CN114177171A

CN114177171A - 花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途

Info

Publication number: CN114177171A
Application number: CN202110939607.6A
Authority: CN
Inventors: 赵军宁; 华桦; 杨安东; 张翼冠; 戴瑛; 李金花
Original assignee: Sichuan Center For Translational Medicine Of Traditional Chinese Medicine; Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences SACMS
Current assignee: Sichuan Center For Translational Medicine Of Traditional Chinese Medicine; Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences SACMS
Priority date: 2020-09-14
Filing date: 2021-08-16
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2041-08-16
Also published as: CN114177171B

Abstract

本发明提供了花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途。本发明还公开了一种以花椒或其提取物可以有效抑制和/或治疗冠状病毒、人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、单纯疱疹病毒、水痘‑带状疱疹病毒或鼻病毒等呼吸道病毒感染，为临床提供了一种新的选择。

Description

花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途。

背景技术

呼吸道病毒是以呼吸道为入侵门户，在呼吸道粘膜上皮细胞增殖，引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官病变的病毒，其侵入下呼吸道引起肺部感染性疾病，即造成呼吸道病毒肺炎。常见的呼吸道病毒包括流行性感冒病毒、副流感病毒、巨细胞病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒，和某些肠道病毒，如柯萨奇、埃可病毒等，以及单纯疱疹、水痘-带状疱疹、风疹、麻疹等病毒等，婴幼儿还常由呼吸道合胞病毒感染产生肺炎。此外，部分肠道病毒如柯萨奇病毒、埃可病毒也可通过呼吸道感染导致出现肺炎的症状。

多种呼吸道病毒感染引发的肺炎严重威胁着人们的健康，因此寻找发现新的抗呼吸道病毒的药物非常有必要。

芸香科(Rutaceae)花椒属植物(Zanthoxylum)植物广泛分布于亚洲、非洲、美洲等地，其果实、根、茎、叶均可入药；例如花椒即花椒属植物的果皮，《中药大辞典》即记载了其诸多药用功效：温中散寒，除湿，止痛，杀虫，治积食停饮，心腹冷痛，齿痛，阴痒，疮疥等。花椒属植物的化学成分主要包括生物碱、酰胺、木质素、香豆素、黄酮类、挥发油和脂肪酸。其中，花椒碱(γ-Fagarine)即是一种广泛存在于芸香科花椒属植物中的呋喃喹啉生物碱，具有如下结构；

近年来研究发现花椒碱具有解痉、抗病毒、抗细菌真菌等作用，然而，花椒碱对呼吸道病毒的作用和机理目前尚未见报道。

发明内容

本发明提供了花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途。

进一步地，上述药物是治疗和/或抑制呼吸道病毒感染的药物。

本发明提供了花椒在制备抗呼吸道病毒的药物中的用途。

进一步地，上述药物是降低呼吸道病毒活性的药物。

更进一步地，上述花椒是花椒属植物或其提取物。

更进一步地，上述花椒属植物提取物含有生物碱。

更进一步地，上述呼吸道病毒是冠状病毒、人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒或鼻病毒；所述肠道病毒包括柯萨奇病毒、埃可病毒。

本发明还提供了一种抗呼吸道病毒和/或防治呼吸道病毒肺炎的药物，它是以花椒为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的药物。

进一步地，上述花椒是花椒属植物或其提取物。

进一步地，上述呼吸道病毒是冠状病毒、人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒或鼻病毒；所述肠道病毒包括柯萨奇病毒、埃可病毒。

本发明提供了花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途。以花椒或其提取物为活性成分，或者以花椒碱或其药学上可接受的盐为活性成分的药物，可以有效抑制和/或治疗冠状病毒、人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒或鼻病毒等呼吸道病毒感染，有很好的临床应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为16HBE细胞活性。

图2为病毒滴度测定结果。

图3为小鼠体重变化情况。

图4为小鼠肺脏病毒滴度测定结果。

具体实施方式

除另有说明外，本发明所用原料均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明利用Vero-E6细胞培养HMPV活病毒，分离得到病毒液(MOI＝10)，用于后续实验。

实施例1、本发明含花椒碱的药物的制备

花椒碱配制成浓度为6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM的溶液。

实验例1、细胞毒性实验

细胞复苏：从液氮罐中取出冻存的16HBE细胞，迅速放至37℃水浴锅中摇晃溶解，将溶解后的细胞加入到已经吸取3ml培养液的15ml BD管中，800rpm离心4min，弃去上清加入1ml的培养液重悬，重悬后的细胞加入到T25培养瓶中，放入培养箱中培养。

细胞铺板：将16HBE细胞培养至接近80％时，消化，重悬细胞并计数，稀释细胞浓度为1*10⁵/mL；每孔100μL加入到96孔板；细胞加药不同浓度(6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM)的花椒碱溶液；设置对照孔和空白孔；放入孵箱过夜培养24h。吸出含药培养液，用PBS清洗三次，加入新的培养液，并加入10μL的CCK-8试剂；作用1-4h后，使用酶标仪测定450nm吸光度值，按照以下公式，计算细胞存活率。

A＝A_C-A₀/A_b-A₀

A_c为加药孔；

A_b为含有细胞的未加药孔；

A₀为不含细胞的未加药孔；

得到的结果如图1所示，结果表明，在各浓度的花椒碱作用下，16HBE细胞的细胞活性均高于80％，说明花椒碱无明显细胞毒性。

实验例2、抑制病毒活性实验

实验前一天将对数生长期的细胞消化重悬后，将2*10⁵/孔16HBE细胞接种于24孔板，生长过夜。第二天，细胞汇合度达到70-80％，加入HMPV病毒液200μL(MOI＝10)，孵箱中感染2h；吸取病毒并用PBS清洗三遍，配制200μM的花椒碱母液，用含有3％FBS的DMEM培养液稀释成不同浓度的含药溶液(0μM，12.5μM，25μM，50μM，100μM，200μM)，实验组分别每孔加入相应的含药溶液。作用24h后，弃去上清，使用总提取RNA试剂盒提取RNA，按说明书操作提取RNA。使用逆转录试剂盒(AG11706-S)，将提取到的RNA进行逆转录；使用TaqMan荧光探针法，荧光定量PCR(Q-PCR)，根据Q-PCR实验中不同组别的Cq值，考察加入不同浓度花椒碱后细胞内病毒载量。

结果如图2所示，实验结果表明，花椒碱溶液的加入能够有效降低细胞内病毒载量，其中，加入花椒碱的含药溶液浓度不低于50μM时能显著降低细胞内病毒载量，即降低病毒滴度，说明花椒碱可以有效抑制病毒活性。

实验例3、小鼠病毒感染治疗实验

购买5-6weeks的BALB/c小鼠，17-20g；雌性；适应一周。

实验分组：(共3组，每组3只)：

1、病毒感染组(hMPV)；2、药物组(实施例1)，给药剂量为50mg/kg；3、利巴韦林组，给药剂量为50mg/kg；

实验步骤：

1、实验前准备，小鼠随机分组，标记；

a.病毒准备：实验前将病毒从-80℃冰箱取出，置于冰上；

b.麻醉：小鼠称重后腹腔注射1％的戊巴比妥(剂量为50mg/kg体重)，置于饲养笼内，等待约5～10min；

2、病毒滴注

将麻醉后的小鼠固定，纯化的hMPV病毒对小鼠进行滴鼻处理(病毒滴度为10^7)，充分打开气道，两只鼻孔交替滴入病毒液10μL，共滴注60μL；观察小鼠情况，直至小鼠苏醒，可采取适当保暖措施。

3.病毒组每日给予灌胃0.4ml的生理盐水，药物组每日口服灌胃花椒碱溶液；利巴韦林组每日灌胃利巴韦林溶液；

4.连续给药4天，并称量小鼠体重；观察小鼠的状态；5天后，摘眼球取血；取小鼠肺组织分别置于EP管冻于-80℃冰箱中考察肺脏病毒滴度。

A.眼球取血：

小鼠摘眼球取血，1500rpm，4℃；离心10min，小心吸取上清。用于病毒滴度检测(Q-PCR)、炎性因子水平(ELISA)、免疫细胞种类考察(淋巴细胞；T细胞；巨噬细胞)。

B.淋巴结淋巴细胞悬液制备

1)小鼠摘眼球取血后，颈椎脱臼处死小鼠后取出小鼠淋巴结。向一个洁净的细菌培养皿中加入1ml PBS，然后再在平皿的口上铺上100目不锈钢钢网(钢网尽量大于平皿)，然后将摘取的淋巴结组织放到钢网上；

2)用10ml的注射器手柄的末端对淋巴结进行研磨，直到无组织块。此过程中，要保证淋巴结组织一直浸润在PBS中；

3)将研磨所得细胞悬液过100目滤网转移到15ml离心管中，并用PBS冲洗平皿，尽量收集更多的细胞，减少细胞损失；

4)离心，4℃，500rpm离心1min；

5)淋巴结过滤液体离心后弃除上清,4℃，500xg离心4分钟去上清液；加入1ml的PBS进行细胞计数后离心，冻存于-80℃，用于后续免疫细胞的分析。

结果如图3、图4所示，可以看出，小鼠感染HMPV病毒后，小鼠体重会下降，而利巴韦林及花椒碱组可以改善小鼠体重降低。花椒碱给药组小鼠肺脏的病毒滴度低于HMPV组，且具有统计学差异，说明花椒碱能显著降低小鼠体内的病毒滴度，对HMPV感染导致的预防呼吸道病毒肺炎具有治疗作用，且效果与阳性对照药物利巴韦林相当。

综上，本发明提供了花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途。以花椒或其提取物为活性成分，或者以花椒碱或其药学上可接受的盐为活性成分的药物，可以有效抑制和/或治疗冠状病毒、人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒或鼻病毒等呼吸道病毒感染，有很好的临床应用前景。

Claims

1.花椒在制备治疗和/或预防呼吸道病毒肺炎的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是治疗和/或抑制呼吸道病毒感染的药物。

3.花椒在制备抗呼吸道病毒的药物中的用途。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述药物是降低呼吸道病毒活性的药物。

5.如权利要求1～4任一项所述的用途，其特征在于，所述花椒是花椒属植物或其提取物。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述花椒属植物提取物含有生物碱。

7.如权利要求1～4任一项所述的用途，其特征在于，所述呼吸道病毒是冠状病毒、人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒或鼻病毒；所述肠道病毒包括柯萨奇病毒、埃可病毒。

8.一种抗呼吸道病毒和/或防治呼吸道病毒肺炎的药物，其特征在于，它是以花椒为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的药物。

9.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述花椒是花椒属植物或其提取物。

10.如权利要求8所述的药物，其特征在于，所述呼吸道病毒是冠状病毒、人偏肺病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、肠道病毒、单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒或鼻病毒；所述肠道病毒包括柯萨奇病毒、埃可病毒。