CN114214334A

CN114214334A - 来源于盐芥的基因EsH2A.3在调控植物耐盐性中的应用

Info

Publication number: CN114214334A
Application number: CN202210030212.9A
Authority: CN
Inventors: 陈翠霞; 张国斌; 于停; 侯新未; 王树楷; 王延翠; 徐萍萍
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2022-01-12
Filing date: 2022-01-12
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2042-01-12
Also published as: CN114214334B

Abstract

本发明公开了来源于盐芥的基因EsH2A.3在调控植物耐盐性中的应用，属于分子生物学技术领域。基因EsH2A.3的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示；其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从盐芥中分离得到一个组蛋白H2A基因EsH2A.3，并首次研究发现：基因EsH2A.3对于植物抵抗外界高盐胁迫中起到了重要的作用，是一个新的抗盐基因。植物一生都生活在各种各样的逆境条件中，可将基因EsH2A.3转化水稻、小麦、玉米等农作物，或者苹果、梨、杨树等木本植物，提高转基因植株的耐盐能力，进而提高其产量和品质，具有重大的经济效益和社会价值。

Description

来源于盐芥的基因EsH2A.3在调控植物耐盐性中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种来源于盐芥的基因EsH2A.3在调控植物耐盐性中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

盐胁迫在人类和农业出现以前就已经存在，是自然界中主要的非生物胁迫之一，尤其是灌溉等农业活动出现以后，使得土壤盐渍化的程度愈演愈烈。现今，世界上约20％的耕地和50％的灌溉用地正在受盐胁迫的影响。盐芥是分布在盐碱地中的一种盐生植物，耐盐性极强。它与模式植物拟南芥的亲缘关系非常近，对从盐芥中克隆的数百个EST(expressed sequence tag)序列的分析说明，盐芥的氨基酸序列与拟南芥的相似度为90％～95％。从全基因组测序的结果来看，盐芥93.7％的基因家族与拟南芥相似，因此有研究者提出把盐芥作为研究植物耐盐性的模式物种。

组蛋白是染色质结构的基本组成元件之一，组蛋白变体和组蛋白修饰是两类基本的染色质结构调控因子.在构成核小体的四种核心组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)当中，H2A拥有最多的变体类型并在染色质结构调控中发挥重要作用.例如Macro H2A与染色质的紧密度是相关，主要富集在异染色质区域；磷酸化的H2A.X是DNA双链突变的标志性参数，其磷酸化程度越高表明DNA损害越严重。在H2A变体中以H2A.Z在进化上最为保守，功能也最为重要。以往对H2A及其变体的研究主要集中在表观遗传所介导的植物生长发育调控等方面，对于他们在介导抗逆性等方面的研究则知之甚少。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供来源于盐芥的基因EsH2A.3在调控植物耐盐性中的应用。本发明从盐芥中分离到了一个组蛋白H2A基因EsH2A.3，通过在拟南芥中转基因的功能分析发现：基因EsH2A.3在抵抗外界高盐胁迫中起到了重要的作用，是一个新的抗盐基因。可将该基因转化小麦、玉米、水稻等一年生农作物，或苹果、梨等多年生木本植物，提高其抗盐胁迫的能力，进而提高其产量和品质，从而产生重要的经济和社会效益。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的第一方面，提供基因EsH2A.3在如下(1)或(2)中的应用；

(1)提高植物耐盐能力；

(2)提高盐胁迫条件下植物的生根情况；

所述基因EsH2A.3为如下i)或ii)或iii)所示的核酸分子：

i)核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

ii)与i)的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性且表达相同功能蛋白质的核酸分子；

iii)除i)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

作为优选的方案，基因EsH2A.3的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示；其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用计算机软件进行评价，例如可采用BLAST算法测定(Altschul et al.1990.Journal of MolecularBiology 215:403-410；Karlin and Altschul.1993.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 90:5873-5877)。

上述核酸分子中，所述90％或90％以上同一性可以为至少90％、91％、92％、95％、96％、98％或99％的同一性。

本发明的第二方面，提供基因EsH2A.3编码的蛋白在如下(1)-(4)任一项中的应用；

(1)提高植物耐盐能力；

(2)制备提高植物耐盐能力的产品；

(3)提高盐胁迫条件下植物的生根情况；

(4)制备提高盐胁迫条件下植物生根情况的产品；

所述蛋白为如下(A1)或(A2)任一所示的蛋白质：

(A1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(A2)在(A1)中所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

其中，(A1)和(A2)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述蛋白中，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。其中，为了使(A1)中的蛋白质便于纯化，可在(A1)的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上标签。所述标签可以为Poly-Arg(通常为6个RRRRR)，Poly-His(通常为6个HHHHHH)，FLAG(DYKDDDDK)，Strep-tagII(WSHPQFEK)或c-myc(EQKLISEEDL)。

本发明的第三方面，提供含有上述基因EsH2A.3的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在如下(1)或(2)中的应用；

(1)提高植物耐盐能力；

(2)提高盐胁迫条件下植物的生根情况。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。

本发明的第四方面，提供上述基因EsH2A.3、基因EsH2A.3编码的蛋白、含有基因EsH2A.3的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在培育耐盐能力提高的植物品种中的应用。

上述应用中，所述植物包括但不限于：拟南芥、小麦、玉米、水稻、苹果或梨。

本发明的第五方面，提供一种提高植物耐盐能力的方法，包括：使植物中基因EsH2A.3过表达的步骤。

上述方法中，使植物中基因EsH2A.3过表达可以通过外源转入基因EsH2A.3的方法；或者上调植物基因组中基因EsH2A.3的表达。

其中，外源转入基因EsH2A.3的方法可以为：将携带有基因EsH2A.3的植物表达载体通过使用Ti质粒、Ri质粒、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。

上调植物基因组中基因EsH2A.3的表达的方法可以包括：导入能够激活或提高基因EsH2A.3的转录水平或翻译水平或蛋白活性的DNA片段；或者控制特异小RNA分子的合成，上调基因EsH2A.3mRNA的积累。

所述的特异小RNA分子可以为：微小RNA分子(microRNA，miRNA)、干扰小RNA(smallinterfering RNA，siRNA)或人工miRNA(artificial microRNA，amiRNA)等。

本发明的第六方面，提供一种培育耐盐能力提高的植物品种的方法，包括以下步骤：

将基因EsH2A.3转入出发植株中，使基因EsH2A.3过表达，获得转基因植株；所述转基因植株的耐盐能力高于出发植株。

上述培育方法中，将基因EsH2A.3转入出发植株中的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法。

本发明的有益效果：

本发明从盐芥中分离得到一个组蛋白H2A基因EsH2A.3，并首次研究发现：基因EsH2A.3对于植物抵抗外界高盐胁迫中起到了重要的作用，是一个新的抗盐基因。植物一生都生活在各种各样的逆境条件中，可将基因EsH2A.3转化水稻、小麦、玉米等农作物(草本植物)，或者苹果、梨、杨树等木本植物，提高转基因植株的耐盐能力，进而提高其产量和品质，具有重大的经济效益和社会价值。

附图说明

图1：盐芥EsH2A.3蛋白的进化树分析。其中，EsH2A.3(盐芥XP_006413100.1)、CsH2A.3(亚麻荠XP_010433394.1)、CsH2A.3_like(亚麻荠XP_010438646.1)、ThH2A.3(醉碟花XP_010533516.1)、AlH2A.3(琴叶拟南芥XP_002867518.1)、CrH2A.3(荠菜XP_006284751.1)、ThH2A.3_like(醉碟花XP_010539268.1)、AtH2A.2(拟南芥NP_001190852.1)、PcH2A.10(柠檬紫苏KAH6786434.1)、CqH2A.3(藜麦XP_021725957.1)。

图2：盐芥EsH2A.3基因及其拟南芥中同源基因AtH2A.2在盐胁迫下的表达量。对盐芥和拟南芥在盐处理条件下的RNA-seq数据进行处理，得到基因表达的TPM值。

图3：野生型和过量表达盐芥EsH2A.3的转基因植物在盐胁迫处理下的生长情况；图中，A、野生型拟南芥和转基因拟南芥株系的半定量RT-PCR检测；B、C.5天大的野生型拟南芥幼苗在正常培养基上继续生长10天，主根生长表型及长度；D、E.5天大的野生型拟南芥幼苗在含100mM NaCl的培养基上继续生长10天，主根生长表型及长度。其中，WT：对照；OE-2：过量表达的转基因株系。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如前所述，目前对于H2A及其变体的研究主要集中在表观遗传所介导的植物生长发育调控等方面，对于他们在介导抗逆性等方面的研究相对较少：周瑛在“拟南芥组蛋白变体H2A.Z在ABA响应中的功能研究”中发现，H2A.Z部分敲除突变体植株对ABA更加敏感，也更耐受干旱、高盐胁迫。龙霏在“组蛋白变体H2A.Z和相关重塑因子在水稻逆境中的功能研究”中发现，OsH2A.Z为组成型表达基因，它的表达量受盐、干旱和胁迫激素的影响。

但上述有关抗逆性的研究主要集中在来源于拟南芥和水稻的H2A蛋白变体H2A.Z，而来源于不同植物的不同亚家族的H2A，其同源性和功能都可能会存在较大差异。目前还未见有来源于盐芥的H2A基因在调控耐盐性方面的报道。

本专利的发明人在遗传分析、分子克隆、基因组学和生物信息学等领域深耕多年，在对拟南芥和盐芥在盐胁迫处理下转录谱的研究过程中发现：许多已知的耐盐基因在盐芥中是组成型高表达，在拟南芥中则是低表达或者诱导表达的。由此认为利用这一表达模式作为标准，可以鉴定出未知的耐盐基因。

本发明利用转录组数据分析和反转录PCR(Polymerase chain reaction,PCR)技术获得了盐芥基因EsH2A.3，该基因的耐盐功能目前还未见有报道。基于该基因与拟南芥中同源基因在盐胁迫处理下表达量的差异，推测该基因可能与耐盐性相关。

基于拟南芥生长速度快、生活周期短、转化方法简便易操作、遗传转化效率高的特点。本发明以拟南芥作为目标植物，对基因EsH2A.3的功能进行了转基因验证。本发明对采用花序侵染法获得的T3代转基因拟南芥进行耐盐能力分析发现，转基因拟南芥中基因EsH2A.3的过量表达能显著提高其耐盐能力。

由此，本发明获得了一个盐芥中与抵御盐胁迫有关的组蛋白基因，根据注释将其命名为EsH2A.3。

该基因序列如下：

(a)序列特征

长度：728bp

类型：核酸

拓扑结构：线性

(b)分析类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：盐芥(Eutrema salsugineum)

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

说明：透明方框中的

表示起始密码子，而灰色方框内的

表示终止密码子。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：盐芥EsH2A.3基因的克隆

(一)利用Trizol法提取总RNA，具体方法如下：

(1)称取约0.1-0.2g盐芥叶片，液氮中研磨为粉末状，移入4℃预冷的1mL Trizol提取液中，漩涡震荡，室温下静置10min使其充分溶解；

(2)匀浆后，4℃，12000g，离心10min；

(3)吸取上清，加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡15sec，混匀，室温静置2-3min，沉淀蛋白质；

(4)4℃，12000g，离心15min；

(5)将上层无色水相转移到新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10min，4℃，12000g，离心10min；

(6)弃去上清，加入预冷的1mL 75％乙醇，震荡重悬，4℃，7500g，离心5min；

(7)75％乙醇漂洗2-3次，4℃，7500g，离心5min；

(8)无菌工作台上，开盖放置5-10min，RNA干燥，乙醇挥发干净后，用30-50μLDEPC处理过的水回溶RNA；

(9)测定RNA的浓度。用微量分光光度计NanoDrop 2000测定RNA的浓度、A260/A280和A260/A230的比值；

(10)-80℃冻存，或立即进行以下反转录实验。

(二)反转录cDNA第一链的合成

(1)在0.2ml的RNase free离心管中配置如下混合液(其中RNA为步骤一)提取获得的；如果用的是-80℃储藏RNA，必须让其在冰上缓慢融解)：

(2)用枪头轻轻混匀，将离心管置于PCR仪(65℃5分钟)进行变性、退火反应；

变性、退火反应条件：

(3)在上述离心管中继续配制下列反转录反应液。

(4)在PCR仪上进行反转录反应：

合成的反转录产物cDNA，用于进行后面的相关实验。

(三)cDNA全长序列的获得

根据NCBI查到的盐芥中H2A基因家族的保守氨基酸序列，设计带有酶切位点的特异引物(5P1和3P1)，以步骤二反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。

5P1：5’-GGATCCATGTCGGGTCGAGGAAAAAC-3’(SEQ ID NO.3)；划横线部分为BamHⅠ酶切位点；

3P1：5’-CCCGGGGTCTTCATCAGTGGGCTTAG-3’(SEQ ID NO.4)；划横线部分为XmaⅠ酶切位点。

PCR扩增体系(以下进行的双引物PCR反应均用此体系)

PCR反应程序：98℃预变性5分钟；循环参数为98℃变性10秒、58℃退火5秒、72℃延伸30秒，进行32个循环；72℃充分延伸10分钟。

PCR反应结束后，进行1.0％琼脂糖凝胶电泳以检测是否有适当大小的条带，并将PCR产物回收(回收根据TRAN公司“EasyPure Quick Gel Extraction Kit”操作)、载体连接(取4.5μl PCR回收产物与pMD19-T载体连接，操作步骤按pMD19-T Vector说明书进行)、转化(连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在含有氨苄青霉素的LB平板培养基上，37℃倒置培养12-20小时；挑取白色单菌落，在LB液体培养基中培养过夜)、碱裂解法提取pMD19-T-EsH2A.3的质粒DNA、酶切鉴定(BamH Ⅰ和Xma Ⅰ双酶切鉴定)、序列测定(将酶切鉴定正确对应的菌液取1ml放到1.5ml离心管中，密封，送到睿博兴科生物技术有限公司进行测序)。测序完成后，利用DANMAN软件进行核苷酸序列和氨基酸序列比对，得到基因EsH2A.3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。保存测序正确的单克隆pMD19-T-EsH2A.3的质粒DNA，-20℃保存，用于后续功能验证实验。

实施例2：盐芥EsH2A.3蛋白氨基酸序列分析及聚类分析

(1)EsH2A.3基因cDNA全长为728bp，其中包括396bp的开放阅读框(open readingframe,ORF)。利用VectorNTI软件进行序列分析，其编码131个氨基酸，预测分子量约为13.87kDa，等电点pI为10.05。利用InterProScan网站的数据库和分析软件，对EsH2A.3蛋白的功能结构域和保守域进行分析，结果发现：EsH2A.3蛋白包含IPR002119domain(注释为Histone_H2A)。

(2)NCBI数据库中搜索出EsH2A.3(盐芥XP_006413100.1)、CsH2A.3(亚麻荠XP_010433394.1)、CsH2A.3_like(亚麻荠XP_010438646.1)、ThH2A.3(醉碟花XP_010533516.1)、AlH2A.3(琴叶拟南芥XP_002867518.1)、CrH2A.3(荠菜XP_006284751.1)、ThH2A.3_like(醉碟花XP_010539268.1)、AtH2A.2(拟南芥NP_001190852.1)、PcH2A.10(柠檬紫苏KAH6786434.1)、CqH2A.3(藜麦XP_021725957.1)的氨基酸序列。

(3)利用MUSCLE软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)对上述序列进行氨基酸序列比对，进而利用MEGA软件(https://www.megasoftware.net/)对不同物种中H2A家族的蛋白通过最大似然法构建进化树，发现盐芥EsH2A.3与亚麻荠中CsH2A.3和CsH2A.3_like、荠菜中CrH2A.3、琴叶拟南芥中AlH2A.3以及拟南芥中AtH2A.2亲缘关系最近(图1)。

实施例3：盐芥EsH2A.3基因及其拟南芥中同源基因AtH2A.2在盐胁迫下的表达量

(1)此处所用到的数据从NCBI下载，检索号为SRP133460。实验过程为：对四周大小的拟南芥和盐芥苗进行100mM NaCl 3天的处理，处理后取材，抽提RNA；进行RNA的建库和测序。

(2)利用专门的RNA-seq数据分析软件Salmon将测序得到的Reads进行处理，得到每个基因的表达量(以TPM值表示，TPM全称为Transcripts Per Kilobase Million)。依据实施例2中的进化树分析结果，提取拟南芥中AtH2A.2和盐芥EsH2A.3的表达量。结果如图2所示。

实施例4：EsH2A.3基因过量表达载体的构建

为研究EsH2A.3基因的功能，将包含有EsH2A.3基因编码区在内的共393bp片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)正确插入表达载体pCAMBIA1300-3xFlag上。(表达载体pCAMBIA1300-3xFlag是将SEQ ID NO.6所示的3xFlag核苷酸序列连接进入pCAMBIA1300，连接位置是pCAMBIA1300的MCS部分(多克隆位点)，具体位置为载体的25-26个碱基处，构建得到载体pCAMBIA1300-3xFlag)。

(1)用BamHⅠ和XmaⅠ两个内切酶，同时双酶切实施例1步骤三中所得到的pMD19-T-EsH2A.3的质粒DNA与pCAMBIA1300-3xFlag质粒，回收EsH2A.3的片段和pCAMBIA1300-3xFlag载体片段，用T4连接酶将二者连接起来，进行转化和阳性克隆鉴定，具体步骤同实施例1步骤三。筛选出阳性克隆，从中选择正确的重组子pCAMBIA1300-EsH2A.3-3xFlag。

(2)用构建好的重组子pCAMBIA1300-EsH2A.3-3xFlag转化农杆菌GV3101感受态细胞。进行PCR鉴定，挑取阳性菌落进行菌液保存。构建正确的重组子pCAMBIA1300-EsH2A.3-3xFlag单克隆用于后面拟南芥的转化。

实施例5：转基因拟南芥的获得

(1)拟南芥为哥伦比亚生态型(Columiba)，移栽成活的拟南芥苗长至开花期时即可用花序侵染转化。

(2)挑取正确的农杆菌单克隆菌落接种于5mL YEP液体培养基(含50mg/l卡那霉素和利福平100mg/l)中，28℃、200rpm，振荡培养至OD₆₀₀为06-0.8(约48小时)；

(3)取其中lmL菌液加入20mL新鲜YEP液体培养基内，28℃、200rpm，振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8(约5小时)。

(4)将菌体倒入大离心管，室温，5000g离心5min。倒掉上清，收集菌体，用适量含5％蔗糖(w/v)及0.04％Silwet-L77(v/v)的侵染液重新悬浮，将菌液浓度至OD₆₀₀＝0.5-1.0，用于拟南芥花序侵染；

(5)选取处于开花期的野生型拟南芥，提前一天用1/3Hongland营养液浇透，并将已经开过的花和果荚去除，准备第二天侵染；

(6)将拟南芥花序浸入侵染液中15s左右，然后将花取离液面，同时将过多的的侵染液体用吸水纸吸掉；

(7)将侵染后的拟南芥在温室中避光暗培养24h，随后转移到长日照中正常生长，培养室正常管理，1周后可再侵染一次，收获种子进行转基因苗筛选。

实施例6：转基因拟南芥基因组DNA分子鉴定

CTAB法提取转基因拟南芥植株不同株系及野生型拟南芥植株基因组DNA，以此为模板，用EsH2A.3的上游引物5P1和3xFlag标签序列上的引物3flag-R进行PCR扩增，能够扩增得到清晰条带的为转基因植株。

3flg-R：5'-GTCATCATCGTCTTTGTAGTC-3'。(SEQ ID NO.7)

实施例7：转基因拟南芥抗盐能力分析

为了确定转基因植株的功能，我们对T3代转基因拟南芥株系进行抗盐能力分析。

(1)EsH2A.3基因在T3代转基因拟南芥不同株系的相对表达量。

通过抗生素(含50mg/L潮霉素)筛选后的拟南芥转化株系，根据实施例6中的方法进行基因组DNA分子鉴定，从获得的转基因拟南芥株系中随机挑选7个T2代株系，提取相应的RNA，并反转录为cDNA，方法同实施例1中的步骤二。在EsH2A.3基因的非保守区设计特异引物5P1和3P1和拟南芥的内参引物AtEF-F和AtEF-R。用拟南芥内参引物AtEF-F和AtEF-R调整cDNA模板，使各cDNA模板浓度一致，进行半定量RT-PCR检测。

AtEF-F:5'-GTATGGTTGTTACCTTTGCTCCCACAG-3'；(SEQ ID NO.8)

AtEF-R:5'-CATCATTTGGCACCCTTCTTCACTGC-3'。(SEQ ID NO.9)

反应程序为：98℃预变性5分钟；循环参数为98℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒，运行20-25个循环；72℃后延伸l0分钟。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上做电泳分析，用BIO-RAD Gel Doc XR凝胶成像仪检测条带亮度，以确定这些转基因株系中EsH2A.3基因的表达水平。

结果显示，EsH2A.3基因在不同株系中的表达量不同，其中OE-2表达量最高(图3A)，选取表达量较高的3个株系OE-1、OE-2、OE-7，单株收取种子，从而得到相应的T3代种子，进行后续转基因功能验证实验。

(2)T3代种子萌发5天的拟南芥经100mM NaCl处理后生长情况：

将T3代转基因拟南芥种子OE-2和野生型对照WT种子消毒，铺在灭菌后的

MS培养基上，置于4℃避光春化5天。将其取出放入22℃短日照培养箱中竖直培养5天，将长势一致的幼苗分别移植到

PNS培养基和添加100mM NaCl的

PNS培养基上，根部朝下竖直培养10天，观察表型差异并进行根长测定。

MS培养基配方：2.2g/L固体MS，1g/L MES，8g/L蔗糖，pH 5.7。

PNS培养基配方：1.25mM KNO₃，0.625mM KH₂PO₄，0.5mM MgSO₄，0.5mM Ca(NO₃)₂，0.025mM Fe-EDTA，0.25ml/L微量元素(母液浓度：70mM H₃BO₃，14mM MnCl₂，1mM ZnSO₄，0.2mM NaMoO₄，10mM NaCl，0.01mM CoCl₂，0.5mM CuSO₄)，pH 7.0。

结果显示：在正常的

PNS培养基上，转基因株系及野生型幼苗生长状况大体一致。在添加100mM NaCl的

PNS培养基上，转基因株系幼苗的根长均比野生型植株的长(图3B-E)。

以上结果说明：EsH2A.3基因转入拟南芥中，提高了转基因拟南芥植株的耐盐能力。

综上，本发明从盐芥中分离到了一个组蛋白H2A基因EsH2A.3，通过在拟南芥中转基因的功能分析可以看出：它在抵抗外界高盐胁迫中起到了重要的作用，是一个新的抗盐基因。可将该基因转化小麦、玉米、水稻等一年生农作物，或苹果、梨等多年生木本植物，提高其抗盐胁迫的能力，进而提高其产量和品质，从而产生重要的经济和社会效益。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 来源于盐芥的基因EsH2A.3在调控植物耐盐性中的应用

<130> 2022

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 728

<212> DNA

<213> 盐芥 (Eutrema salsugineum)

<400> 1

aatactcatt attatcattt cctcgaaaga atttctcaat tacgctttct ccataacttt 60

tttttttttt aatctctaga aaattttctt ggttgtagaa aaaatgtcgg gtcgaggaaa 120

aacgcttgga tctggtgcgg cgaagaagtc tacctctcgt agtagcaagg cggggcttca 180

gttccccgtg ggtcgtatcg ctcgattcct caaagccgga aaatacgccg aacgtgttgg 240

tgccggagct ccggtctatc tcgccgccgt tcttgaatac ttagctgccg aggtacttga 300

actcgctggg aacgcagcaa gagacaacaa gaagacccgt atagttcctc gtcacattca 360

gcttgctgtg aggaacgatg aggaactaag caaactactt ggagatgtga ccattgccaa 420

tggaggagtg atgcctaaca tccacaatca ccttctcccc aagaagactg gtccctctaa 480

gcccactgat gaagactagg agatctattt acaaagatag ataatttcgg aaaatggttg 540

atgtcagtga gtgatcaagc aatgattagt cgaaaatgct tagggatgtt gtcttttttt 600

tggttactct cttatttgtt tttctttcct ctgcagcaat ggaagctgag tggttgtatt 660

agttgtaagg atacattgtt tcactttgtg tgaatatatg aagaaaattc tcttcttttc 720

gtcagtaa 728

<210> 2

<211> 131

<212> PRT

<213> 盐芥 (Eutrema salsugineum)

<400> 2

Met Ser Gly Arg Gly Lys Thr Leu Gly Ser Gly Ala Ala Lys Lys Ser

1 5 10 15

Thr Ser Arg Ser Ser Lys Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Ile

20 25 30

Ala Arg Phe Leu Lys Ala Gly Lys Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly

35 40 45

Ala Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Ala Ala Glu Val

50 55 60

Leu Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile

65 70 75 80

Val Pro Arg His Ile Gln Leu Ala Val Arg Asn Asp Glu Glu Leu Ser

85 90 95

Lys Leu Leu Gly Asp Val Thr Ile Ala Asn Gly Gly Val Met Pro Asn

100 105 110

Ile His Asn His Leu Leu Pro Lys Lys Thr Gly Pro Ser Lys Pro Thr

115 120 125

Asp Glu Asp

130

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggatccatgt cgggtcgagg aaaaac 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccggggtct tcatcagtgg gcttag 26

<210> 5

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgtcgggtc gaggaaaaac gcttggatct ggtgcggcga agaagtctac ctctcgtagt 60

agcaaggcgg ggcttcagtt ccccgtgggt cgtatcgctc gattcctcaa agccggaaaa 120

tacgccgaac gtgttggtgc cggagctccg gtctatctcg ccgccgttct tgaatactta 180

gctgccgagg tacttgaact cgctgggaac gcagcaagag acaacaagaa gacccgtata 240

gttcctcgtc acattcagct tgctgtgagg aacgatgagg aactaagcaa actacttgga 300

gatgtgacca ttgccaatgg aggagtgatg cctaacatcc acaatcacct tctccccaag 360

aagactggtc cctctaagcc cactgatgaa gac 393

<210> 6

<211> 78

<212> DNA

<213> 3xFLAG标签

<400> 6

gattacaagg atgacgacga taagggagat tacaaggatg acgacgataa gatcgattac 60

aaggatgacg acgataag 78

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gtcatcatcg tctttgtagt c 21

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtatggttgt tacctttgct cccacag 27

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

catcatttgg cacccttctt cactgc 26

Claims

1.基因EsH2A.3在如下(1)或(2)中的应用；

(1)提高植物耐盐能力；

(2)提高盐胁迫条件下植物的生根情况；

所述基因EsH2A.3为如下i)或ii)或iii)所示的核酸分子：

i)核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

iii)除i)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子。

2.基因EsH2A.3编码的蛋白在如下(1)-(4)任一项中的应用；

(1)提高植物耐盐能力；

(2)制备提高植物耐盐能力的产品；

(3)提高盐胁迫条件下植物的生根情况；

(4)制备提高盐胁迫条件下植物生根情况的产品；

所述蛋白为如下(A1)或(A2)任一所示的蛋白质：

(A1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3.含有基因EsH2A.3的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在如下(1)或(2)中的应用；

(1)提高植物耐盐能力；

(2)提高盐胁迫条件下植物的生根情况；

所述基因EsH2A.3为如下i)或ii)或iii)所示的核酸分子：

i)核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

iii)除i)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子。

4.基因EsH2A.3、基因EsH2A.3编码的蛋白、含有基因EsH2A.3的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在培育耐盐能力提高的植物品种中的应用；

所述基因EsH2A.3为如下i)或ii)或iii)所示的核酸分子：

i)核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

iii)除i)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物包为拟南芥、小麦、玉米、水稻、苹果或梨。

6.一种提高植物耐盐能力的方法，其特征在于，包括：使植物中基因EsH2A.3过表达的步骤；

所述基因EsH2A.3为如下i)或ii)或iii)所示的核酸分子：

i)核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

iii)除i)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使植物中基因EsH2A.3过表达的方法包括：外源转入基因EsH2A.3；或者上调植物基因组中基因EsH2A.3的表达。

8.一种培育耐盐能力提高的植物品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将基因EsH2A.3转入出发植株中，使基因EsH2A.3过表达，获得转基因植株；所述转基因植株的耐盐能力高于出发植株；

所述基因EsH2A.3为如下i)或ii)或iii)所示的核酸分子：

i)核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

iii)除i)以外的编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将基因EsH2A.3转入出发植株中的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法。