CN114209679B - 3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇的合成方法及其应用 - Google Patents

3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇的合成方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了3，5‑二羟基‑4‑甲氧基苄醇的合成方法及其应用。3，5‑二羟基‑4‑甲氧基苄醇的合成方法，包括如下步骤：（1）室温下，向含有没食子酸甲酯的1,4‑二氧六环的溶液中加入碳酸铯搅拌置入冰浴中，滴加碘甲烷自然升温反应完全后除去碳酸铯，滤液减压浓缩纯化后，得到对位甲基化的没食子酸甲酯；（2）将对位甲基化的没食子酸甲酯溶解到无水乙醇中，加入七水合三氯化铈，室温反应完全后用冰浴降温，向体系中滴加丙酮淬灭反应，向体系中加入饱和氯化铵水溶液，浓缩纯化后，得到3，5‑二羟基‑4‑甲氧基苄醇。本发明提出新型的DHMBA的人工合成路径，可以高效规模化制备3，5‑二羟基‑4‑甲氧基苄醇。

Description

3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇的合成方法及其应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇的合成方法及其应用。
背景技术
活性氧（reactive oxygen species，ROS）是机体在氧化还原反应过程中产生的一类氧的单电子还原产物，包括超氧阴离子 (O2-)、过氧化氢 (H2O2)、羟基自由基 (OH•) 等。在正常生理条件下，ROS可以作为信号分子调控细胞周期、信号转导、肌肉收缩、免疫应答等多种作用。然而在氧化应激条件下，过量的ROS会导致蛋白、脂质和DNA的氧化损伤，而这些氧化损伤的积累进而导致多种病理过程，例如衰老、包括阿尔兹海默症在内的神经退行性疾病、癌症、心血管疾病、糖尿病等。
衰老被认为是神经退行性疾病的主要风险因素，衰老过程中累积的氧化损伤是神经系统恶化的主要原因。大脑神经元对于活性氧格外敏感，因为神经活动会消耗大量氧气，同时具有丰富的高氧化还原活性的金属（如铁和铜），导致产生过量的ROS。同时，大脑中还含有丰富的非饱和脂肪酸，及其容易受到氧化攻击。加之大脑中抗氧化因子相对不足，这些都导致氧化应激的ROS诱导神经退行性疾病的发生。临床研究显示，神经退行性疾病患者的大脑内ROS水平会显著升高，同时携带有神经退行性疾病基因突变的神经元对氧化应激更加敏感。
因此，发现并利用自然界天然的抗氧化剂（Natural antioxidants）是提高人类健康、延缓衰老、甚至治疗神经退行性疾病的一种重要手段。如植物来源的α-生育酚、L-抗坏血酸和类黄酮类物质都可以有效的预防由ROS氧化应激导致的相关疾病。除了植物来源的抗氧化剂，人们把目光越来越多的投向了海洋生物，其中蕴含了多种新型抗氧化剂。
长牡蛎（Crassostrea gigas）是在潮间带固着生活的海洋软体动物，由于对环境变化具有超强的适应能力，也被公认为抗胁迫的模式生物。最近，通过使用乙醇提取从长牡蛎中分离了一种新型的抗氧化剂，3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇（DHMBA），具有优异的抗氧化能力。
亟待开发新型的DHMBA的人工合成路径，可以高效规模化制备DHMBA分子。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇的合成方法及其应用，作为无细胞毒性和高水溶性的天然抗氧化剂，3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇（DHMBA）可以改善焦虑、抗衰老、提高记忆力、减缓老年痴呆的发生等多种作用，显示了在生命健康领域中巨大的应用前景。
本发明所采取的的技术方案是：
本发明提供3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇在制备抗衰老、抗老年痴呆、改善睡眠和缓解焦虑药物中的应用。
本发明还提供了一种抗衰老/抗老年痴呆/改善睡眠/缓解焦虑药物，包括3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇作为活性成分。
本发明提供的DHMBA分子可穿透血脑屏障，具有促进睡眠、改善焦虑、抗衰老和减缓老年痴呆等多种作用。同时，DHMBA分子具有极高的生物安全性和极低的细胞毒性，在生命健康领域中巨大的应用前景。
本发明还提供3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇的合成方法，包括以下步骤：
反应式如式（i）所示：
Figure 841870DEST_PATH_IMAGE001
（i）
（1）向含有没食子酸甲酯的1,4-二氧六环的溶液中加入碳酸铯搅拌均匀，将反应容器置入冰浴中，而后向反应容器中慢慢滴加碘甲烷，之后自然升温反应，反应完全后除去碳酸铯，所得滤液减压浓缩纯化后，得到对位甲基化的没食子酸甲酯；
（2）将步骤（1）所得对位甲基化的没食子酸甲酯溶解到无水乙醇中得到对位甲基化的没食子酸甲酯的乙醇溶液，之后向上述溶液中加入七水合三氯化铈反应，反应完全后将反应体系用冰浴降温，而后向体系中滴加5~10体积当量的丙酮淬灭反应，之后向体系中加入饱和氯化铵水溶液，经浓缩纯化后，得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇。
优选地，步骤（1）含有没食子酸甲酯的1,4-二氧六环的溶液中没食子酸甲酯的摩尔浓度为0.3~1.0 mol/L，没食子酸甲酯和碳酸铯的摩尔比为1:1~1:3，没食子酸甲酯和碘甲烷的摩尔比为1:0.9~1:1.1。
优选地，步骤（1）自然升温反应，反应完全后除去碳酸铯，所得滤液减压浓缩纯化后，得到对位甲基化的没食子酸甲酯的具体步骤为：自然升温反应9~11小时，TLC显示反应完全后，用硅藻土减压过滤除去碳酸铯，所得滤液减压浓缩，之后用硅胶柱纯化产物，再用洗脱剂淋洗得到对位甲基化的没食子酸甲酯。
进一步优选，所述的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，石油醚和乙酸乙酯的体积比为3:1~10:1。
优选地，步骤（2）对位甲基化的没食子酸甲酯的乙醇溶液的摩尔浓度为0.3~1.0mol/L，对位甲基化的没食子酸甲酯与七水合三氯化铈的摩尔比为95:1~105:1。
优选地，步骤（2）反应完全后将反应体系用冰浴降温，而后向体系中滴加丙酮淬灭反应，之后向体系中加入饱和氯化铵水溶液，经浓缩纯化后，得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇的具体步骤为：室温反应18~22 h，TLC显示原料反应完全后，将反应体系用冰浴降温，而后向体系中慢慢滴加丙酮淬灭反应，之后向体系中加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯萃取，合并有机相干燥浓缩，所得固体用硅胶柱纯化产物，再用洗脱剂淋洗得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇。
进一步优选，所述的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:1~3:1。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
1、本发明提供的DHMBA分子，具有高度的水溶性和稳定性；通过经口喂食，可以穿透血脑屏障，不仅具有改善睡眠、缓解焦虑、提高记忆力和减缓老年痴呆的作用，还具有促进老年小鼠毛发再生的作用，同时具有极高的生物安全性和极低的细胞毒性。
2、本发明提出新型的DHMBA的人工合成路径，可以高效规模化制备DHMBA分子。同时，作为无细胞毒性和高水溶性的天然抗氧化剂，DHMBA可以缓解焦虑、抗衰老、提高老年老鼠的记忆力、减缓老年痴呆的发生等多种作用，显示了在生命健康领域中巨大的应用前景。
附图说明
图1为实施例1得到 3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇核磁氢谱图；
图2为实施例1得到 3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇的定量标准曲线；
图3为实施例1得到 3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇在水中的稳定性测试；
图4为实施例1得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇在小鼠脑部的药代动力学测试图；
图5为实施例1得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇对小鼠睡眠的调节作用比较图；
图6为实施例1得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇促进衰老小鼠毛发再生的作用比较图；
图7为实施例1得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇改善衰老小鼠的运动行为比较图；
图8为实施例1得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇减缓阿尔茨海默病模型小鼠认知记忆能力下降的作用图；
图9 为实施例1得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇的细胞毒性图；
图10为实施例1得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇对血糖和体重的影响图；
图11为实施例1得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇对血清生化指标的影响图；
图12为实施例1得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇对血清生化指标的影响图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。除特别说明，本发明提出的试剂和设备均为市购。
实施例1
3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇的合成方法，包括以下步骤：
反应式如式（i）所示：
Figure 921821DEST_PATH_IMAGE002
（i）
步骤（1）所用的试剂具体如表1所示：
表1
Figure 275442DEST_PATH_IMAGE003
室温下，向没食子酸甲酯（3.68 g, 1.0equiv, 20 mmol）的50 mL1,4-二氧六环的溶液中加入碳酸铯（7.82 g, 1.2equiv, 24 mmol），室温搅拌15 min，将反应瓶置入冰浴中，而后向反应瓶中慢慢滴加碘甲烷（1.25 mL, 1.0equiv, 20 mmol），之后自然升温反应10小时，TLC显示反应完全，用硅藻土减压过滤除去碳酸铯。所得滤液减压浓缩，之后用硅胶柱纯化（淋洗梯度石油醚/乙酸乙酯(v/v) 10/1-3/1），得到对位甲基化的没食子酸甲酯纯品3.01 g（淡黄色油状透明液体，产率76%）。
步骤（2）所用的试剂具体如表2所示：
表2
Figure 870371DEST_PATH_IMAGE004
将步骤（1）所得的对位甲基化的没食子酸甲酯（3.96 g, 1.0equiv, 20 mmol）溶解到干燥的无水乙醇50 mL中，之后向上述溶液中加入七水合三氯化铈（74.5 mg,0.01equiv, 0.2 mmol），之后室温反应20 h，TLC显示原料反应完全，将反应体系用冰浴降温，而后向体系中慢慢滴加丙酮10 mL淬灭反应，之后向体系中慢慢加入饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯萃取，合并有机相干燥浓缩，所得固体用硅胶柱纯化（淋洗梯度石油醚/乙酸乙酯(v/v) 3/1-1/1），得到DHMBA纯品1.96 g（类白色固体，产率75%）。
如图1所示，利用NRM进行结构鉴定：1H-NMR(400M, DMSO) 8.91(2H, s), 6.25(2H, s), 4.95(1H, t, J=5.6Hz), 4.26(2H, d, J=5.2Hz), 3.64(3H, s).
对实施例1得到的3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇（DHMBA）做如下实验测试：
实验例1
DHMBA在水溶液的稳定性
DHMBA在水溶液中的稳定性通过质谱定量方法进行分析表征：
（1）利用DHMBA标准品（实施例1中合成），配置浓度梯度（0-5000 ppb）的DHMBA水溶液；
（2）分别取10 μL水溶液在质谱仪中进行测定，分别测定不同浓度的标准品溶液中DHMBA对应的峰面积；
（3）质谱MRM的定量标准曲线，X-轴为DHMBA浓度，y-轴为质谱峰面积，如图2所示，DHMBA的定量标准曲线具有很好的线性相关性，可用于后续定量。
（4）将DHMBA分子溶于去离子水中，配成同等浓度的标准溶液，室温下分别放置0、24、48、72小时；
（5）通过上述定量方法进行检测水溶液中剩余DHMBA的浓度。结果如图3所示，DHMBA在水溶液中的衰减较慢，放置72小时后无显著变化，表明DHMBA水溶液中具有良好的稳定性。
实验例2
DHMBA分子在小鼠脑部的药代动力学特征：能否穿透血脑屏障以及了解脑部的药代动力学特征，是评估药物在神经性疾病治疗效果的第一步。
（1）给14月龄自然衰老C57小鼠经饮水给药（n=9只），一次性喂食含有3 mM DHMBA溶液，自由饮用，分别喂食后10-360 min，进行脑部取样；
（2）匀浆脑组织样品，使用乙酸乙酯进行萃取，使用HPLC-C18反相柱（内径 250 ×4.6 mm; SHISEIDO, 东京, 日本；洗脱液乙腈/水（v:v =5:95）；温度30 °C；流速1.0 mL/min；检测波长UV 270 nm）进行分离，收取保留时间8-12 min的馏分，冷冻干燥，溶于去离子水；
（3）利用实验例1中的方法进行定量分析，具体为：
（a）利用DHMBA标准品（实施例1中合成），配置浓度梯度（0-5000 ppb）的DHMBA水溶液；
（b）取10 μL体积的水溶液在质谱仪中进行测定，分别测定不同浓度的标准品溶液中DHMBA对应的峰面积，质谱MRM的定量标准曲线，X-轴为DHMBA浓度，y-轴为质谱峰面积。
结果如图4显示，DHMBA经饮水给药方式为小鼠摄入后，可以在10-30 min内快速转运至脑部，并在30 min后形成浓度峰值，之后浓度以大约60 min为半衰期衰减下降。同时，实验结果确认饮水给药方式的有效性及DHMBA在小鼠体内良好的转运和分散性。
实验例3
DHMBA对小鼠睡眠的调节作用
（1）在药物处理前，利用慢性应激刺激构建C57应激焦虑模型，具体操作如下：将6-8月龄的C57小鼠分别放入 CD-1 小鼠笼中，接受CD-1 小鼠的攻击，时间为10 min，然后用透明带孔的隔板将其隔离，受测试的C57小鼠可通过视觉或嗅觉感受到来自 CD-1的威胁，放置24小时；第二天依次重复，维持10天；
（2）将C57应激焦虑小鼠分为两组，其中实验组为自由饮用3 mM浓度DHMBA水溶液饲喂的加药组（n=10只），对照组为自由饮用同等浓度的淀粉水溶液作为安慰剂的安慰剂组（n=10只）；分别喂养4周，期间以1周为间隔，分别测定小鼠的清醒时间和睡眠时间。
结果如图5显示，焦虑小鼠模型对照组清醒时间比例随着时间显著提升，DHMBA给药的小鼠清醒时间显著低于对照组的小鼠，而且随DHMBA饲喂时间的增加而显著扩大。表明DHMBA分子具有缓解小鼠焦虑行为、促进小鼠睡眠的作用。
实验例4
DHMBA促进衰老小鼠毛发再生的作用
（1）将14月龄自然衰老C57小鼠分为两组经饮水给药，其中实验组为自由饮用3 mM浓度DHMBA水溶液饲喂的加药组（n=9只），对照组为自由饮用同等浓度的淀粉水溶液作为安慰剂的安慰剂组（n=8只）；
（2）分别喂养4周，期间以1周为间隔，经过4.5个月的饲喂后，在18.5月龄时记录小鼠的表型变化。
结果如图6显示，实验组小鼠的毛发与对照组形成了显著差异。实验组的小鼠毛发普遍发黑浓密，对照组的小鼠出现了不同程度的秃斑，并且具有一定比例的灰白色毛发。表明DHMBA可以抗衰老作用和促进衰老小鼠毛发再生的作用。
实验例5
DHMBA改善衰老小鼠的运动行为
（1）将14月龄自然衰老C57小鼠分为两组经饮水给药，其中实验组为自由饮用3 mM浓度DHMBA水溶液饲喂的加药组（n=9只），对照组为自由饮用同等浓度的淀粉水溶液作为安慰剂的安慰剂组（n=8只）；
（2）分别喂养4周，期间以1周为间隔，经过4.5个月的饲喂后，在18.5月龄时对小鼠进行行为学检测，使用Y迷宫实验检测小鼠的运动探索能力；
（3）Y迷宫具体实验设置：由三个完全相同的臂组成，随机设为新异臂、起始臂和其他臂，各臂的夹角为120°，臂尺寸为30cm*8cm*15cm（长*宽*高），中央交汇处三边各有一个可移动的隔板，内外壁都是黑色。小鼠固定放在一个臂的末端，记录5 min内小鼠进入各个臂的顺序。其中，记录值包括实际Alternation数，最大Alternation数及二者的百分数、动物活动的总路程和总进臂次数。其中，Alternation指的是连续进入Y迷宫对应三个臂臂的先后次序，如（1，2，3或1，3，2）；最大Alternation为进臂次数的总和-2，然后计算自发性交替比例=实际alternation/最大alternation ×100%。利用Graphpad Prism 8软件统计数据，One-way ANOVA分析，p<0.05 具有显著性差异。在Y迷宫实验中，分别记录每只衰老小鼠的进臂次数，进臂次数较多的衰老小鼠可以认定为保有更高水平的运动探索能力。
结果如图7显示，DHMBA饲喂的衰老小鼠的进臂次数相对于对照组的衰老小鼠具有显著提高，表明DHMBA具有提高衰老小鼠运动探索能力的作用。
实验例6
DHMBA减缓阿尔茨海默病模型小鼠认知记忆能力下降的作用
（1）采用0.3 mM、1 mM、3 mM三种浓度梯度的DHMBA水溶液经饮水给药方式饲喂5月龄阿尔茨海默病模型小鼠（3×Tg-AD模型小鼠），同时分别采用同月龄的野生型（WT）小鼠和同月龄用同等浓度淀粉水溶液作为安慰剂的3×Tg-AD模型小鼠作为对照组，DHMBA水溶液或淀粉水溶液自由饮用；
（2）分别喂养4周，期间以1周为间隔，饲喂2个月后，对所有小鼠进行行为学检测，采用新物体识别实验作为判断小鼠认知能力的依据。
结果如图8显示，当给药浓度为3 mM时，3×Tg-AD模型小鼠有了显著性提高，和WT小鼠的认知能力无显著性差别。表明DHMBA具有减缓AD小鼠认知记忆能力下降的作用。
实验例7
CCK-8检测DHMBA分子细胞毒性
（1）采用浓度梯度法以细胞培养基（含有10% FBS的DMEM培养基）为溶剂，配置不同浓度DHMBA溶液。使用细胞培养基培养HT-22，N2A-sw 细胞，培养条件为5% CO2，37 ℃培养。
（2）经过培养后的HT-22，N2A-sw 细胞，以6×105/孔的细胞培养在24孔板上，使用CCK-8法检测这两种细胞的细胞活力。使用20 μL CCK-8 反应液孵育1 h，然后加入50 μL含有1% (w/v) 的十二烷基硫酸钠反应液，整个反应在黑暗中进行，最后在450 nm测量吸收峰（N=6）。
结果如图9所示，DHMBA分子具有极低的细胞毒性，在DHMBA浓度小于等于2mM时，细胞活性和对照组无显著差异。仅当DHMBA浓度达到4 mM，两种细胞系的活力才出现显著的下降。
实验例8
检测DHMBA的生物安全性
（1）将14月龄自然衰老C57小鼠分加为两组经饮水给药，其中实验组为自由饮用3mM浓度DHMBA水溶液饲喂的加药组（n=9只），对照组为自由饮用同等浓度的淀粉水溶液作为安慰剂的安慰剂组（n=8只）；
（2）分别喂养4周，期间以1周为间隔，饲喂9个月后，在23月龄时记录小鼠的体重、血糖和血清生化指标。
结果图10-12显示，经过3 mM浓度的DHMBA水溶液饲喂9个月的小鼠，其各项指标均与对照组小鼠无差异，证明DHMBA在长期饲喂的情况下动物毒性较低，生物安全性高。
因此，本发明通过实施例1表明可以稳定合成3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇（DHMBA），与天然新型牡蛎DHMBA分子无差异，并可以用于规模化制备。通过实验例1和实验例2的实验表明，DHMBA的水溶液具有稳定性，可以通过饮水给药方式摄入至实验动物体内、能较快的分散到全身并突破血脑屏障进入脑部。
通过实验例3-6的动物实验表明，DHMBA在模型小鼠中表现出了缓解焦虑、改善睡眠、促进毛发再生、减缓衰老和阿尔茨海默病导致的认知能力下降等功能。同时实验例7和实验例8表明，DHMBA毒性极低，即使高浓度长期摄入，仍在细胞和动物层面均表现出了良好的生物安全性，具备应用于人体的前景。
对比例1
Chem. Pharm. Bull. 54(12) 1662—1679 (2006)，通过文献中公开的方法，具体为用四氢铝锂做还原剂，在四氢呋喃溶剂中，55℃加热2小时，得到3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇。
此方法所用四氢铝锂更为活泼，淬灭时剧烈放热，十分危险。而且淬灭后生成大量固体的氢氧化铝很难后处理。
实施例2
合成步骤与实施例1相同，不同的是：
步骤（1）中含有没食子酸甲酯的1,4-二氧六环的溶液中没食子酸甲酯的摩尔浓度为0.3 mol/L，没食子酸甲酯和碳酸铯的摩尔比为1:1，没食子酸甲酯和碘甲烷的摩尔比为1:0.9；自然升温反应9小时。对位甲基化的没食子酸甲酯的产率为76%。
步骤（2）中对位甲基化的没食子酸甲酯的乙醇溶液的摩尔浓度为1.0 mol/L，对位甲基化的没食子酸甲酯与七水合三氯化铈的摩尔比为105:1；室温反应22 h。3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇的产率为74%。
实施例3
合成步骤与实施例1相同，不同的是：
步骤（1）中含有没食子酸甲酯的1,4-二氧六环的溶液中没食子酸甲酯的摩尔浓度为1.0 mol/L，没食子酸甲酯和碳酸铯的摩尔比为1:3，没食子酸甲酯和碘甲烷的摩尔比为1: 1.1；自然升温反应11小时。对位甲基化的没食子酸甲酯的产率为77%。
步骤（2）中对位甲基化的没食子酸甲酯的乙醇溶液的摩尔浓度为0.3 mol/L，对位甲基化的没食子酸甲酯与七水合三氯化铈的摩尔比为95:1；室温反应18 h。3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇的产率为76%。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1. 3，5-二羟基-4-甲氧基苄醇作为唯一活性成分在制备促进毛发再生药物中的应用。
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