CN114208857B - 虎皮兰粗提取物在制备用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用 - Google Patents

虎皮兰粗提取物在制备用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了虎皮兰粗提取物在制备用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用，所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的有效使用浓度为1.80‑18.00mg/mL。本发明还公开了一种用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂、一种用于防治由霜霉菌引起的植物病害的方法以及一种从虎皮兰提取防治由霜霉菌引起的植物病害的活性物质的方法。本发明通过室内毒力测定，证明了虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌具有良好的抑制活性。虎皮兰粗提取物作为杀菌剂，具有低毒的优点。虎皮兰粗提取物作为一种可降解、无污染、对环境友好的植物提取物，病原菌不易产生抗药性，对非靶标生物及人畜安全，能够保证农产品的高品质，符合可持续发展的要求，其研究和市场应用前景广阔。

Description

虎皮兰粗提取物在制备用于防治由霜霉菌引起的植物病害的 杀菌剂中的应用
技术领域
本发明涉及杀菌活性化合物，具体涉及虎皮兰粗提取物在制备用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用。
背景技术
黄瓜霜霉病(Pseudoperonospora cubensis)是由古巴假霜霉侵染而引起的一种严重病害。黄瓜霜霉病流行性强，具备较快的传播速度以及较高的发生率，如果气候较为适宜，仅仅1～2周即导致黄瓜植株叶片全部枯萎死亡，使黄瓜结果受到直接影响。通常情况下，霜霉病可导致瓜减产30％～50％，如果病害较为严重其减产幅度会超过70％，甚至可能会导致绝产。因此，霜霉病是黄瓜生产栽培中危害严重的病害之一，发病影响巨大，损失严重。目前，生产上以化学药剂防治作为控制该病流行的主要方法。但由于导致黄瓜霜霉病的古巴假霜霉极易产生抗药性，加之不科学的大量单一使用化学药剂，导致防效不理想，并且对生态环境造成污染。
虎皮兰(Sansevieria trifasciata)，又名金边虎皮兰，典型的龙舌兰科虎尾兰属，是一种常绿多年生草本植物，在热带、亚热带均有分布，对环境的适应能力强。虎皮兰能净化室内环境的观叶植物。经研究发现，虎皮兰能够提高室内空气质量，被动吸收类似氮氧化合物及甲醛等有害气体，常作为一种室内环保型观叶植物深受大众喜爱。另外，药理作用方面，金边虎皮兰味甘微辛，性平，无毒，具有润肺、化痰止咳之功，可用于化痰定喘，治咳嗽吐血、治哮喘等。
近年来研究表明，虎皮兰中含有大量的蛋白质、钙、粗纤维、色素及各种人体所必需的营养元素，虎皮兰中的氨基酸种类齐全、含量丰富，所含多种人体必需的微量元素，维生素含量较高，重金属元素的含量低于我国食品重金属残留限量国家标准。
但是，目前国内外尚无虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病具有抑制作用的报道。
发明内容
本发明的目的旨在针对现有技术的不足，提供虎皮兰粗提取物在制备用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用。本发明通过毒力测定，证明了虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌具有良好的抑制活性，虎皮兰粗提取物作为杀菌剂，其低毒、可降解、无污染、对环境友好，适合于植物病害防治的要求。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了虎皮兰粗提取物在制备用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用。
如上所述的应用，所述虎皮兰粗提取物为虎皮兰的根、茎和/或叶片的提取物。优选的，所述虎皮兰粗提取物为虎皮兰的叶片的提取物。
如上所述的应用，所述虎皮兰粗提取物按照以下方法制备：加入一定量灭菌水研磨新鲜的虎皮兰叶片，过滤、离心，取上清液50～70℃烘干后定容，于4℃冰箱保存待用，所述研磨用灭菌水与虎皮兰叶片的体积质量比为(1-5)mL：10g。优选的，所述研磨用灭菌水与虎皮兰叶片的体积质量比为2mL：10g。优选取上清液60℃烘干后定容。
如上所述的应用，所述霜霉菌为黄瓜霜霉病菌。
如上所述的应用，所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的有效使用浓度为1.80-18.00mg/mL。所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的有效使用浓度低于1.80mg/mL时，对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放和游动的抑制不明显，同时对休止孢的萌发及其芽管伸长的抑制也不明显。在此浓度范围内，在虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的保护作用试验中，保护作用的相对防效随浓度增加而提高。
优选的，所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的有效使用浓度为10.08-18.00mg/mL。在此浓度范围内，在虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的病斑扩展和产孢量影响试验中，当所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的有效使度低于10.80g/mL时，对黄瓜叶片病斑扩展的抑制率和产孢抑制率分别低于67.01％，34.35％。
更优选的，所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的有效使用浓度为14.40-18.00mg/mL。在此浓度范围内，虎皮兰粗提取物有效抑制黄瓜霜霉病菌的产孢量，当浓度大于14.40mg/mL时，处理组与吡唑醚菌酯对照组差异显著；在对黄瓜霜霉病的治疗作用试验中，当所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的有效使用浓度低于14.40mg/mL时对黄瓜叶片的相对防效低于53.01％。
最优选的，所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的有效使用浓度为18.00mg/mL，在此浓度下，对黄瓜霜霉病的病斑扩展的抑制率和产孢抑制率分别78.35％和66.77％，校正防效达为32.37％；在此浓度下，对霜霉病的保护作用效果最佳，相对防治效果达到88.00％；在此浓度下，对霜霉病的治疗作用效果最佳，相对防治效果达到54.22％；在此浓度下，盆栽保护作用相对防效达68.38％；在此浓度下，虎皮兰粗提取物处理组与对照组的病情指数差异显著，盆栽相对防效也显著高于吡唑醚菌酯处理组；在此浓度下，盆栽治疗作用相对防效为21.33％。
因此，所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的预防有效使用浓度最优选为18.00mg/mL。所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的治疗有效使用浓度最优选为18.00mg/mL。
基于同一个发明构思，本发明提供了一种用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂，含有虎皮兰粗提取物。
基于同一个发明构思，本发明提供了一种用于防治由霜霉菌引起的植物病害的方法，使用含虎皮兰粗提取物的杀菌剂。
基于同一个发明构思，本发明提供了一种从虎皮兰提取防治由霜霉菌引起的植物病害的活性物质的方法，该方法包括以下步骤：加入一定量灭菌水研磨新鲜的虎皮兰叶片，过滤、离心，取上清液50～70℃烘干后定容即得虎皮兰粗提取物，于4℃冰箱保存待用，所述研磨用灭菌水与虎皮兰叶片的体积质量比为(1-5)mL：10g。优选的，所述研磨用灭菌水与虎皮兰叶片的体积质量比为2mL：10g。优选取上清液60℃烘干后定容。
本发明的有益效果是：
1、本发明绿色环保：本发明中虎皮兰粗提取物作为一种可降解、无污染、对环境友好的植物提取物，病原菌不易产生抗药性，对非靶标生物及人畜安全，能够保证农产品的高品质，符合可持续发展的要求，其研究和市场应用前景广阔。
2、本发明防治效果显著：试验结果显示，虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放有明显的抑制作用，当浓度为7.20mg/mL时，游动孢子释放抑制率为100％，而浓度为3.60mg/mL时释放抑制率也达89.97％；虎皮兰粗提取物对黄瓜箱霉病菌休止孢萌发及芽管伸长均有明显的抑制作用；虎皮兰粗提取物能够抑制已发病黄瓜叶片的病斑扩展，浓度为1.80-18.00mg/mL时显著优于对照，效果显著；虎皮兰粗提取物同样有效抑制黄瓜霜霉病菌的产孢量，单位病斑面积产孢量随药剂浓度的升高而降低，14.40-18.00mg/mL时显著优于对照，效果显著，其中药剂浓度为18.00mg/mL时，校正防效为32.37％；虎皮兰粗提取物对离体黄瓜叶片霜霉病的防治效果较好，其中药剂浓度为18.00mg/mL时，相对防效达到88.00％，此时保护效果最佳；虎皮兰粗提取物对离体黄瓜叶片霜霉病也有治疗效果，其中药剂浓度为18.00mg/mL时，相对防效达54.22％。虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病具有较好的防治作用，当药剂浓度达18.00mg/mL时盆栽保护作用相对防效达68.38％。粗提取物处理与对照组的病情指数差异显著且18.00mg/mL时的盆栽相对防效显著高于吡唑醚菌酯处理。当药剂浓度达18.00mg/mL时盆栽治疗作用相对防效为21.33％。
综上，本发明通过室内毒力测定，证明了虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌具有良好的抑制活性。虎皮兰粗提取物作为杀菌剂，具有低毒的优点，适合于植物病害防治的要求。
3、本发明中虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的持效期长：虎皮兰粗提取物浓度为18.00mg/mL时，喷施3d和7d后的相对防效分别为86.46％、83.08％，喷施14d后的相对防效仍在65％以上，7.20mg/mL处理在14d后的相对防效也能在50％以上。因此，虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病有3-14d的持效期。
附图说明
图1为不同浓度虎皮兰粗提取物处理对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放的影响(A:7.20mg/mL虎皮兰粗提取物；B:1.80mg/mL虎皮兰粗提取物；C:无菌水对照)；
图2为不同浓度虎皮兰粗提取物处理对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响(A:7.20mg/mL虎皮兰粗提取物；B:1.80mg/mL虎皮兰粗提取物；C:无菌水对照)；
图3为虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的保护作用(离体叶片)；
图4为虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的保护作用(室内盆栽)(A:无菌水对照；B:3.60mg/mL虎皮兰粗提取物；C:10.80mg/mL虎皮兰粗提取物；D:18.00mg/mL虎皮兰粗提取物；E:0.167mg/mL吡唑醚菌酯)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
实验材料：本实施例中的虎皮兰为金边虎皮兰，由青岛农业大学真菌学室提供。虎皮兰粗提取物的制备方法具体包括以下步骤：用灭菌剪刀剪取3年生以上的虎皮兰叶片，自来水冲洗干净后，用70％酒精表面消毒15s后，无菌水冲洗三遍，剪成5mm左右的碎块，灭菌滤纸擦干称重10g新鲜的虎皮兰叶片碎块，加入2mL灭菌自来水研磨呈匀浆状态后加入10mL无菌自来水，单层滤纸过滤、离心，离心转速为3000r/min，离心时间为20min，之后将上清液转入直径9cm的培养皿中，60℃烘干称重，加10mL无菌自来水将干物质定容为36mg/mL的虎皮兰叶片粗提取物，于4℃冰箱保存待用。
实施例1虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及游动的影响1、试验方法：
本实施例采用凹玻片法测定虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及游动的影响。
本试验共计7个处理，分别为：36mg/mL的虎皮兰叶片粗提取物配制成7.20mg/mL、3.60mg/mL、1.80mg/mL、1.08mg/mL、0.36mg/mL的5个梯度浓度，以及浓度为0.167mg/mL的吡唑醚菌酯药剂对照和灭菌自来水的空白对照，将上述处理与2×105个/mL孢子囊悬浮液等体积混匀。各处理分别取20μL滴加在凹玻片上，将凹玻片放入铺有湿滤纸的培养皿中，放在4℃，RH>80％黑暗的冰箱中保湿培养1h，再在20℃培养箱中培养1h。待对照中80％以上的孢子囊释放出游动孢子，在显微镜下观察100个孢子囊的空囊率及游动的游动孢子频率(闫磊，2013)，并进行显微拍照。每处理设3个重复，试验重复2次。
游动孢子释放抑制率＝(对照组游动孢子释放率-处理组游动孢子释放率)/对照组游动孢子释放率
游动孢子游动抑制率＝(对照组游动孢子游动率-处理组游动孢子游动率)/对照组游动孢子游动率
2、虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及游动的影响结果：
表1虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及游动的影响
Figure BDA0003452423100000071
Figure BDA0003452423100000081
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
试验结果如表1所示，虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放有明显的抑制作用，其中浓度为7.20mg/mL时对游动孢子的释放抑制率为100％，3.60mg/mL时释放抑制率可达89.97％，而吡唑醚菌酯为66.66％。当浓度大于3.60mg/mL时对游动孢子的游动抑制率可达100％，1.80mg/mL时为94.63％，吡唑醚菌酯为88.48％。差异显著性分析表明，7.20、3.60mg/mL、1.80、1.08、0.36mg/mL与吡唑醚菌酯之间的游动孢子的释放率和游动率均差异显著，1.80、1.08、0.36mg/mL之间的游动孢子释放率差异也显著。由不同浓度虎皮兰粗提取物处理的游动孢子释放抑制率得回归曲线y＝2.3754x+4.8221(R2＝0.9208)，有效抑制中浓度EC50＝1.19mg/mL。游动孢子游动抑制率回归曲线y＝5.0094x+5.565(R2＝0.9668)，有效抑制中浓度EC50＝0.77mg/mL。
图1显示了不同浓度虎皮兰粗提取物处理对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放的影响(A:7.20mg/mL虎皮兰粗提取物；B:1.80mg/mL虎皮兰粗提取物；C:无菌水对照)，从图1中可以看出，处理A的虎皮兰粗提取物浓度高，影响孢子囊的原生质割裂和游动孢子的分化，没有游动孢子释放；处理B的虎皮兰粗提取物浓度较低，因此，图1-B中孢子囊中有的已经释放游动孢子；图1-C中没有虎皮兰粗提取物，因此孢子囊的原生质割裂和游动孢子的分化较完整，孢子囊中的游动孢子释放较快，游动孢子大都释放出去。
实施例2虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响
1、试验方法：
采用凹玻片法测定虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响。
用灭菌自来水制备浓度为2×105个/mL的孢子囊悬浮液。将孢子囊悬浮液20μL滴加到凹玻片上，放在13℃、RH＞80％黑暗的培养箱中保湿培养2h，待对照中80％以上的孢子囊释放，分别加入7.20mg/mL、3.60mg/mL、1.80mg/mL、1.08mg/mL、0.36mg/mL的粗提取物和浓度为0.167mg/mL的吡唑醚菌酯各20μL，以灭菌的自来水为对照。放入13℃、RH＞80％黑暗的培养箱中保湿培养4-5h，待大于80％的游动孢子形成休止孢，再继续培养4h后，待对照休止孢萌发率大于45％，进行拍照记录并测量芽管长度。
2、虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响结果：
表2虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响
Figure BDA0003452423100000091
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
试验结果如表2所示，虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发有明显的抑制作用，各处理浓度与对照间均差异显著，当粗提取物浓度为7.20mg/mL时，休止孢不萌发；当粗提取物浓度大于等于0.36mg/mL时对黄瓜霜霉病菌的芽管伸长有显著的抑制作用，7.20、3.60、1.80、1.08mg/mL的萌发抑制率均显著高于吡唑醚菌酯处理，7.20、3.60、1.80mg/mL的芽管长度抑制率均显著高于吡唑醚菌酯处理。由不同浓度虎皮兰粗提取物处理的休止孢萌发抑制率得回归曲线y＝3.3601x+5.5255(R2＝0.9492)，有效抑制中浓度EC50＝0.70mg/mL；由芽管伸长抑制率得回归曲线y＝1.3911x+4.5432(R2＝0.9223)，有效抑制中浓度EC50＝2.13mg/mL。
图2显示了不同浓度虎皮兰粗提取物处理对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响(A:7.20mg/mL虎皮兰粗提取物；B:1.80mg/mL虎皮兰粗提取物；C:无菌水对照)，从图2中可以看出，处理A的虎皮兰粗提取物浓度高，休止孢发生裂解；处理B的虎皮兰粗提取物浓度较低，但可使芽管弯曲变形；图2-C中没有虎皮兰粗提取物，芽管正常伸长。
实施例3虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌病斑扩展和产孢的影响
1、试验方法：
本试验采用离体叶片喷雾法测定虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌病斑扩展和产孢的影响。
用离体叶片代替叶盘，将大小一致的黄瓜叶片背面朝上置于垫有湿润滤纸的培养皿中，于叶片背面接种浓度为1×105个/mL的孢子囊悬浮液，每个叶片5个点，每个点滴10μL，在20℃全暗培养箱中保湿培养24h，转置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中培养4d，此时病斑产生但未产孢，调查初始病斑面积。再用小喷壶将浓度为18.00mg/mL、14.40mg/mL、10.80mg/mL、7.20mg/mL、3.60mg/mL、1.80mg/mL的粗提取物及浓度为0.167mg/mL的吡唑醚菌酯均匀喷施到叶片表面至流失，空白对照喷无菌水，培养3～6d至产孢，调查最终病斑面积。根据不同浓度药剂处理的初始值与最终值计算病斑面积的扩展抑制率；单位病斑面积产孢量调查采用1mL无菌水将各处理叶片上产生的霉层洗下制成孢子囊悬浮液，摇匀后取10μL在10×10倍显微镜下检查孢子囊数量，并换算每毫升孢子囊悬浮液中所含的孢子囊数量，进而计算单位体积单位病斑面积的产孢量，根据处理及对照叶片的产孢量比较计算不同浓度药剂处理的产孢抑制率。
病斑扩展量＝病斑最终面积平均值-病斑初始面积平均值
病斑扩展抑制率＝[(对照的平均病斑扩展量-处理的平均病斑扩展量)/对照的平均病斑扩展量]×100％
病情指数＝[∑(各级代表值×各级病斑数)/(调查总病斑数×最高级代表值)]×100
校正防效＝[1-(处理组药后病情指数×CK药前病情指数)/(处理组药前病情指数×CK药后病情指数)]×100％
单位病斑面积产孢量抑制率＝[(对照的单位病斑面积产孢量-处理的单位病斑面积产孢量)/对照的单位病斑面积产孢量]×100％
2、虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病菌病斑扩展和产孢的影响结果：
表3虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病病斑扩展及产孢的影响
Figure BDA0003452423100000111
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
试验结果如表3所示，虎皮兰粗提取物能够抑制已发病黄瓜叶片的病斑扩展，差异显著性分析表明，18.00、14.40、10.80mg/mL与空白对照间差异均显著，18.00、14.40mg/mL的病斑扩展抑制率也显著高于吡唑醚菌酯。由不同浓度处理的平均扩展量抑制率得回归曲线y＝2.9661x+2.1569(R2＝0.9642)，有效抑制中浓度EC50＝9.09mg/mL；但是各处理校正防效均未达到50％。
虎皮兰粗提取物同样有效抑制黄瓜霜霉病菌的产孢量，单位病斑面积产孢量随药剂浓度的升高而降低，当浓度大于等于14.40mg/mL时，处理与空白对照间差异显著，且单位产孢量显著低于吡唑醚菌酯，根据不同浓度虎皮兰粗提取物处理的单位病斑面积产孢量抑制率得回归曲线y＝3.1512x+1.4739(R2＝0.971)，有效抑制中浓度EC50＝13.15mg/mL。
实施例4虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的保护作用(离体叶片)
1、试验方法：
本试验采用离体叶片喷雾法测定虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的保护作用。
选取大小一致的黄瓜叶片，用自来水冲洗后吸干水分，背面朝上置于垫有湿滤纸的培养皿中，待用。用灭菌自来水制备浓度为1×105个/mL的孢子囊悬浮液。用小喷壶将浓度为18.00mg/mL、14.40mg/mL、10.80mg/mL、7.20mg/mL、3.60mg/mL、1.80mg/mL的粗提取物及浓度为0.167mg/mL的吡唑醚菌酯均匀喷施到叶片表面至流失，空白对照喷无菌水，待药液稍干燥后接种病原菌。采用离体叶片定点接种法接种，每个叶片5个点，每个点10μL孢子囊悬浮液。在20℃全暗培养箱中保湿培养24h，转置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中培养7d后测量病斑大小，根据病斑大小计算病情指数和防治效果。离体叶片接种分级标准(傅淑云，1984)如下所示：
Figure BDA0003452423100000121
Figure BDA0003452423100000131
病情指数＝[∑(各级代表值×各级病斑数)/(调查总病斑数×最高级代表值)]×100
相对防效＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％
2、虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的保护作用结果：
表4虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的保护作用
Figure BDA0003452423100000132
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
试验结果如图3和表4所示，虎皮兰粗提取物对离体黄瓜叶片霜霉病的防治效果较好。其中粗提取物浓度为18.00mg/mL时，相对防效高达88.00％。差异显著性分析表明，各处理与空白对照间病情指数均差异显著，18.00、14.40、10.80mg/mL的相对防效显著高于吡唑醚菌酯处理。根据不同浓度虎皮兰粗提取物处理对离体黄瓜叶片霜霉病的抑制率得回归曲线y＝1.6785x+4.0475(R2＝0.9756)，有效抑制中浓度EC50＝3.69mg/mL。
实施例5虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的治疗作用(离体叶片)
1、试验方法：
本试验采用离体叶片喷雾法测定虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的治疗作用。
选取大小一致的黄瓜叶片，用自来水冲洗后吸干水分，背面朝上置于垫有湿滤纸的培养皿中，待用。用灭菌自来水制备浓度为1×105个/mL的孢子囊悬浮液。虎皮兰粗提取物浓度分别为18.00mg/mL、14.40mg/mL、10.80mg/mL、7.20mg/mL、3.60mg/mL、1.80mg/mL，吡唑醚菌酯浓度为0.167mg/mL。在叶片背面先接种病原菌，采用离体叶片定点接种法接种，每个叶片5个点，每个点滴10μL。在20℃全暗培养箱中培养24h后，分别将不同浓度药剂均匀喷施至叶片背面，对照均匀喷施无菌水，置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中培养培养7d后调查病情，防效调查方法同实施例4保护作用。
2、虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的治疗作用(离体叶片)结果：
表5虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的治疗作用(离体叶片)
Figure BDA0003452423100000141
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
试验结果如表5所示，虎皮兰粗提取物对离体黄瓜叶片霜霉病有一定防效，各处理与对照间均差异显著，相对防效最高达54.22％，18.00、14.40mg/mL的相对防效显著高于吡唑醚菌酯处理。根据不同浓度虎皮兰粗提取物处理对离体黄瓜叶片霜霉病的抑制率得回归曲线y＝1.177x+3.6307(R2＝0.9829)，有效抑制中浓度EC50＝14.57mg/mL。
实施例6虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的铲除作用(离体叶片)
1、试验方法：
本试验采用离体叶片喷雾法测定虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的铲除作用。
将大小一致的黄瓜叶片背面朝上置于垫有湿润滤纸的培养皿中，于叶片背面接种浓度为1×105个/mL的孢子囊悬浮液，每个叶片5个点，每个点滴10μL，在20℃全暗培养箱中保湿培养24h，转置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中培养4d，此时病斑产生但未产孢，调查初始病斑面积。再用小喷壶将浓度为18.00mg/mL、14.40mg/mL、10.80mg/mL、7.20mg/mL、3.60mg/mL、1.80mg/mL的粗提取物及浓度为0.167mg/mL的吡唑醚菌酯均匀喷施到叶片表面至流失，空白对照喷无菌水，培养3～6d至产孢，调查最终病斑面积。根据不同浓度药剂处理的初始值与最终值计算病斑面积的扩展抑制率；产孢量调查采用200μL无菌水将各处理叶片上产生的霉层洗下制成孢子囊悬浮液，摇匀后取10μL在10×10倍显微镜下检查孢子囊数量，根据处理及对照叶片的产孢量比较计算不同浓度药剂处理的产孢抑制率。将各处理及对照叶片上的霉层用无菌水洗脱，制成1×104个/mL的孢子囊悬浮液，分别接种未经药剂处理的健康离体叶片，培养7～10d后，调查再侵染率和产孢率。
再侵染率＝(发病叶片数/接种叶片数)×100％
产孢率＝(产孢叶片数/接种叶片数)×100％
2、虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的铲除作用(离体叶片)结果：
表6虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的铲除作用(离体叶片)
Figure BDA0003452423100000161
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
试验结果如表6所示，黄瓜霜霉病菌经粗提取物处理后，其孢子囊悬浮液接种未用药剂处理的叶片，仍具有再侵染能力，在各个处理浓度下，虎皮兰粗提取物均能不同程度抑制黄瓜霜霉病菌的病斑扩展，其中18.00mg/mL的抑制率达到了79.84％，1.80mg/mL的抑制率仍为31.45％。差异显著性分析表明，18.00mg/mL粗提取物处理与1.80mg/mL粗提取物处理之间的病斑扩展抑制率差异显著，其余4个处理之间的病斑扩展抑制率差异不显著，同时4个处理与最高质量浓度或最低质量浓度之间的病斑扩展抑制率也无显著差异，说明18.00mg/mL质量浓度处理对黄瓜霜霉病菌的病斑扩展的抑制效果明显。
虎皮兰粗提取物能有效抑制黄瓜霜霉病菌孢子囊的产生，其中18.00mg/mL的抑制率达到了83.04％，1.80mg/mL的抑制率为12.24％。且差异显著性分析表明，18.00、14.40mg/mL与3.60、1.80mg/mL粗提取物浓度之间的产孢抑制率差异显著，且18.00mg/mL的产孢抑制率显著高于吡唑醚菌酯处理的产孢抑制率。
实施例7虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的保护作用(室内盆栽)
1、试验方法：
用灭菌自来水制备浓度为1×104个/mL的孢子囊悬浮液，用于喷雾接种。将供试粗提取物用无菌水稀释为18.00mg/mL、10.80mg/mL和3.60mg/mL。以沙子与营养土质量比1：1作为育苗基质，将黄瓜种子播种于育苗盘，幼苗长到约有2-3片真叶时移栽到5×5×7cm的花盆中，待幼苗长至4-5片真叶时进行盆栽试验。将各浓度虎皮兰粗提取物与浓度为0.167mg/mL的吡唑醚菌酯均匀喷施至叶片背面，每盆用量2mL，以灭菌自来水为对照，待药液稍干燥后再均匀喷施孢子囊悬浮液于叶片背面，每盆用量2mL。每个处理3个重复，试验重复2次。各处理在接种病原菌后，在20℃全暗培养箱中保湿培养24h，转置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中培养，7d后调查各处理的发病情况，计算病情指数和相对防效。
2、虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的保护作用(室内盆栽)结果：
根据NY/T1156.7-2006《农药室内生物测定试验准则杀菌剂》第7部分：防治黄瓜霜霉病试验盆栽法的分级标准：0级:无病；1级:病斑面积占整片叶面积的5％以下；3级:病斑面积占整片叶面积的6％～10％；5级:病斑面积占整片叶面积的11％～25％；7级:病爽面积占整片叶面积的26％～50％；9级:病斑面积占整片叶面积的50％以上。
病情指数＝[∑(各级代表值×各级病斑数)/(调查总病斑数×最高级代表值)]×100
相对防效＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100％
表7虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的保护作用(室内盆栽)
Figure BDA0003452423100000181
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
试验结果如图4和表7所示，虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病具有较好的防治作用。请参见表7，当药剂浓度达18.00mg/mL时相对防效达68.38％。差异显著性分析表明，粗提取物处理与对照组的病情指数差异显著且18.00mg/mL时的相对防效显著高于吡唑醚菌酯处理。
实施例8虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的治疗作用(室内盆栽)
1、试验方法：
用灭菌自来水制备浓度为1×104个/mL的孢子囊悬浮液，用于喷雾接种。将供试粗提取物用无菌水稀释为18.00mg/mL、10.80mg/mL和3.60mg/mL。沙子与营养土质量比1：1作为育苗基质，将黄瓜种子播种于育苗盘，幼苗长到约有2-3片真叶时移栽到5×5×7cm的花盆中，待幼苗长至4-5片真叶时进行盆栽试验。在叶片背面先接种病原菌，采用喷雾法，喷施孢子囊悬浮液于叶片背面，每盆用量2mL。在20℃全暗培养箱中培养24h后，分别将各浓度虎皮兰粗提取物与浓度为0.167mg/mL的吡唑醚菌酯均匀喷施至叶片背面，对照均匀喷施无菌水，每盆用量2mL。每个处理3个重复，试验重复2次。各处理在喷施药剂后，置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中培养，7d后调查各处理的发病情况，计算病情指数和相对防效。防效调查方法同实施例7室内盆栽保护作用。
2、虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的治疗作用(室内盆栽)结果：
试验结果如表8所示，当药剂浓度达18.00mg/mL时相对防效为21.33％。差异显著性分析表明，粗提取物浓度为18.00mg/mL时与对照组的病情指数差异显著，虎皮兰粗提取物与吡唑醚菌酯处理的病情指数差异不显著，各药剂处理的相对防效差异也不显著。
表8虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的治疗作用(室内盆栽)
Figure BDA0003452423100000191
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
实施例9虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的持效期
1、试验方法：
本试验采用离体叶片喷雾法测定虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的持效期。
用灭菌自来水制备浓度为1×105个/mL的孢子囊悬浮液，用于接种，将大小一致的黄瓜叶片洗净后背面朝上置于垫有湿润滤纸的培养皿中，把浓度为18.00mg/mL、14.40mg/mL、10.80mg/mL、7.20mg/mL、3.60mg/mL、1.80mg/mL的粗提取物均匀喷施到叶片表面至流失，空白对照喷无菌水，置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中，在3d、7d、10d、14d后分别于叶片背面用离体叶片定点接种法接种孢子囊悬浮液，每个叶片5个点，每个点滴10μL，在20℃全暗培养箱中保湿培养24h，转置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中培养，7d后调查各处理的发病情况，计算病情指数和相对防效。防效调查方法同实施例4离体叶片保护作用。
2、虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的持效期结果
表9虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病的持效期
Figure BDA0003452423100000201
注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(Duncan氏新复极差法)
持效期试验结果如表9所示，虎皮兰粗提取物浓度为18.00mg/mL时，喷施3d和7d后的相对防效分别为86.46％、83.08％，喷施14d后的相对防效仍为68％以上，7.20mg/mL处理在14d后的相对防效也能在50％以上。因此，虎皮兰粗提取物对黄瓜霜霉病具有较长的持效期。差异显著性分析表明，在喷药3d、7d、10d、14d后，各浓度粗提物处理与空白对照的病情指数之间的差异均显著。在喷药3d、7d、10d、14d后，粗提取物浓度为18.00mg/mL与3.60mg/mL和1.80mg/mL之间的相对防效差异均显著，且除了1.80mg/mL之外，其余粗提取物浓度处理的相对防效均显著高于吡唑醚菌酯处理的相对防效。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.虎皮兰粗提取物在制备用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用，其特征在于，所述虎皮兰粗提取物按照以下方法制备：加入一定量灭菌水研磨新鲜的虎皮兰叶片，过滤、离心，取上清液50～70℃烘干后定容，于4℃冰箱保存待用；所述霜霉菌为黄瓜霜霉病菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的有效使用浓度为1.80-18.00mg/mL。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的预防有效使用浓度为18.00mg/mL。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述杀菌剂中虎皮兰粗提取物的治疗有效使用浓度为18.00mg/mL。
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