CN114196684A

CN114196684A - 玉米ZmCYP724B3基因及其用途

Info

Publication number: CN114196684A
Application number: CN202111076696.2A
Authority: CN
Inventors: 郭新梅; 孙智仪; 宋希云; 张恩盈; 李军; 裴玉贺; 赵美爱
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2021-09-14
Filing date: 2021-09-14
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2041-09-14
Also published as: CN114196684B

Abstract

本发明公开了ZmCYP724B3基因在改善目标植物性状中的用途，ZmCYP724B3基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。本发明还公开了一种改善目标植物性状的育种方法，育种方法为：将ZmCYP724B3基因的编码序列转入目标植物基因组，使经转基因的目标植物能够表达蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示的ZmCYP724B3基因。改善目标植物性状选自：提高目标植物的抗旱性；增加目标植物的生物量；减缓或修复目标植物的细胞损伤；提高目标植物的生长发育相关基因的表达量；提高目标植物的抗旱相关基因的表达量；促进目标植物生长。目标植物为玉米或烟草。

Description

玉米ZmCYP724B3基因及其用途

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及玉米ZmCYP724B3基因的用途，特别涉及玉米ZmCYP724B3基因在植物抗旱育种中的用途。

背景技术

玉米(Zea mays L.)，是世界也是我国最重要的粮食作物之一，不仅种植范围广、产量高而且用途多。玉米生产对满足市场需求和保障国家粮食安全具有非常重要的意义。选育优质玉米品种，提高单位土地面积产量才是玉米现在和将来的发展之路。据调查，我国淡水资源人均占有率仅为世界平均占有率的四分之一，属于缺水国家。我国水资源存在着分配不均、工农业污染、利用率低、资源匮乏等问题，作为农业大国，水是发展农业的基础，发展高效节水型农业具有重要意义。选择耐旱作物是从根本上减少水资源的消耗，达到节水的目的，因此，开发研究耐旱作物在缓解水资源矛盾上具有重要的意义。干旱会引起植株体内水分减少，影响生理生化过程，进而影响生长发育。细胞色素P450(CytochromeP450，CYP450s)家族基因种类众多，到目前研究为止，基因个数已超过13 000个，该家族是基因数据库中最大的蛋白质家族，而且，新的基因还在不断被发现。该家族基因参与动物、植物、微生物及人体生命活动的诸多过程。

发明内容

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本研究将玉米ZmCYP724B3基因克隆并转化至野生型本生烟，探究该基因的过表达对本生烟生长发育和抗旱性等方面的影响。CYP450家族基因功能多样，研究该家族基因功能对研发优质作物品种具有重要的意义。

本发明第一方面提供了一种ZmCYP724B3基因，所述ZmCYP724B3基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。

在一些实施方式中，所述ZmCYP724B3基因的核酸编码序列如SEQ ID NO.25所示。

本发明第二方面提供了ZmCYP724B3基因在改善目标植物性状中的用途，所述ZmCYP724B3基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；

所述改善目标植物性状选自：提高所述目标植物的抗旱性；增加所述目标植物的生物量；减缓或修复所述目标植物的细胞损伤；提高所述目标植物的生长发育相关基因的表达量；提高所述目标植物的抗旱相关基因的表达量；和促进所述目标植物生长中的任一种或其组合。

在一些实施方式中，所述提高所述目标植物的抗旱性选自：提高所述目标植物中脯氨酸的含量；和/或提高所述目标植物中叶片相对含水量。

在一些实施方式中，所述增加所述目标植物的生物量选自：提高所述目标植物的叶长；提高所述目标植物的叶宽；提高所述目标植物的叶面积；提高所述目标植物的株高；提高所述目标植物的茎粗；提高所述目标植物的地上鲜重；提高所述目标植物的地下鲜重；提高所述目标植物的根长；和提高所述目标植物的根面积中的任一种或其组合。

在一些实施方式中，所述减缓或修复所述目标植物的细胞损伤选自：降低所述目标植物的叶绿素含量；降低所述目标植物的丙二醛含量；提高所述目标植物的过氧化氢酶含量；提高所述目标植物的超氧化物酶含量；和提高所述目标植物的过氧化物酶含量中的任一种或其组合。

在一些实施方式中，所述生长发育相关基因为LNG1基因和/或AN3基因。

在一些实施方式中，所述抗旱相关基因为LEA5基因和/或ACTIN基因。

在一些实施方式中，所述目标植物为玉米或烟草。

本发明第三方面提供了一种改善目标植物性状的育种方法，所述育种方法为：将ZmCYP724B3基因的编码序列转入目标植物基因组，使经转基因的所述目标植物能够表达所述ZmCYP724B3基因，所述ZmCYP724B3基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；所述改善目标植物性状选自：提高所述目标植物的抗旱性；增加所述目标植物的生物量；减缓或修复所述目标植物的细胞损伤；提高所述目标植物的生长发育相关基因的表达量；提高所述目标植物的抗旱相关基因的表达量；和促进所述目标植物生长中的任一种或其组合。

在一些实施方式中，所述目标植物为玉米或烟草。

在一些实施方式中，所述育种方法包括如下步骤：S1：将所述ZmCYP724B3基因的编码序列克隆到植物表达载体，得到重组载体；S2：将所述重组载体转化农杆菌，得到重组农杆菌；S3：用所述重组农杆菌转化所述目标植物，得到转基因的所述目标植物。

在一些实施方式中，所述植物表达载体为植物双元表达载体。

在一些实施方式中，所述植物双元表达载体为pCambia1300。

在一些实施方式中，所述农杆菌为LBA4404。

ZmCYP724B3基因在本生烟中的过表达促进了本生烟的生长发育，负调控转ZmCYP724B3基因本生烟的干旱敏感能力，但是转ZmCYP724B3基因本生烟更耐旱。

附图说明

图1示出了玉米昌7-2与TC19多年多点籽粒表型鉴定结果。

图2示出了昌7-2和TC19籽粒不同发育时期ZmCYP724B3基因的相对表达量。

图3示出了自然干旱胁迫下玉米ZmCYP724B3基因的表达情况。

图4示出了6种不同激素处理下玉米ZmCYP724B3基因的表达情况。

图5示出了ZmCYP724B3蛋白质保守区预测结果。

图6示出了本生烟叶片的转基因植株培育过程。

图7示出了转基因本生烟中ZmCYP724B3的相对表达水平。

图8示出了T₃代转ZmCYP724B3基因本生烟萌发期表型。

图9示出了T₃代转ZmCYP724B3基因本生烟萌发期发芽率(A)及根长比较(B)。

图10示出了T₃代转ZmCYP724B3基因本生烟1月龄株型对比情况。

图11示出了T₃代转ZmCYP724B3基因本生烟1月龄表型鉴定情况。

图12示出了T₃代转ZmCYP724B3基因本生烟荚果鉴定情况。

图13示出了T₃代转ZmCYP724B3基因本生烟不同干旱时期表型对情况。

图14示出了自然干旱胁迫处理下本生烟叶片叶绿素含量、相对电导率、脯氨酸(Pro)、相对含水量(RWC)。

图15示出了自然干旱胁迫处理下本生烟叶片丙二醛(MDA)含量和过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性的变化情况。

图16示出了T₃代转ZmCYP724B3基因本生烟生长发育和抗旱相关基因表达情况。

图17示出了自然干旱胁迫处理下本生烟油菜素甾醇(BR)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA)、乙烯(ETH)含量的变化情况。

注：附图中，“*”：差异显著(P<0.05)，“**”：差异极显著(P<0.01)。

具体实施方式

本申请没有详细说明的材料为本领域常用材料，可通过商业途径购买获得。本申请没有详细说明的方法和步骤，为本领域常规操作，可参考技术手册或商用仪器或试剂说明书来操作，或委托商业服务机构完成。

材料：本发明的材料为玉米自交系昌7-2及其大粒突变体TC19(即玉米新材料昌新19)和野生型本生烟种子。

引物：用软件Primer Premier5设计表1所示引物，委托上海派森诺生物科技股份有限公司合成。

表1.引物序列

实施例1：玉米昌7-2与TC19成熟期籽粒表型鉴定

对玉米昌7-2和TC19成熟期籽粒进行多年多点拷种，结果参见图1，其中，HN：海南，JZ：胶州；A：粒宽，B：粒长，C：粒厚，D：百粒重。这两种玉米籽粒在不同年份、不同地点均表现为TC19的粒长、粒宽、粒厚及百粒重显著或极显著大于昌7-2，说明这两种玉米籽粒之间的差异是由遗传因素决定的。

实施例2：ZmCYP724B3基因的表达分析

1)方法

以玉米自交系昌7-2或其大粒突变体TC19为材料，使用Plant RNA ExtractionKit试剂盒(购买于Takara公司)，按照试剂盒说明书的操作进行RNA提取，得到总RNA。使用Master mix，将总RNA反转录成cDNA。以表1所示qRT-ZmCYP724B3-F和qRT-ZmCYP724B3-R为引物，以qRT-Actin-F和qRT-Actin-R为内参，针对cDNA进行荧光定量PCR检测，具体检测项目如下。

2)ZmCYP724B3基因的时间和品种特异性表达分析

为检测昌7-2与TC19玉米籽粒不同发育时期ZmCYP724B3基因的相对表达量，对授粉14、21和28DAP(Days after pollination)的玉米籽粒中ZmCYP724B3基因的相对表达量进行实时荧光定量分析。结果参见图2。由图2可见，ZmCYP724B3基因表达具有品种及时期差异性，TC19玉米籽粒中ZmCYP724B3基因的相对表达量显著高于昌7-2。其中，在TC19授粉21天后的籽粒中ZmCYP724B3基因表达量最高，因此，推测该基因与粒长、粒宽、粒厚及百粒重等籽粒发育相关。

3)ZmCYP724B3基因在自然干旱胁迫下的表达分析

以玉米自交系昌7-2为材料，在玉米三叶期时，进行自然干旱胁迫处理。试验设置2个处理：(1)对照组(无干旱处理)：WT；(2)处理组：自然干旱；用实时荧光定量PCR方法检测玉米ZmCYP724B3基因在自然干旱条件下7天不同部位(根、茎、叶)的表达量，结果如图3中A所示。由此可见，自然干旱胁迫上调了玉米ZmCYP724B3基因的表达，说明ZmCYP724B3基因受自然干旱胁迫调控且具有抗旱功能。

用实时荧光定量PCR方法检测玉米ZmCYP724B3基因在自然干旱条件下不同时间点(0、12、24、36、48h)根、茎、叶中该基因的表达量，三叶期玉米的根、茎、叶3个组织器官在不同时间自然干旱胁迫处理下，玉米ZmCYP724B3基因的表达量情况分别参见图3中B、C、D。由图可见，自然干旱胁迫处理下ZmCYP724B3基因在根、茎、叶中的表达量都降低了，而且3个组织器官中的基因表达量都随着干旱时间的增加先骤降再缓慢增加并趋于稳定，在干旱处理12h时基因表达量最低。而达到7天表达量是提高的(见A)，这可能是玉米ZmCYP724B3基因在干旱轻微的时候被抑制而低表达，干旱比较严重时才被激活，对干旱的损伤进行保护或修护。

4)ZmCYP724B3基因在不同激素处理下的表达分析

为探究玉米ZmCYP724B3基因是否响应激素调控，对三叶期玉米幼苗进行激素处理，试验设置两个处理：(1)对照组:WT；(2)处理组分别为:脱落酸(ABA、处理液浓度50μmol/L)、油菜素甾醇(BR，处理液浓度10μmol/L)、乙烯(ETH，处理液浓度25mmol/L)、赤霉素(GA、处理液浓度100μmol/L)、茉莉酸(JA，处理液浓度50μmol/L)、水杨酸(SA，处理液浓度2mmol/L)，每个处理三次重复，每个重复至少3株。处理的第0h、1h、3h、6h、9h、12h分别进行取样，并测定玉米叶片中ZmCYP724B3基因在不同激素处理下的表达水平。每种激素处理中，将0小时基因表达量设置为1，计算其他时间的相对值。结果如图4所示，由此可见，ABA和BR处理下调了该基因的表达，ETH、SA、GA和JA处理上调了该基因的表达，6种激素处理下的基因表达模式都不相同。

实施例3：ZmCYP724B3基因的克隆与生物信息分析

以玉米TC19叶片组织为材料，采用实施例2相同的方法得到cDNA，以表1所示ZmCYP724B3-F和ZmCYP724B3-R为引物，进行PCR扩增反应，反应产物经凝胶电泳显示约为1450bp的单一条带。

通过Taq酶催化反应，使前述PCR产物平末端变成以A为末端碱基的粘性末端。

通过DNA连接酶催化反应，将末端加A的PCR产物连接到pMD19-T载体，将重组载体命名为pMD19T-ZMCYP724B3。

将pMD19T-ZMCYP724B3转化入大肠杆菌感受态细胞，以表1所示ZmCYP724B3-F和ZmCYP724B3-R为引物，对菌落中核酸进行PCR扩增反应，扩增得到大小约为1450bp的单一条带进行后续DNA测序。

对前述PCR扩增产物进行DNA测序，通过Bioxm软件对ZmCYP724B3基因进行序列分析，结果显示ZmCYP724B3基因所编码的开放阅读框的序列长度为1446bp，具体序列如下(SEQ ID NO.25)：

ATGATGATGATGATGGCGGGGGAGCACGTGCTGGCCGCTCTGGCCACCCTGCTTCTGGCCTCGCTCCTGACCCTGGTGCTGAACCACTTCCTGCCCTTGCTTCTGAACCCCAAGGCCCCCAGGGGAAGCTTCGGGTGGCCGCTCCTCGGCGAGACGCTCAGGTTCCTCACGCCGCACGCCTCCAACACGCTGGGCGGCTTCCTCGAGGATCACTGCTCCAGGTATGGGCGGGTGTTCAAGTCCCACCTGTTCTGCACCCCGACGGTGGTGTCCTGCGACCAGGACCTCAACCACTTCATCCTGCAGAACGAGGAGCGGCTGTTCCAGTGCAGCTACCCGAGGCCGATCCATGGCATCCTGGGCAAGTCCTCCATGCTCGTCGTCCTGGGCGAGGACCACAAGCGCCTCAGGAACCTCGCCCTCGCCCTCGTCACCTCCACCAAGCTCAAGCCCAGCTACCTAGGCGACATCGAGAAGATCGCGCTGCACGTCGTCGGCGCATGGCGACGGCACGGCGGCGTCAGGGTCGTCGCATTCTGCGAGGAGGCAAGAAAGTTCGCATTCAGTGTGATAGTGAAGCAGGTGCTGGGGCTGTCGCCAGAGGAGCCGGTCACTGCAAGGATACTGGAGGACTTCCTGGCCTTCATGAAGGGACTCATCTCCTTCCCCCTCTACATCCCAGGGACCCCATATGCCAAGGCTGTCCGGGCGAGAGAGAGGATATCCAGCACTGTGAAGGGCATCATCAAGGAGCGGAGGAGCGCTGGGTCATGCAACAAGCAGGGCGACTTCCTTGACGTGCTGCTGTCAAGCGACGAGCTATCTGACGAGGAGAAAGTGAGCTTTGTGCTGGACTCCCTGCTGGGAGGATATGAGACCACCTCGCTCCTCATCTCCATGGTCGTTTATTTCCTTGGCCAGTCTGCTCAAGATCTGGACCTGGTTAAGAGGGAGCACTACAGCATAAGATCCAACAAAGGCAAGGAGGAGTGCTTGACTTCAGAAGACTACAAGAAGATGGAATATACCCAACAAGTCATCAACGAGGCGCTGAGATGCGGCAACATCGTCAAGTTCGTCCACAGGAAGGCGCTGAAAGACGTCAAATACAAAGAGTATCTGATTCCATCTGGCTGGAAGGTCCTACCGGTCTTCACTGCCGTTCATCTGAACCCCTCACTTCATGGAGACGCGCAGCAGTTTCAGCCCTGTAGGTGGGAGGGCACAAGCCAAGGGACAAGCAAGAGGTTTACACCGTTCGGTGGTGGCCCCAGGCTCTGCCCAGGATCAGAGCTCGCTAAAGTGGAGGCTGCTTTCTTCCTCCATCACCTTGTCCTCAATTATAGATGGAGAATTGACGGCGATGACATTCCAATGGCATACCCGTATGTGGAGTTTCAGAGAGGTCTGCCAATAGAAATCGAGCCAACGTCCCCTGAATCTTGA

ZmCYP724B3基因编码481个氨基酸，具体序列如下(SEQ ID NO.26)：

MMMMMAGEHVLAALATLLLASLLTLVLNHFLPLLLNPKAPRGSFGWPLLGETLRFLTPHASNTLGGFLEDHCSRYGRVFKSHLFCTPTVVSCDQDLNHFILQNEERLFQCSYPRPIHGILGKSSMLVVLGEDHKRLRNLALALVTSTKLKPSYLGDIEKIALHVVGAWRRHGGVRVVAFCEEARKFAFSVIVKQVLGLSPEEPVTARILEDFLAFMKGLISFPLYIPGTPYAKAVRARERISSTVKGIIKERRSAGSCNKQGDFLDVLLSSDELSDEEKVSFVLDSLLGGYETTSLLISMVVYFLGQSAQDLDLVKREHYSIRSNKGKEECLTSEDYKKMEYTQQVINEALRCGNIVKFVHRKALKDVKYKEYLIPSGWKVLPVFTAVHLNPSLHGDAQQFQPCRWEGTSQGTSKRFTPFGGGPRLCPGSELAKVEAAFFLHHLVLNYRWRIDGDDIPMAYPYVEFQRGLPIEIEPTSPES

通过NCBI的保守功能区域分析程序CDS(Conserved Domains)分析ZmCYP724B3基因保守区，结果如图5所示，表明ZmCYP724B3基因属于细胞色素P450超家族。通过ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在线软件对ZmCYP724B3基因进行预测分析，结果显示ZmCYP724B3基因所编码的蛋白质分子式为C₄₂₁₇H₆₉₉₀N₁₄₄₆O₁₇₃₈S₄₂₄，相对分子量为53.99kD，理论等电点为8.55，正电荷残基(Arg+Lys)总数为56，负电荷残基(Asp+Glu)总数为51，不稳定系数为46.49，属于不稳定型蛋白。

实施例4：转ZmCYP724B3基因烟草的制备

1)植物表达载体pCambia1300-ZmCYP724B3的构建

以Xba I-ZmCYP724B3-F、Bam HI-ZmCYP724B3-R为引物(见表1)，使用高保真酶对pMD19T-ZmCYP724B3进行PCR扩增，在质粒的两端加上保护碱基，并回收。将回收产物与植物表达载体pCambia1300分别用Xba I和Bam HI进行双酶切，DNA连接酶连接，将连接产物植物表达载体命名为：pCambia1300-ZMCYP724B3。将pCambia1300-ZMCYP724B3转化入大肠杆菌感受态细胞，以表1所示ZmCYP724B3-F和ZmCYP724B3-R为引物，对菌落中核酸进行PCR扩增反应，经凝胶电泳显示，扩增得到大小约为1450bp的单一条带的菌落，为转化成功的菌。

2)ZmCYP724B3基因遗传转化本生烟

将pCambia1300-ZMCYP724B3转化农杆菌LBA4404感受态细胞，以表1所示ZmCYP724B3-F和ZmCYP724B3-R为引物，进行PCR扩增验证。将转化成功的农杆菌遗传转化本生烟，本生烟叶片的侵染及筛选过程参见图6，其中，A：离体叶片、B：愈伤组织、C：幼芽、D：诱导生根植株、E：已生根植株、F：正常生长植株。

以表1所示ZmCYP724B3-F和ZmCYP724B3-R为引物，对转基因本生烟基因组DNA进行PCR扩增，挑选阳性转基因植株，以表1所示qRT-ZmCYP724B3-F和qRT-ZmCYP724B3-R为引物，检测ZmCYP724B3基因在阳性转基因本生烟中的表达情况，选取相对表达量高的3个株系，命名为D1、D2、D3，用于后续实验，它们与野生型烟草中的ZmCYP724B3基因相对表达量参见图7。

实施例6：转ZmCYP724B3烟草对干旱胁迫响应

观察野生型本生烟和T3代转ZmCYP724B3基因本生烟萌发期的根长、发芽率及自然干旱胁迫下的生长状况。结果如图8所示，图A是10天龄本生烟根长的比较，可以看出3个转ZmCYP724B3基因株系的根长明显长于野生型本生烟；图B是萌发期发芽率的比较，4个株系没有明显差别；图C是10天龄本生烟自然干旱胁迫7天的结果，可以看出D2、D3两个株系的长势明显好于野生型本生烟，但是，D1株系和野生型株系长势没有明显区别。

测定萌发期转ZmCYP724B3基因本生烟和野生型本生烟的发芽率和根长，结果参见图9，由此可见，ZmCYP724B3基因在本生烟的过表达略微促进发芽率，但显著促进了植株根长的生长，转基因株系的根长约是野生型植株的1.5倍。

通过观察相同种植条和管理件下1月龄转ZmCYP724B3基因本生烟和野生型本生烟表型，结果参见图10，由此可见，转ZmCYP724B3基因本生烟和野生性本生烟的叶片、茎粗、株高、根系等有明显差别，说明ZmCYP724B3基因参与了本生烟的生长发育。

测量转ZmCYP724B3基因本生烟和野生型本生烟的表型性状，结果参见图11，由此可见，转ZmCYP724B3基因本生烟的叶长(A)、叶宽(B)、叶面积(C)、株高(D)、茎粗(E)、地上鲜重(F)、地下鲜重(G)、根长(H)、根面积(I)均显著高于野生型本生烟，说明ZmCYP724B3基因在本生烟的过表达促进了植株的生长发育。

通过观察转ZmCYP724B3基因本生烟和野生型本生烟的荚果表型和测定荚果重量，结果参见图12，由此可见，二者具有一些差异。

为了进一步研究ZmCYP724B3基因对干旱胁迫的响应，本实验对T₃代转ZmCYP724B3基因和野生型一月龄本生烟进行自然干旱胁迫处理。结果参见图13，A：干旱3天，B：干旱7天，C：干旱15天，D：复水3天，E：成熟；WT为野生型本生烟草，D1、D2、D3为3个转ZmCYP724B3基因株系。由此可见，自然干旱处理3天时，转ZmCYP724B3基因本生烟首先出现萎蔫，第7天时，野生型本生烟也出现萎蔫，但转ZmCYP724B3基因本生烟萎蔫程度更严重，持续干旱15天，野生型本生烟明显比转ZmCYP724B3基因本生烟生长缓慢，复水3天后，野生型本生烟和转ZmCYP724B3基因本生烟均恢复生长，但不能正常结实。

对四周龄的野生型本生烟和转ZmCYP724B3基因本生烟进行自然干旱处理。在干旱处理第0天、第3天(初次有株系出现萎蔫，即转ZmCYP724B3基因株系叶片萎蔫)、第7天(4个株系叶片均萎蔫)、第15天(干旱胁迫后，本生烟可以恢复生长的极限)、复水3天、成熟5个时期分别取样，测定叶片相对含水率、相对电导率、叶绿素、丙二醛、脯氨酸、6种激素(脱落酸、油菜素甾醇、乙烯利、赤霉素、茉莉酸、水杨酸)的含量和过氧化物酶、超氧化物酶、过氧化氢酶的活性，并观察复水后株系是否能正常完成生长发育开花结实。

在自然干旱胁迫条件下，转ZmCYP724B3基因本生烟和野生型本生烟的叶绿素含量、相对电导率、脯氨酸含量和相对含水量如图14所示。其中，A：叶绿素含量，B：相对电导率；C：脯氨酸含量，D：相对含水量；WT为野生型本生烟草，D1、D2、D3为3个转ZmCYP724B3基因株系；Dr0：干旱0天，Dr3:干旱3天，Dr7:干旱7天，Dr15:干旱15天，Re3:复水3天，Maturity：成熟。

图A显示的是1月龄本生烟在自然干旱胁迫处理后不同时期(Dr0、Dr3、Dr7、Dr15、Re3、Maturity)的叶片叶绿素含量的变化情况。由图可知，野生型本生烟和转ZmCYP724B3基因本生烟的变化趋势是一致的，先增加后减少，干旱3天后叶绿素含量达到最大值，之后叶绿素含量随时间增加而减少。

图B显示的是1月龄本生烟在自然干旱胁迫处理后不同时期(Dr0、Dr3、Dr7、Dr15、Re3、Maturity)的叶片相对电导率的变化情况。由图可知，野生型本生烟和转ZmCYP724B3基因本生烟的变化趋势一致，先增加后减少，Dr0时，野生型本生烟和转ZmCYP724B3基因本生烟的相对电导率几乎一致，Dr3-Dr7时期，野生型本生烟的相对电导率显著低于转ZmCYP724B3基因本生烟，Dr15时，野生型本生烟的相对电导率显著高于转ZmCYP724B3基因本生烟，且二者相对电导率都达到最大值，Re3-Maturity时期，二者相对电导率又趋近于一致。说明，Dr3-Dr7时期野生型本生烟细胞膜受到的损伤比转ZmCYP724B3基因本生烟小，Dr15时，野生型本生烟细胞膜受到的损伤比转ZmCYP724B3基因本生烟大。

图C显示的是1月龄本生烟在自然干旱胁迫处理后不同时期(Dr0、Dr3、Dr7、Dr15、Re3、Maturity)的脯氨酸含量的变化情况。由图可知，野生型本生烟和转ZmCYP724B3基因本生烟的变化趋势一致，先增加后减少。Dr0-Dr7时期，野生型本生烟比转ZmCYP724B3基因本生烟的脯氨酸含量高，Dr15时，野生型本生烟的脯氨酸含量显著低于转ZmCYP724B3基因本生烟，Re3-Maturity时期，二者脯氨酸含量降低。

图D显示的是1月龄本生烟在自然干旱胁迫处理后不同时期(Dr0、Dr3、Dr7、Dr15、Re3、Maturity)的含水量的变化情况。由图可知，野生型本生烟和转ZmCYP724B3基因本生烟的变化趋势一致，先减少后增加。Dr0-Dr7时期，野生型本生烟含水量高于转ZmCYP724B3基因本生烟，Dr15时，野生型本生烟含水量为27％，3个转ZmCYP724B3基因株系含水量分别为37％、39％、36％，显著高于野生型。

干旱胁迫下，植物为了适应环境，会进行许多生理生化反应，脯氨酸是一种有效的渗透调节物质，有利于植物组织与细胞的持水。抗性强的品种渗透调节物质的含量高于抗性弱的品种。叶片相对含水量(RWC)可以直观反映植物抗旱性能，RWC较高的作物抗旱性较好，在胁迫过程当中，RWC越高的耐旱性越好。

在自然干旱胁迫条件下，转ZmCYP724B3基因本生烟和野生型本生烟的丙二醛含量，过氧化氢酶活性，超氧化物酶活性，过氧化物酶活性；如图15所示。其中，A：丙二醛含量，B：过氧化氢酶活性，C：超氧化物酶活性，D：过氧化物酶活性；D1、D2、D3为3个转ZmCYP724B3基因株系；Dr0：干旱0天，Dr3:干旱3天，Dr7:干旱7天，Dr15:干旱15天，Re3:复水3天，Maturity：成熟。

图A是1月龄本生烟在自然干旱胁迫处理后不同时期(Dr0、Dr3、Dr7、Dr15、Re3、Maturity)的丙二醛(MDA)含量的变化情况。由图可知，野生型本生烟和转ZmCYP724B3基因本生烟的变化趋势一致，先增加后减少。D0-D15时期，野生型本生烟MDA含量从低于到接近再超过转ZmCYP724B3基因本生烟，在D15时，二者含量达到最大值，说明植株受损伤程度达到最大。复水后，二者MDA明显含量降低，直至成熟。

图B、C、D是1月龄本生烟在自然干旱胁迫处理后不同时期(Dr0、Dr3、Dr7、Dr15、Re3、Maturity)的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)含量的变化情况。在干旱胁迫条件下，各个株系中的保护酶的含量先增加后减少，在Dr7天时达到最大值，且转ZmCYP724B3基因本生烟的含量高于野生型本生烟。

在逆境条件下，超氧化物歧化酶(SOD)可以将细胞内的有害物质转化生成H₂O₂和O₂，而过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)将清除这些产物，因此这三种抗氧化酶在协同作用下减轻了逆境胁迫对植株的伤害。细胞膜是一种选择透过性膜，干旱发生后，细胞膜透性通常会改变，脂膜过氧化反应生成丙二醛，因而丙二醛含量和细胞膜透性的改变可作为衡量植物抗旱性的指标之一。MDA是脂质过氧化的最终分解产物，MDA的水平反应了植物损伤的程度。

为了探究本生烟中ZmCYP724B3基因的过表达是否促进植物生长发育相关基因和干旱胁迫相关基因的表达，选择了与植物生长发育相关的基因LNG1(叶片长度)、ROT3(叶片长度)、AN3(叶片宽度)和抗旱相关基因CDPK2、LEA5、ERD10C、ACTIN2，进行实时定量PCR检测。具体以NBEF1a-F和NBEF1a-R为本生烟内参引物；NtLNG1-F和NtLNG1-R为扩增LNG1基因的引物；NtROT3-F和NtROT3-R为扩增ROT3基因引物；NtAN3-F和NtAN3-R为扩增AN3基因引物；NtERD10C-F和NtERD10C-R为扩增ERD10C基因引物；NtCDPK2-F和NtCDPK2-R为扩增CDPK2基因引物；NtLEA5-F和NtLEAR5-R为扩增LEA5基因引物；NtACTIN2-F和NtACTIN2-R为扩增ACTIN2基因引物。

结果如图16所示，转ZmCYP724B3基因本生烟中LNG1和AN3基因的表达量显著高于野生型本生烟。在自然干旱条件下，LEA5和ACTIN2基因在野生型本生烟和转ZmCYP724B3基因中都被诱导，且转ZmCYP724B3基因本生烟中的表达量显著高于野生型本生烟。

植物激素不仅调控植物的生长发育，而且还参与各种胁迫的响应。图17示出了1月龄本生烟在自然干旱胁迫处理后不同时期(Dr0、Dr3、Dr7、Dr15、Re3、Maturity)的油菜素甾醇(BR)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA)、乙烯(ETH)含量的变化。从图17中可以看到，野生型本生烟和转ZmCYP724B3基因本生烟的BR、JA含量都是随着干旱胁迫程度的增加而增加，复水后降低，但转ZmCYP724B3基因本生烟的BR含量始终高于野生型本生烟；野生型本生烟和转ZmCYP724B3基因本生烟的SA、GA含量随着干旱程度的增加先降低再升高，复水后趋于稳定且高于干旱胁迫前含量，转ZmCYP724B3基因本生烟的SA含量始终高于野生型本生烟；野生型本生烟和转ZmCYP724B3基因本生烟的ABA、ETH含量随着干旱程度的增加没有明显变化，复水后有增加趋势。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 玉米ZmCYP724B3基因及其用途

<130> C1CNCN210596

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgatga tgatggcggg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaagattca ggggacgttg g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctgcgagga ggcaagaaag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgggatgt agagggggaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtccatgagg ccacgtacaa 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccggaccagt ttcgtcata 19

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctctagaat gatgatgatg gcggg 25

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgggatcctc aagattcagg ggacgttgg 29

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctcaagaag gttggataca ac 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcttgggctc attaatctgg tc 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atccagccat acaaacagcc 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcggcgaatc tatgtgctt 19

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caccatctcg tcaccaccta ca 22

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gggcatgatg ttgataggca g 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gagccagaac tcagggaaac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atcagcaata gcagcaaggt 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcttcacagc aaaagcctca 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtgaccccat tatgcaatcc 20

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aggtgagctt ttcgatagga ttatt 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acttctggtg caacatagta aggac 25

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttgttagcag gcgtgggtat 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctctcgctct tgttgggttc 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ttgttagcag gcgtgggtat 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctctcgctct tgttgggttc 20

<210> 25

<211> 1446

<212> DNA

<213> 玉米(maize)

<400> 25

atgatgatga tgatggcggg ggagcacgtg ctggccgctc tggccaccct gcttctggcc 60

tcgctcctga ccctggtgct gaaccacttc ctgcccttgc ttctgaaccc caaggccccc 120

aggggaagct tcgggtggcc gctcctcggc gagacgctca ggttcctcac gccgcacgcc 180

tccaacacgc tgggcggctt cctcgaggat cactgctcca ggtatgggcg ggtgttcaag 240

tcccacctgt tctgcacccc gacggtggtg tcctgcgacc aggacctcaa ccacttcatc 300

ctgcagaacg aggagcggct gttccagtgc agctacccga ggccgatcca tggcatcctg 360

ggcaagtcct ccatgctcgt cgtcctgggc gaggaccaca agcgcctcag gaacctcgcc 420

ctcgccctcg tcacctccac caagctcaag cccagctacc taggcgacat cgagaagatc 480

gcgctgcacg tcgtcggcgc atggcgacgg cacggcggcg tcagggtcgt cgcattctgc 540

gaggaggcaa gaaagttcgc attcagtgtg atagtgaagc aggtgctggg gctgtcgcca 600

gaggagccgg tcactgcaag gatactggag gacttcctgg ccttcatgaa gggactcatc 660

tccttccccc tctacatccc agggacccca tatgccaagg ctgtccgggc gagagagagg 720

atatccagca ctgtgaaggg catcatcaag gagcggagga gcgctgggtc atgcaacaag 780

cagggcgact tccttgacgt gctgctgtca agcgacgagc tatctgacga ggagaaagtg 840

agctttgtgc tggactccct gctgggagga tatgagacca cctcgctcct catctccatg 900

gtcgtttatt tccttggcca gtctgctcaa gatctggacc tggttaagag ggagcactac 960

agcataagat ccaacaaagg caaggaggag tgcttgactt cagaagacta caagaagatg 1020

gaatataccc aacaagtcat caacgaggcg ctgagatgcg gcaacatcgt caagttcgtc 1080

cacaggaagg cgctgaaaga cgtcaaatac aaagagtatc tgattccatc tggctggaag 1140

gtcctaccgg tcttcactgc cgttcatctg aacccctcac ttcatggaga cgcgcagcag 1200

tttcagccct gtaggtggga gggcacaagc caagggacaa gcaagaggtt tacaccgttc 1260

ggtggtggcc ccaggctctg cccaggatca gagctcgcta aagtggaggc tgctttcttc 1320

ctccatcacc ttgtcctcaa ttatagatgg agaattgacg gcgatgacat tccaatggca 1380

tacccgtatg tggagtttca gagaggtctg ccaatagaaa tcgagccaac gtcccctgaa 1440

tcttga 1446

<210> 26

<211> 481

<212> PRT

<213> 玉米(maize)

<400> 26

Met Met Met Met Met Ala Gly Glu His Val Leu Ala Ala Leu Ala Thr

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Thr Leu Val Leu Asn His Phe Leu Pro

20 25 30

Leu Leu Leu Asn Pro Lys Ala Pro Arg Gly Ser Phe Gly Trp Pro Leu

35 40 45

Leu Gly Glu Thr Leu Arg Phe Leu Thr Pro His Ala Ser Asn Thr Leu

50 55 60

Gly Gly Phe Leu Glu Asp His Cys Ser Arg Tyr Gly Arg Val Phe Lys

65 70 75 80

Ser His Leu Phe Cys Thr Pro Thr Val Val Ser Cys Asp Gln Asp Leu

85 90 95

Asn His Phe Ile Leu Gln Asn Glu Glu Arg Leu Phe Gln Cys Ser Tyr

100 105 110

Pro Arg Pro Ile His Gly Ile Leu Gly Lys Ser Ser Met Leu Val Val

115 120 125

Leu Gly Glu Asp His Lys Arg Leu Arg Asn Leu Ala Leu Ala Leu Val

130 135 140

Thr Ser Thr Lys Leu Lys Pro Ser Tyr Leu Gly Asp Ile Glu Lys Ile

145 150 155 160

Ala Leu His Val Val Gly Ala Trp Arg Arg His Gly Gly Val Arg Val

165 170 175

Val Ala Phe Cys Glu Glu Ala Arg Lys Phe Ala Phe Ser Val Ile Val

180 185 190

Lys Gln Val Leu Gly Leu Ser Pro Glu Glu Pro Val Thr Ala Arg Ile

195 200 205

Leu Glu Asp Phe Leu Ala Phe Met Lys Gly Leu Ile Ser Phe Pro Leu

210 215 220

Tyr Ile Pro Gly Thr Pro Tyr Ala Lys Ala Val Arg Ala Arg Glu Arg

225 230 235 240

Ile Ser Ser Thr Val Lys Gly Ile Ile Lys Glu Arg Arg Ser Ala Gly

245 250 255

Ser Cys Asn Lys Gln Gly Asp Phe Leu Asp Val Leu Leu Ser Ser Asp

260 265 270

Glu Leu Ser Asp Glu Glu Lys Val Ser Phe Val Leu Asp Ser Leu Leu

275 280 285

Gly Gly Tyr Glu Thr Thr Ser Leu Leu Ile Ser Met Val Val Tyr Phe

290 295 300

Leu Gly Gln Ser Ala Gln Asp Leu Asp Leu Val Lys Arg Glu His Tyr

305 310 315 320

Ser Ile Arg Ser Asn Lys Gly Lys Glu Glu Cys Leu Thr Ser Glu Asp

325 330 335

Tyr Lys Lys Met Glu Tyr Thr Gln Gln Val Ile Asn Glu Ala Leu Arg

340 345 350

Cys Gly Asn Ile Val Lys Phe Val His Arg Lys Ala Leu Lys Asp Val

355 360 365

Lys Tyr Lys Glu Tyr Leu Ile Pro Ser Gly Trp Lys Val Leu Pro Val

370 375 380

Phe Thr Ala Val His Leu Asn Pro Ser Leu His Gly Asp Ala Gln Gln

385 390 395 400

Phe Gln Pro Cys Arg Trp Glu Gly Thr Ser Gln Gly Thr Ser Lys Arg

405 410 415

Phe Thr Pro Phe Gly Gly Gly Pro Arg Leu Cys Pro Gly Ser Glu Leu

420 425 430

Ala Lys Val Glu Ala Ala Phe Phe Leu His His Leu Val Leu Asn Tyr

435 440 445

Arg Trp Arg Ile Asp Gly Asp Asp Ile Pro Met Ala Tyr Pro Tyr Val

450 455 460

Glu Phe Gln Arg Gly Leu Pro Ile Glu Ile Glu Pro Thr Ser Pro Glu

465 470 475 480

Ser

Claims

1.一种ZmCYP724B3基因，所述ZmCYP724B3基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示。

2.如权利要求1所述的ZmCYP724B3基因，其特征在于，所述ZmCYP724B3基因的核酸编码序列如SEQ ID NO.25所示。

3.ZmCYP724B3基因在改善目标植物性状中的用途，所述ZmCYP724B3基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；

所述改善目标植物性状选自：

提高所述目标植物的抗旱性；

增加所述目标植物的生物量；

减缓或修复所述目标植物的细胞损伤；

提高所述目标植物的生长发育相关基因的表达量；

提高所述目标植物的抗旱相关基因的表达量；和

促进所述目标植物生长中的任一种或其组合。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述提高所述目标植物的抗旱性选自：

提高所述目标植物中脯氨酸的含量；和/或

提高所述目标植物中叶片相对含水量；

优选地，所述增加所述目标植物的生物量选自：

提高所述目标植物的叶长；

提高所述目标植物的叶宽；

提高所述目标植物的叶面积；

提高所述目标植物的株高；

提高所述目标植物的茎粗；

提高所述目标植物的地上鲜重；

提高所述目标植物的地下鲜重；

提高所述目标植物的根长；和

提高所述目标植物的根面积中的任一种或其组合；

优选地，所述减缓或修复所述目标植物的细胞损伤选自：

降低所述目标植物的叶绿素含量；

降低所述目标植物的丙二醛含量；

提高所述目标植物的过氧化氢酶含量；

提高所述目标植物的超氧化物酶含量；和

提高所述目标植物的过氧化物酶含量中的任一种或其组合；

优选地，所述生长发育相关基因为LNG1基因和/或AN3基因；

优选地，所述抗旱相关基因为LEA5基因和/或ACTIN基因。

5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述ZmCYP724B3基因的核酸编码序列如SEQID NO.25所示。

6.如权利要求3所述的用途，其特征在于优选地，所述目标植物为玉米或烟草。

7.一种改善目标植物性状的育种方法，所述育种方法为：将ZmCYP724B3基因的编码序列转入目标植物基因组，使经转基因的所述目标植物能够表达所述ZmCYP724B3基因，所述ZmCYP724B3基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.26所示；

所述改善目标植物性状选自：

提高所述目标植物的抗旱性；

增加所述目标植物的生物量；

减缓或修复所述目标植物的细胞损伤；

提高所述目标植物的生长发育相关基因的表达量；

提高所述目标植物的抗旱相关基因的表达量；和

促进所述目标植物生长中的任一种或其组合。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述提高所述目标植物的抗旱性选自：

提高所述目标植物中脯氨酸的含量；和/或

提高所述目标植物中叶片相对含水量；

优选地，所述增加所述目标植物的生物量选自：

提高所述目标植物的叶长；

提高所述目标植物的叶宽；

提高所述目标植物的叶面积；

提高所述目标植物的株高；

提高所述目标植物的茎粗；

提高所述目标植物的地上鲜重；

提高所述目标植物的地下鲜重；

提高所述目标植物的根长；和

提高所述目标植物的根面积中的任一种或其组合；

优选地，所述减缓或修复所述目标植物的细胞损伤选自：

降低所述目标植物的叶绿素含量；

降低所述目标植物的丙二醛含量；

提高所述目标植物的过氧化氢酶含量；

提高所述目标植物的超氧化物酶含量；和

提高所述目标植物的过氧化物酶含量中的任一种或其组合；

优选地，所述生长发育相关基因为LNG1基因和/或AN3基因；

优选地，所述抗旱相关基因为LEA5基因和/或ACTIN基因；

优选地，所述ZmCYP724B3基因的核酸编码序列如SEQ ID NO.25所示；

优选地，所述目标植物为玉米或烟草。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述育种方法包括如下步骤：

S1：将所述ZmCYP724B3基因的编码序列克隆到植物表达载体，得到重组载体；

S2：将所述重组载体转化农杆菌，得到重组农杆菌；

S3：用所述重组农杆菌转化所述目标植物，得到转基因的所述目标植物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体为植物双元表达载体；

优选地，所述植物双元表达载体为pCambia1300；

优选地，所述农杆菌为LBA4404。