CN113667758A - 用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物和试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物和试剂盒及检测方法,所述组合物包括用于检测基因突变或拷贝数变异的第一组合物、以及用于检测基因融合的第二组合物,其中,所述第一组合物包括用于FGFR1目的基因的特异性引物A和探针A、用于FGFR2目的基因的特异性引物B和探针B、用于FGFR3目的基因的特异性引物C和探针C、用于FGFR4目的基因的特异性引物D和探针D,所述第二组合物包括用于FGFR1目的基因的特异性引物a和探针a、用于FGFR2目的基因的特异性引物b和探针b、用于FGFR3目的基因的特异性引物c和探针c、用于FGFR4目的基因的特异性引物d和探针d。本发明旨在提供一种能够诊断尿路上皮癌变异类型和位点的生物标志组合物。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体涉及一种用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物和试剂盒及检测方法。
背景技术
绝大部分肾盂癌、输尿管癌和膀胱癌都起源于尿路上皮,统称为“尿路上皮癌。目前,尿路上皮癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗和免疫治疗等。约一半的尿路上皮癌患者在术后都会出现复发或转移的问题。目前,转移性尿路上皮癌的标准一线治疗方案为化疗,然而中位生存时间只有1年左右,预后并不理想。
随着医学的发展,免疫药物PD-1/PD-L1及FGFR抑制剂的兴起为尿路上皮癌带来新治疗选择。在尿路上皮癌中,FGFR基因在不同类型的尿路上皮癌变异频率为10~20%。2019年4月12日FDA加速批准了第一个FGFR选择抑制剂,该FGFR选择抑制剂的ORR(客观缓解率)为40%,能够用于治疗一线含铂化疗后进展和新辅助含铂化疗后12个月内进展、且FGFR2/3基因异常的局部晚期或转移性尿路上皮癌。目前国内也开启了针对FGFR基因变异的晚期尿路上皮癌多项临床试验。
寻找灵敏度高、特异性强的标志物,对提高局部晚期或转移性尿路上皮癌的诊断率,实现早期干预治疗具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物和试剂盒及检测方法,旨在提供一种能够诊断尿路上皮癌变异类型和位点的生物标志组合物。
为实现上述目的,本发明提出一种用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物,所述用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物包括用于检测基因突变或拷贝数变异的第一组合物、以及用于检测基因融合的第二组合物,其中,所述第一组合物包括用于FGFR1目的基因的特异性引物A和探针A、用于FGFR2目的基因的特异性引物B和探针B、用于FGFR3目的基因的特异性引物C和探针C、用于FGFR4目的基因的特异性引物D和探针D,所述第二组合物包括用于FGFR1目的基因的特异性引物a和探针a、用于FGFR2目的基因的特异性引物b和探针b、用于FGFR3目的基因的特异性引物c和探针c、用于FGFR4目的基因的特异性引物d和探针d。
可选地,所述第一组合物中:
特异性引物A和探针A包括:
A-F:TGTGACCAAAGTGGCTGTGAA;
A-R:ATATTCTTATGCTTCCCGATCATCT;
探针A:ACAAGTCTTTCTCTGTTGCGTCCG;
特异性引物B和探针B包括:
B-F:GCTTTTCTGGCATGAGGT;
B-R:TGCAGACAAACTCTACGTCTC;
探针B:CTTCCCTCTCTCCACCAGAGCGATCG;
特异性引物C和探针C包括:
C-F:GGTGGCCCCTGAGCGTCATCT;
C-R:GGGCTGTGCGTCACTGTACACCT;
探针C:AGCGTCATCTGCCCCCACAGAGCGCTCC;
特异性引物D和探针D包括:
D-F:TCTCGGAGATGGAGGTGATGAAGC;
D-R:CCACCCCGGGCCCAG;
探针D:ACCCCCATCCAGTTCTGCCCCA。
可选地,特异性引物a和探针a包括:
a-F: GTACATGATGATGCGGGACTG;
a-R:CAGTCCCGCATCATCATGTAC;
探针a:GTACATGATGATGCGGGACTG;
特异性引物b和探针b包括:
b-F:CATGCAGTGCCCTCACAG;
b-R:TCTTTTCCAAGTGCCACTTCC;
探针b:AAGGCCACGATGCGGTCCA;
特异性引物c和探针c包括:
c-F:: CCCAGAGGCCCACCTTCAAG;
c-R:TCCAGGTTCTTCCCGTGGAGC;
探针c:CCGGTTCTCCTCCTGTGTCGCCTT;
特异性引物d和探针d包括:
d-F:TCCCAGAGGCCCACCTTC;
d-R:AACAGACTTACCGTTTACAGCTT;
探针d:ATTTCGCAGCCCAGGATTGAACT。
此外,本发明还提出一种用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的试剂盒,所述用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的试剂盒包括用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物,所述用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物包括用于检测基因突变或拷贝数变异的第一组合物、以及用于检测基因融合的第二组合物,其中,所述第一组合物包括用于FGFR1目的基因的特异性引物A和探针A、用于FGFR2目的基因的特异性引物B和探针B、用于FGFR3目的基因的特异性引物C和探针C、用于FGFR4目的基因的特异性引物D和探针D,所述第二组合物包括用于FGFR1目的基因的特异性引物a和探针a、用于FGFR2目的基因的特异性引物b和探针b、用于FGFR3目的基因的特异性引物c和探针c、用于FGFR4目的基因的特异性引物d和探针d。
此外,本发明还提出一种局部晚期或转移性尿路上皮癌的检测方法,所述局部晚期或转移性尿路上皮癌的检测方法包括以下步骤:
提供一如上文所述的用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的试剂盒;
从尿路上皮组织样品中提取DNA和RNA;
使用所述第一组合物对所述DNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在基因突变;
使用所述第一组合物对所述DNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在拷贝数变异;
使用所述第二组合物对所述RNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在基因融合。
可选地,所述试剂盒还包括内参引物;
所述使用所述第一组合物对所述DNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在基因突变的步骤包括:
以所述DNA为模板,使用所述第一组合物和所述内参引物进行多重PCR扩增,得到特异性引物的ct值和内参引物的ct值;
计算得到所述特异性引物与所述内参引物的ct值的差值ΔCt;
当所述差值ΔCt≤1时,判定为所述尿路上皮组织样品存在基因突变,当所述差值ΔCt>1时,判定为所述尿路上皮组织样品不存在基因突变。
可选地,所述试剂盒还包括内参引物;
所述使用所述第一组合物对所述DNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在拷贝数变异的步骤包括:
以所述DNA为模板,使用所述第一组合物和所述内参引物进行多重PCR扩增,得到特异性引物的ct值和内参引物的ct值;
计算得到所述特异性引物与所述内参引物的ct值的差值ΔCt;
当所述差值2-ΔΔCt>2.0时时,判定为所述尿路上皮组织样品存在拷贝数异常增多;当所述差值2-ΔΔCt<1.5时,判定为所述尿路上皮组织样品不存在拷贝数变异;当2.0≥2-ΔΔCt≥1.5时,判定为所述尿路上皮组织样品基因拷贝数异常情况“不确定”。
可选地,所述试剂盒还包括内参引物;
所述使用所述第二组合物对所述RNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在基因融合的步骤包括:
以所述RNA为模板,使用所述第二组合物和所述内参引物进行多重PCR扩增,得到特异性引物的ct值和内参引物的ct值;
计算得到所述特异性引物与所述内参引物的ct值的差值ΔCt;
当所述差值ΔCt≤2时,判定为所述尿路上皮组织样品存在基因融合,当所述差值ΔCt>2时,判定为所述尿路上皮组织样品不存在基因融合。
可选地,在进行多重PCR扩增时,配制的PCR反应预混液中加入野生型阻断剂。
本发明提供的技术方案中,所述用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物包括用于检测基因突变或拷贝数变异的第一组合物、以及用于检测基因融合的第二组合物,各组合物包括分别针对FGFR1-4目的基因的特异性引物和探针,通过利用第一组合物对基因组DNA进行多重PCR能够检测FGFR家族基因是否发生基因突变或拷贝数变异,通过第二组合物对基因组RNA进行多重PCR能够检测FGFR家族基因是否发生基因融合,从而能够实现对局部晚期或转移性尿路上皮癌的检测,且该检测结果能够对其突变类型进行分型;此外,本组合物针对多个基因位点以及多个突变类型进行检测,具有敏感度高、特异性强、检测靶点多、检测速度快的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为FGFR1基因点突变检测的灵敏度试验;
图2为FGFR1基因点突变检测的特异度试验;
图3为FGFR1基因拷贝数变异的灵敏度试验;
图4为FGFR1基因融合变异的灵敏度试验。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例,参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外,全文中出现的“和/或”的含义,包括三个并列的方案,以“A和/或B”为例,包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外,各个实施例之间的技术方案可以相互结合,但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础,当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在,也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提出一种用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物,所述用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物包括用于检测基因突变或拷贝数变异的第一组合物、以及用于检测基因融合的第二组合物,其中,所述第一组合物包括用于FGFR1目的基因的特异性引物A和探针A、用于FGFR2目的基因的特异性引物B和探针B、用于FGFR3目的基因的特异性引物C和探针C、用于FGFR4目的基因的特异性引物D和探针D,所述第二组合物包括用于FGFR1目的基因的特异性引物a和探针a、用于FGFR2目的基因的特异性引物b和探针b、用于FGFR3目的基因的特异性引物c和探针c、用于FGFR4目的基因的特异性引物d和探针d。
本发明提供的技术方案中,所述用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物包括用于检测基因突变或拷贝数变异的第一组合物、以及用于检测基因融合的第二组合物,各组合物包括分别针对FGFR1-4目的基因的特异性引物和探针,通过利用第一组合物对基因组DNA进行多重PCR能够检测FGFR家族基因是否发生基因突变或拷贝数变异,通过第二组合物对基因组RNA进行多重PCR能够检测FGFR家族基因是否发生基因融合,从而能够实现对局部晚期或转移性尿路上皮癌的检测,且该检测结果能够对其突变类型进行分型,并具有敏感度高、特异性强、检测速度快的特点。
本发明提供的组合物包括第一组合物和第二组合物。
其中,第一组合物包括4对特异性引物和对应的4个探针,分别针对FGFR1目的基因、FGFR2目的基因、FGFR3目的基因以及FGFR4目的基因。
针对FGFR1目的基因的特异性引物A和探针A的序列如下:
正向引物序列A-F如SEQ ID NO:1所示,具体为:
TGTGACCAAAGTGGCTGTGAA;
反向引物序列A-R如SEQ ID NO:2所示,具体为:
ATATTCTTATGCTTCCCGATCATCT;
探针A如SEQ ID NO:3所示,具体为:
ACAAGTCTTTCTCTGTTGCGTCCG。
针对FGFR2目的基因的特异性引物B和探针B的序列如下:
正向引物序列B-F如SEQ ID NO:4所示,具体为:
GCTTTTCTGGCATGAGGT;
反向引物序列B-R如SEQ ID NO:5所示,具体为:
TGCAGACAAACTCTACGTCTC;
探针B如SEQ ID NO:6所示,具体为:
CTTCCCTCTCTCCACCAGAGCGATCG。
针对FGFR3目的基因的特异性引物C和探针C的序列如下:
正向引物序列C-F如SEQ ID NO:7所示,具体为:
GGTGGCCCCTGAGCGTCATCT;
反向引物序列C-R如SEQ ID NO:8所示,具体为:
GGGCTGTGCGTCACTGTACACCT;
探针C如SEQ ID NO:9所示,具体为:
AGCGTCATCTGCCCCCACAGAGCGCTCC。
针对FGFR4目的基因的特异性引物D和探针D的序列如下:
正向引物序列D-F如SEQ ID NO:10所示,具体为:
TCTCGGAGATGGAGGTGATGAAGC;
反向引物序列D-R如SEQ ID NO:11所示,具体为:
CCACCCCGGGCCCAG;
探针D如SEQ ID NO:12所示,具体为:
ACCCCCATCCAGTTCTGCCCCA。
其中,第二组合物包括4对特异性引物和对应的4个探针,分别针对FGFR1目的基因、FGFR2目的基因、FGFR3目的基因以及FGFR4目的基因。
针对FGFR1目的基因的特异性引物a和探针a的序列如下:
正向引物序列a-F如SEQ ID NO:13所示,具体为:
GTACATGATGATGCGGGACTG;
反向引物序列a-R如SEQ ID NO:14所示,具体为:
CAGTCCCGCATCATCATGTAC;
探针a如SEQ ID NO:15所示,具体为:
GTACATGATGATGCGGGACTG。
针对FGFR2目的基因的特异性引物b和探针b的序列如下:
正向引物序列b-F如SEQ ID NO:16所示,具体为:
CATGCAGTGCCCTCACAG;
反向引物序列b-R如SEQ ID NO:17所示,具体为:
TCTTTTCCAAGTGCCACTTCC;
探针b如SEQ ID NO:18所示,具体为:
AAGGCCACGATGCGGTCCA。
针对FGFR3目的基因的特异性引物c和探针c的序列如下:
正向引物序列c-F如SEQ ID NO:19所示,具体为:
CCCAGAGGCCCACCTTCAAG;
反向引物序列c-R如SEQ ID NO:20所示,具体为:
TCCAGGTTCTTCCCGTGGAGC;
探针c如SEQ ID NO:21所示,具体为:
CCGGTTCTCCTCCTGTGTCGCCTT;
针对FGFR4目的基因的特异性引物d和探针d的序列如下:
正向引物序列d-F如SEQ ID NO:22所示,具体为:
TCCCAGAGGCCCACCTTC;
反向引物序列d-R如SEQ ID NO:23所示,具体为:
AACAGACTTACCGTTTACAGCTT;
探针d如SEQ ID NO:24所示,具体为:
ATTTCGCAGCCCAGGATTGAACT。
此外,本发明还提出一种用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的试剂盒。所述用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的试剂盒包括上述用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物。具体地,所述用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物包括用于检测基因突变或拷贝数变异的第一组合物、以及用于检测基因融合的第二组合物,其中,所述第一组合物包括用于FGFR1目的基因的特异性引物A和探针A、用于FGFR2目的基因的特异性引物B和探针B、用于FGFR3目的基因的特异性引物C和探针C、用于FGFR4目的基因的特异性引物D和探针D,所述第二组合物包括用于FGFR1目的基因的特异性引物a和探针a、用于FGFR2目的基因的特异性引物b和探针b、用于FGFR3目的基因的特异性引物c和探针c、用于FGFR4目的基因的特异性引物d和探针d。
该试剂盒能够对尿路上皮癌的多重关联基因进行检测,并能检测出多种变异类型的尿路上皮癌,例如,基因融合型、基因突变型、拷贝数变异型、多种变异混合型等。本试剂盒的设计能够用于对尿路上皮癌的多重PCR检测,检测速度快且敏感度高、特异性强。
此外,试剂盒还包括内参引物、DNA聚合酶、dNTP、缓冲体系、核酸提取液等。将引物、探针、DNA聚合酶、dNTP、缓冲体系混合即可获得PCR反应预混液,以用于进行多重PCR。其中,由于本试剂盒针对多重目的基因设计,因此,相应地,内参基因也包括一对PCR扩增引物和一条Taqman探针,以用于FGFR1-4目的基因的突变、拷贝数变异和融合的检测,具体地,内参引物的序列如下所示:
内参基因正向引物序列:CTCCATCCTGGCCTCGCTGT;
内参基因反向引物序列:GCTGTCACCTTCACCGTTCC;
内参引物探针:GGCAGCTCATTGCAGCTTAG。
此外,本发明还提出一种局部晚期或转移性尿路上皮癌的检测方法。所述局部晚期或转移性尿路上皮癌的检测方法包括以下步骤:
步骤S10,提供一如上文所述的用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的试剂盒。
步骤S20,从尿路上皮组织样品中提取DNA和RNA。
其中,采集的样本类型为尿路上皮肿瘤组织样品,采集后可以使用福尔马林固定石蜡包埋样本。
步骤S30,使用所述第一组合物对所述DNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在基因突变。
本实施例使用第一组合物配制PCR反应预混液,然后进行多重PCR扩增,再根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在基因突变。其中,在配制PCR反应预混液时,可以向其中加入野生型阻断剂以封闭野生型热点,从而特异地扩增突变型热点的DNA序列,提升检查灵敏度。其中,野生型阻断剂可以在市面上购得。
具体实施时,步骤S30可以包括:
步骤S301,以所述DNA为模板,使用所述第一组合物和所述内参引物进行多重PCR扩增,得到特异性引物的ct值和内参引物的ct值;
步骤S302,计算得到所述特异性引物与所述内参引物的ct值的差值ΔCt;
步骤S303,当所述差值ΔCt≤1时,判定为所述尿路上皮组织样品存在基因突变,当所述差值ΔCt>1时,判定为所述尿路上皮组织样品不存在基因突变。
如图1所示,针对利用FGFR1点突变参考品配制的不同突变频率的样品,利用本发明提供的检测方法均能有效检测出各样品存在基因突变,且可检测到的基因突变水平低至0.5%,灵敏度较高。
此外,考虑到第一组合物包含四对引物和探针,实际操作时,可以将第一组合物的四对特异性引物和探针两两分组,分别进行扩增。例如,设置两组反应管,其中一组加入特异性引物A、探针A、特异性引物B和探针B,以针对FGFR1/2目的基因进行基因突变检测,另一组加入特异性引物C、探针C、特异性引物D和探针D,以针对FGFR3/4目的基因进行基因突变检测.可以理解的是,除加入的特异性引物和探针不同外,两管的反应条件以及预混液其他组分均相同。
步骤S40,使用所述第一组合物对所述DNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在拷贝数变异。
本实施例使用第一组合物配制PCR反应预混液,然后进行多重PCR扩增,再根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在拷贝数变异。其中,在配制PCR反应预混液时,可以向其中加入野生型阻断剂以封闭野生型热点,从而特异地扩增突变型热点的DNA序列,提升检查灵敏度。
具体实施时,步骤S40可以包括:
步骤S401,以所述DNA为模板,使用所述第一组合物和所述内参引物进行多重PCR扩增,得到特异性引物的ct值和内参引物的ct值;
步骤S402,计算得到所述特异性引物与所述内参引物的ct值的差值ΔCt;
步骤S403,当所述差值2-ΔΔCt>2.0时时,判定为所述尿路上皮组织样品存在拷贝数异常增多;当所述差值2-ΔΔCt<1.5时,判定为所述尿路上皮组织样品不存在拷贝数变异;当2.0≥2-ΔΔCt≥1.5时,判定为所述尿路上皮组织样品基因拷贝数异常情况“不确定”,建议采用其他方法重新检测,以进一步确认。
如图3所示,针对利用FGFR1拷贝数变异参考品配制的不同拷贝数浓度的样品,利用本发明提供的检测方法均能有效检测出各样品存在拷贝数变异。
此外,实际操作时,可以将第一组合物的四对特异性引物和探针两两分组,分别进行扩增,具体操作如上所述,在此不做详述。
步骤S50,使用所述第二组合物对所述RNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在基因融合。
本实施例使用第二组合物配制PCR反应预混液,然后进行多重PCR扩增,再根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在基因融合。
具体实施时,步骤S50可以包括:
步骤S501,以所述RNA为模板,使用所述第二组合物和所述内参引物进行多重PCR扩增,得到特异性引物的ct值和内参引物的ct值;
步骤S502,计算得到所述特异性引物与所述内参引物的ct值的差值ΔCt;
步骤S503,当所述差值ΔCt≤2时,判定为所述尿路上皮组织样品存在基因融合,当所述差值ΔCt>2时,判定为所述尿路上皮组织样品不存在基因融合。
如图4所示,针对利用FGFR1基因融合参考品配制的融合频率的样品,利用本发明提供的检测方法均能有效检测出各样品存在基因融合。
此外,实际操作时,可以将第二组合物的四对特异性引物和探针两两分组,分别进行扩增,具体操作如上所述,在此不做详述。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明,应当理解,以下实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1 试剂盒的灵敏度试验(以FGFR1基因点突变检测为例)
本发明试剂盒的检测方法按照下述步骤进行:
1、样本采集与处理
取尿路上皮肿瘤组织作为样本,并提取DNA备用。
2、配制溶液
1)取出DNA聚合酶,振荡混匀,快速离心15秒待用。
2)分别向体积均为18μL的突变频率为10%、2%、1%和0.5%的FGFR1点突变参考品中加入2 μL DNA聚合酶,涡旋器上混匀15秒,然后快速离心15秒。
3)将PCR反应条放置于在PCR管冰架上,轻轻揭开管盖。如发现管盖内侧有液滴,开盖前请先离心。
4)将混好的DNA样品依次取5 µL靠着PCR管上管壁加入PCR反应条中,然后小心盖上PCR反应条的管盖,快速离心PCR反应条15秒。
5)将PCR反应条平行放入实时荧光定量PCR仪器。
3、PCR扩增
第一阶段:95℃ 5分钟,1个循环;
第二阶段:95℃ 25秒,64℃ 20秒,72℃ 20秒,15个循环;
第三阶段:93℃ 25秒,60℃ 35秒,72℃ 20秒,31个循环;
信号收集:第三阶段60℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号。
4、结果分析:
结果如图1所示,从图中可以看出,该方法最低可检测频率低至0.5%的点突变,具有较高的灵敏度。
实施例2 试剂盒的特异度试验(以FGFR1基因点突变检测为例)
本发明试剂盒的检测方法按照下述步骤进行:
1、样本采集与处理
取尿路上皮肿瘤组织作为样本,并提取DNA备用。
2、配制溶液
1)取出DNA聚合酶,振荡混匀,快速离心15秒待用。
2)分别向体积均为18μL的FGFR1点突变的阴性参考品(NC-1、NC-2和NC-3)中分别加入2 μL DNA聚合酶,涡旋器上混匀15秒,然后快速离心15秒。
3)将PCR反应条放置于在PCR管冰架上,轻轻揭开管盖。如发现管盖内侧有液滴,开盖前请先离心。
4)将混好的DNA样品依次取5 µL靠着PCR管上管壁加入PCR反应条中,然后小心盖上PCR反应条的管盖,快速离心PCR反应条15秒。
5)将PCR反应条平行放入实时荧光定量PCR仪器。
5、PCR扩增
第一阶段:95℃ 5分钟,1个循环;
第二阶段:95℃ 25秒,64℃ 20秒,72℃ 20秒,15个循环;
第三阶段:93℃ 25秒,60℃ 35秒,72℃ 20秒,31个循环;
信号收集:第三阶段60℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号。
6、结果分析:
结果如图2所示,从图中可以看出,该方法未在阴性参考品中检出FGFR1基因的点突变,具有较高的特异度。
实施例3 试剂盒的灵敏度试验(以FGFR1基因拷贝数变异检测为例)
本发明试剂盒的检测方法按照下述步骤进行:
1、样本采集与处理
取尿路上皮肿瘤组织作为样本,并提取DNA备用。
2、配制溶液
1)取出DNA聚合酶,振荡混匀,快速离心15秒待用。
2)分别向体积均为18μL的突变频率为10%、2%、1%和0.5%的FGFR1点突变参考品中加入2 μL DNA聚合酶,涡旋器上混匀15秒,然后快速离心15秒。
3)将PCR反应条放置于在PCR管冰架上,轻轻揭开管盖。如发现管盖内侧有液滴,开盖前请先离心。
4)将混好的DNA样品依次取5 µL靠着PCR管上管壁加入PCR反应条中,然后小心盖上PCR反应条的管盖,快速离心PCR反应条15秒。
5)将PCR反应条平行放入实时荧光定量PCR仪器。
7、PCR扩增
第一阶段:95℃ 5分钟,1个循环;
第二阶段:95℃ 25秒,64℃ 20秒,72℃ 20秒,15个循环;
第三阶段:93℃ 25秒,60℃ 35秒,72℃ 20秒,31个循环;
信号收集:第三阶段60℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号。
8、结果分析:
结果如图3所示,从图中可以看出,当2-ΔΔCt>2.0时,FGFR1基因发生了拷贝数扩增。
实施例4 试剂盒的灵敏度试验(以FGFR1基因融合变异检测为例)
本发明试剂盒的检测方法按照下述步骤进行:
1、样本采集与处理
取尿路上皮肿瘤组织作为样本,并提取DNA备用。
2、配制溶液
1)取出DNA聚合酶,振荡混匀,快速离心15秒待用。
2)分别向体积均为18μL的FGFR1点突变的阴性参考品(NC-1、NC-2和NC-3)中分别加入2 μL DNA聚合酶,涡旋器上混匀15秒,然后快速离心15秒。
3)将PCR反应条放置于在PCR管冰架上,轻轻揭开管盖。如发现管盖内侧有液滴,开盖前请先离心。
4)将混好的DNA样品依次取5 µL靠着PCR管上管壁加入PCR反应条中,然后小心盖上PCR反应条的管盖,快速离心PCR反应条15秒。
5)将PCR反应条平行放入实时荧光定量PCR仪器。
9、PCR扩增
第一阶段:95℃ 5分钟,1个循环;
第二阶段:95℃ 25秒,64℃ 20秒,72℃ 20秒,15个循环;
第三阶段:93℃ 25秒,60℃ 35秒,72℃ 20秒,31个循环;
信号收集:第三阶段60℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号。
10、结果分析:
结果如图4所示,从图中可以看出,该方法最低可检测频率低至1%的融合变异,具有较高的灵敏度。
综上所述,本发明试剂盒具有特异性好、准确性高、灵敏度高、精确度高的优点,且与现有的同类试剂盒相比,未出现假阴性,具有更高的准确度。
以上仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 求臻医学科技(北京)有限公司
<120> 用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物和试剂盒及检测方法
<130> 20210924
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tgtgaccaaa gtggctgtga a 21
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
acaagtcttt ctctgttgcg tccg 24
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gcttttctgg catgaggt 18
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tgcagacaaa ctctacgtct c 21
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cttccctctc tccaccagag cgatcg 26
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ggtggcccct gagcgtcatc t 21
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gggctgtgcg tcactgtaca cct 23
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<212> DNA
<213> 人工合成
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agcgtcatct gcccccacag agcgctcc 28
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
tctcggagat ggaggtgatg aagc 24
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
ccaccccggg cccag 15
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
acccccatcc agttctgccc ca 22
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
gtacatgatg atgcgggact g 21
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cagtcccgca tcatcatgta c 21
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
gtacatgatg atgcgggact g 21
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catgcagtgc cctcacag 18
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<212> DNA
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<400> 17
tcttttccaa gtgccacttc c 21
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<212> DNA
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cccagaggcc caccttcaag 20
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ccggttctcc tcctgtgtcg cctt 24
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<213> 人工合成
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 23
aacagactta ccgtttacag ctt 23
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
atttcgcagc ccaggattga act 23
Claims (9)
1.一种用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物,其特征在于,包括用于检测基因突变或拷贝数变异的第一组合物、以及用于检测基因融合的第二组合物,其中,所述第一组合物包括用于FGFR1目的基因的特异性引物A和探针A、用于FGFR2目的基因的特异性引物B和探针B、用于FGFR3目的基因的特异性引物C和探针C、用于FGFR4目的基因的特异性引物D和探针D,所述第二组合物包括用于FGFR1目的基因的特异性引物a和探针a、用于FGFR2目的基因的特异性引物b和探针b、用于FGFR3目的基因的特异性引物c和探针c、用于FGFR4目的基因的特异性引物d和探针d。
2.如权利要求1所述的用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物,其特征在于,所述第一组合物中:
特异性引物A和探针A包括:
A-F:TGTGACCAAAGTGGCTGTGAA;
A-R:ATATTCTTATGCTTCCCGATCATCT;
探针A:ACAAGTCTTTCTCTGTTGCGTCCG;
特异性引物B和探针B包括:
B-F:GCTTTTCTGGCATGAGGT;
B-R:TGCAGACAAACTCTACGTCTC;
探针B:CTTCCCTCTCTCCACCAGAGCGATCG;
特异性引物C和探针C包括:
C-F:GGTGGCCCCTGAGCGTCATCT;
C-R:GGGCTGTGCGTCACTGTACACCT;
探针C:AGCGTCATCTGCCCCCACAGAGCGCTCC;
特异性引物D和探针D包括:
D-F:TCTCGGAGATGGAGGTGATGAAGC;
D-R:CCACCCCGGGCCCAG;
探针D:ACCCCCATCCAGTTCTGCCCCA。
3.如权利要求1所述的用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物,其特征在于,特异性引物a和探针a包括:
a-F: GTACATGATGATGCGGGACTG;
a-R:CAGTCCCGCATCATCATGTAC;
探针a:GTACATGATGATGCGGGACTG;
特异性引物b和探针b包括:
b-F:CATGCAGTGCCCTCACAG;
b-R:TCTTTTCCAAGTGCCACTTCC;
探针b:AAGGCCACGATGCGGTCCA;
特异性引物c和探针c包括:
c-F:: CCCAGAGGCCCACCTTCAAG;
c-R:TCCAGGTTCTTCCCGTGGAGC;
探针c:CCGGTTCTCCTCCTGTGTCGCCTT;
特异性引物d和探针d包括:
d-F:TCCCAGAGGCCCACCTTC;
d-R:AACAGACTTACCGTTTACAGCTT;
探针d:ATTTCGCAGCCCAGGATTGAACT。
4.一种用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1至3任意一项所述的用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的组合物。
5.一种局部晚期或转移性尿路上皮癌的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
提供一如权利要求4所述的用于诊断局部晚期或转移性尿路上皮癌的试剂盒;
从尿路上皮组织样品中提取DNA和RNA;
使用所述第一组合物对所述DNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在基因突变;
使用所述第一组合物对所述DNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在拷贝数变异;
使用所述第二组合物对所述RNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在基因融合。
6.如权利要求5所述的局部晚期或转移性尿路上皮癌的检测方法,其特征在于,所述试剂盒还包括内参引物;
所述使用所述第一组合物对所述DNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在基因突变的步骤包括:
以所述DNA为模板,使用所述第一组合物和所述内参引物进行多重PCR扩增,得到特异性引物的ct值和内参引物的ct值;
计算得到所述特异性引物与所述内参引物的ct值的差值ΔCt;
当所述差值ΔCt≤1时,判定为所述尿路上皮组织样品存在基因突变,当所述差值ΔCt>1时,判定为所述尿路上皮组织样品不存在基因突变。
7.如权利要求5所述的局部晚期或转移性尿路上皮癌的检测方法,其特征在于,所述试剂盒还包括内参引物;
所述使用所述第一组合物对所述DNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在拷贝数变异的步骤包括:
以所述DNA为模板,使用所述第一组合物和所述内参引物进行多重PCR扩增,得到特异性引物的ct值和内参引物的ct值;
计算得到所述特异性引物与所述内参引物的ct值的差值ΔCt;
当所述差值2-ΔΔCt>2.0时时,判定为所述尿路上皮组织样品存在拷贝数异常增多;当所述差值2-ΔΔCt<1.5时,判定为所述尿路上皮组织样品不存在拷贝数变异;当2.0≥2-ΔΔCt≥1.5时,判定为所述尿路上皮组织样品基因拷贝数异常情况“不确定”。
8.如权利要求5所述的局部晚期或转移性尿路上皮癌的检测方法,其特征在于,所述试剂盒还包括内参引物;
所述使用所述第二组合物对所述RNA进行多重PCR扩增,根据扩增结果判断所述尿路上皮组织样品是否存在基因融合的步骤包括:
以所述RNA为模板,使用所述第二组合物和所述内参引物进行多重PCR扩增,得到特异性引物的ct值和内参引物的ct值;
计算得到所述特异性引物与所述内参引物的ct值的差值ΔCt;
当所述差值ΔCt≤2时,判定为所述尿路上皮组织样品存在基因融合,当所述差值ΔCt>2时,判定为所述尿路上皮组织样品不存在基因融合。
9.如权利要求5所述的局部晚期或转移性尿路上皮癌的检测方法,其特征在于,在进行多重PCR扩增时,配制的PCR反应预混液中加入野生型阻断剂。
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