CN117126238A - 具有降血糖功能的桑叶肽及咀嚼片 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了具有降血糖功能的桑叶肽及咀嚼片，该桑叶肽包含如下氨基酸序列：AAGRLPGY、VVRDFHNA、RWPFFAFM，其采用碱性蛋白酶酶解制备得到，酶解工艺条件为：反应温度为53.0℃、反应时间4.7h、酶添加量17800U/g、底物浓度0.5％。该咀嚼片中填充剂：矫味剂：黏合剂：润滑剂：桑叶肽的质量比为10:20:1.5:1:2，填充剂为微晶纤维素，矫味剂为甘露醇和无糖奶粉，甘露醇和无糖奶粉的质量比为1：1，黏合剂为羧甲基纤维素钠，润滑剂为硬脂酸镁。本发明筛选出了桑叶肽中发挥降血糖功效的3个功能肽段，同时优选了桑叶肽咀嚼片的制备工艺条件，为桑叶的高附加值加工提供参考，有助于推动我国桑蚕业的产业发展和升级转型。

Description

具有降血糖功能的桑叶肽及咀嚼片
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及具有降血糖功能的桑叶肽及咀嚼片。
背景技术
现阶段居民生活节奏加快，生活水平也越来越高，糖尿病也成为新型健康杀手。糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性慢性疾病，我国是全球糖尿病患病率增长最快的国家之一，目前糖尿病患者超过9700万，前期人群约1.5亿，其中II型糖尿病作为最常见的类别约占病患总数的90％。目前，II型糖尿病的治疗药物主要包括胰岛素增敏剂、碳水化合物抑制剂和胰岛素类似物等，但长期服用易存在药物依赖性。
正常人进食后，食物中的碳水化合物在口腔、胃等消化器官中水解成寡糖，寡糖在α-葡萄糖苷酶作用下生成单糖后才被小肠吸收，因此降低人体内α-葡萄糖苷酶的活性，能够减少食物中多糖转换为单糖的量，从而达到抑制血糖升高的效果。
桑叶是我国传统的中草药，具有广泛的食疗价值，是被我国卫生部认定的“药食同源”典型食品，根据《中华人民共和国药典》记载，桑叶有疏风散热、清肺降燥、清肝明目等功效。干基桑叶蛋白含量最高可达25％，还含有人体必需的维生素和矿物质，此外桑叶中还含有丰富的生物碱、多糖、黄酮、甾醇等生物活性成分，赋予桑叶一些特殊生物功能，如：抗氧化、抑菌、降血糖等。
生物活性肽是上千种生物肽段的总称，主要是指两个及以上个氨基酸通过肽键链接，其通常由2-20个氨基酸组成，作为生物小分子有机物，在人体内发挥生理活性作用。活性肽从生物蛋白中断裂释放出来，组成活性肽氨基酸序列决定了其生理功能活性，满足不同的人体健康需求。活性肽作为保健食品或药品，具有生物相容性、无副作用、易被人体吸收等诸多优点。这些肽的来源不同，有些来源于植物蛋白如大豆肽、桑叶肽等；还有些来源于动物蛋白如深海鱼皮肽、海参肽等。对比活性肽的两种生物来源渠道，植物资源更丰富、高度可再生且成本更低，从植物中获取生物活性肽将会成为一种发展趋势。
由于糖尿病患者对治疗药物的依赖性，故广大科技工作者逐步将研究重点转向具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的天然植物多肽提取物，期望从饮食健康和膳食干预的角度，开发出毒副作用小、疗效好的降血糖食源性功能肽产品。已知桑叶具有降血糖的功效，但是现阶段国内外对于桑叶的研究相当一部分只关注桑叶蛋白的营养价值综合评价或者体内消化情况，以促进桑蚕业饲料的改进或开发新型食品添加剂。而桑叶来源的多肽降血糖功能特性尚未见文献报道，如何利用桑叶蛋白资源为降血糖研究领域拓展新渠道还有待进一步探索。
发明内容
本发明提供了具有降血糖功能的桑叶肽及咀嚼片，筛选出了桑叶肽中发挥降血糖功效的3个功能肽段，同时优选出了桑叶肽咀嚼片的制备工艺条件，为桑叶的高附加值加工提供参考，有助于推动我国桑蚕业的产业发展和升级转型。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了具有降血糖功能的桑叶肽，所述桑叶肽包含如下氨基酸序列：AAGRLPG Y、VVRDFHNA、RWPFFAFM。
在以上技术方案中，所述桑叶肽的制备方法包括以下步骤：
(1)桑叶粗蛋白的提取：以桑叶为原料，经过浸提、沉淀、透析除盐步骤后得到桑叶粗蛋白；
(2)酶解：去除步骤(1)得到的所述桑叶粗蛋白中内源蛋白酶抑制剂的活性，再采用碱性蛋白酶进行酶解，结束后离心，取上清所得溶液即包含所述桑叶肽；
其中，步骤(2)中的酶解工艺条件为：反应温度为53.0℃、反应时间4.7h、酶添加量17800U/g、底物浓度0.5％。
本发明还提供了上述桑叶肽在食品、保健品、药品方面的应用。
本发明还提供了具有降血糖功能的咀嚼片，所述咀嚼片包含上述桑叶肽。
在以上技术方案中，所述咀嚼片还包含有填充剂、矫味剂、黏合剂、润滑剂。
在以上技术方案中，所述填充剂为微晶纤维素；所述矫味剂为甘露醇和无糖奶粉，甘露醇和无糖奶粉的质量比为1：1；所述黏合剂为羧甲基纤维素钠；所述润滑剂为硬脂酸镁。
在以上技术方案中，填充剂：矫味剂：黏合剂：润滑剂：桑叶肽的质量比为10:20:1.5:1:2。
本发明的有益效果在于：本发明基于生物酶解法从桑叶中提取桑叶蛋白肽，优选出高得率桑叶肽的提取工艺参数，基于分子对接与体外固相合成相结合的手段，筛选出了桑叶肽中发挥降血糖功效的3个功能肽段，同时优选出了桑叶肽咀嚼片的制备工艺条件，为桑叶的高附加值加工提供参考，有助于推动我国桑蚕业的产业发展和升级转型。
附图说明
图1是不同蛋白酶对桑叶蛋白的酶解曲线，其中Alc、Try、Neu、Pro、Pap分别代表碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶，下同；
图2是酶种类对可溶性肽收率的影响；
图3是桑叶蛋白及不同蛋白酶的酶解产物的红外图谱；
图4是桑叶肽分子量分布图谱及组分统计，其中，图A表示各酶酶解产物的分子量分子量分布谱图，图B表示各位各酶酶解产物的分子量分布统计；
图5是底物浓度对DH和YSP的影响，其中，不同小写字母表示样品间存在显著差异(p<0.05)，下同；
图6是温度对DH和YSP的影响；
图7是加酶量对DH和YSP的影响；
图8是反应pH对DH和YSP的影响；
图9是酶解时间对DH和YSP的影响；
图10是反应时间和酶解温度对桑叶粗蛋白水解度影响的响应面和等高线；
图11是反应温度和加酶量对桑叶粗蛋白水解度影响的响应面和等高线图；
图12是加酶量和反应时间对桑叶粗蛋白水解度影响的响应面和等高线图；
图13是分子量分布范围对比，其中，Alc表示未经过响应面优化的碱性蛋白酶酶解粗肽；
图14是桑叶肽和阿卡波糖对α-葡萄糖糖苷酶的抑制曲线，其中，图A表示阿卡波糖对于α-葡萄糖苷酶抑制率曲线(阳性对照)、图B表示水解度15％的桑叶粗肽对于α-葡萄糖苷酶的抑制率曲线、图C表示经过响应面优化后制得的桑叶肽对α-葡萄糖苷酶的抑制率曲线；
图15是不同级分的桑叶肽对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线，其中，图A、图B分别表示3-10kD、＜3kD桑叶肽级分对于α-葡萄糖苷酶抑制率曲线；
图16是桑叶肽<3kDa级分的总离子流色谱图(TIC)、一级质谱Basepeak图和二级质谱Basepeak图，其中，图A、图B、图C分别表示总离子流色谱图(TIC)、一级质谱Basepeak图和、级质谱Basepeak图；
图17左图是盲性对接网格BOX，右图是实际对接网格BOX；
图18是多肽(以AAGRLPGY-蛋白为例)和阳性对照的盲性对接，其中，左图为AAGRLPGY-蛋白对接构象，右图为阿卡波糖-蛋白(阳性对照)对接构象；
图19是阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶的对接结果，其中，蛋白质的骨架呈管状结构，阿卡波糖呈棒状结构，受体蛋白与阿卡波糖相互作用的关键残基呈绿色棒状，结合点位呈红色和亮蓝色，不同颜色的虚线代表阿卡波糖与受体蛋白关键残基形成的不同相互作用；
图20是多肽对接结合自由能统计热图，其中，对接结合自由能越低，对接效果越好，着色程度越深；
图21是不同肽段的自由结合能比较；
图22是多肽对于α葡萄糖苷酶的抑制率曲线图；
图23是降血糖桑叶肽咀嚼片制备流程图；
图24是不同填充剂类型咀嚼片的崩解时限与感官评分；
图25是填充剂添加量对咀嚼片崩解时限和感官评分的影响；
图26是矫味剂种类对咀嚼片崩解时限的影响；
图27是矫味剂添加量对于崩解时限的影响；
图28是不同黏合剂种类的崩解时限；
图29是黏合剂添加量对崩解时限和感官评分的影响；
图30是不同润滑剂添加量片剂的崩解时限与感官评分；
图31是桑叶降血糖肽咀嚼片成品图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明做进一步描述。本发明可以许多不同的形式实施，而不应该被理解为限于在此阐述的实施例。相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。
一、桑叶肽的酶法制备
1、实验方法
1.1桑叶粗蛋白的提取
(1)浸提：将桑叶烘干后使用粉碎机进行粉碎，得到的桑叶干粉过80目筛，使用质量浓度为5g/L的NaOH溶液浸提液对过筛后的桑叶干粉浸提，辅以40Hz超声波常温处理10min，40℃水浴提取1h。
(2)沉淀：除去浸提液中的桑叶干粉残渣，收集桑叶粗蛋白浸提液，使用1mol/LHCl调节浸提液pH至3.0，静置0.5h后4000r/min离心，收集粗蛋白沉淀。
(3)透析除盐：首先将收集到的蛋白沉淀置于0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.6)中透析(Jielepu透析袋，截留分子质量1kD)，透析48小时后再置于蒸馏水中24h，达到调节酸碱性并除去小分子物质的目的。透析完成之后收集样品，使用真空冷冻干燥机进行冻干备用，冻干后的粗蛋白标记为FMP。
1.2桑叶粗蛋白的酶解
桑叶粗蛋白(FMP)用蒸馏水溶解，配制1％(w/v)的蛋白溶液，95℃加热10min，去除FMP中内源蛋白酶抑制剂的活性。选择碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶来对桑叶粗蛋白进行酶解，按照各蛋白酶说明书中最适反应条件(表1)调节反应体系，固定各种酶的添加量(E/S)10000U/g，在最适温度条件下酶解FMP。结束后，将酶解液于95℃灭酶活10min以终止反应。8000g离心10min，取上清，冷冻干燥备用。
表1不同蛋白酶的最适作用条件
1.3各酶酶解产物指标测定
水解度测定使用pH-stat法进行测定。
可溶性肽收率(YSP)测定使用双缩脲法进行测定。
傅里叶红外光谱分析使用傅里叶变换红外光谱仪进行测定，通过origin2021b软件分析红外光谱进行绘图并分析测定结果。
分子量分布测定使用配备定性的检测器十八角度激光光散射仪测定分子量分布范围，色谱柱选择凝胶渗透色谱柱(WYATT:WTC-010S5)。
降血糖活性测定验证：使用酶标仪和96孔板，将25μL的α-葡萄糖苷酶溶液(0.2U/mL，PBS缓冲液，pH7.0)与25μL的不同浓度的样品溶液在磷酸二氢钾缓冲液(PBS,0.2M，pH7.0)中预混合。在37.0℃下孵育20分钟后，加入25μL的α-对硝基苯基吡喃葡萄糖苷(α-pNPG，2.0mM)底物启动反应，使用PBS控制反应体系总体积为100μL。样品背景组使用PBS代替α-葡萄糖苷酶，对照组使用PBS替代各浓度样品溶液，反应混合物在37.0℃下孵育30分钟。用酶标仪在405nm处测定对硝基苯酚的释放量，并用下式计算抑制活性，GraphPadPrism软件做非线性回归分析，得出IC50值。
1.4桑叶蛋白的酶解工艺优化实验
(1)底物浓度优化：取FMP分别配置成底物浓度为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％的粗蛋白溶液，使用0.1M的NaOH溶液调节pH至10.0。按10000U/g(酶活/固形物含量)加入碱性蛋白酶，在45℃环境中酶解4h，测定反应体系的水解度。
(2)酶解温度优化：在上一步的单因素酶解实验的基础上，取FMP调节成底物浓度为1.0％的粗蛋白溶液，使用0.1M的NaOH溶液调节pH至10.0。按10000U/g(酶活/固形物含量)加入碱性蛋白酶，分别在25℃、35℃、45℃、55℃、65℃环境中酶解4h，测定反应体系的水解度。
(3)酶添加量优化：在上一步单因素酶解实验的基础上，取适量FMP配置成底物浓度为1％的粗蛋白溶液，使用0.1M的NaOH溶液调节pH至10.0。分别按5000U/g、10000U/g、15000U/g、20000U/g、25000U/g(酶活/蛋白含量)加入碱性蛋白酶，酶解4h后，测定反应体系的水解度。
(4)酶解pH值优化：在上一步单因素酶解实验的基础上，配制底物浓度为1％的粗蛋白溶液，使用0.1M的NaOH溶液分别调节pH至9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5。按15000U/g(酶活/固形物含量)加入碱性蛋白酶，酶解4h后，测定反应体系的水解度。
(5)酶解时间优化：在上一步单因素酶解实验的基础上，配制底物浓度为1％的粗蛋白溶液，使用0.1M的NaOH溶液分别调节pH至10.5。按15000U/g(酶活/固形物含量)加入碱性蛋白酶，分别酶解2h、3h、4h、5h、6h、7h，测定反应体系的水解度。
1.5响应面实验
根据单因素实验结果与Box－Behnken试验设计原理，选取酶解温度(A)、酶解时间(B)、酶添加量(C)3个因素，以水解度(R1)为响应值，采用3因素3水平的响应面试验分析桑叶降血糖活性肽的最佳工艺条件。
2、实验过程
2.1不同蛋白酶的酶解实验
(1)水解度及可溶性肽收率结果分析
酶解过程中的水解度可以通过影响多肽分子量大小和氨基酸组成进而影响肽段的生物活性。以表1中五种蛋白酶(Alc、Neu、Pro、Try、Pap分别对应碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶)的最适酶解条件为准，测定反应体系水解度，结果如图1所示，不同类型的蛋白酶、不同的酶解时间对FMP的水解度影响有明显差异(p＜0.05)。
由图1可知，在五种蛋白质水解酶中，Alc对于桑叶粗蛋白酶解体系表现出最高的DH，显著高于其他4种酶，表明其对桑叶蛋白有较高水平的水解能力。图2表示的是不同类型的蛋白酶对可溶性肽含量(YSP)的影响，从图中可知Alc、Neu、Pro三种酶解产物的可溶性肽收率(YSP)显著高于Try、Pap(p＜0.05)。
(2)FTIR结果分析
图3表示的是各酶的酶解产物红外谱图。粗蛋白在3300cm-1处的宽峰为羟基和氨基的伸缩振动的叠加，2900cm-1左右的一组峰为碳链中的甲基亚甲基的反对称和对称伸缩振动，1680cm-1左右为酰胺键Ⅰ带的羰基伸缩振动，1550cm-1为酰胺Ⅱ带的C-N-H伸缩振动，1280cm-1为酰胺Ⅲ带的C-N伸缩振动，1100cm-1为C-O伸缩振动。根据图3进行分析，桑叶蛋白在经过酶水解后，酰胺键断裂水解为氨基和羧基，Alc的酶解产物在1550cm-1处的酰胺Ⅱ带强度下降最为明显，对比粗蛋白，其在1280cm-1附近的C-N伸缩振动峰强度下降明显，在1600cm-1附近新增的峰为酶解产物氨基酸的-COO-反对称伸缩振动。对比粗蛋白，Try酶解产物在1550cm-1处酰胺Ⅱ带的峰强度没有发生变化。目前有研究表明，水解度越高酶解产物的结构变化越显著。对各酶解产物与粗蛋白的波峰改变情况进行对比分析，粗蛋白经过Alc酶解后的产物裂解程度最大，剩余其它的酶解产物断裂程度Neu＝Pro＞Pap>Try，其中Try变化程度非常小。
(3)酶解产物分子量分布
图4表示的分别是Alc、Neu、Pro三种酶的酶解产物分子量分布范围图谱和分子量分布范围统计。由图谱可知，使用不同的蛋白酶进行酶解制得的粗肽峰型不同。三种蛋白质水解酶的酶解产物出峰时间也有明显差异，出峰时间越晚表示其平均分子量越小，酶解越彻底。根据图4中的分子量分布范围统计，Alc、Neu、Pro酶解产物的平均分子量分别为5.0kD、9.6kD、4.7kD，其平均分子量大小关系与分子量分布图谱中三种酶出峰时间相符合。在三种酶解粗肽中，Alc的酶解粗肽的0-1kD的组分远远高于Neu和Pro的酶解粗肽，由于Alc的水解度显著高于另外两种酶，桑叶蛋白肽键断裂更彻底，小分子肽段含量也更多，0-1kD的组分占到了33.9％，而Neu10-20 kD的组分占比将近50％，其平均分子量也最大。
综合以上分析，选择Alc水解桑叶蛋白时，可以获得高水解程度、高得率的酶解产物，同时产物中的低分子量肽级分也最多，因此，Alc为最优解。
2.2单因素实验结果分析
(1)底物浓度对碱性蛋白酶水解度及可溶性肽收率的影响
水解度(DH)的大小表示蛋白酶解液中游离氨基态氮含量占总氨基态氮含量的百分比，可以直观反映肽段断裂的程度。可溶性肽收率(YSP)表示酶解液中蛋白质含量与酶解前原料中总蛋白含量的比值，YSP可以反映酶解前后蛋白质的利用程度。图5表示底物浓度(w/v)对于DH和YSP的影响，随着底物浓度的增加，Alc酶解体系的DH呈现下降趋势，当底物浓度大于1.50％时，水解度小于20％，桑叶蛋白与Alc热运动受阻，酶解效率降低，肽键断裂速度变慢，整个酶解体系的pH值降低速度变小最终导致水解度的降低。6个实验组的YSP值始终围绕60％波动，底物浓度为0.5％、1.5％、2.0％、2.5％的四个实验组的可溶性肽含量没有显著性差异(p＞0.05)。综合考虑水解度、可溶性肽收率，选择底物浓度为0.5％进行下一步的单因素实验。
(2)反应温度对碱性蛋白酶水解度及可溶性肽收率的影响
图6表示的是反应温度对水解度和可溶性肽收率量的影响，从图中可以得知，在25℃～55℃的范围内，随着酶解温度的提高，水解度逐渐升高，在此范围内温度的升高会提高酶的活性，Alc对桑叶粗蛋白肽键的水解效率明显提高，随着更多的肽键的断裂，pH下降速度更快，水解度也更高。水解在温度上升至65℃时，水解度显著下降(p＜0.05)，过高的温度可能导致碱性蛋白酶整体结构发生改变，碱性蛋白酶的活性被抑制。可溶性肽含量在温度高于25℃时没有显著性变化(p＞0.05)，YSP的大小跟水解度的大小没有显著相关性。综上，确定酶解温度为55℃进行后续实验。
(3)加酶量对碱性蛋白酶水解度及可溶性肽收率的影响
图7表示的是加酶量对于水解度和可溶性肽含量的影响，随着酶添加量的升高，Alc对桑叶粗蛋白的DH也随之增加在增加到一定程度后便不再增加，DH变化不显著，在加酶为15000U/g，水解度为22％，此后水解度无显著性变化(p＜0.05)。在加酶量为20000U/g时YSP最高，在酶添加量从5000U/g增长到10000U/g时的水解度增长幅度最大为20％。在一定范围内，酶量的增加可以增加单位体积内桑叶粗蛋白与Alc的接触面积，在整个酶解过程中大分子桑叶蛋白不断被水解成小分子量的小肽，断裂的肽键也更多，从而提高水解度，但是随着酶添加越来越多，当Alc添加量达到饱和之后，随着酶量的增加会对酶解反应产生抑制作用，这也与加酶量达到15000U/g之后的酶解组水解度不再增加的实验结果相符合。因此，确定加酶量15000U/g进行后续单因素实验。
(4)酶解pH碱性蛋白酶水解度及可溶性肽收率的影响
确定酶添加量为15000U/g、底物浓度0.5％、酶解温度55℃，改变反应pH值，测定水解度和可溶性肽收率，结果如图8所示。随着pH值的增加，水解度也随之增加，在pH达到10.5后水解度的增加不再显著(p＞0.05)，在pH为10.0时，可溶性肽含量最高，达到57.1％，可溶性肽含量与水解度并没有显著正相关性。酶解pH对酶解水解度影响较大，这与Alc的pH-活性曲线相关，在pH值过低时，Alc在酶解系统中的溶解性降低，酶活性受到抑制，水解度降低，在pH值过高时，Alc的三维结构改变。根据图8分析，Alc在pH值为10.5时进入最佳反应范围，此后水解度不再发生显著变化(p＞0.05)。因此，确定pH为10.5进行后续单因素实验。
(5)酶解时间碱性蛋白酶水解度及可溶性肽收率的影响
图9表示的是酶解时间对于DH和YSP的影响，随着时间的增加，Alc对桑叶粗蛋白的水解度呈现先上升后趋于平缓的趋势，其中，在水解2h～3h时水解度上升幅度最大，达到34％，水解度在7h的反应时间达到最大，但相比于6h时DH没有显著性差异(p＞0.05)，在反应6h之后酶解几乎处于停滞状态，这可能是由于反应长达6h酶解时间后，在整个酶解液中的桑叶粗蛋白可提供的肽键数量降低，酶解液的pH值不再发生改变。同时从图中看出，可溶性肽含量在6h时达到最大，达到77.0％，在酶解时间7h时，YSP值迅速降低，分析原因，可能是由于在6h～7h酶解时间段内，水解得到的可溶性小肽与Alc结合，而整个水解处于停滞状态，小分子肽段被消耗，导致整个酶解液的可溶性肽含量降低。综合酶解效果、可溶性肽收率确定酶解时间为6h为最佳反应时间。
2.3响应面法优化试验设计及结果分析
(1)实验结果方差分析
根据单因素实验的结果与Box－Behnken试验的设计原理，固定底物浓度0.5％、反应pH 10.5来进行响应面优化实验，选择反应温度(A)、反应时间(B)及Alc添加量(C)3个因素，以水解度为响应值，采用3因素3水平的响应面试验分析酶解实验各因素影响，探究桑叶活性肽的最佳工艺条件。试验设计见表2。以水解度DH为响应值，对数据进行多元回归拟合，得到水解度(R)与Alc酶解反应温度(A)、反应时间(B)、酶添加量(C)的回归方程：
R＝26.56-0.86A+1.05B+1.00C-0.83AB-0.080AC-0.15BC-2.89A2-1.31B2-1.02C2
方差分析结果如表3所示。模型的p<0.0001，表明该模型达到极显著水平，失拟检验项的p＝0.2458，说明未知因素对实验结果影响不显著，得到的拟合方程可信。此模型的R2＝0.9902，表明试验数据能较好地与回归数学模型拟合，因此该响应面模型能较好地预测各指标的实际值。A、B、C、AB、A2、B2、C2’对R(水解度)有显著性影响(p＜0.05)。在方差分析中，通过F值的大小也能判断各项因素对于R值影响的程度，FB(酶解时间)＞Fc(加酶量)＞Fa(酶解温度)，因此可以得出结论，在所选择的数值范围内对于水解度影响最大的是反应时间，其次是加酶量和反应温度。
表2响应面因素水平表
表3响应面实验方案及结果
(2)各因素之间的交互作用
图10反映了加酶量(A)和反应时间(B)的交互作用对桑叶蛋白的酶解效果影响。等高线呈椭圆形，说明加酶量和反应时间两个因素之间有显著相互作用。在等高线图中，沿反应时间轴线方向的等高线更加密集，沿加酶量轴线方向的等高线较为稀疏，这说明相对于酶添加量，反应时间对于水解度的影响更加显著。同时，在三维曲面图中形成的相响应曲面的陡峭坡度越大，表明该因素的改变对响应值产生的影响越大，在沿着反应时间方向时曲面的陡峭程度更大，说明反应时间对于响应面峰值的影响大于酶添加量。
图11反映了加酶量(A)和反应温度(C)交互作用对反应体系中水解度的影响，其中等高线图的中心点落在中心椭圆内，且等高线呈现椭圆形，两个因素的交互作用明显，对水解度有显著影响。在反应时间3～4.8h，温度在45℃～55℃范围内两者有着明显的增效作用，水解度随着反应时间和温度的升高而升高，在超过这一范围后，两者的交互增效作用降低，水解度随着两因素指标的升高而降低，根据等高面图可以得出，沿加酶量方向比反应温度方向的响应曲面的坡度更陡峭，同时，在加酶量和反应温度的交互作用图中也可以看出沿着加酶量轴向的变化幅度较大，所以在此响应面实验中，加酶量对于反应体系的影响要大于温度对于对于水解度的影响。
图12反映了反应时间(B)和加酶量(C)交互作用对反应体系中水解度的影响，其中等高线图的中心点落在中心椭圆内，等高线的形状呈圆形，表示两因素交互作用不显著。综合三因素之间交互作用的等值线图可看出，反应时间与温度的交互作用等值线图呈椭圆形程度最高，对于响应值的影响最大，这与表4中的方差分析的结果一致。
(3)最佳工艺条件试验验证
采用Design-Expert.V 8.0.6软件分析Alc水解度最大值，对优化后的工艺条件进行验证。根据实验优化后，得出的最优Alc酶解工艺为：反应温度为53.0℃、反应时间4.7h、酶添加量17800U/g，3次重复实验的放映体系水解度分别达到26.49％、26.34％、26.75％，平均值为26.52％，与预测值26.93％较为接近，说明模型的拟合性较好。
2.4酶解产物评价
(1)分子量分布
图13表示的是未经响应面优化的粗肽和经过响应面优化后的粗肽分子量分布图谱及分子量分布统计，经过响应面工艺优化后的酶解产物出峰时间明显比未经过优化的晚，平均分子量较小、粗肽中小分子量肽段含量较多，蛋白水解越彻底，出峰时间越晚。经过响应面优化后所制得的桑叶肽分子量主要集中在0-10kDa的范围内，该分子量范围占比为93.71％，没有经过响应面优化的酶解产物在该范围的肽含量只有83.0％。同时，经过响应面优化后所制备的肽在＜1kD的范围中占到了将近60％，没有经过优化的酶解产物只有33.99％，这说明响应面优化工艺对于桑叶蛋白的水解更加彻底，其水解产物的平均分子量只有2.7kD，研究表明分子量分布与酶解体系的水解度有关，酶解液的水解度越高，较小分子量的肽段越多。在本发明中，经过优化的酶解工艺的反应体系水解度达到26.52％，其产出的桑叶粗肽在＜1kDa范围内的肽段占比明显大于未经过工艺优化的桑叶粗肽。
(2)体外降血糖活性测定
对响应面优化后实验条件生产的多肽进行体外降血糖活性验证。人体中α-葡萄糖苷酶能催化α-1-4糖苷键水解，使小肠内麦芽糖、蔗糖等寡糖水解进而引起人体血糖升高，因此常通过α-葡萄糖苷酶抑制率来评价活性肽的降血糖活性。在图14中，A图表示阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制曲线阳性对照(IC50＝0.48mg/ml，R2＝0.9783)，B图表示未经过响应面优化的Alc酶解4h制得的FMP(水解度15％)的抑制曲线，C图为响应面优化后生产的FMP对α-葡萄糖苷酶的抑制率曲线，根据拟合曲线可计算此肽段对于α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度(IC50＝27.33mg/ml，R2＝0.9613)。从图中可以得知，水解度为15％的粗肽并没有表现出降血糖活性，同时随着粗蛋白溶液浓度的上升α-葡萄糖苷酶的活性反而在上升，且趋势明显，低水解度的粗肽不能够表现出降血糖功能活性。经过充分酶解后的肽段相比于桑叶粗蛋白平均分子量大大降低，得到降血糖桑叶粗肽的反应体系水解度达到了26.52％，其平均分子量仅为2.7kD，经过酶解而得到的桑叶肽是多个肽段级分的组合，半抑制浓度IC50＝27.33mg/ml，对α-葡萄糖苷酶能够表现出良好的降血糖活性。
二、降血糖桑叶肽活性肽结构鉴定
1、实验过程
1.1降血糖肽的超滤分级
用超滤杯分别选用3kDa、10kDa的超滤膜对降血糖桑叶肽进行超滤，将其分为＞10kD、10kD-3kD和＜3kD的三个级分，收集分别收集10kD-3kD、＜3kD的肽级分，使用真空冷冻干燥机冻干备用。
1.2体外降血糖活性评价
同上
1.3多肽序列测定
(1)固相萃取纯化：将样本12000g离心10分钟，取上清用10kD超滤管过滤，取滤过液用C18柱进行除盐处理，除盐后的肽段溶液经离心浓缩仪抽干后，冻存于-20℃等待上机检测。
(2)质谱检测：质谱数据使用Q Exactive HF-X质谱仪串联EASY-nLC 1200液相的液质联用系统进行采集。
(3)质谱分析：质谱数据通过MaxQuant(V1.6.6)软件进行检索，采用的数据库检索算法是Andromeda。检索使用的数据库是Uniprot中Morus的蛋白质组参考数据库。
(4)多肽对α-葡萄糖苷酶抑制机理研究：本发明以受体蛋白和配体的三维构型为基础，利用AutoDock vina 1.2.3软件计算对接结合自由能，通过计算结合自由能判断受体分子在α-葡糖糖敢酶结合口袋处结合的构象，使用Discovery Studio2017获得受体-蛋白结合相键位互作用并显示与配体相互作用的氨基酸残基。
a、受体的准备：从PDB蛋白质数据库(https://wwwrcsb.org/pdb/)检索获得α-葡萄糖酶的晶体结构(PDB ID:5ZCE,分辨率:)。通过NOTEPAD++软件查看验证5ZCE与配体共结晶的关键氨基酸残基无缺失，通过PyMOL-2.5.2对α-葡萄糖酶的晶体进行去水，之后使用MglTools 1.5.6进行去除杂原子、添加缺少的氢原子、合并孤对电子等系列操作，制备受体蛋白质结构并输出pdbqt格式文件。
b、对接BOX的确定：通过Auto Grid的网格框准备网格地图。为确定活性结合口袋，首先选择5ZCE中自带配体(麦芽糖四糖配合物)进行盲性对接，根据MglTools软件中AutoGrid工具根据蛋白分子自动生成最大尺寸的对接BOX，网格框的中心坐标为:x＝3.234，y＝48.118，z＝82.147，大小为：x-dimension＝88；y-dimension＝78；z-dimension＝92，通过盲性对接结果反向推测受体蛋白活性位点，进而确定最终的对接网络框的中心点以及尺寸数据。
c、多肽的构建：本发明中桑叶降血糖多肽的构建采用ALPHA FOLD 2在线服务器进行构建多肽，模型的循环次数选择默认值3，不同等级的肽段预测模型根据匹配评分(plDDT)等级进行取舍，所构建的65条肽段均选择最高plDDT值的模型。
d、对接：通过拉马克遗传算法搜索配体受体最佳结合位置，采用半经验自由能的能量评估函数对每个停靠系统进行10次自动停靠搜索。为了分析抑制剂与酶之间的相互作用，指定每个配体的最佳构象，并使用Pymol和Discovery Studio 2017处理及可视化结果。
2、结果与分析
2.1降血糖桑叶肽体外活性评价
α-葡萄糖苷酶是人体小肠内促进多糖水解成人体可以吸收单糖的重要消化系统酶属，在体外α-葡萄糖苷酶可以催化PNPG生成PNG(硝基苯酚)，PNG溶液呈黄绿色，PNG溶液在405nm吸收波长处的OD值与浓度成正比。对于＜3kD级分的肽段的反应底物，体外活性试验的合适浓度梯度范围为1～10mg/ml，图15分别表示不同级分的桑叶肽对于α-葡糖糖苷酶的抑制率，选择目前市售药物阿卡波糖作为阳性对照组，通过IC50(半抑制浓度)来评价各级分对于降血糖活性的强弱。其中＜3kDa级分的IC50值为5.407mg/ml，明显小于3-10kDa级分的IC50值，其对于α-葡萄糖苷酶抑制效果为3-10kD级分的2.6倍，表现出了较优的抑制活性。在本发明中，分子量＜3kDa肽级分被认为是有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
2.2多肽序列测定
上述实验确定了降血糖活性最优的桑叶肽级分，对该级分进行肽段序列解析，通过LC-MS对样品进行检测，通过MaxQuant软件分析原始质谱数据，匹配蛋白数据库，获得蛋白数据信息，展开鉴定和定量分析。
降血糖桑叶肽＜3kDa级分的总离子流色谱图(TIC)、一级质谱Basepeak图和二级质谱Basepeak如图16所示，其中A、B、C分别表示总离子流色谱图(TIC)、一级质谱Basepeak图和二级质谱Basepeak图。
使用MaxQuant软件中的Andromeda算法对所检测到的所有肽段离子最佳匹配谱图进行评分，得分越高表明二级谱图与肽段离子的匹配程度越好，肽段鉴定证据越充分，一般认为评分高于0的肽段均为有效鉴定。所检测出纯度较高的肽段序列、评分和分子量等信息如表4所示。相关研究表明的大多数活性肽的分子量处于200-2000Da之间，由表4分析，所检测出来的65条桑叶肽段分子量均在500-1500之间。
表4肽段检测结果
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2.3多肽与α-葡萄糖苷酶蛋白相互作用分析
本发明对通过质谱数据得到的65条肽段序列和阳性对照阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶进行分子对接与分析探究降血糖桑叶肽。
(1)多肽的构建
根据质谱检测结果构建了65个特异性多肽，肽段构建工具选择ALPHA FOLD 2。
(2)多肽对α-葡萄糖苷酶抑制作用的分析
a、盲性对接
为确定α-葡萄糖苷酶的对接结合口袋位置，探究其与多肽的结合位置，以阳性对照阿卡波糖、多肽以AAGRLPGY为例，做盲性对接，对接盒子与整个α-葡萄糖苷酶的相对位置与大小见图17，对接时将配体和受体蛋白全部放入对接盒子中。
通过拉马克遗传算法对上述两个对接系统进行10次自动停靠搜索，对对接结果进行分割显示，如图18所示，左图为肽段AAGRLPGY对接受体蛋白、右图以阿卡波糖对接α-葡萄糖苷酶做阳性对照，两次对接共产生20种对接构象。无论是阿卡波糖与受体蛋白的对接还是多肽与受体蛋白的对接，所有的对接位相较为集中，表明配体与α-葡糖糖苷酶的结合中位相相对集中，分布单一，对接相位集中于11个氨基酸组成亲水性口腔口袋，形成了良好的疏水匹配。但由于盲性对接是配体与受体所有表面蛋白尝试对接后所得的结果，所得结论精确性不足，本发明通过盲性对接探究出α-葡萄糖苷酶的对接活性口袋位点，为下一步探究缩小了对接网格尺寸，提高对接精确度，经过优化后的对接网格相对位置与大小如图17所示，中心点坐标为X＝3.234、Y＝50.597、Z＝80.37，尺寸为x＝92.75、y＝69.19、z＝92.75。
b、阳性对照组的对接结果分析
阿卡波糖是目前市面上最为常见的降血糖药物之一，本发明选择其对于α-葡萄糖苷酶的抑制机理和结合模式作为对照组进行分析。选择CHARMm力场，局部电荷选择Monany-Rone分析阿卡波糖与受体蛋白的结合模式。
图19中，上图表示α-葡萄糖苷酶和阿卡波糖复合物的整体3D结构及复合物的二维蛋白质-配体相互作用图，蛋白质的骨架呈管状着红色，阿卡波糖呈棒状并由元素着色，右侧为其与阿卡波糖结合的活性位点的近距离视图。与阿卡波糖相互作用的关键残基呈绿色棒状，蛋白质残基以圆圈呈现并根据其性质着色：绿色为疏水残基；紫色为极性残基。阿卡波糖与蛋白质的256-GLN、199-ASP、327-ASP、60-ASP、63-TYR残基形成了六个氢键，其中阿卡波糖与256号残基谷氨酰胺形成两个氢键且均为常规氢键，发现阿卡波糖可以与63号位的酪氨酸TYR形成的是π-供体氢键，这些与受体蛋白活性位点产生相互作用的氢键平均距离为远短于传统氢键的/>的常规氢键。这些氢键的存在对于稳定在α-葡萄糖苷酶的活性位点的阿卡波糖具有重要意义。除氢键之外，阿卡波糖与411号位的精氨酸之间形成范德瓦尔斯力。对相互作用图继续观察，阿卡波糖与α-葡萄糖苷酶163号位的苯丙氨酸残基形成π-sigma键，此外，144号位苯丙氨酸残基与原始配体形成π-Alkyl键，最终阿卡波糖和α-葡萄糖苷酶的结合自由能为-9.91kcal/mol。通过相互作用分析进一步确定了α-葡萄糖苷酶的活性口袋，缩小对接盒子，确定对接参数，提高多肽与α-葡萄糖苷酶后续对接准确性。
c、多肽对接结果分析
对本发明中肽段序列质谱检测结果出的65个特异性肽段，应用上文确定的对接网格数据进行大批量的分子对接。为更直观的观察每个肽段对于受体蛋白结合效果强弱，65条多肽和受体蛋白的对接结果做成如图20所示的自由结合能热图，颜色越深代表结合自由能越低，结合效果越好，其中每一条肽段均有十个结合构象，通过多肽对接结合自由能统计表以及接对接结合自由能热图中从65个肽段中选择结合效果最优的10个肽段即VLPAHKFG、RRYVRQLP、SDVYAPRS、VFPKQHIF、SALPVGIW、AAGRLPGY、VVRDFHNA、RWPFFAFM、VGINCAPP、LFYRRARK，计算平均结合自由能，并与阳性对照阿卡波糖做比较，图21表示上述十个肽段分别与α-葡萄糖苷酶对接十次所得到的平均结合自由能。从图21可以看到AAGRLPGY、VVRDFHNA、RWPFFAFM三条肽段的平均结合自由能最低，对接效果最优，其中肽段RWPFFAFM对于α-葡萄糖苷酶的结合自由能为-8.65kcal/mol与阿卡波糖的对接自由能(-8.84kcal/mol)十分接近。根据对接结果的平均结合自由能分析，上述三条对于降血糖桑叶肽抑制α-葡萄糖苷酶的效果贡献度最大。
2.4肽段活性验证
图22显示的分别是AAGRLPGY、VVRDFHNA、RWPFFAFM三条肽段体外抑制α-葡萄糖苷酶的抑制曲线，根据不同肽段序列的平均分子量进行浓度换算，三条肽段对于α-葡萄糖苷酶的抑制效果的IC50分别为1.318mM((R2＝0.94)、2.123mM(R2＝0.90)、1.300mM(R2＝0.96)，对比阿卡波糖的IC50值为0.741mM(R2＝0.98)，三条肽段均表现出良好的降血糖活性。
三、桑叶降血糖肽咀嚼片的制备
1、实验方法
1.1降血糖桑叶肽脱色
取酶解上清液预热，添加0.5wt％活性炭水浴脱色30min，使用双层慢速定性滤纸趁热抽滤，取滤液喷雾干燥备用。
1.2咀嚼片制备工艺
本发明通过湿法制粒压片法制备降血糖桑叶肽咀嚼片剂的工艺流程简图如图23所示。
1.3咀嚼片配方筛选
(1)填充剂种类的筛选
本发明选用目前市面常见的片剂填充剂：药用碳酸钙、微晶纤维素、甘露醇作为桑叶降血糖肽咀嚼片的备用填充剂(10g)，以脱色之后桑叶肽为原料(添加量为2g)，固定其他辅料的添加量(矫味剂：奶粉10g，甘露醇10g，黏合剂：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)1g，润滑剂：硬脂酸镁1g、水2g)，通过改变不同的填充剂种类，以颗粒收率、休止角、色度、硬度、崩解时限、感官评分为评价指标，对上述三种填充剂进行综合评价，筛选出综合指标较优的填充剂。
(2)填充剂添加量的筛选
使用上述优选出来的填充剂，以脱色之后桑叶降血糖肽为原料(添加量为2g)，其他辅料的用量同上，以颗粒收率、休止角、色度、硬度、崩解时限、感官评分为评价指标，探究其添加量对于咀嚼片品质的影响。
(3)矫味剂种类的筛选
选用常用的矫味剂：木糖醇、甘露醇、无糖奶粉作为桑叶降血糖肽咀嚼片的备选矫味剂，以脱色之后桑叶肽为原料(添加量为2g)，固定其他辅料的添加量，改变矫味剂混合种类，以颗粒收率、休止角、色度、硬度、崩解时限、感官评分为评价指标，探究矫味剂种类对桑叶降血糖肽咀嚼片的影响。
(4)矫味剂添加量的筛选
选用上一步优选出的矫味剂混合种类，同样以脱色之后桑叶肽为原料(添加量为2g)，固定其他辅料的添加量，改变矫味剂的添加量(10，15，20，25和30g)，以颗粒收率、休止角、色度、硬度、崩解时限、感官评分为评价指标，评价矫味剂添加量对于桑叶降血糖肽咀嚼片品质的影响。
(5)黏合剂种类的筛选
选用常用的片剂黏合剂：水、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)作为备选黏合剂，以脱色之后桑叶肽为原料(添加量为2g)，固定其他辅料的添加量，改变黏合剂的种类，以颗粒收率、休止角、色度、硬度、崩解时限、感官评分为评价指标，对三种备用黏合剂进行综合评价，选出综合指标较优的黏合剂。
(6)黏合剂添加量的筛选
选用上一步优选出的黏合剂种类，以脱色之后桑叶肽为原料(添加量为2g)，固定其他辅料的添加量，改变黏合剂的添加量(0.5g，1g，1.5g、2g、2.5g)，以颗粒收率、休止角、色度、硬度、崩解时限、感官评分为评价指标，探究对于桑叶降血糖肽咀嚼片品质的影响。
(7)润滑剂添加量的筛选
以脱色之后桑叶肽为原料(添加量为2g)，以上一步实验探究出来的辅料配方为基础并固定其添加量，改变润滑剂(硬脂酸镁)的添加量(0，1.5，2，2.5和3g)，以颗粒收率、休止角、色度、硬度、崩解时限、感官评分为评价指标，探究对于桑叶降血糖肽咀嚼片品质的影响。
(8)正交实验设计
本发明以单因素实验的结果为基础，设计L9(34)正交试验(见表5)，选择各种辅助原料比较适宜的添加量范围，通过各因素间的交互作用，探讨不同因素对降血糖桑叶肽的感官品质的影响，并筛选出最佳配方。
表5正交因素水平编码表
1.4评价指标的测定
颗粒收率、休止角、色度、硬度、崩解时限的测定均采用现有技术进行。感官评价的方法为：随机挑选10名身体条件健康的志愿者进行感官评鉴，对各组样品的色泽、适口性、外观、硬度质地按满分制100每项25％的分值进行评分，分值越高表示感官越好。
2、结果与分析
2.1填充剂种类对咀嚼片品质的影响
本发明选择的是药用碳酸钙、微晶纤维素、甘露醇作为填充剂备选材料，通过各项指标综合评价选择出一种优秀填充剂。各项指标测试结果如表6、表7、图24所示。
表6填充剂类型对于颗粒收率、休止角的影响
从表6可以看出，在三种填充剂材料中，微晶纤维素的颗粒收率最高，其值将近65％。微晶纤维素为填充剂的实验组的原料颗粒休止角明显小于其他两个实验组，表示以微晶纤维素为填充剂的实验原料颗粒更适宜作为压片的原材料。
表7填充剂类型咀嚼片色度的影响
表7表示的是填充剂的种类对于压片色度的影响，其中填充剂的种类对于压片的L*、a*、b*值均有显著影响(p<0.05)，此外，可以发现填充剂种类对于片剂的黄蓝值(b*)影响最大，不同的填充剂种类对于b*值的影响显著。W表示压片的白度，W值越高表示压片色泽越明亮越洁白质量越好，根据W值判断选择微晶纤维素作为压片的填充剂白度最高色泽最好，品质最优。图24表示填充剂种类对于压片的崩解时限和感官评分的影响，选择微晶纤维素和甘露醇作为填充剂时，压片的崩解时间没有显性差异，可以选择两者作为填充剂的备用原料。填充剂种类的改变对咀嚼片的感官评分有显著影响(p<0.05)。当选择微晶纤维素作为桑叶降血糖肽咀嚼片的填充剂时，咀嚼片的感官评分最高，其品质也最高。综合上述各因素，选择微晶纤维素作为桑叶降血糖多肽的填充剂。
2.2填充剂添加量对咀嚼片品质的影响
表8显示的是微晶纤维素添加量对桑叶降血糖肽咀嚼片颗粒收率、休止角以及硬度的影响。由表可知，微晶纤维素的添加量的改变对于颗粒收率、休止角、硬度均有显著性影响(p<0.05)，随着微晶纤维素添加量的增加，颗粒收率先上升后下降，在添加量为12.5g时达到最高，为65.84％，此时制粒过程对于原料的利用率最高。休止角随着添加量的增加一直在上升，休止角的上升说明在一定范围内填充剂的增加会降低原料的流动性，不利于压片。片剂的硬度在微晶纤维素添加量为10g时达到最大，此后随着填充剂的添加量增加硬度不断降低，添加过多的填充剂会导致硬度过低，更易产生塑形形变，降低片剂的机械强度。随着填充剂的占比的增加压片的白度显著增加。
表8填充剂添加量对咀嚼片颗粒收率、休止角、硬度、白度的影响
图25表示崩解时限与压片的感官评分随填充剂添加量改变的变化，在微晶纤维素添加量＜10g范围内，崩解时间随着添加量的增高而降低，在超过10g的添加范围后崩解时间开始上升，在添加量为10g时崩解时间最低，桑叶降血糖肽溶出速率最快，崩解时间的变化和硬度的变化相反，塑性形变与崩解时间紧密相关，塑形形变程度的上升会延长片剂的崩解时间。随着填充剂添加量的逐渐增加，咀嚼片的成形性得到提升，硬度不断增大，口感也由粗糙转向细腻，感官品质好转，其中在添加量为10g、12.5g时最高，两者没有显著性差异，超过这一范围后，过多的填充剂无法与其他辅料进行黏合，导致压片不易崩解，适口性降低，片剂太过干燥且易碎，片剂的品质下降。综合片剂的颗粒收率、休止角、硬度和白度等指标，填充剂在10g和12.5g时品质较优，其中在添加量为12.5g时白度最高颗粒收率也显著大于其他实验组，原料利用率较高，因此选择填充剂添加量为12.5g进行后续实验。
2.3矫味剂种类对咀嚼片品质的影响
片剂的口感对于产品整体的品质和接受度有很大影响。本发明选择木糖醇、甘露醇、无糖奶粉作为片剂的备用矫味剂。为防止咀嚼片口味过于单调，对上述三种矫味剂两两混合(混合总重为20g)即N+G(无糖奶粉：甘露醇＝1：1)、M+G(木糖醇：甘露醇＝1：1)、N+M(无糖奶粉：木糖醇＝1：1)。表9显示三种矫味剂混合类型对于咀嚼片制备过程中各项指标的影响，选择无糖奶粉和木糖醇时颗粒得率最高，但是休止角低于其他两个矫味剂组合，这说明该组合原料的利用率较高，但是其流动性不好，不利于压片。对于木糖醇和甘露醇组合休止角与无糖奶粉和木糖醇组合没有显著性差异，但是颗粒收率最低，对于原料的利用率并不高，选择无糖奶粉和甘露醇这一矫味剂时休止角仅为21.73°，其软材的流动性良好，硬度也最大，机械强度适中，品质较好，因此无糖奶粉和甘露醇符合作为理想的矫味剂材料。
表9矫味剂混合种类对咀嚼片颗粒收率、休止角、硬度的影响
表10矫味剂种类对咀嚼片色度的影响
表10显示矫味剂种类对于咀嚼片色泽的影响，其中无糖奶粉加甘露醇、奶粉甘露醇的组合两个组合的L*没有显著性差异，而木糖醇加甘露醇的组合的L*显著大于另外两者组合，这说明其的明暗值较高，但是在对红绿值、黄蓝值进行整合计算和所得出来的三者的白度W没有显著性差异(p＞0.05)。图26表示的是不同矫味剂种类对于片剂的崩解时限和感官评分的影响，矫味剂种类的不同其崩解时间有显著性差异，无糖奶粉加木糖醇组合的崩解时间最高且显著高于另外两组，当选择另外两组原料作为矫味剂时片剂中的桑叶降血糖肽更容易溶出，生物利用率高，是理想的矫味剂选择材料。矫味剂种类的改变对咀嚼片的感官评分有显著影响(p<0.05)。当选择以无糖奶粉和甘露醇作为矫味剂时感官评分显著大于另外两组矫味剂，奶粉具备独特口感和甘露醇具备的甜味相结合使咀嚼片具有香甜、清爽的口感，同时也掩盖了桑叶降血糖肽本身的腥味。
2.4矫味剂添加量对咀嚼片品质的影响
表11表示在不同矫味剂添加量对于咀嚼片软材的颗粒收率、休止角以及成片的硬度、白度的影响，矫味剂添加量的改变对于各项指标都有明显的影响。随着矫味剂添加量的增加颗粒收率呈现出先增大后减少的趋势，在添加量在20g～25g时最大，原辅料的利用率最高，休止角表现出相反的趋势，在颗粒收率达到极大值时休止角也达到极小值，原辅料具有良好的流动性，适合于压片，压片的硬度在添加量为25g时达到最大值且于30g时没有显著性差异。随着矫味剂添加量的增加压片的白度也呈现一直上升的趋势。
表11矫味剂添加量对颗粒收率、休止角、硬度、白度的影响
图27表示矫味剂添加量改变时其感官评分的变化，不同的矫味剂添加量对于感官评分有显著影响且随着矫味剂的增加感官评分呈现先增加后降低的趋势，矫味剂越多片剂的奶香味就越重，对于活性肽本身的腥味掩盖效果就越好，但是在矫味剂添加过多时又会造成片剂过甜过腻，因此对于桑叶降血糖肽咀嚼片的矫味剂要控制在合适的范围，综合考虑以上各种指标选择矫味剂添加量20g进行下一步实验。
2.5黏合剂种类对咀嚼片品质的影响
选用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、水、羟丙基甲基纤维素(HPMC)这三种常见的黏合剂，通过综合评价选出最优的一种，各项指标测试结果如表12、表13、图28所示。
表12显示的是不同黏合剂类型对于颗粒收率、硬度、休止角的影响，在选择羧甲基纤维素钠作为片剂的黏合剂时其软材的颗粒收率最大，原料的利用率最高，对于原辅料的浪费最少，同时其休止角也最小，显著小于以水作为黏合剂的软材，这说明羧甲基纤维素钠实验组的软材颗粒流动性好，有助于压片，成片的硬度显著高于水，保证了咀嚼片的机械强度，此时片剂拥有较好的适口性。
表12不同黏合剂类型对颗粒收率、休止角、硬度的影响
表13不同黏合剂类型对片剂色度的影响
表13中可知三种黏合剂对于片剂的明亮度(L*)没有显著性影响。通过三种黏合剂成片通过综合计算得出的白度(W)没有显著性差异。图28中可知，以水作为黏合剂的压片崩解时限最长，羧甲基纤维素钠实验组的片剂崩解时间最短，活性成分更易释放，生物利用率最高。黏合剂种类的改变对咀嚼片的感官评分有显著影响(p<0.05)。当选择羧甲基纤维素钠作为桑叶降血糖肽咀嚼片的黏合剂时，咀嚼片的感官评分最高，代表其质量最好。
2.6黏合剂添加量对咀嚼片品质的影响
本实验通过改变黏合剂的添加量来探究其对于颗粒收率、休止角、硬度等指标的影响，各项指标的结果如表14、图29所示。表14显示了CMC-Na添加量不同时桑叶降血糖肽咀嚼片的颗粒收率、休止角、硬度、白度的变化情况，CMC-Na添加量的改变对咀嚼片的颗粒收率、休止角、硬度、白度均有显著影响(p＜0.05)，随着黏合剂添加量的增加，颗粒收率呈现先增加后减小的趋势，在CMC-Na添加量为1.5g时颗粒收率最大，原料的利用率最高，同时休止角也在此时达到最小，物料的流动性良好，休止角的变化与颗粒收率的变化趋势相反，在黏合剂添加量过多时CMC-Na所具备的吸湿性表现出来，影响颗粒干燥效果导致软材的流动性变差。当添加量为2.0g时硬度达到最高值，片剂的白度呈现出先升高后降低的趋势，其在添加量为1.5g时达到最高，显著高于其他实验组，说明此时片剂的洁白度和光泽最佳，在添加量过高时产品的白度又会降低，这是因为CMC-Na的吸湿性改变了压片内部各原料的结合状态导致产品白度改变。
表14不同黏合剂添加量对颗粒收率、休止角、硬度、白度的影响
图29表示不同黏合剂添加量对咀嚼片崩解时限和感官评分的变化，黏合剂添加量的改变对咀嚼片的崩解时限有显著影响(p＜0.05)，在添加量升高的同时崩解时间也同样一直在升高，这是因为随着黏合剂增多，其成品片剂的各成分之间的结合更加紧密，成片的表面疏水作用越明显，导致崩解时间的增加。黏合剂添加量的改变对样品的感官评分有显著影响(p＜0.05)。随着黏合剂添加量的增加，感官评分呈现先增大后减小的趋势，这类变化主要是由于片剂质地结构的改变引起的适口性不同，添加量过多可能会导致片剂更加黏牙，不易吞咽，而添加量过少则会导致片剂机械强度小、产品掉渣等不良影响，导致感官评分较低。综合以上各方面因素最终选择添加量为1.5g各方面品质最佳。
2.7润滑剂添加量对咀嚼片品质的影响
片剂的润滑剂需要同时具备抗粘性、增流性和润滑性。硬脂酸镁别名十八酸镁，白色、为蓬松细粉，是食品药品制备工艺中常见的功能润滑剂。硬脂酸镁具备金属盐类的特性同时也具备硬脂酸镁的特性，作为润滑剂加入到片剂产品中时可以把硬脂酸固有的脂肪特性发挥出来，改变物料颗粒之间的结合力，从而对片剂产生一定的软化作用。本发明选用硬脂酸镁作为桑叶降血糖肽的润滑剂，通过改变硬脂酸镁的添加量再结合硬度、白度、崩解时限等指标来探究其添加量对咀嚼片的影响。表15表示硬脂酸镁添加量对桑叶降血糖肽咀嚼片色度和硬度的影响，润滑剂添加量对于产品的白度、硬度有显著性影响。随着润滑的增多产品的白度呈现下降的趋势，片剂的硬度也呈现出下降的趋势，在片剂中适当性的添加硬脂酸镁，可以增加原辅料在压片过程中的流动性，使压片更加均匀，从而减少颗粒间的孔隙，同时在硬脂酸镁添加量超过一定范围后也可能会影响物料间的粘合，导致产品的硬度下降。
表15不同润滑剂添加量对硬度、白度的影响
图30显示了硬脂酸镁添加量对桑叶降血糖肽咀嚼片崩解时限的影响。润滑剂添加量的改变对咀嚼片的崩解时限有显著影响(p<0.05)。随着硬脂酸镁添加量的增加，崩解时限呈现不断延长的趋势。对比不同硬脂酸镁添加量对于硬度的变化情况说明片剂的硬度与崩解时限没有必然联系。润滑剂添加量的改变对咀嚼片的感官评分有显著影响(p<0.05)。其中在硬脂酸镁添加量为1.5g时感官评价最高，片剂中由于有硬脂酸镁的存在，改善了片剂的质量使得片剂入口更加丝滑、口感更加细腻，更易于人接受。综合以上各指标分析可以得出，在硬脂酸镁添加量为1.5g时咀嚼片的各方面最佳。
2.8正交试验
以上述单因素实验结果为根据，设计4因素3水平正交试验L934。对正交试验结果进行极差R值的分析可知，填充剂添加量(A)、矫味剂添加量(B)、黏合剂添加量(C)和润滑剂添加量(D)这4个因素对降血糖桑叶肽感官鉴评评分影响的主次顺序为B＞A＞C＞D。由表16可知，降血糖桑叶肽咀嚼片的最佳配方为A1B2C2D3，由于该试验组合(A1B2C2D3)在正交试验表中并未出现，因此进行验证试验，验证实验的结果如表17所示，对于填充剂添加量为10g，矫味剂添加量为20g、黏合剂为1.5g，润滑剂为1g时咀嚼片的方面指标能到较优水平，其中硬度控制在了5000以下，崩解时间较短，休止角为20.9°，颗粒的流动性良好，利于压片成型，其色泽也饱满完整，咀嚼片入口口感细腻，具有奶香味和甜味，清凉甜爽，其成品咀嚼片如图31所示。
表16正交试验结果
表17验证试验结果
2.9总结
本发明探究了填充剂、矫味剂、黏合剂和润滑剂种类及添加量对桑叶降血糖肽咀嚼片制备的影响，通过单因素和正交实验优化得出最佳的制片工艺为：填充剂(微晶纤维素)添加量为10g，矫味剂(甘露醇：无糖奶粉＝1：1)添加量为20g、黏合剂(羧甲基纤维素钠)为1.5g，润滑剂(硬脂酸镁)为1g、桑叶降血糖肽添加量为2g，通过此方法得到的咀嚼片各方面性能良好，在制备软材中颗粒收率达到66.67％，休止角20.90°硬度4624.03g，白度11.17，崩解时限4min，感官评分93.33分。其成品咀嚼片不包含糖类食品添加剂且色泽明亮，光洁完整，硬度适中适宜咀嚼，其口感细腻清爽，适口性良好。

Claims (7)

1.具有降血糖功能的桑叶肽，其特征在于：所述桑叶肽包含如下氨基酸序列：AAGRLPGY、VVRDFHNA、RWPFFAFM。
2.根据权利要求1所述桑叶肽，其特征在于：所述桑叶肽的制备方法包括以下步骤：
(1)桑叶粗蛋白的提取：以桑叶为原料，经过浸提、沉淀、透析除盐步骤后得到桑叶粗蛋白；
(2)酶解：去除步骤(1)得到的所述桑叶粗蛋白中内源蛋白酶抑制剂的活性，再采用碱性蛋白酶进行酶解，结束后离心，取上清所得溶液即包含所述桑叶肽；
其中，步骤(2)中的酶解工艺条件为：反应温度为53.0℃、反应时间4.7h、酶添加量17800U/g、底物浓度0.5％。
3.权利要求1-2任一项所述桑叶肽在食品、保健品、药品方面的应用。
4.具有降血糖功能的咀嚼片，其特征在于：所述咀嚼片包含权利要求1-2任一项所述桑叶肽。
5.根据权利要求4所述咀嚼片，其特征在于：所述咀嚼片还包含有填充剂、矫味剂、黏合剂、润滑剂。
6.根据权利要求5所述咀嚼片，其特征在于：所述填充剂为微晶纤维素；所述矫味剂为甘露醇和无糖奶粉，甘露醇和无糖奶粉的质量比为1：1；所述黏合剂为羧甲基纤维素钠；所述润滑剂为硬脂酸镁。
7.根据权利要求6所述咀嚼片，其特征在于：填充剂：矫味剂：黏合剂：润滑剂：桑叶肽的质量比为10:20:1.5:1:2。
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