CN114200131A - 类夜明珠发光特性的检测系统及配套检测试纸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供类夜明珠发光特性的检测系统及配套检测试纸的制备方法，其中包括水溶性类夜明珠发光材料的制备：将200mg类夜明珠材料9,9'‑(2,5‑二溴‑1,4‑苯撑)双[9H咔唑]，40mg表面活性剂聚乙烯吡络烷酮(PVP)，20mg羧甲基纤维素(CMC)混合，并向其中加入水与四氢呋喃的共混体系12mL(水的体积分数为85％)，用细胞破碎机在70℃的水浴环境中对其超声120分钟(工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240w)。本发明可通过简便的操作，在短时间内合成大批量水溶性类夜明珠发光材料，且合成过程安全无毒，所得的水溶性纳米颗粒均一性好、分散性佳。

Description

类夜明珠发光特性的检测系统及配套检测试纸的制备方法

技术领域

本发明属于检测设备技术领域，尤其涉及类夜明珠发光特性的检测系统及配套检测试纸的制备方法。

背景技术

类夜明珠发光是一种延迟发光现象，现实生活中又将这种材料称为夜光粉或长余辉粉。其发光原理属于光致发光，即当材料受到光源激发时在激发态存储激发能，当激发光源关掉后，再将能量以光的形式缓慢释放出来。1996年Matsuzawa等人报道了将铕(Eu)、镝(Dy)等掺杂到铝酸锶(srA l ₂O₄)体系中，发现余辉可以达到10小时，发光效率和热稳定性、化学稳定性等方面都很好。在此之后这种稀土掺杂的铝酸盐长余辉材料就得到了商业界的广泛关注，在照明发光、信息加密防伪、安全应急指示、生物成像等领域得到了广泛运用。而免疫层析技术因其快速、简便、检测成本低等特点得到迅速发展，已经广泛应用于医学检测、食品质量监测、毒品检测和环境监测。将类夜明珠发光特性检测系统与免疫层析检测卡相结合，可实现对各类抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等高灵敏、高特异性的快速检测。

胶体金免疫层析技术是20世纪80年代发展起来的。由于其检测时间短、安全、简便、且不需任何仪器设备等优点，被广泛应用于医学检测、农产品农药兽药残留、进出口产品病原微生物检测等领域。胶体金是呈胶体状态的金颗粒。由于碱性溶液中的金颗粒表面带有负电荷，它们之间的静电斥力使其在溶液中形成稳定的胶体。当溶液中有较大的分子如蛋白质分子时，金颗粒表面的负电荷与蛋白质表面的正电荷结合，使金颗粒能够吸附到蛋白质分子上，并且不影响蛋白质的生物活性。胶体金溶液呈现一定的颜色，随着溶液浓度的升高，溶液的颜色也会由低浓度的桔红色变化为高浓度紫红色。也正是因为它具有化学性质稳定、可吸附和有颜色这3种性质，使它具备了作为检测标记物的特点。免疫层析技术在层析材料上发生的免疫反应，具备免疫反应的高特异性、高效率性、高亲和性的特点。具体过程含有待测物的样品溶液通过纤维层析材料的毛细作用沿着层析材料上移，与固定在层析材料上的针对待测物的受体(抗原或抗体)结合并发生特异性免疫反应。在该过程中，抗原抗体复合物不断被积累富集，通过如标记物胶体金使之显色，从而达到检测目标物质的目的。

荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。对于只具有单一抗原表位的小分子抗原(农兽药、违禁药物等)，待测小分子抗原与荧光标记抗体结合后，由于空间位阻作用难以再与检测线上的包被抗体结合。所以，具有单一抗原表位的小分子待测物多采用竞争免疫层析法检测。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供类夜明珠发光特性的检测系统及配套检测试纸的制备方法。

本发明采用如下技术方案：

水溶性类夜明珠发光材料的制备方法，包括如下步骤：

步骤1.将10份类夜明珠材料9,9'-(2,5-二溴-1,4-苯撑)双[9H咔唑]，2份表面活性剂聚乙烯吡络烷酮，1份羧甲基纤维素混合；

步骤2.并向步骤1中加入水与四氢呋喃的共混体系，水的体积分数为85％；

步骤3.用细胞破碎机在70℃的水浴环境中对其超声120分钟，工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240w；

步骤4.将所得的溶液反复离心清洗后重悬于适量的去离子水，再用细胞破碎仪超声细乳化30分钟，工作时间：2s；暂停时间：4s；超声功率40w。

类夜明珠发光特性试纸制备方法，包括如下步骤：

从上述制备(水溶性类夜明珠发光材料)的溶液中取3mg类夜明珠发光材料于离心管中；并加入适量MES溶液至总体积为1mL；用冷冻离心机离心，离心机工作时间8分钟，工作温度4℃，离心转速12000rmp；

步骤2.离心完成后倒去离心管中的上清液，并加入1mLMES，用超声波细胞粉碎机超声1分钟，工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240W；

步骤3.超声后向步骤2中加入1.5mgEDC、1.2mgNHS，然后将离心管放于转盘式混匀器上转动1h；转完1h后，用冷冻离心机离心，(工作时间8分钟，工作温度4℃，离心转速12000rmp)，离心后倒去上清液，然后加入1mL的PBS，用超声波细胞粉碎机超声1分钟，工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240W，然后取0.5mg待标记的蛋白质加入离心管中，放于转盘式混匀器上转动2h；

步骤4.转完后用冷冻离心机离心，(工作时间8分钟，工作温度4℃，离心转速12000rmp)；离心后倒去上清液，然后加入1mL的PBS，用超声波细胞粉碎机超声1分钟，工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240W，然后加入100uL的含10％BSA的PBS溶液，放于转盘式混匀器上转动1h；

步骤5.转完1h，用冷冻离心机离心，(工作时间8分钟，工作温度4℃，离心转速12000rmp)，离心后倒去上清液，然后加入1mL的含1％BSA的水溶液，用超声波细胞粉碎机超声1分钟，工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240W，完成标记溶液的制备；

步骤6.用三维划膜喷金仪将标记溶液在玻纤上进行喷金；喷金完成后，将玻纤放入电热鼓风干燥箱烘干，37℃过夜；

步骤7.将吸水纸、NC膜分别贴在底卡上，并用三维划膜喷金仪在NC膜上用抗体和二抗进行划线，划线完成后，将底卡放入干燥箱烘干，37℃过夜；将烘干的玻纤贴在底卡上，并用试纸数量拆切机将底卡切成试纸条。

类夜明珠发光特性检测系统，由上壳体、主控板、硅光电池、激发光源、触发开关、显示屏、底壳组成，上壳体安装在底壳上，显示屏安装在上壳体上，底壳上具有检测卡插口。主控板安装于底壳底部，硅光电池安装在主控板上部，激发光源安装在硅光电池的侧面，主控板通过触发开关与激发光源相连接、主控板与硅光电池相连接，触发开关安装在主控板的上侧，位于检测卡插口相对的另一侧，显示屏位于上壳体上。

当有检测卡插入触发开关即系统进入检测状态，主控板控制激发光源发光、获取硅光电池的信号，然后通过信号放大、AD转换、MCU处理，最后显示在显示屏上。所有的状态、结果通过显示屏进行显示。

类夜明珠发光特性检测卡，检测卡，由试纸条、上卡壳、下卡壳组成，上卡壳，与下卡壳具有侧激发光缺口，试纸条放置于下卡壳内。

本发明的有益效果：

用本发明的技术方案得到的带有羧基基团的水溶性类夜明珠发光材料可通过“一步法”实现大批量制备，且材料毒性低，灵敏度高，发光信号稳定性好，外界背景干扰小，即使载体或样品中荧光特性基质多，也能几乎排除其影响，抗荧光干扰能力强。得到的类夜明珠发光特性检测卡可实现对目标蛋白快速、灵敏和定量检测。用本发明得到的类夜明珠发光特性检测系统可解决传统免疫层析检测系统信号读数稳定性、重复性差的问题。

附图说明

图1为本发明的检测卡结构示意图；

图2为检测卡、硅光电池、激发光源空间位置图；

图3为夜明珠发光效应光强衰减图；

图4为检测系统结构示意图；

图5为本发明的主控板控制处理过程结构框图；

图6为检测卡检测浓度与信号值相关曲线图Ⅰ；

图7为检测卡检测浓度与信号值相关性曲线图Ⅱ；

图中，100-检测卡、1000-侧激发光缺口；

200-检测系统、2001-上壳体、2002-底壳、2003-激发光源、2004-硅光电池、2005-触发开关、2006-主控板、2007-检测卡插口、2008-显示屏。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1).水溶性类夜明珠发光材料大批量制备方法：将200mg类夜明珠材料9,9'-(2,5-二溴-1,4-苯撑)双[9H咔唑])，40mg表面活性剂聚乙烯吡络烷酮(PVP)，20mg羧甲基纤维素(CMC)混合，并向其中加入水与四氢呋喃的共混体系(水的体积分数为85％)，用细胞破碎机在70℃的水浴环境中对其超声120分钟(工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240w)，将所得的溶液反复离心清洗后重悬于适量的去离子水，再用细胞破碎仪超声细乳化30分钟(工作时间：2s；暂停时间：4s；超声功率40w)即可得到水溶性类夜明珠发光材料。

2).类夜明珠发光特性试纸条制备方法：从上述制备的溶液中取3mg类夜明珠发光材料于离心管中；并加入适量MES溶液至总体积为1mL；用冷冻离心机离心，离心机工作时间8分钟，工作温度4℃，离心转速12000rmp；离心完成后倒去离心管中的上清液，并加入1mLMES，用超声波细胞粉碎机超声1分钟(工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240W)；超声后向其中加入1.5mgEDC、1.2mgNHS，然后将离心管放于转盘式混匀器上转动1h；转完1h后，用冷冻离心机离心(工作时间8分钟，工作温度4℃，离心转速12000rmp)，离心后倒去上清液，然后加入1mL的PBS，用超声波细胞粉碎机超声1分钟(工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240W)，然后取0.5mg待标记的蛋白质加入离心管中，放于转盘式混匀器上转动2h；转完后用冷冻离心机离心(工作时间8分钟，工作温度4℃，离心转速12000rmp)；离心后倒去上清液，然后加入1mL的PBS，用超声波细胞粉碎机超声1分钟(工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240W)，然后加入100uL的含10％BSA的PBS溶液，放于转盘式混匀器上转动1h；转完1h，用冷冻离心机离心(工作时间8分钟，工作温度4℃，离心转速12000rmp)，离心后倒去上清液，然后加入1mL的含1％BSA的水溶液，用超声波细胞粉碎机超声1分钟(工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240W)，完成标记溶液的制备；

用三维划膜喷金仪将标记溶液在玻纤上进行喷金；喷金完成后，将玻纤放入电热鼓风干燥箱烘干(37℃过夜)；将吸水纸、NC膜分别贴在底卡上，并用三维划膜喷金仪在NC膜上用抗体和二抗进行划线，划线完成后，将贴有吸水纸和NC膜的底卡放入干燥箱烘干(37℃过夜)；将烘干的玻纤贴在底卡上，并用试纸数量拆切机将贴好的底卡切成试纸条，制得类夜明珠发光特性试纸条。

夜明珠发光特性是一种被激发后逐步衰减的发光特性。通过高灵敏的硅光电池可检测到这一过程。由于发光强度是由强转弱，检测需要完整的捕捉到此光强变换，为了提高灵敏度需要将硅光电池在结构上贴近发光区域。同时又因为贴近后365nm光源无法从侧面进行照射，配套检测卡也需开出对应缺口。激发光源照射关闭后，立即对检测卡发光过程进行捕捉，此时发光波长为610nm，通过放大电路，AD转换电流最终形成测量值，此测量值与被测物浓度正相关。

如图3所示，关闭365nm激发光源后，被激发的610nm发光呈现出一个逐步衰减的过程。通过硅光电池对被激发光源强度衰减的持续检测，此过程被AD转换后被完整的记录至MCU当中，MCU对该信号进行积分运算所获取的值与被测物浓度就是正相关，通过对不同浓度型号的采集，最终可形成如图6、图7所示的采集信号与浓度的对应图，通过线性拟合，即可得出转换公式。将此公式写入MCU中，后续获取检测的信号值代入公式，就可以得出对应浓度。

本发明的类夜明珠发光特性检测系统整体结构如图4所示，由上壳体2001、主控板2006、硅光电池2004、激发光源2003、触发开关2005、显示屏2008、底壳2002，上壳体2001安装在底壳2002上，显示屏2008安装在上壳体2001上，底壳2002上具有检测卡插口2007。主控板2006安装于底壳2002底部，硅光电池2004安装在主控板2006上部，激发光源2003安装在硅光电池2004的侧面，主控板2006通过触发开关2005与激发光源2003相连接、主控板2006与硅光电池2004相连接，触发开关2005安装在主控板2006的上侧，位于检测卡插口2007相对的另一侧，显示屏2008位于上壳体上2001。当有检测卡100插入触发开关2005即系统进入检测状态，主控板2006控制激发光源2003发光、获取硅光电池2004的信号，然后通过信号放大、AD转换、MCU处理，最后显示在显示屏2008上。所有的状态、结果通过显示屏2008进行显示。

如图1所示为类夜明珠发光特性检测卡，由试纸条、上卡壳、下卡壳组成，上卡壳与下卡壳卡接连接，下卡壳具有侧激发光缺口1000，前述制得类夜明珠发光特性试纸条放置于下卡壳内。

如图2所示，为在检测时，类夜明珠发光特性检测系统中去掉其他部件后，激发光源2003与硅光电池2004检测位置空间关系，从图中可以看出，激发光源2003位于侧激发光缺口1000侧面，硅光电池2004位于侧激发光缺口1000的上侧。

在空间结构上，激发光源2003与检测卡100的检测窗口呈90度关系，激发光源2003发光时，光线从检测卡100的侧面缺口照入。硅光电池2004的检测面与检测卡100的检测窗口呈水平关系，并且安装位置与发光点尽量靠近。被激发光可以最大化进入硅光电池2004的检测范围。

实验1

类夜明珠发光材料实验

实验时间：2021.06.03

实验仪器，夜明珠发光特性检测一

测试仪器预热169min

实验方案

通过预热对类夜明珠发光材料进行测值

实验数据：

实验数据：

如图6-7所示，实验结论：1.浓度线性较好，相关系数达到0.99。

通过365nm光源进行照射后，开始计算延时发光的数值，对该数值进行时段积分。由于是检测的延时发光值，系统当中就无需常规荧光仪器必备的365nm滤镜，去滤掉激发光源2003的干扰，直接进行检测即可。

由于是探测的延时发光，原本365nm光源照射血液时，血液当中的内源干扰光就不存在，因此能获得更高精度。

本发明通过365nm光源对检测卡100进行激发，照射30s后，关闭激发光源2003，然后开启硅光电池2004对被激发的610nm光源进行放大，放大的信号通过AD转换变为数字信号，系统在被激发光源2003发光期间进行持续信号采集，直至低于最低探测阈值为止。通过计算探测期间的积分值，可以反应出检测卡物质的含量，形成信号与浓度的对应关系。将此关系进行换算后，即可得出被测物的浓度。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.类夜明珠发光特性试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.制备得到水溶性类夜明珠发光材料；

步骤1.将200mg类夜明珠材料9,9'-(2,5-二溴-1,4-苯撑)双[9H咔唑]，40mg表面活性剂聚乙烯吡络烷酮，20mg羧甲基纤维素混合；

步骤2.并向步骤1中加入水与四氢呋喃的共混体系12mL，水的体积分数为85％；

步骤3.用细胞破碎机在70℃的水浴环境中对其超声120分钟，工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240w；

步骤4.将所得的溶液反复离心清洗后重悬于适量的去离子水，再用细胞破碎仪超声细乳化30分钟，工作时间：2s；暂停时间：4s；超声功率40w；

步骤S2.制备类夜明珠发光特性检测试纸；

步骤1.从S1中取3mg类夜明珠发光材料于离心管中；并加入适量MES溶液至总体积为1mL；用冷冻离心机离心，离心机工作时间8min，工作温度4℃，工作速率12000rmp；

步骤2.离心完成后倒去离心管中的上清液，并加入1mLMES溶液，用超声波细胞粉碎机超声1分钟，工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240W；

步骤3.超声后向步骤2中加入1.5mgEDC、1.2mgNHS，然后将离心管放于转盘式混匀器上转动1h；转完1h后，用冷冻离心机离心，工作时间8min，工作温度4℃，工作速率12000rmp，离心后倒去上清液，然后加入1mL的PBS，用超声波细胞粉碎机超声1分钟，工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240W，然后取0.5mg待标记的蛋白质加入离心管中，放于转盘式混匀器上转动2h；

步骤4.转完后用冷冻离心机离心，工作时间8min，工作温度4℃，工作速率12000rmp；离心后倒去上清液，然后加入1mL的PBS，用超声波细胞粉碎机超声1分钟，工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240W，然后加入100uL的含10％BSA的PBS溶液，放于转盘式混匀器上转动1h；

步骤5.转完1h，用冷冻离心机离心，工作时间8min，工作温度4℃，工作速率12000rmp，离心后倒去上清液，然后加入1mL的含1％BSA的水溶液，用超声波细胞粉碎机超声1分钟，工作时间：2s；暂停时间：2s；超声功率：240W，完成标记溶液的制备；

步骤6.用三维划膜喷金仪将标记溶液在玻纤上进行喷金；喷金完成后，将玻纤放入电热鼓风干燥箱烘干，37℃过夜；

步骤7.将吸水纸、NC膜分别贴在底卡上，并用三维划膜喷金仪在NC膜上用抗体和二抗进行划线，划线完成后，将底卡放入干燥箱烘干，37℃过夜；将烘干的玻纤贴在底卡上，并用试纸数量拆切机将底卡切成试纸条。

2.类夜明珠发光特性检测系统，其特征在于，由上壳体、主控板、硅光电池、激发光源、触发开关、显示屏、底壳组成，上壳体安装在底壳上，显示屏安装在上壳体上，底壳上具有检测卡插口，主控板安装于底壳底部，硅光电池安装在主控板上部，激发光源安装在硅光电池的侧面，主控板通过导线与激发光源相连接，主控板与硅光电池相连接，触发开关安装在主控板的上侧，位于检测卡插口相对的另一侧，显示屏位于上壳体上。

3.根据权利要求2所述的类夜明珠发光特性检测系统，其特征在于，当有检测卡从检测卡插口插入，触发触发开关时，系统进入检测状态，主控板控制激发光源发光、获取硅光电池的信号，通过信号放大、AD转换、MCU处理，在显示屏上显示。

4.根据权利要求2所述的类夜明珠发光特性检测系统，其特征在于，检测卡，由试纸条、上卡壳、下卡壳组成，上卡壳，与下卡壳具有侧激发光缺口，试纸条放置于下卡壳内。

Images