGGGTTGACTCTGGTTTG SEQ ID NO.17
检测探针 TCCTGGAACTTCACGACAGCGG SEQ ID NO.18
配制CDKN2A基因反应液，其中CDKN2A基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制NUMA1基因反应液，其中NUMA1基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制FOSL2基因反应液，其中FOSL2基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制BECN1基因反应液，其中BECN1基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM。
取500ng/μL的人基因组DNA，分别稀释到100ng/μL、20ng/μL、4ng/μL、0.8ng/μL，获得5个浓度梯度的人基因组DNA样本；
按表7的体系配制20μL反应体系(每个梯度的样本做3个重复)。
表7
试剂名称 体积(μL)
2×主反应混合液 10
靶基因反应液 1
梯度稀释的人基因组DNA 2
无菌去离子水 7
按表8的反应程序，在ABI 7500仪器上进行PCR反应：
表8
Figure BDA0003463629190000061
根据扩增的结果，绘制各靶标基因分别相对内参基因CFTR1和POP1的△Ct值标准曲线，见图1和图2。结果显示，CDKN2A基因、NUMA1基因、FOSL2基因、BECN1基因相对CFTR1的△Ct值标准曲线的斜率分别是0.0043、-0.0029、0.0086、0.0029，相对POP1的△Ct值标准曲线的斜率分别是0.01、0.0129、-0.0186、-0.0114，斜率都在斜率范围-0.1～0.1之间，说明各靶标和内参基因CFTR1和POP1引物扩增效率接近，证明本方法和试剂盒适用于2-ΔΔCt法(Livak法)进行相对定量。
实施例2
检测基因拷贝数
配制CDKN2A基因反应液，其中CDKN2A基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制NUMA1基因反应液，其中NUMA1基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制FOSL2基因反应液，其中FOSL2基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制BECN1基因反应液，其中BECN1基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制阳性参考品，其中包含CDKN2A基因、NUMA1基因、FOSL2基因、BECN1基因、CFTR1基因和POP1基因部分序列的6种质粒DNA，6种质粒DNA按摩尔量CDKN2A基因：NUMA1基因：FOSL2基因、BECN1基因：CFTR1基因：POP1基因＝1：4：4：4：2：2混合组成，总拷贝数约为20000拷贝；
配制阴性参考品，包含100ng/μL的正常人基因组DNA溶液。
按表9配制20μL反应体系(每个样本做3个重复)。
表9
试剂名称 体积(μL)
2×主反应混合液 10
靶基因反应液 1
阳性参考品/阴性参考品 2
无菌去离子水 7
按表10的反应程序，在ABI 7500仪器上进行PCR反应：
表10
Figure BDA0003463629190000071
拷贝数判定的规则见表11：
表11
2<sup>-ΔΔCt</sup> 拷贝数
小于0.2 0
大于等于0.2，小于0.8 1
大于等于0.8，小于1.6 2
大于等于1.6 >2
检测Ct值统计见表12：
表12
Figure BDA0003463629190000081
利用2-ΔΔCt法(Livak法)计算相对定量结果见表13：
表13
Figure BDA0003463629190000082
结果表明，阳性参考品拷贝数判读准确。
实施例3
建立尿路上皮癌辅助诊断的预测模型
分别收取50例尿路上皮癌阳性和30例尿路上皮癌阴性样本，所有样本均来自医院，且阴阳性的判断依据来自临床诊断。取30mL尿液样本分离尿沉淀，提取DNA。
配制CDKN2A基因反应液，其中CDKN2A基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制NUMA1基因反应液，其中NUMA1基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制FOSL2基因反应液，其中FOSL2基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制BECN1基因反应液，其中BECN1基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制阳性参考品，其中包含CDKN2A基因、NUMA1基因、FOSL2基因、BECN1基因、CFTR1基因和POP1基因部分序列的6种质粒DNA，6种质粒DNA按摩尔量CDKN2A基因：NUMA1基因：FOSL2基因、BECN1基因：CFTR1基因：POP1基因＝1：4：4：4：2：2混合组成，总拷贝数约为20000拷贝；
配制阴性参考品，包含100ng/μL的正常人基因组DNA溶液。
按表14配制20μL反应体系：
表14
试剂名称 体积(μL)
2×主反应混合液 10
靶基因反应液 1
阳性参考品/阴性参考品/待检测样本DNA X
无菌去离子水 9-X
注：其中阳性参考品/阴性参考品加入2μL，待检测样本加入100ng。
按表15反应程序，在ABI 7500仪器上进行PCR反应：
表15
Figure BDA0003463629190000091
检测Ct值统计如表16所示：
表16
Figure BDA0003463629190000092
Figure BDA0003463629190000101
根据检测的Ct值，采用2-ΔΔCt法(Livak法)相对定量方式分别计算CDKN2A，NUMA1，FOSL2，BECN1四个基因的拷贝数。其计算方法如下：
1)计算阴性参考品与同一反应孔内参基因CFTR1基因、POP1基因的△Ct值，然后取根据两个内参基因计算的△Ct值的平均值，记为△CtR；
2)分别计算靶基因与同一反应孔内参基因CFTR1基因、POP1基因的△Ct值，然后取根据两个内参基因计算的△Ct值的平均值，记为△CtT；
3)靶基因△△Ct＝△CtT-△CtR，靶基因的相对拷贝数＝靶基因的相对表达量＝2-ΔΔCt。
根据各样本的临床检测结果和各靶基因2-ΔΔCt值，确定各靶基因的权重，赋予一定的系数，获得模型检验分值K，使用统计软件Medcalc做80例临床样本的ROC曲线，使得运用本试剂盒和方法检测的结果获得最佳医学决定水平。运用以上方法获得的最佳的模型检验分值K计算公式为：
K＝0.4*2ΔΔCt(CDKN2A)+0.1*2-ΔΔCt(NUMA1)+0.3*2-ΔΔCt(FOSL2)+0.2*2-ΔΔCt(BECN1)
各样本的靶基因相对表达量2-ΔΔCt结果及K值计算统计如表17所示：
表17
Figure BDA0003463629190000111
Figure BDA0003463629190000121
拷贝数判定的规则如表18：
表18
2<sup>-ΔΔCt</sup> 拷贝数
小于0.2 0
大于等于0.2，小于0.8 1
大于等于0.8，小于1.6 2
大于等于1.6 >2
K值判断结果的规则如表19所示：
表19
K值 结果
小于1 阴
大于等于1，小于1.2 灰区
大于等于1.2 阳
根据检测结果，统计单个基因表达量及模型检验分值K检测尿路上皮癌的性能如表20所示：
表20
项目 CDKN2A NUMA1 FOSL2 BECN1 K
阳性结果数 49 59 44 56 50
阴性结果数 31 21 36 24 26
真阳结果数 37 39 32 39 44
真阴结果数 18 10 18 13 21
灵敏度 75.51％ 66.10％ 72.72％ 69.64％ 88.00％
特异性 60.00％ 33.33％ 50.00％ 43.33％ 80.77％
准确率 68.75％ 61.25％ 62.50％ 63.75％ 81.25％
结果显示，单个基因表达或拷贝数异常作为尿路上皮癌诊断的标志物，灵敏度不高，特异性差，而运用本发明筛选的4个靶基因，通过预测模型计算K值，可以大大提高尿路上皮癌检测的灵敏度，特异性和准确率。
根据检测结果计算的ROC曲线如图3所示。
实施例4
独立性能验证实验
成立临床多中心，从不同医院收取30例尿路上皮癌阳性和30例尿路上皮癌阴性样本，所有样本均来自医院，且阴阳性的判断依据来自临床诊断。取30mL尿液样本分离尿沉淀，提取DNA。
配制CDKN2A基因反应液，其中CDKN2A基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制NUMA1基因反应液，其中NUMA1基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制FOSL2基因反应液，其中FOSL2基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制BECN1基因反应液，其中BECN1基因正、反向引物浓度为20μM，探针浓度为5μM，内参基因CFTR1基因和POP1基因的正、反向引物浓度均为5μM；
配制阳性参考品，其中包含CDKN2A基因、NUMA1基因、FOSL2基因、BECN1基因、CFTR1基因和POP1基因部分序列的6种质粒DNA，6种质粒DNA按摩尔量CDKN2A基因：NUMA1基因：FOSL2基因、BECN1基因：CFTR1基因：POP1基因＝1：4：4：4：2：2混合组成，总拷贝数约为20000拷贝；
配制阴性参考品，包含100ng/μL的正常人基因组DNA溶液。
按表21配制20μL反应体系：
表21
试剂名称 体积(μL)
2×主反应混合液 10
靶基因反应液 1
阳性参考品/阴性参考品/待检测样本DNA X
无菌去离子水 9-X
注：其中阳性参考品/阴性参考品加入2μL，待检测样本加入100ng。
按表22反应程序，在ABI 7500仪器上进行PCR反应：
表22
Figure BDA0003463629190000131
检测Ct值统计如表23所示：
表23
Figure BDA0003463629190000132
Figure BDA0003463629190000141
Figure BDA0003463629190000151
根据检测的Ct值，采用2-ΔΔCt法(Livak法)相对定量方式分别计算CDKN2A，NUMA1，FOSL2，BECN1四个基因的拷贝数。其计算方法如下：
1)计算阴性参考品与同一反应孔内参基因CFTR1基因、POP1基因的△Ct值，然后取根据两个内参基因计算的△Ct值的平均值，记为△CtR；
2)分别计算靶基因与同一反应孔内参基因CFTR1基因、POP1基因的△Ct值，然后取根据两个内参基因计算的△Ct值的平均值，记为△CtT；
3)靶基因△△Ct＝△CtT-△CtR，靶基因的相对拷贝数＝靶基因的相对表达量＝2-ΔΔCt。
4)运用以下模型计算K值，并对结果进行判读：
K＝0.4*2ΔΔCt(CDKN2A)+0.1*2-ΔΔCt(NUMA1)+0.3*2-ΔΔCt(FOSL2)+0.2*2-ΔΔCt(BECN1)
各样本的靶基因2-ΔΔCt结果及K值计算及检测结果统计如表24所示：
表24
Figure BDA0003463629190000152
Figure BDA0003463629190000161
Figure BDA0003463629190000171
K值判断结果的规则如表25所示：
表25
K值 结果
小于1 阴
大于等于1，小于1.2 灰区
大于等于1.2 阳
根据检测结果，统计单个基因表达量及模型检验分值K检测尿路上皮癌的性能见表26：
表26
项目 数值
阳性结果数 30
阴性结果数 27
真阳结果数 26
真阴结果数 24
灰区结果数 3
灵敏度 86.67％
特异性 88.88％
准确率 83.33％
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
序列表
<110> 中南大学湘雅三医院
湖南大地同年生物科技有限公司
<120> 用于尿路上皮癌靶基因拷贝数qPCR定量检测的特异性引物、探针组合及应用
<130> 2021
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tcccagtctg cagttaaggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggagggtcac caagaacctg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cctctggtgc caaagggcgg 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aagactgaaa tcctaacagg gcag 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
caggtcaacg gggtgagtca g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gtgtgggtgt ggcttggcag t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cctggaggga agtcagaccg 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ttcctagcac tggtttcctg tc 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cccaggatgt gagcggaggc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
aggtgagggt ggtgatgaga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ctgggtctct cctggtttcg 20
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
cccatacttt cagatgccct cctgc 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
acaggtgtag cctgtaagag 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ctttcctcaa aattggtctg gt 22
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tccaaatctg tatggagacc aaatc 25
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ggtcaatgtt gccacccaac 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
tgggggttga ctctggtttg 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
tcctggaact tcacgacagc gg 22

Claims (10)

1.用于尿路上皮癌靶基因拷贝数qPCR定量检测的特异性引物、探针组合，其特征在于，包括：
(1)CDKN2A基因的特异性引物及探针：
正向引物：5’-TCCCAGTCTGCAGTTAAGGG-3’，如SEQ ID NO.1所示；
反向引物：5’-GGAGGGTCACCAAGAACCTG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
探针：5’-CCTCTGGTGCCAAAGGGCGG-3’，如SEQ ID NO.3所示；
(2)NUMA1基因的特异性引物及探针：
正向引物：5’-AAGACTGAAATCCTAACAGGGCAG-3’，如SEQ ID NO.4所示；
反向引物：5’-CAGGTCAACGGGGTGAGTCAG-3’，如SEQ ID NO.5所示；
探针：5’-GTGTGGGTGTGGCTTGGCAGT-3’，如SEQ ID NO.6所示；
(3)FOSL2基因的特异性引物及探针：
正向引物：5’-CCTGGAGGGAAGTCAGACCG-3’，如SEQ ID NO.7所示；
反向引物：5’-TTCCTAGCACTGGTTTCCTGTC-3’，如SEQ ID NO.8所示；
探针：5’-CCCAGGATGTGAGCGGAGGC-3’，如SEQ ID NO.9所示；
(4)BECN1基因的特异性引物及探针：
正向引物：5’-AGGTGAGGGTGGTGATGAGA-3’，如SEQ ID NO.10所示；
反向引物：5’-CTGGGTCTCTCCTGGTTTCG-3’，如SEQ ID NO.11所示；
探针：5’-CCCATACTTTCAGATGCCCTCCTGC-3’，如SEQ ID NO.12所示。
2.根据权利要求1所述的特异性引物、探针组合，其特征在于，CDKN2A基因、NUMA1基因、FOSL2基因、BECN1基因的探针5端修饰FAM荧光基团，3端修饰MGB淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的特异性引物、探针组合，其特征在于，所述组合还包括内参基因CFTR1基因的特异性引物及探针：
正向引物：5’-ACAGGTGTAGCCTGTAAGAG-3’，如SEQ ID NO.13所示；
反向引物：5’-CTTTCCTCAAAATTGGTCTGGT-3’，如SEQ ID NO.14所示；
探针：5’-TCCAAATCTGTATGGAGACCAAATC-3’，如SEQ ID NO.15所示。
4.根据权利要求1所述的特异性引物、探针组合，其特征在于，所述组合还包括内参基因POP1基因的特异性引物及探针序列：
正向引物：5’-GGTCAATGTTGCCACCCAAC-3’，如SEQ ID NO.16所示；
反向引物：5’-GGTCAATGTTGCCACCCAAC-3’，如SEQ ID NO.17所示；
探针：5’-TCCTGGAACTTCACGACAGCGG-3’，如SEQ ID NO.18所示。
5.权利要求1～4任一项所述特异性引物、探针组合在制备用于尿路上皮癌qPCR定量检测的试剂盒中的应用。
6.用于尿路上皮癌qPCR定量检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～4中任一项所述特异性引物、探针组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含CDKN2A反应液、NUMA1反应液、FOSL2反应液、BECN1反应液、主反应混合液、阴性参考品、阳性参考品和空白对照品。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，CDKN2A、NUMA1、FOSL2、BECN1四个基因的反应液中，正向引物、反向引物浓度均为0.1～100μM，更进一步优选为20μM；探针的浓度均为0.01～20μM，更进一步优选为5μM；内参基因CFTR1和内参基因POP1两个基因正向引物、反向引物浓度均为0.05～50μM，更进一步优选为5μM；内参基因探针的浓度均为0.01～10μM，更进一步优选为1μM。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述主反应混合液包含热启动Taq聚合酶、UDG酶、PCR反应缓冲溶液、dNTPs/dUTP、Mg2+、ROX荧光参比染料。
10.用于辅助诊断或早筛尿路上皮癌的预测模型，其特征在于，如公式Ⅰ所示：
K＝0.4*2ΔΔCt(CDKN2A)+0.1*2-ΔΔCt(NUMA1)+0.3*2-ΔΔCt(FOSL2)+0.2*2-ΔΔCt(BECN1)(公式Ⅰ)；
其中，K为模型检验分值，2ΔΔCt(CDKN2A)、2-ΔΔCt(NUMA1)、2-ΔΔCt(FOSL2)、2-ΔΔCt(BECN1)分别表示CDKN2A基因、NUMA1基因、FOSL2基因、BECN1基因采用△△Ct值法相对定量方式计算得到的2-ΔΔCt值的倒数。
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