CN114225023A - 抗csf-1r抗体联合抗pd-l1抗体的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗CSF‑1R抗体联合抗PD‑L1抗体的应用。特别地，抗CSF‑1R抗体联合抗PD‑L1抗体在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。其中，所述抗CSF‑1R抗体和所述抗PD‑L1抗体如本发明中所定义。本发明人意外发现，抗CSF‑1R抗体与抗PD‑L1抗体联用治疗肿瘤(特别是结直肠癌)效果优异(抑瘤率可达90％以上)，且无毒性。

Description

抗CSF-1R抗体联合抗PD-L1抗体的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗CSF-1R抗体联合抗PD-L1抗体的应用。
背景技术
这里的陈述仅是提供与本发明有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
细胞毒性T细胞响应对于控制癌症的发展、产生免疫和消除肿瘤细胞具有重要意义。目前，多种用于治疗晚期癌症的探索性免疫疗法已获得快速批准，最广泛的方法是利用免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitors，ICI)来提高T细胞活性。然而，目前接受ICI治疗的患者中只有不到50％的患者产生持久的T细胞响应，迫切需要新的治疗方案。
为克服耐药、追求更大的临床获益，联合疗法已然成为当下抗癌研究中最热门的方向之一。靶向联合、免疫联合等创新的联合模式已成为趋势。从20世纪40年代第一批联合用药获批以来，联合用药的获批数量一直处于高速增长中。非肿瘤领域疾病的联合治疗药物在近20年时间里获批了100余种。在肿瘤治疗领域，获批的联合用药外加超说明书用药，药物联用方案更是种类繁多。肿瘤领域的联合用药跟新药的研发进展息息相关。在靶向药出现之前，业内热衷于第一代化疗药的联用；靶向药出现后，业内开始探索靶向药的联用；随着生物药的兴起，免疫治疗起步，制药界快速进入PD-1/PD-L1的时代。
Clinical Trial(美国临床试验数据库)有关肿瘤领域的临床试验信息显示，目前基本处于化疗药、靶向药与PD-1/PD-L1抗体组合的状态，几类药品的竞争赛道十分拥挤。
CSF-1/CSF-1R
肿瘤微环境极其复杂，不仅包括了肿瘤细胞本身，还有其周围的成纤维细胞、免疫和炎性细胞、胶质细胞等各种细胞，同时也包括附近区域内的细胞间质、微血管以及浸润在其中的生物分子。肿瘤微环境主要有三大类特征：缺氧、慢性炎症及免疫抑制。三者相辅相成，形成一个复杂的机制网络，对肿瘤的发展产生重要作用。
肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAMs)是肿瘤微环境中最丰富的非癌细胞之一，在许多癌症中，巨噬细胞浸润到肿瘤与肿瘤不良预后相关。研究表明，在肿瘤微环境中，肿瘤相关巨噬细胞的比例超过50％与预后不良相关。肿瘤相关巨噬细胞通过促进细胞侵袭转移增加的途径，包括血管生成、基质重塑和上皮向间充质转化，在肿瘤进展中发挥关键作用。
集落刺激因子-1受体(Colony-stimulating Factor 1Receptor,CSF-1R)属III型蛋白酪氨酸激酶受体家族。集落刺激因子1(Colony-stimulating Factor-1，CSF1)可促进TAMs的浸润和向M2型极化，从而导致免疫微环境中趋化因子、细胞因子改变，抑制免疫细胞功能、促进血管生成和耐药等作用，CSF-1R是其主要的受体。CSF-1/CSF-1R信号转导调控单核巨噬细胞系的存活、增殖、分化和迁移，CSF-1R及其配体的过度表达会引起该受体介导的细胞信号异常激活。在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和宫颈癌等实体瘤中发现免疫抑制性的肿瘤相关巨噬细胞(Tumor Associated Macrophages,TAM)与肿瘤不良预后有关，在女性生殖系统(乳腺、卵巢、子宫内膜、宫颈等)肿瘤以及人霍奇金淋巴瘤的肿瘤细胞上也发现了CSF-1/CSF-1R的表达，肿瘤微环境中T或瘤细胞的CSF-1/CSF-1R表达与肿瘤生长以及肿瘤患者不良预后有关，可通过分泌血管生成因子、蛋白酶和其他生长因子和细胞因子促进肿瘤进展。
现阶段，已有多种CSF1/CSF-1R的小分子抑制剂和抗体问世，上市的靶向药物共有6款，适应症主要集中在肿瘤治疗领域，尤其肾癌和胰腺癌。目前临床上的CSF-1R抑制剂数量不少，包括已经获批用于腱鞘巨细胞瘤的Pexidartinib(TURALIO)，正在临床试验的PLX7486、ARRY-382、Edicotinib(JNJ-40346527)、BLZ945、AMG820、IMC-CS4、lacnotuzumab(MCS110)、C019199片等。在研药物在其早期临床研究中显示出良好安全性和前景，其中单克隆抗体的安全性优于小分子抑制剂，但其单药临床疗效总体较低(4％～5％)。仅在腱鞘巨细胞瘤中显示出了较高的临床疗效，ORR可达80％以上。
基于此，多项CSF-1R抑制剂联合化疗或免疫治疗的临床研究也正在开展中。根据报道的早期实验结果，CSF1R小分子抑制剂联合紫杉醇治疗实体瘤疗效可达17％。有文献(Cancer Res；74(18)；5057–5069)报道CSF-1/CSF-1R信号通路的阻断能够上调肿瘤微环境中T细胞免疫检查点分子水平，包括PD-L1、CTLA-4，从而限制了CSF-1R抗体发挥疗效。US9765147公开了在CT26和MC38实体瘤中，CSF-1R抗体阻断能够上调肿瘤中PD-L1表达。由此说明，CSF-1R单抗联合其他免疫检查点的单抗治疗仍存在一些潜在可探索领域。
PD-1/PD-L1
PD-l(程序性死亡分子1，Programmed Death-l)是1992年发现的表达在T细胞表面的一个蛋白受体，主要参与到细胞的凋亡过程。PD-1有两个配体，分别为PD-L1和PD-L2。PD-L1主要表达于T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(Dendritic Cell,DC)上，在活化后细胞上的表达能够进行上调。而PD-L2的表达相对较局限，主要表达在抗原呈递细胞上，如活化的巨噬细胞和树突状细胞。
PD-1和PD-L1是表达在T细胞和抗原呈递细胞上的一对免疫调节分子，这类分子与激活型T细胞受体合作，用于维持人体免疫系统的平衡。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞通过高表达PD-L1，结合T细胞表达的PD-1受体，抑制T细胞功能，达到肿瘤的免疫逃逸状态。PD-L1存在于多种类型肿瘤中，在瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞中高表达，且在部分肿瘤类型中PD-L1高表达常与肿瘤患者的不良预后相关。
PD-L1单抗已经有多种获批上市的药物，并给患者带来临床获益。然而，由于肿瘤微环境中存在多种内在或者外在的免疫逃逸机制，并募集了许多具有免疫抑制功能的免疫细胞(如肿瘤相关巨噬细胞)以及上调表达多个免疫检查点分子(如LAG-3等)，这些抑制因素共同组成了复杂的免疫抑制调控网络，从而限制了PD-L1抗体单药的效果。因此，在PD-L1单抗的联合用药上，国内外多家制药公司在临床阶段开展了多角度的全方位探索。
综合以上，抗CSF-1R抗体与PD-L1抑制剂联用存在一些潜在可探索领域。专利CN105473617A介绍了抗CSF-1R抗体和PD-L1抗体的组合疗法治疗癌症、炎性疾病、骨丢失等。该专利体内实验选用了皮下CT26 WT和MC38实体瘤模型，结果显示所用的鼠源抗CSF-1R抗体并未表现抑瘤效果(TGI为0％)，且联用时TGI值并未提升，同时联用组相对于PD-L1单用组肿瘤体积中值>700mm3进展前时间未有改善，说明联用并未增效。
专利CN104271158A公开了在MC38结肠癌荷瘤小鼠模型中抗CSF-1R抗体与多种药物配伍使用的抗肿瘤疗效，包括免疫增强剂阿地白介素、Folfiri(伊立替康、亚叶酸钙、5-氟尿嘧啶)、奥沙利铂、CD40单抗FGK45、抗Ang2/VEGF双抗。与单药相比，配伍使用或三药共用能显著增强抗CSF-1R抗体抗肿瘤效果，能够延长肿瘤体积中值>700mm3进展前时间。
CN110072553A公开了在抗PD-L1/PD1治疗失败之后抗CSF-1R抗体与抗PD-L1抗体组合对肿瘤的治疗效果，涉及到的瘤种包括尿路上皮膀胱癌(UBC)、黑素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌(RCC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、淋巴瘤(例如B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL))等。患者在抗PD-L1/PD1抗体治疗失败之后，接受抗CSF-1R抗体和抗PD-L1抗体的组合治疗，患者显示部分响应，有较好的临床益处。
有文献(Cancer Res；74(18)；5057–5069)报道了阻断CSF1/CSF-1R通路可增强胰腺导管腺癌对PD1-拮抗剂和/或CTLA4-拮抗剂的免疫治疗的反应。在Kras-INK鼠源原位胰腺癌和KC鼠源原位胰腺癌模型中，CSF-1R抑制剂能够联合CTLA-4抗体和/或PD-1抗体，改善肿瘤微环境，增强免疫抑制剂的抗肿瘤疗效。
然而，目前尚无有效的联合抗CSF-1R抗体和抗PD-L1抗体进行治疗的报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种含抗CSF-1R抗体和抗PD-L1抗体的药物组合物及其应用，本发明人意外发现，抗CSF-1R抗体与抗PD-L1抗体联用治疗肿瘤(特别是结直肠癌)效果优异(抑瘤率可达90％以上)，且无毒性。
本发明第一方面提供抗CSF-1R抗体联合抗PD-L1抗体在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用，所述抗CSF-1R抗体包含VLCSF-1R和VHCSF-1R；其中，所述VLCSF-1R包含序列如SEQ ID NO:11所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:12所示的CDR2和序列如SEQ ID NO:13所示的CDR3；所述VHCSF-1R包含序列如SEQ ID NO:14所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:15所示的CDR2和序列如SEQ ID NO:16所示的CDR3；
所述抗PD-L1抗体包含VLPD-L1和VHPD-L1，其中，所述VLPD-L1包含序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2和序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述VHPD-L1包含序列如SEQ ID NO:4所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:5所示的CDR2和序列如SEQ ID NO:6所示的CDR3。
上述应用中，所述抗CSF-1R抗体中，所述VLCSF-1R较佳地包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，且所述VHCSF-1R较佳地包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
上述应用中，所述抗PD-L1抗体中，所述VLPD-L1较佳地包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，且所述VHPD-L1较佳地包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在某一较佳实施方案中，所述抗CSF-1R抗体包含序列如SEQ ID NO:19所示的轻链，且包含序列如SEQ ID NO:20所示的重链。
在某一较佳实施方案中，所述抗PD-L1抗体包含序列如SEQ ID NO:9所示的轻链，且包含序列如SEQ ID NO:10所示的重链。
在本发明一具体实施方案中，所述抗CSF-1R抗体包含序列如SEQ ID NO:19所示的轻链，包含序列如SEQ ID NO:20所示的重链；且所述抗PD-L1抗体包含序列如SEQ ID NO:9所示的轻链，且包含序列如SEQ ID NO:10所示的重链。
所述抗CSF-1R抗体与抗PD-L1抗体的序列信息如下表1：
表1抗体信息
Figure BDA0003427662220000061
上述应用中，所述肿瘤较佳地为CSF-1R和/或PD-L1相关肿瘤，例如结直肠癌。
上述应用中，所述药物中优选所述抗CSF-1R抗体与所述抗PD-L1抗体的质量比为(4-30):1，优选(4-20):1，进一步优选(10-20):1。
本发明第二方面提供一种药物组合物，其包含抗CSF-1R抗体与抗PD-L1抗体，其中，所述抗CSF-1R抗体和所述抗PD-L1抗体如本发明第一方面中所定义。
上述药物组合物中，所述抗CSF-1R抗体与所述抗PD-L1抗体的质量比优选为(4-30):1，更优选(4-20):1，进一步更优选(10-20):1。
在某一较佳实施方案中，所述抗CSF-1R抗体与所述抗PD-L1抗体的质量比为20:1、15:1、25:1、或12:1。
本发明第三方面提供一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，所述药盒A包含如本发明第一方面所定义的抗PD-L1抗体、编码其的核酸、含所述核酸的重组表达载体、含所述核酸的转化体、或含所述重组表达载体的转化体；
所述药盒B包含如本发明第一方面所定义的抗PD-L1抗体、编码其的核酸、含所述核酸的重组表达载体、含所述核酸的转化体、或含所述重组表达载体的转化体；
所述套装药盒中，药盒A或药盒B中的所述转化体优选为CAR-T细胞。
所述套装药盒较佳地还包含药盒C，所述药盒C含有其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
本发明第四方面提供一种如本发明第二方面所述的药物组合物或如本发明第三方面所述的套装药盒在制备治疗和/或预防肿瘤的产品中应用。
上述应用中，所述肿瘤优选为CSF-1R和/或PD-L1相关肿瘤，例如结直肠癌。
本发明抗体A(抗CSF-1R抗体)能够特异性结合CSF-1R胞外区的Ig4-5结构域，阻断CSF-1/CSF-1R信号传导。本发明抗体A与人、食蟹猴CSF-1R具有交叉反应。本发明抗体B(抗PD-L1抗体)作用于PD-L1使PD-1/PD-L1结合被阻断后，可解除肿瘤微环境中的免疫抑制状态，促进T细胞增殖，并恢复T细胞的肿瘤杀伤功能，从而发挥抗肿瘤作用。此外，本发明抗体B的Fc端可与自然杀伤细胞、单核细胞表面的Fcγ受体结合，从而引发抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，共同发挥抗肿瘤作用。本发明抗体B与人、鼠、食蟹猴PD-L1具有交叉反应。在此基础上，探讨本发明抗体A与本发明抗体B联用在鼠结肠癌MC38-hCSF-1上的抗肿瘤疗效。
本发明提供了本发明抗体A与本发明抗体B联用在小鼠实体瘤中治疗癌症的效果。在本次研究中，本发明抗体A单药20mg/kg组和60mg/kg组抑瘤率相当，并未表现出明显差异。但与本发明抗体B联用后，与G5-本发明抗体A-20mg/kg+本发明抗体B-5mg/kg组相比，G6-本发明抗体A-60mg/kg本发明抗体B-5mg/kg+组抑瘤率更大，说明本发明抗体B放大了本发明抗体A的治疗效果。与单药组相比，联用组均能显著抑制肿瘤生长，增效明显。在本次实验中，G6-本发明抗体A-60mg/kg+本发明抗体B-5mg/kg组有两只小鼠肿瘤完全缓解，抑瘤效果显著。
本发明所述的抗CSF-1R抗体与所述PD-L1抗体联用可用于治疗的疾病有：晚期恶性实体瘤(包括肺癌、非小细胞肺癌、气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、乳腺癌、子宫癌症、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、胃癌、腱鞘巨细胞瘤、颈鳞状细胞癌、头颈癌、脑癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲状腺癌、恶性胸膜间皮瘤、肝癌、肝细胞瘤、肝胆癌、胃癌、胃肠道癌、肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、肾癌、透明细胞肾细胞癌、卵巢癌、子宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、软骨肉瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、鳞状细胞癌、尤因氏肉瘤、全身性轻链淀粉样变性和梅克尔细胞癌)以及自身免疫病。
本发明的积极进步效果在于：发明人意外发现，抗CSF-1R抗体与抗PD-L1抗体联用治疗肿瘤(特别是结直肠癌)效果优异(抑瘤率可达90％以上)，且无毒性。
附图说明
图1为本发明抗体A与本发明抗体B联用对MC38-hCSF-1荷瘤小鼠移植瘤的影响；vsG1列表示第25天时，各组相对于G1-PBS组的P值，其中：*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001；vs G2列表示第25天时，各组相对于G2-本发明抗体B-5mg/kg组的P值，其中：#表示P＜0.05；##表示P＜0.01；###表示P＜0.001。
图2为本发明抗体A与本发明抗体B联用对MC38-hCSF-1荷瘤小鼠移植瘤的影响；vsG1列表示D28时，各组相对于G1-PBS组的P值，其中：*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001；vs G4列表示D28时，各单药组相对于G4-本发明抗体A-60mg/kg+本发明抗体B-3mg/kg组的P值，其中：#表示P＜0.05；##表示P＜0.01；###表示P＜0.001。
具体实施方式
术语解释
在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含合适的药学上可接受的载体例如药用辅料，如本领域中已知的药用载体、药用赋形剂，包括缓冲剂。如本发明所用，“药学上可接受的载体”或“药用载体”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第五版，R.C.Rowe、P.J.Seskey和S.C.Owen，Pharmaceutical Press，London，Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准药用载体和/或赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。可以通过将具有所需纯度的本发明的抗体或其抗原结合片段与一种或多种任选的药用辅料(Remington’sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本发明所述的药物制剂或药物组合物，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应症所需的，优选具有不会不利地彼此影响的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供其它抗感染活性成分，例如其它抗体、抗感染活性剂、小分子药物或免疫调节剂等。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的抗体或其抗原结合片段的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
在本发明中，上述所列CDR的氨基酸序列均是按照Kabat定义规则所示出的。但是，本领域人员公知，在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR，例如基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人，Journal of Molecular Biology，273，927-948(1997))、基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人，U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes ofHealth(1987))、AbM(University of Bath)，Contact(University College London)、国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(万维网imgt.cines.fr/)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的North CDR定义。本领域技术人员应当理解的是，除非另有规定，否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”应理解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如本领域技术人员知晓，或参见文献(J.Biol.Chem，243，p3558(1968))中所述。
如本发明所用，“载体”表示构建体，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体、包囊化于脂质体中的DNA或RNA表达载体以及某些真核细胞，例如生产细胞。
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
测试例1：本发明抗体A(抗CSF-1R抗体)与本发明抗体B(抗PD-L1抗体)联用小鼠体内药效试验
通过hCSF-1/hCSF-1R双转基因C57小鼠皮下接种MC38-hCSF-1鼠结肠癌细胞(野生型MC38细胞购自上海南方模式生物科技股份有限公司，MC38-hCSF-1细胞经lipo稳转构建，lipo购自Invitrogen)，给予本发明抗体A和本发明抗体B，以及本发明抗体A与本发明抗体B联用，检测小鼠肿瘤体积大小的变化，评价受试抗体对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。
hCSF-1/hCSF-1R双转基因C57小鼠，65只，雌性，购自百奥赛图江苏基因工程有限公司，6周龄，小鼠体重16-19g，4只/笼饲养于SPF级环境，温度20-25℃，湿度40-60％，许可证号SCXK(苏)2016-0004。适应性饲养约21天左右。
将MC38-hCSF-1细胞(稳转表达hCSF-1的鼠结肠癌MC38细胞)5×105个/100μL/只接种于65只双转基因C57小鼠右肋部皮下，待成瘤后(平均肿瘤体积约66mm3)去除肿瘤体积过大和过小的小鼠，按肿瘤体积将小鼠随机分为6组，每组7只。并于分组当天开始给药，定义为D1，共4周。每周测3次瘤体积，称体重，记录数据。分组及给药情况见下表2。
表2测试例1给药情况
Figure BDA0003427662220000111
Figure BDA0003427662220000121
实验结束时将各组小鼠安乐处死。使用Excel统计软件：平均值以AVE计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT(每组动物数)计算；使用GraphPad Prism6.0软件作图，组间差异P值以Student's t test分析。
肿瘤体积(TV)计算公式为：TV＝0.5×长径×短径2。
抑瘤率TGItv(％)：用于评价药物抗肿瘤活性的作用，抑瘤率(％)＝[1-(TVt-TVinitial)/(CVt-CVinitial)]×100％，其中，TVt表示治疗组每次测量时的肿瘤体积；TVinitial表示分组给药时治疗组的肿瘤体积；CVt表示对照组每次测量时的肿瘤体积；CVinitial表示分组给药时对照组的肿瘤体积。
试验结果见图1。本次实验中，给药至D18，当天各实验组根据实验设计分别给予本发明抗体A和本发明抗体B，G2-本发明抗体B-5mg/kg组的#28号小鼠和G5-本发明抗体A-20mg/kg+本发明抗体B-5mg/kg组的#53号小鼠，在给药后出现死亡，考虑是本发明抗体B引起的超敏反应导致的死亡。在后续的实验中，未出现其它动物死亡现象。因此，在本次的实验数据处理中，#28号和#53号小鼠的原始数据未纳入统计。
与PBS组相比，各给药组均能降低肿瘤体积，抑制MC38-hCSF-1肿瘤生长。G2-本发明抗体B-5mg/kg组抑瘤率TGItv为46.36％，且相比G1-PBS组有显著统计学意义(**P<0.01)。G3-本发明抗体A-20mg/kg组和G4-本发明抗体A-60mg/kg组抑瘤效果相当，抑瘤率TGItv分别为37.52％(***P<0.001vs G1)和37.73％(**P<0.01vs G1)。G5-本发明抗体A-20mg/kg+本发明抗体B-5mg/kg组和G6-本发明抗体A-60mg/kg+本发明抗体B-5mg/kg组抑瘤率TGItv分别为59.02％(***P<0.001vs G1)和80.09％(***P<0.001vs G1)。
与G2-本发明抗体B-5mg/kg组相比，G5-本发明抗体A-20mg/kg+本发明抗体B-5mg/kg组(P＝0.4098vs G2)和G6-本发明抗体A-60mg/kg+本发明抗体B-5mg/kg组(*P<0.05vsG2)抑瘤率更大，说明抗体A与抗体B联用有增强药效的效果。
与G3-本发明抗体A-20mg/kg组相比，G5-本发明抗体A-20mg/kg+本发明抗体B-5mg/kg组抑瘤率更大，但无统计学差异(P＝0.071vs G3)。
与G4-本发明抗体A-60mg/kg组相比，G6-本发明抗体A-60mg/kg+本发明抗体B-5mg/kg组抑瘤率更大，且具有统计学差异(***P<0.001vs G4)。
测试例2本发明抗体A(抗CSF-1R抗体)与本发明抗体B(抗PD-L1抗体)联用小鼠体内药效试验
通过hCSF-1/hCSF-1R双转基因C57小鼠皮下接种MC38-hCSF-1鼠结肠癌细胞(野生型MC38细胞购自上海南方模式生物科技股份有限公司，MC38-hCSF-1细胞经lipo稳转构建，lipo购自Invitrogen)，给予本发明抗体A(抗CSF-1R抗体)和本发明抗体B(抗PD-L1抗体)，以及本发明抗体A与本发明抗体B联用，检测小鼠肿瘤体积大小的变化，评价受试抗体对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。
hCSF-1/hCSF-1R双转基因C57小鼠，20只，雌性，购自百奥赛图江苏基因工程有限公司，6周龄，小鼠体重16-19g，4只/笼饲养于SPF级环境，温度20-25℃，湿度40-60％，许可证号SCXK(苏)2016-0004。适应性饲养约14天左右。
本次实验所购双转基因小鼠共20只，其中1只被用于检疫，实际接种19只。接种细胞前将小鼠按体重随机分组，分成4组，PBS组为4只，其他每组5只。将MC38-hCSF-1细胞(稳转表达hCSF-1的鼠结肠癌MC38细胞)5×105个/100μL/只接种于双转基因C57小鼠右肋部皮下。在接种过程中，G2-本发明抗体A-60mg/kg组#2号小鼠接种时出现严重漏液现象，所以后续实验数据统计未纳入该只小鼠。接种当天定义为D1天，并于D1天开始给药。每周测3次瘤体积，称体重，记录数据。分组及给药情况见下表3。
表3测试例2给药情况
Figure BDA0003427662220000141
实验结束时将各组小鼠安乐处死。使用Excel统计软件：平均值以AVE计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT(每组动物数)计算；使用GraphPad Prism6.0软件作图，组间差异P值以Student's t test分析。
肿瘤体积(TV)计算公式为：TV＝0.5×长径×短径2。
抑瘤率TGItv(％)：用于评价药物抗肿瘤活性的作用，抑瘤率(％)＝[1-(TVt-TVinitial)/(CVt-CVinitial)]×100％，其中，TVt表示治疗组每次测量时的肿瘤体积；TVinitial表示分组给药时治疗组的肿瘤体积；CVt表示对照组每次测量时的肿瘤体积；CVinitial表示分组给药时对照组的肿瘤体积。
试验结果见附图2。本次实验给药至D28，D28实验结束，当天称重量瘤后将小鼠安乐死，并剥瘤称瘤重。
本实验中，与PBS组相比，各给药组均能降低肿瘤体积，抑制MC38-hCSF-1肿瘤生长。G2-本发明抗体A-60mg/kg组、G3-本发明抗体B-3mg/kg组、G4-本发明抗体A-60mg/kg+本发明抗体B-3mg/kg组抑瘤率TGItv分别为65.71％(*P<0.05vs G1)、66.80％(*P<0.05vsG1)、92.94％(**P<0.01vs G1)。
与单药组G2-本发明抗体A-60mg/kg组相比，联用组G4-本发明抗体A-60mg/kg+本发明抗体B-3mg/kg组能显著降低MC38-hCSF-1肿瘤体积(***P<0.001vs G2)。
与单药组G3-本发明抗体B-3mg/kg组相比，联用组G4-本发明抗体A-60mg/kg+本发明抗体B-3mg/kg组能显著降低MC38-hCSF-1肿瘤体积(*P<0.05vs G3)。
在此次给药过程中，各组小鼠体重呈正常增长趋势，一般观察未见明显异常，提示目前给药剂量动物耐受良好。
数据表明本发明抗体A与本发明抗体B联用有增强抗肿瘤药效的效果。
本次实验表明本发明抗体A与本发明抗体B联用能够改善肿瘤微环境增强抗肿瘤药效。联用组疗效优于单药组，且联用未见毒性增加，小鼠体重无明显变化，也未引起死亡，显示了两者联合使用对于肿瘤治疗的可行性。
综上所述，本发明涉及了抗CSF-1R抗体联合抗PD-L1抗体治疗疾病的方法和药物组合。在非临床鼠结肠癌MC38-hCSF-1模型中，本发明抗体A联合本发明抗体B表现出协同抗肿瘤效果，此结果预示着抗CSF-1R抗体与抗PD-L1抗体临床治疗癌症的潜力，有希望推广到临床使得更多病人临床获益。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。
SEQUENCE LISTING
<110> 宝船生物医药科技（上海）有限公司
<120> 抗CSF-1R抗体联合抗PD-L1抗体的应用
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Pro Ser Phe
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CSF-1R 重链
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Gly Tyr Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Gly Val Gly Gly Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445

Claims (10)

1.抗CSF-1R抗体联合抗PD-L1抗体在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述抗CSF-1R抗体包含VLCSF-1R和VHCSF-1R；其中，所述VLCSF-1R包含序列如SEQ ID NO:11所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:12所示的CDR2和序列如SEQ ID NO:13所示的CDR3；所述VHCSF-1R包含序列如SEQ ID NO:14所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:15所示的CDR2和序列如SEQ ID NO:16所示的CDR3；
所述抗PD-L1抗体包含VLPD-L1和VHPD-L1，其中，所述VLPD-L1包含序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2和序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3；所述VH PD-L1包含序列如SEQ ID NO:4所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:5所示的CDR2和序列如SEQ ID NO:6所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述VLCSF-1R包含如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，且所述VHCSF-1R包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列；较佳地，所述抗CSF-1R抗体包含序列如SEQ ID NO:19所示的轻链，且包含序列如SEQ ID NO:20所示的重链；
和/或，
所述VLPD-L1包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，且所述VHPD-L1包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；较佳地，所述抗PD-L1抗体包含序列如SEQ ID NO:9所示的轻链，且包含序列如SEQ ID NO:10所示的重链。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物中，所述抗CSF-1R抗体与所述抗PD-L1抗体的质量比为(4-30):1，优选(4-20):1，更优选(10-20):1。
4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为CSF-1R和/或PD-L1相关肿瘤，优选结直肠癌。
5.一种药物组合物，其包含抗CSF-1R抗体与抗PD-L1抗体，其特征在于，所述抗CSF-1R抗体和所述抗PD-L1抗体如权利要求1或2中所定义。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述抗CSF-1R抗体与所述抗PD-L1抗体的质量比为(4-20):1，优选(4-20):1，更优选(10-20):1。
7.一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，所述药盒A包含如权利要求1或2中所定义的抗PD-L1抗体、编码其的核酸或者含所述核酸的重组表达载体或转化体；
所述药盒B包含如权利要求1或2中所定义的抗PD-L1抗体、编码其的核酸或者含所述核酸的重组表达载体或转化体；
所述药盒A或药盒B中的所述转化体优选为CAR-T细胞。
8.如权利要求7所述的套装药盒，其特征在于，所述套装药盒还包含药盒C，所述药盒C含有其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
9.如权利要求5或6所述的药物组合物或如权利要求7或8所述的套装药盒在制备治疗和/或预防肿瘤的产品中应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为CSF-1R和/或PD-L1相关肿瘤，优选结直肠癌。
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