CN114196719A - 一种提高桑叶肽降血糖活性的工艺 - Google Patents

一种提高桑叶肽降血糖活性的工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高桑叶肽降血糖活性的工艺，经收割的新鲜桑叶清洗、绞碎后，加入水，加入碱性蛋白酶，提取，结束后灭酶得到桑叶肽提取物；经过板框过滤，得清液和滤渣；得到的清液经过超滤和纳滤膜进行分级，得到不同分子量区间组份；得到的不同分子量区间组份分别进行浓缩、滤芯进行除菌、喷雾干燥得到不同分子量区间组份的产品。本发明在桑叶肽提取过程中的分级纯化技术，分级出来的不同规格的桑叶肽产品，针对不同的降糖案例和场景。

Description

一种提高桑叶肽降血糖活性的工艺
技术领域
本发明属于医药和生化领域，具体为一种提高桑叶肽降血糖活性的工艺。
背景技术
桑叶，始载于《神农本草经》，具有降血糖、降血压、降血脂、抗衰老、抗肿瘤、消炎退肿等功效；富含黄酮、生物碱、桑叶多糖、γ-氨基丁酸等多种活性成分。桑叶作为药食同源的物质被收录于2015版《中国药典》中，其提取物通常被用于降血糖药物的开发。以桑叶或桑叶提取物为原料生产降血糖相关产品较多，但是瞄准桑叶肽为活性成分的产品品类很少。
专利“一种高活性桑叶低聚肽粉提取工艺(201911374156.5)”公开了一种高活性桑叶低聚肢粉提取工艺,在对蛋白质进行提取之前先通过定向酶解的方式解构蛋白质外包裹的纤维素,而后选用适当的蛋白酶和酶解条件对蛋白质进行酶解,使得到的肽段中84.14％均为分子量不高于1000的易于被人体吸收的低聚肽,而且提取过程中产品清除自由基的性能﹑活性成分总黄酮和r氨基丁酸的含量也得到了最大程度的保留。
发明内容
本发明提出了一种提高桑叶肽降血糖活性的工艺，在桑叶肽提取过程中的分级纯化技术，分级出来的不同规格的桑叶肽产品，针对不同的降糖案例和场景。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案为：
桑叶——打浆——提取——分离—分级-—浓缩——除菌——干燥——包装——成品。
一种提高桑叶肽降血糖活性的工艺，所述方法包括以下步骤：
步骤1、经收割的新鲜桑叶清洗、绞碎后，加入水，加入蛋白酶，提取，结束后灭酶得到桑叶肽提取物；
步骤2、将步骤1中的提取物经过板框过滤，得清液和滤渣；
步骤3、将步骤2中得到的清液经过超滤和纳滤膜进行分级，得到不同分子量区间组份；
步骤4、将步骤3中得到的不同分子量区间组份分别进行浓缩；
步骤5、将步骤4中得到的浓缩液经过滤芯进行除菌；
步骤6、将步骤5中得到的产品浓缩液喷雾干燥得到不同分子量区间组份的产品；完成提高桑叶肽降血糖活性的工艺。
优选地，所述步骤1中，加入3-6倍质量的水，于50-60℃，加入叶重1％-3％的蛋白酶，使用或者不使用超声波提取1-5h，超声功率为80-300w。
优选地，所述步骤1中，加入碱性蛋白酶酶解之前，控制pH在8-10的范围内采用脉冲光处理，脉冲光处理条件为：脉冲光强度为10^4-10^5uW/cm2，脉冲次数 1次/s，5-20s。
进一步优选地，所述步骤1中，调节pH可以使用氢氧化钠、氢氧化钙、氨水、盐酸、磷酸或硫酸。
优选地，所述步骤2中，得到的清液进行冷冻处理，解冻后再进行步骤3处理，冷冻温度为-18℃，冷冻3-6h。
优选地，所述步骤3中，通过超滤和纳滤膜进行分级得到的不同分子量区间组份分别为：小于500D，500-2000D，2000-5000D三个区间组份。
优选地，所述步骤5中，滤芯孔径为0.15-0.3微米。
优选地，所述步骤6中，喷雾干燥中，进风180±20℃、出风90±5℃。
优选地，所述提高桑叶肽降血糖活性的工艺得到的桑叶肽，所述工艺得到的不同分子量区间组份的桑叶肽产品：
小于500D的产品：DNJ含量5.5-7.5％，蛋白质含量50-65％，总糖含量25-35％，伽马氨基丁酸含量13000-22000ppm；
500-2000D的产品：DNJ含量1.1-1.9％，蛋白质含量41-47％，总糖含量23-29％，伽马氨基丁酸含量2000-2600ppm；
2000-5000D的产品：DNJ含量0.06-0.14％，蛋白质含量22-30％，总糖含量 45-55％，伽马氨基丁酸含量300-450ppm。
优选地，所述提高桑叶肽降血糖活性的工艺得到的桑叶肽，所述工艺得到的不同分子量区间组份的桑叶肽产品：
小于500D的产品用于空腹血糖大于12mmol/L的二型糖尿病患者的药物或保健品或食品的制备；
500-2000D的产品用于空腹血糖小于12mmol/L的二型糖尿病患者的药物或保健品或食品的制备；
2000-5000D的产品用于空腹血糖小于8mmol/L的轻微糖尿病患者的药物或保健品或食品或有控制体重人群需求的减肥产品的制备。
本发明具有以下有益效果：
本发明方法中，发明人对桑叶肽的提取并提高其降血糖活性进行了提取和分级研究，在无数次的试验和研究后，发现在碱性条件下高压之后，采用超声波技术预处理，产生了预料之外的效果，主要表现在：(1)控制pH在8-10的范围内，采用脉冲光处理，可以在大大提高桑叶肽中有效成分的溶出，利于酶解效率的提高，减少了酶制剂的使用量；(2)酶解过程中，采用80-300w的超声波辅助酶解过程，可以增加提取率，缩短提取时间；(3)虽然不十分明确机理，但是将初滤液冷冻之后，再解冻，可以进一步去除不溶性大分子杂质，可以明显地提高桑叶肽的活性，经检测，活性成分的含量是有所增加的，冷冻的参数为-18℃，冷冻3-6h；(4)将经冷冻去除杂质的提取液，进一步经过膜分级，得到的不同组分，在某些活性成分的分布上呈现意想不到的效果，活性也相应的提高和降低，使得桑叶肽可以用于不同的场景。所述的分级用膜为超滤和纳滤膜，孔径分别为500D，2000D，5000D。(5)料液比控制在1:15-1:25 之间比较合适，料液比太高会增加浓缩成本、降低生产效率。进一步的，为了获得更高的提取率和桑叶肽活性，
本发明在工艺过程中进行了膜分级，得到的3个不同规格的产品，相关活性成分的含量不同，降血糖效果也不同，适应于不同的场景。通过不同孔径的膜分离，500D， 2000D，5000D，得到小于500D，500-2000D，2000-5000D三个区间的产品。对比了成分(DNJ含量，蛋白质含量，总糖含量，伽马氨基丁酸含量)，降血糖效果。小于 500D的产品生物碱DNJ的含量较高，蛋白肽含量较高，桑叶多糖含量相对较低，降血糖活性较高，可以用于降血糖药物开发，以及针对空腹血糖较高(大于12mmol/L) 的二型糖尿病患者；500-2000D的产品生物碱DNJ和蛋白肽含量的含量适中，可以用于病情不太严重，空腹血糖小于12mmol/L的二型糖尿病患者；2000-5000D的产品生物碱DNJ含量较低，蛋白肽含量较高，可以用于轻微糖尿病患者(空腹血糖小于8)，以及有控制体重人群的需求，开发减肥产品。
具体实施方式:
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
体外降血糖和抗氧化活性(DPPH自由基清除)检测方法：
α-葡萄糖苷酶抑制活性试验：
取浓度为0.2U/mLα-葡萄糖苷酶溶液0.1mL加入2mL0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)，37℃水浴15min，加入样品溶液反应10min后再加入0.25mL25mmol/L 底物PNPG。水浴30min后，加入0.1mol/L2mLNa2CO3终止反应，于400nm处测定吸光度(A2)；以1mL缓冲液替代样品溶液，测其吸光度值为(A0)；以0.1mL 缓冲液替代酶液测定其吸光值为(A1)。重复测定3次，并以阿卡波糖为阳性对照。α-葡萄糖苷酶抑制率/％＝[1-(A2-A1)/A0]*100
用DPPH法对桑叶肽进行清除自由基活性的测定：
具体检测方法为：将1.5mL样品加入1.5mL 0.1mmol/L DPPH·(95％乙醇)中，混匀并在25℃保温30min。在517nm处测量吸光度。VC溶液用作对照。DPPH·清除能力w(％)计算如下：
Figure BDA0003370870120000041
其中A0是1.5mL蒸馏水和1.5mL含0.1mmol/L DPPH的95％乙醇的吸光度值， A1是含有0.1mmol/L DPPH·的1.5mL水解产物的吸光度值，A2是值1.5mL水解产物和1.5mL 95％乙醇的吸光度。
桑叶肽提取率计算：
桑叶肽提取率是指经过一系列提取、纯化、分级等工艺过程后得到的桑叶肽溶液经过干燥处理得到的产品即为桑叶肽，与桑叶原料之比即为桑叶肽提取率，计算如下：
W(％)＝m(桑叶肽)/m(桑叶)
实施例1
一种提高桑叶肽降血糖活性的工艺，所述方法包括以下步骤：
步骤1、经收割的新鲜桑叶清洗、绞碎后，加入水，加入碱性蛋白酶，提取，结束后灭酶得到桑叶肽提取物；
步骤2、将步骤1中的提取物经过板框过滤，得清液和滤渣；
步骤3、将步骤2中得到的上清液经过超滤和纳滤膜进行分级，得到不同分子量区间组份；
步骤4、将步骤3中得到的不同分子量区间组份分别进行浓缩，浓度为30％；
步骤5、将步骤4中得到的浓缩液经过滤芯进行除菌；
步骤6、将步骤5中得到的产品浓缩液喷雾干燥得到不同分子量区间组份的产品；
完成提高桑叶肽降血糖活性的工艺。
优选地，所述步骤1中，加入4倍质量的水，于55℃，加入叶重2％的碱性蛋白酶，使用超声波提取3h，超声功率为80w。
优选地，所述步骤3中，不同分子量区间组份分别为：小于500D，500-2000D， 2000-5000D三个区间组份。
优选地，所述步骤5中，滤芯孔径为0.22微米。
优选地，所述步骤6中，喷雾干燥中，进风180℃、出风90℃。
实施例2
一种提高桑叶肽降血糖活性的工艺，所述方法包括以下步骤：
步骤1、经收割的新鲜桑叶清洗、绞碎后，加入水，加入碱性蛋白酶，提取，结束后灭酶得到桑叶肽提取物；
步骤2、将步骤1中的提取物经过板框过滤，得清液和滤渣；
步骤3、将步骤2中得到的上清液经过超滤和纳滤膜进行分级，得到不同分子量区间组份；
步骤4、将步骤3中得到的不同分子量区间组份分别进行浓缩，浓度为30％；
步骤5、将步骤4中得到的浓缩液经过滤芯进行除菌；
步骤6、将步骤5中得到的产品浓缩液喷雾干燥得到不同分子量区间组份的产品；
完成提高桑叶肽降血糖活性的工艺。
优选地，所述步骤1中，加入5倍质量的水，于50℃，加入叶重3％的碱性蛋白酶，使用超声波提取1h，超声功率为300w。
优选地，所述步骤3中，不同分子量区间组份分别为：小于500D，500-2000D， 2000-5000D三个区间组份。
优选地，所述步骤5中，滤芯孔径为0.15微米。
优选地，所述步骤6中，喷雾干燥中，进风190℃、出风95℃。
实施例3
一种提高桑叶肽降血糖活性的工艺，所述方法包括以下步骤：
步骤1、经收割的新鲜桑叶清洗、绞碎后，加入水，加入碱性蛋白酶，提取，结束后灭酶得到桑叶肽提取物；
步骤2、将步骤1中的提取物经过板框过滤，得清液和滤渣；
步骤3、将步骤2中得到的上清液经过超滤和纳滤膜进行分级，得到不同分子量区间组份；
步骤4、将步骤3中得到的不同分子量区间组份分别进行浓缩，浓度为30％；
步骤5、将步骤4中得到的浓缩液经过滤芯进行除菌；
步骤6、将步骤5中得到的产品浓缩液喷雾干燥得到不同分子量区间组份的产品；
完成提高桑叶肽降血糖活性的工艺。
优选地，所述步骤1中，加入6倍质量的水，于60℃，加入叶重1.5％的碱性蛋白酶，使用超声波提取4h，超声功率为400w。
优选地，所述步骤3中，不同分子量区间组份分别为：小于500D，500-2000D， 2000-5000D三个区间组份。
优选地，所述步骤5中，滤芯孔径为0.25微米。
优选地，所述步骤6中，喷雾干燥中，进风170℃、出风85℃。
上述三个实施例得到的产品性能如下表1-3所示。
实施例4
在实施例3的基础上，所述步骤1中，加入6倍质量的水，于60℃，加入碱性蛋白酶酶解之前，控制pH在8采用脉冲光处理，脉冲光处理条件为(脉冲光强度为 10^4uW/cm2，脉冲次数1次/s，15s)。加入叶重1％的碱性蛋白酶，使用超声波提取 4h，超声功率为400w。
其他同实施例3。
实施例5
在实施例3的基础上，所述步骤2中，得到的清液进行冷冻处理，解冻后再进行步骤3处理，冷冻温度为-18℃，冷冻4h。其他同实施例3。
实施例6
在实施例3的基础上，所述步骤1中，加入碱性蛋白酶酶解之前，控制pH在8-10 的范围内采用脉冲光处理，脉冲光处理条件为(脉冲光强度为10^4uW/cm2，脉冲次数1次/s，15s)。其他同实施例3。
所述步骤2中，得到的清液进行冷冻处理，解冻后再进行步骤3处理，冷冻温度为-18℃，冷冻4h。其他同实施例3。
实施例7
在实施例3的基础上，所述步骤1中，不采用超声波提取4h。
表1实施例1分子量区间组份的产品的指标及体外降血糖和抗氧化活性
Figure BDA0003370870120000071
表2实施例2分子量区间组份的产品的指标及体外降血糖和抗氧化活性
Figure BDA0003370870120000072
表3实施例3分子量区间组份的产品的指标及体外降血糖和抗氧化活性
Figure BDA0003370870120000073
上述原液为步骤2得到的清液，由表1-3可知，采用超滤和纳滤膜分级处理后，不同分子量区间组份的产品的DNJ、蛋白质、总糖含量、伽马氨基丁酸含量的含量是不同的，同时α-葡萄糖苷酶抑制活性、DPPH·清除能力区别较大。小于500D的产品的伽马氨基丁酸含量、α-葡萄糖苷酶抑制活性、DPPH·清除能力要高于500-2000D 产品、2000-5000D产品，可以根据需要开括不同的产品应用场景。
表4是否采用脉冲光处理的产品的指标及体外降血糖和抗氧化活性
Figure BDA0003370870120000074
Figure BDA0003370870120000081
由表4可知，控制pH在8左右的范围内，实施例4相对于实施例3，伽马氨基丁酸含量有较大的提高，且实施例4产品的α-葡萄糖苷酶抑制活性、DPPH·清除能力的能力要远高于实施例3，实施例4采用较少的酶添加量(1％)还能实现较高的提取率(7.7％)，即采用脉冲光处理，可以在大大提高桑叶肽中有效成分的溶出，利于酶解效率的提高，减少了酶制剂的使用量。
表5是否选择冷冻除杂的产品的指标及体外降血糖和抗氧化活性
Figure BDA0003370870120000082
由表5可知，实施例5相对于实施例3，伽马氨基丁酸含量有较大的提高，且实施例5产品的α-葡萄糖苷酶抑制活性、DPPH·清除能力的能力要远高于实施例3，即将初滤液冷冻之后，再解冻，可以进一步去除不溶性大分子杂质，可以明显地提高桑叶肽原液的活性，可以提高后期分离各组分有效产品的总含量。
表6实施例6分子量区间组份的产品的指标及体外降血糖和抗氧化活性
Figure BDA0003370870120000083
由表6可知，实施例6相对于实施例3-5，实施例6产品的伽马氨基丁酸含量、α- 葡萄糖苷酶抑制活性、DPPH·清除能力的能力要远高于实施例3-5，即采用脉冲光结合初滤液冷冻之后再解冻，可以在大大提高桑叶肽中有效成分的溶出，去除不溶性大分子杂质，明显地提高桑叶肽原液的活性，提高后期分离各组分有效产品的总含量。
表7对比例1分子量区间组份的产品的指标及体外降血糖和抗氧化活性
Figure BDA0003370870120000091
由表7可知，对比例1相对于实施例3，不经过超声处理，对比例1的原液的伽马氨基丁酸含量、α-葡萄糖苷酶抑制活性、DPPH·清除能力的能力要远略低于实施例3，且提取率要远低于实施例3。即采用超声波辅助酶解过程，可以增加提取率，缩短提取时间。
采用实施例6得到的不同区间的组分进行动物实验
1方法：
1.2.1桑叶多肽对正常小鼠血糖的影响
健康雄性昆明小鼠禁食3－5小时，自由饮水，测空腹血糖，按空腹血糖水平将 50只小鼠随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组，桑叶多肽小于500D组，桑叶多肽500-2000D组，桑叶多肽2000-5000D组和保健品组。实验组给予不同的受试样品溶液，给药剂量分别为2.01g/kg，2.01g/kg，1.05g/kg，2.01g/kg，给药体积为0.2ml/10g，对照组给予相同体积的无菌蒸馏水，连续给药30天后，禁食16小时，测空腹血糖，比较两组动物空腹血糖值。
1.2.2桑叶多肽对四氧嘧啶诱导胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱大鼠模型血糖的影响
健康SD雄性大鼠105只，普通维持饲料适应饲养3－5天，禁食3－5小时，取尾血，测定给葡萄糖前(即0小时)血糖值，给2.5g/kg BW葡萄糖后0.5、2小时血糖值，作为该批次动物基础值。以0、0.5小时血糖水平分7组，分别为空白对照组、模型对照组，桑叶多肽小于500D高剂量组，桑叶多肽小于500D中剂量组，桑叶多肽小于500D低剂量组，桑叶多肽500-2000D组和桑叶多肽2000-5000D组，每组15 只。空白对照组不做处理，5个实验组灌胃给予不同浓度受试样品，给药剂量分别为 2.01g/kg、0.67g/kg、0.335g/kg、2.01g/kg和1.05g/kg，模型对照组给予同体积溶剂，连续33天。各组给予维持料饲养1周后模型对照组和3个剂量组更换高热能饲料，喂饲3周后，模型对照组和3个剂量禁食24小时(不禁水)，给予四氧嘧啶105mg/kg，腹腔注射，注射量1ml/100g体重。注射后继续给予高热能饲料喂饲3－5天。试验结束，各组动物禁食16小时，检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素及胆固醇、甘油三脂水平。
1.3数据处理及结果判定
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算 F值，F值<F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
1.3.1指标判定
1.3.1.1正常动物降糖试验
血糖指标：空腹血糖受试样品剂量组与对照组比较无统计学意义，判定对正常动物血糖无影响。
1.3.1.2高血糖模型降糖试验
空腹血糖指标：模型成立的前提下，受试样品剂量组与模型对照组比较，空腹血糖下降或血糖下降百分率升高有统计学意义，判定该受试样品空腹血糖指标结果阳性。
糖耐量指标：模型成立的前提下，受试样品剂量组与模型对照组比较，在给葡萄糖或医用淀粉后0.5、2小时任一时间点血糖下降(或血糖下降百分率升高)有统计学意义，或0、0.5、2小时血糖曲线下面积降低有统计学意义，判定该受试样品糖耐量指标结果阳性。
血脂指标：模型成立的前提下，受试样品剂量组与模型对照组比较，血清胆固醇或甘油三酯下降有统计学意义，可判定该受试样品降血脂指标阳性。
1.3.2结果判定
方案二：空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，且血脂(总胆固醇、甘油三酯)无明显升高，对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品有助于维持血糖健康水平功能动物实验结果阳性。
2结果
2.1正常小鼠空腹血糖
正常小鼠分组前体重及血糖值如表1，给药30天后，各给药组小鼠体重与对照组相比，无明显变化，桑叶多肽小于500D、桑叶多肽500-2000D、桑叶多肽2000-5000D 空腹血糖值较对照组有所下降，其中，桑叶多肽小于500D组血糖值降低有统计学意义。保健品组与对照组相比无明显变化。
该实验结果提示，桑叶多肽小于500D可降低正常动物血糖水平，桑叶多肽 500-2000D、桑叶多肽2000-5000D和保健品组对正常动物血糖水平无明显影响。结果如表2所示。
表1正常小鼠给药前空腹血糖
Figure BDA0003370870120000111
Figure BDA0003370870120000112
与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；
表2正常小鼠给药30天后空腹血糖
Figure BDA0003370870120000113
Figure BDA0003370870120000114
与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；
2.2大鼠空腹血糖、糖耐量及血脂指标
大鼠分组前血糖指标如表3所示，各组大鼠血糖指标无明显差异。
大鼠给药33天后，大鼠血糖、糖耐量及血脂水平如表4所示，从表中可以看出，正常对照组、模型对照组和各实验组0h血糖值均在3.2-6.3mmol/L之间，模型组较正常组血糖升高有显著性差异，各给药组与模型组相比，无明显变化；给葡萄糖0.5h 后，各组血糖均在10.0mmol/L以上，桑叶多肽小于500D的低、中、高三个剂量组的血糖值均低于模型对照组，但差异不显著；桑叶多肽500-2000D和桑叶多肽 2000-5000D组血糖值较模型对照组明显降低，且差异显著，有统计学意义。给葡萄糖2h后，各组大鼠血糖值较0.5h明显下降，且模型组血糖值仍大于10.0mmol/L，与正常对照组相比，曲线下面积显著升高，差异有统计学意义，说明糖代谢紊乱模型复制成功。各实验组2h血糖值明显低于模型对照组，且差异显著，均具有统计学意义。结果提示桑叶多肽小于500D高、中、低剂量组、桑叶多肽500-2000D、桑叶多肽2000-5000D都具有明显的降低血糖的作用。
给药33天后，模型组大鼠血清中CHO较正常组明显升高，具有统计学意义， TG模型组较正常组有所升高，但无统计学意义。各给药组与模型组相比，CHO、TG 指标均无明显变化(桑叶多肽2000-5000D组TG较模型组明显升高，是个别动物TG 异常升高所致整体均数和标准差升高，可考虑剔除)，结果提示，桑叶多肽小于500D、桑叶多肽500-2000D、桑叶多肽2000-5000D对血脂没有明显的作用。
表3大鼠给药前血糖指标
Figure BDA0003370870120000121
Figure BDA0003370870120000122
与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
表4大鼠给药33天后血糖和血脂指标
Figure BDA0003370870120000131
Figure BDA0003370870120000132
与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；
3结论
在正常小鼠降糖实验中，桑叶多肽500-2000D、桑叶多肽2000-5000D和保健品组小鼠空腹血糖与对照组比较无统计学意义，判定其对正常动物血糖无影响。
在大鼠糖代谢紊乱模型成立的前提下，受试样品组与模型对照组比较，在给葡萄糖后0.5h桑叶多肽500-2000D和桑叶多肽2000-5000D血糖与模型组相比差异显著，具有统计学意义；且各实验组2h血糖与模型组相比均差异显著，有统计学意义，判定该受试样品糖耐量指标结果阳性，桑叶多肽小于500D、桑叶多肽500-2000D和桑叶多肽2000-5000D均具有一定的降血糖效果。此外，从桑叶多肽小于500D低中高三个实验组的血糖指标可以看出，桑叶多肽小于500D的降血糖效果有一定的剂量依赖性，剂量越高，2h后的降糖效果越明显。
根据维持血糖平衡的结果判定方法，空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性，且血脂(总胆固醇、甘油三酯)无明显升高，对正常动物空腹血糖无影响，即可判定该受试样品有助于维持血糖健康水平功能动物实验结果阳性。所以，桑叶多肽500-2000D、桑叶多肽2000-5000D都具有有助于维持血糖健康水平，桑叶多肽小于 500D对正常动物血糖有一定降低作用，对于高血糖动物降血糖作用也较明显。
针对以上的动物实验结果，我们发现桑叶多肽三个组分的降血糖活性依次是：小于500D组分＞500-2000D组分＞2000-5000D组分。根据这个特性，我们可以对桑叶多肽纯化分级，得到的产品在实际病症针对性的使用。
由于500D的产品生物碱DNJ的含量较高，蛋白肽含量较高，桑叶多糖含量相对较低，降血糖活性较高，可以用于降血糖药物开发，以及针对空腹血糖较高(大于12mmol/L)的二型糖尿病患者；500-2000D的产品生物碱DNJ和蛋白肽含量的含量适中，可以用于病情不太严重，空腹血糖小于12mmol/L的二型糖尿病患者； 2000-5000D的产品生物碱DNJ含量较低，蛋白肽含量较高，可以用于轻微糖尿病患者(空腹血糖小于8)，以及有控制体重人群的需求，开发减肥产品。
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高桑叶肽降血糖活性的工艺，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、经收割的新鲜桑叶清洗、绞碎后，加入水，加入蛋白酶，提取，结束后灭酶得到桑叶肽提取物；
步骤2、将步骤1中的提取物经过板框过滤，得清液和滤渣；
步骤3、将步骤2中得到的清液经过超滤和纳滤膜进行分级，得到不同分子量区间组份；
步骤4、将步骤3中得到的不同分子量区间组份分别进行浓缩；
步骤5、将步骤4中得到的浓缩液经过滤芯进行除菌；
步骤6、将步骤5中得到的产品浓缩液喷雾干燥得到不同分子量区间组份的产品；
完成提高桑叶肽降血糖活性的工艺。
2.根据权利要求1所述提高桑叶肽降血糖活性的工艺，其特征在于，所述步骤1中，加入3-6倍质量的水，于50-60℃，加入叶重1%-3%的蛋白酶，使用或者不使用超声波提取1-5h，超声功率为80-300w。
3.根据权利要求1所述提高桑叶肽降血糖活性的工艺，其特征在于，所述步骤1中，加入碱性蛋白酶酶解之前，控制pH在8-10的范围内采用脉冲光处理，脉冲光处理条件为：脉冲光强度为10^4-10^5uW/cm²，脉冲次数1次/s，5-20s。
4.根据权利要求3所述提高桑叶肽降血糖活性的工艺，其特征在于，所述步骤1中，调节pH可以使用氢氧化钠、氢氧化钙、氨水、盐酸、磷酸或硫酸。
5.根据权利要求1所述提高桑叶肽降血糖活性的工艺，其特征在于，所述步骤2中，得到的清液进行冷冻处理，解冻后再进行步骤3处理，冷冻温度为-18℃，冷冻3-6h。
6.根据权利要求1所述提高桑叶肽降血糖活性的工艺，其特征在于，所述步骤3中，通过超滤和纳滤膜进行分级得到的不同分子量区间组份分别为：小于500D，500-2000D，2000-5000D三个区间组份。
7.根据权利要求1所述提高桑叶肽降血糖活性的工艺，其特征在于，所述步骤5中，滤芯孔径为0.15-0.3微米。
8.根据权利要求1所述提高桑叶肽降血糖活性的工艺，其特征在于，所述步骤6中，喷雾干燥中，进风180±20℃、出风90±5℃。
9.权利要求1-8任意一项所述提高桑叶肽降血糖活性的工艺得到的桑叶肽，其特征在于，所述工艺得到的不同分子量区间组份的桑叶肽产品，
小于500D的产品：DNJ含量5.5-7.5%，蛋白质含量50-65%，总糖含量25-35%，伽马氨基丁酸含量13000-22000ppm；
500-2000D的产品：DNJ含量1.1-1.9%，蛋白质含量41-47%，总糖含量23-29%，伽马氨基丁酸含量2000-2600ppm；
2000-5000D的产品：DNJ含量0.06-0.14%，蛋白质含量22-30%，总糖含量45-55%，伽马氨基丁酸含量300-450ppm。
10.权利要求1-8任意一项所述提高桑叶肽降血糖活性的工艺得到的桑叶肽，其特征在于，所述工艺得到的不同分子量区间组份的桑叶肽产品，
小于500D的产品用于空腹血糖大于12mmol/L的二型糖尿病患者的药物或保健品或食品的制备；
500-2000D的产品用于空腹血糖小于12mmol/L的二型糖尿病患者的药物或保健品或食品的制备；
2000-5000D的产品用于空腹血糖小于8mmol/L的轻微糖尿病患者的药物或保健品或食品或有控制体重人群需求的减肥产品的制备。
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Pledgor: HUBEI REBORN BIOTECH CO.,LTD.

Registration number: Y2024980006282

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