CN114163591B - 一种嵌段共聚物、嵌段共聚物载药胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

一种嵌段共聚物、嵌段共聚物载药胶束及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种嵌段共聚物、嵌段共聚物载药胶束及其制备方法。所述嵌段共聚物包括通过共价连接的亲水性嵌段、由阳离子单体和π结构单体制得的共聚嵌段。本发明通过在嵌段共聚物中引入了阳离子单体和具有π结构的单体，使得嵌段共聚物具有高稳定性和载药普适性。这是因为在嵌段共聚物中，可以形成多种阳离子‑π的相互作用区域，因而使整个共聚物具有较高的稳定性，同时，阳离子单元和药物分子形成的阳离子‑药物的复合物使载药胶束具有良好的载药稳定性，极大的减少了在储存过程中的药物泄露以及在血液循环中的药物提前释放，减轻了药物的毒副作用。

Description

一种嵌段共聚物、嵌段共聚物载药胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种嵌段共聚物、嵌段共聚物载药胶束及其制备方法。
背景技术
虽然现代医学及相关基础研究发展迅速，肿瘤依然是目前威胁人类生存的重要医疗卫生问题，目前手术及化疗作为最主要的两种治疗手段仍然难以解决肿瘤的转移、复发及耐药性等问题。传统的小分子药物化疗在肿瘤治疗中虽然也能取得一定的疗效，但其选择性差，效率低等问题，给传统的化疗手段带来了极大的毒副作用，大大降低了化疗患者的生活质量。其次药物递送效率低下的问题又会导致肿瘤耐药性的产生，给常规的癌症治疗带来了更大的挑战。
伴随着纳米技术的飞速发展，纳米技术与医学的结合给癌症的化疗带来了新的策略。目前研究人员已创造性的发展出多种类、多功能的纳米制剂以满足临床上对癌症的诊断和治疗的需求。截止至目前，已应用在临床上的纳米制剂包括脂质体阿霉素，紫杉醇白蛋白纳米制剂等均显示出优于传统小分子药物的特性，一定程度上解决了传统小分子化疗药物水溶性差、循环半衰期短和毒副作用大等问题，这无疑极大地推动了纳米医学的发展。
尽管聚合物胶束、囊泡和脂质体等有机纳米颗粒等多功能药物材料已经成功发展，但胶体稳定性差(Serre,Christian,et al.Adv.Mat.2018,30,1707365.)、长期储存导致的聚集和药物泄漏(Fairen-Jimenez,David,et al.J.Am.Chem.Soc.2021,143,13557.)等问题仍是当前药物递送系统设计的重要障碍，也限制了其治疗效果，阻碍了其临床转化。更重要的是，在目前广泛研究且极富应用前景的载体材料如聚合物胶束和囊泡依然存在载药量低的问题(低于10％)(Jianwei Li,et al.Angew.Chem.Int.Ed.2021,60,3062.)。此外，受限于材料本身的功能特性，很少有药物递送载体(特别是胶束)能实现对不同性质(亲疏水性)药物的通用负载能力(Jianjun Cheng,et al.J.Am.Chem.Soc.2015,137, 3458.)，药物负载普适性的实现无疑简化了现有药物递送系统开发中越发繁杂的结构和功能设计，降低了其在生物体内应用的不确定性，因而，此类载体的开发具有广泛的应用前景。
近年来利用肿瘤内特定微环境(如肿瘤组织附近或溶酶体内弱酸性环境、特定活性酶、细胞内氧化还原环境等)构建高效的药物传输体系在受到了广泛的关注。然而，当前这类载体存在响应不灵敏、响应速率慢等特征，从而导致药物释放的不灵敏和释放缓慢(Shiyong.Liu,et al.J.Am.Chem.Soc.2016,138,10452.)，进而导致肿瘤部位药物浓度较低，最后导致耐药性的产生。因此，开发能够对肿瘤微环境自身特性灵敏响应并发生快速可控释放的纳米药物载体仍然面临挑战。
显然，上述问题的存在很大程度上制约着纳米药物的临床转化，如何在利用简单的物理作用简化药物负载过程的同时，提高载体的药物负载普适性和载药量，并增强纳米药物的稳定性，依然是一个巨大的挑战和亟待解决的问题。此外，在增强药物负载稳定性的同时，增强载体材料的响应灵敏度和速率，可以降低化疗药物的毒副作用，提高纳米药物的递送效率进而提高抗肿瘤效果。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种嵌段共聚物。
本发明还提供了一种嵌段共聚物载药胶束。
本发明还提供了所述嵌段共聚物载药胶束的制备方法。
本发明还提供了一种嵌段共聚物药物胶束制剂。
本发明的第一方面提供了嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包括通过共价连接的亲水性嵌段、阳离子单体和π结构单体的共聚嵌段。
本发明关于嵌段共聚物的技术方案中的一个技术方案，至少具有以下有益效果：
本发明通过在嵌段共聚物中引入了阳离子单体和具有π结构的单体，使得嵌段共聚物具有高稳定性和载药普适性。这是因为在嵌段共聚物中，可以形成多种阳离子-π的相互作用区域，因而使整个共聚物具有较高的稳定性，同时，阳离子单元和药物分子形成的阳离子-药物的复合物使载药胶束具有良好的载药稳定性，极大的减少了在储存过程中的药物泄露以及在血液循环中的药物提前释放，减轻了药物的毒副作用。
另外，引入阳离子-π相互作用，使该载体材料具有普适性的药物负载能力，使传统胶束不能负载的亲水药物能够通过聚合物中的阳离子和亲水药物中的π结构形成阳离子-π的复合体实现亲水药物负载，同时，疏水药物也同样的能通过阳离子-π的相互作用实现药物负载。
根据本发明的一些实施方式，所述亲水性嵌段选自聚乙二醇、单取代聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(寡聚乙二醇单甲醚)或聚(N,N-二甲胺基乙基甲基丙烯酸酯)中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述阳离子单体选自季铵盐、叔胺盐、仲胺盐、伯胺盐或胍基中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述π结构单体选自硼酸、含有苯环取代的硼酸酯、苯环、萘环、蒽环或或不饱和杂环中至少一种。
所述不饱和杂环是五元芳香杂环、六元芳香杂环或芳香稠环中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述五元芳香杂环为咪唑、呋喃、噻吩、吡咯、噻唑、咪唑或恶唑中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述六元芳香杂环为哒嗪、吡啶、吡嗪或嘧啶中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述芳香稠环为苯并呋喃、苯并咪唑、吲哚、吲唑、嘌呤、喹啉、异喹啉或咔唑中至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述嵌段共聚物的结构式如式(I)所示：
其中，R1为含π结构单体，R2为阳离子单体；n＝2～400；m＝2～200，n和m为正整数，0＜x＜1。
根据本发明的一些实施方式，式(I)中co是指将两种单体在一定的条件下进行聚合，所得到的聚合物为共聚物。
根据本发明的一些实施方式，所述R1选自如下结构式：
中至少一种；其中R选自氢、频哪醇、单糖、二糖或多糖。
根据本发明的一些实施方式，所述单糖是指含3～6个碳原子的多羟基醛或多羟基酮，例如甘油醛或二羟基丙酮。
根据本发明的一些实施方式，所述二糖是指由两个单糖缩合脱水而成，其中两个单糖可以是相同结构，也可以是不同结构的单糖。
根据本发明的一些实施方式，所述多糖是指由2个以上的单糖通过缩合脱水形成的聚糖。
根据本发明的一些实施方式，所述R2选自如下结构式：
中至少一种。
本发明的第二方面提供了一种嵌段共聚物载药胶束，包含所述的嵌段共聚物，以及药物活性成分，所述药物活性成分与嵌段共聚物的质量比为1：(4～10)。
本发明的嵌段共聚物载药胶束在水中可以组装成均一的纳米结构，，相对于基于苯硼酸的传统胶束，阳离子-π相互作用的引入提高了该纳米胶束对H2O2的响应灵敏性，能够在较低的H2O2浓度(＜200μM)下，较短时间内(＜6h)快速且完全释放负载的药物。从而快速提高了化疗药物在肿瘤细胞中的浓度，提高了肿瘤杀伤作用以及降低耐药性的发生。
根据本发明的一些优选的实施方式，所述药物活性成分为疏水性药物和/或亲水性药物
根据本发明的一些优选的实施方式，所述药物活性成分为抗肿瘤药物、抗病毒药物或抗菌药物中的至少一种；
根据本发明的一些优选的实施方式，所述药物活性成分为盐酸阿霉素、氨苄西林钠、苯唑西林、伐昔洛韦、环丙沙星、盐酸多西环素、 中至少一种。
本发明的第三方面提供了所述嵌段共聚物载药胶束的制备方法，包括如下步骤：
将所述的嵌段共聚物与药物活性成分在有机溶剂中与磷酸盐缓冲液混合进行反应，经透析后即得到嵌段共聚物载药胶束。
根据本发明的一些优选的实施方式，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环、丙酮或四氢呋喃中至少一种。
本发明的第四方面提供了一种嵌段共聚物载药胶束制剂，包括所述嵌段共聚物载药胶束，以及药学上可接受的介质或辅料。
根据本发明的一些优选的实施方式，所述制剂为溶液，其中所述的嵌段共聚物载药胶束均匀分散在水或水介质中。
根据本发明的一些优选的实施方式，该含水介质包含药学上可接受的辅料。
附图说明
图1是实施例1中TAMA化合物的核磁共振氢谱图；
图2是实施例1中TAMA化合物的核磁共振碳谱图；
图3是实施例1制备的嵌段共聚物的核磁共振氢谱图；
图4是实施例3～6制备的嵌段共聚物载药胶束的粒径分布图；
图5是实施例3的嵌段共聚物载药胶束制备的冷冻电镜图；
图6是实施例3～6制备的嵌段共聚物载药胶束的体外释放试验图；
图7是实施例3的嵌段共聚物载药胶束在不同过氧化氢浓度下的体外释放试验图；
图8是实施例3和实施例5制备的嵌段共聚物载药胶束的对细胞毒性检测图；
图9是实施例2制备的嵌段共聚物核磁共振氢谱图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
以下实施例中采用的原料如下：
4T1细胞购自上海ATCC细胞库；N,N-二甲基乙醇胺和甲基丙烯酸异氰基乙酯购自上海麦克林生化科技有限公司；碘甲烷，喜树碱购自上海吉至生化科技有限公司；阿霉素盐酸盐、4-(羟甲基)苯硼酸频哪酯购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；聚乙二醇甲醚丙烯酸脂、二月桂酸二丁基锡，2-氰丙基-2-基苯并二硫购自Sigma-Aldrich；盐酸米托蒽醌购自阿达玛斯试剂有限公司；紫杉醇购自天津希恩思生化科技有限公司；苄基丙烯酰胺购自上海毕得医药科技有限公司。
实施例1
实施例1提供一种嵌段共聚物，所述嵌段共聚物的结构式如下，制备方法包括如下步骤：
1)TAMA的制备，合成路线如下：
S1.将1.8g N，N-二甲基乙醇胺(20.0mmol)溶于40mL无水四氢呋喃，然后加入催化量的二月桂酸二丁基锡(40μL)，搅拌15分钟后，缓慢滴加3.8g甲基丙烯酸异氰基乙酯(24.0mmol)。室温搅拌4h后，反应混合物减压浓缩，通过碱性氧化铝柱分离纯化，得到无色油状产物4.2g，(产率：85％)。
S2.将步骤S1的产物(4.2g，17.2mmol)溶于无水四氢呋喃(30mL)，冰浴15分钟后缓慢滴加2.7g碘甲烷(18.9mmol)，搅拌30分钟后，继续室温下搅拌2h，反应体系有大量白色沉淀产生，过滤反应混合物，并用四氢呋喃(50mL)洗涤，在室温下真空干燥，得到白色TAMA固体5.9g(产率：88％)。
2)QPBA的制备
S3.将2.4g 4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇酯(10.0mmol)加入无水四氢呋喃(50mL)，加入催化量的二月桂酸二丁基锡(50μL)，搅拌30分钟后，缓慢滴加1.9g甲基丙烯酸异氰基乙酯(12.0mmol)。室温搅拌4h后，终止反应，反应液浓缩后，，用碱性氧化铝分离纯化(洗脱液：DCM/正己烷＝1：2)，得到白色QPBA固体3.47g(产率：87％)
3)PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109的制备，合成路线如下：
S4.将400mg QPBA(1.04mmol)，120mg TAMA(0.31mmol)，23..7mg PEG45-CTA(0.01mmol)和1.5mg偶氮二异丁腈(0.009mmol)溶于700μL N，N-二甲基甲酰胺，然后转移到聚合管中，通过三次冻融循环脱气，最后在真空下密封。然后将聚合管浸入提前预热的65℃油浴中。搅拌5h后，将聚合管置于液氮中片刻后，打开盖子终止聚合。将反应混合物在100mL乙醚中沉淀，然后将沉淀溶解在少量二甲基甲酰胺中，再次在乙醚中沉淀。上述溶解-沉淀循环进行了三次，即得得到413mg PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109(产率：76％)。
实施例2
本实施例2提供一种新的嵌段共聚物，与实施例1的区别在于单体不相同，结构式如下，制备方法如下：
将83mg苄基丙烯酰胺(0.51mmol)，200mg TAMA(0.51mmol)，238mg聚乙二醇甲醚丙烯酸脂(Mw：300)(0.68mmol)和1.5mg偶氮二异丁腈(0.009mmol)，3.757mg 2-氰丙基-2-基苯并二硫(0.017mmol)溶于600μL N，N-二甲基甲酰胺，然后转移到聚合管中，通过三次冻融循环脱气，最后在真空下密封。然后将聚合管浸入提前预热的 65℃油浴中。搅拌10h后，将聚合管置于液氮中片刻后，打开盖子终止聚合。将反应混合物在100mL乙醚中沉淀，然后将沉淀溶解在少量二甲基甲酰胺中，再次在乙醚中沉淀。上述溶解-沉淀循环进行了三次，即得得到264mg聚合物(产率：51％)。
实施例3
实施例3提供一种嵌段共聚物载药胶束，包括实施例1制备的嵌段共聚物以及药物活性成分，所述药物活性成分为喜树碱。所述嵌段共聚物载药胶束的制备方法包括如下步骤：
将实施例1制备的5mg PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109和喜树碱共溶于1mL 合适的有机溶剂中(二氧六环)，快速加入剧烈搅拌的PBS中(9mL，10mM,pH 7.4)，继续搅拌7分钟后将样品转移到透析袋中，在水中透析以除去有机溶剂及未负载的药物。
实施例4
实施例4提供一种嵌段共聚物载药胶束，包括实施例1制备的嵌段共聚物，以及药物活性成分，所述药物活性成分为紫杉醇，制备方法与实施3相同。
实施例5
实施例5提供一种嵌段共聚物载药胶束，包括实施例1制备的嵌段共聚物，以及药物活性成分，所述药物活性成分为盐酸阿霉素，制备方法与实施3相同。
实施例6
实施例6提供一种嵌段共聚物载药胶束，包括实施例1制备的嵌段共聚物，以及药物活性成分，所述药物活性成分为米托蒽醌盐酸盐，制备方法与实施3相同。
性能测试
实施例1的核磁共振测试：
对实施例1制备的嵌段共聚物单体产物和PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109进行了核磁共振氢谱和碳谱确认，见图1～图3，从图1看，阳离子单体TAMA各个位置的氢都已在图中进行归属和积分，图中没有其他杂峰，说明所合成的TAMA单体结构正确，同时，从图2来看，TAMA的碳数目与碳谱结果一致，且化学位移与预测结果几乎无异。从图3结果来看，根据聚乙二醇的特征峰(3.6ppm附近)、TAMA特征峰(季铵基团的甲基氢化学位移3.4ppm附近)以及QPBA的特征峰(苯环7.5ppm附近)的峰面积计算出三者的组成比，确定该聚合物组成为PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109。
实施例3～6的嵌段共聚物载药胶束的冷冻电镜测定和粒径测定：
测试方法：分别取实施例3～6制得的PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109载药胶束水溶液1毫升置于未开封的动态光散射培养皿内并进行溶液的粒径测试；取少量载药胶束冷冻后进行常规的冷冻电镜测试操作。
从图4看，PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109载药胶束为水合粒径大小约50-70nm的纳米粒子，PDI较小(低于0.2)，说明纳米粒子尺寸比较均一，从代表性载药胶束的冷冻电镜结果来看(图5)，负载了喜树碱的纳米粒子在冷冻电镜下为尺寸均一的实心纳米粒子，由此可推断PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109与药物自助装成了纳米胶束。
实施例3～6的嵌段共聚物载药胶束的体外释放试验：
取一定量的实施例3～6制得的PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109载药胶束经适当稀释后置于透析袋中，并将透析袋置于不同浓度(0-200μM)的H2O2溶液中透析，于特定时间点收集透析外液，并补充相应的新鲜透析液，最后计算药物的累积释放量。
相对于已报道的传统过氧化氢响应的载药体系，药物释放需要在相对较高的过氧化氢条件下才能释放，有些文献报导的过氧化氢载药体系的释放条件甚至达到了1mM过氧化氢浓度，这种条件在体内生理条件下难以满足。从图6看，负载了疏水性药物喜树碱的载药胶束在前3小时释放速率较快，几乎释放了所负载的90％的药物并在4小时达到释放完全。紫杉醇载药胶束在前2小时就已完成了快速释放的过程并在4小时释放完全；同样地，亲水性药物盐酸阿霉素载药胶束在2小时时释放较快，释放率约为70％，于4小时达到释放完全；盐酸米托蒽醌的载药胶束的体外释放显示，3小时内呈快速释放的趋势，释放率也达到约70％。以上不管是疏水还是亲水药物代表，均显示出灵敏且快速的特点；各载药胶束均能够在相对较低的H2O2浓度条件下(＜200μM)快速(＜ 6小时)且完全地(＞90％)释放出所负载的药物,而在无过氧化氢的条件下，释放率均低于20％；同时，从图7可以看出，以负载喜树碱的载药纳米胶束为代表，随着过氧化氢浓度的升高(0-200μM),喜树碱的释放速率也随之加快，释放完全所需的时间也有明显的降低。
实施例3～6制备的嵌段共聚物载药胶束的性能测试，见表1：
表1实施例3～6的嵌段共聚物载药胶束的数据
其中，NP1/CPT是指采用实施例1的的嵌段共聚物与喜树碱形成的胶束；
NP1/PTX是指采用实施例1的的嵌段共聚物与紫杉醇形成的胶束；
NP1/DOX是指采用实施例1的的嵌段共聚物与盐酸阿霉素形成的胶束；
NP1/MIT是指采用实施例1的的嵌段共聚物与盐酸米托蒽醌形成的胶束。
粒径和ζ电位测试方法：分别取实施例3～6制得的载药胶束水溶液1毫升置于电位测定专用样品池内并用马尔文粒度仪进行溶液的电位测试。
负载率及包封率测试方法：按实施例3～6所述步骤制备载药胶束，分别于500mL烧杯中透析，每隔2h收集透析液并对其进行含量测定(喜树碱和盐酸阿霉素通过荧光分光光度计定量，紫杉醇和盐酸米托蒽醌通过高效液相色谱法定量)，直至透析完全，用加入的总药物量减去透析除去的药物量，计算得到负载的药物量，并通过公式：药物负载量(％)＝胶束中药物量/(胶束中药物质量+胶束质量)×100％；包封率(％)＝胶束中药物质量/加入的总药量×100％。
实施例3和实施例5的共聚物载药胶束对4T1细胞的毒性检测：
测试方法：分别将实施例3和5制备的PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109和游离小分子药物进行细胞毒性的测试。使用标准MTT测试方法，使用细胞为4T1细胞。首先，在96孔细胞培养板上种上4T1细胞并培养24小时待其贴壁。随后弃去上层培养液并加入含PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109的载药胶束以及游离小分子药物，使4T1 细胞培养液内的药物浓度达到相应的浓度，孵育8小时后，弃去含药完全培养基，用 PBS洗涤两次后，加入新鲜完全培养基继续孵育16小时，随后取出96孔细胞培养板并按照MTT标准操作法来进行细胞毒性检测，结果如图8所示。
结果表明：PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109载药胶束和游离小分子药物相比，在相同浓度下的PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109载药胶束显示出显著的毒性增强的现象，这说明了药物在PEG45-b-P(QPBA0.78-co-TAMA0.22)109胶束中的快速释放，极大的提高了其对肿瘤细胞的杀伤作用。
图9是实施例2制备的嵌段共聚物的核磁共振氢谱图数据。
上面结合实施例对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (9)

1.一种嵌段共聚物，其特征在于，所述嵌段共聚物的结构式如式（I）所示：
式（I）
其中， n=2~400；m=2~200，n和m为正整数，0＜x＜1；
所述R1选自如下结构式：
、/>或/>中的一种；
所述R2选自如下结构式：
中的至少一种。
2.一种嵌段共聚物，其特征在于，所述嵌段共聚物的结构式如式（I）所示：
式（I）
其中， n=2~400；m=2~200，n和m为正整数，0＜x＜1；
所述R1选自如下结构式：
、/>或/>中的一种；
所述R2选自如下结构式：
。
3.一种嵌段共聚物载药胶束，其特征在于，包含权利要求1或2所述的嵌段共聚物和药物活性成分，其中，所述药物活性成分与嵌段共聚物的质量比为1：（4~10）。
4.根据权利要求3所述的嵌段共聚物载药胶束，其特征在于，所述药物活性成分为疏水性药物和/或亲水性药物。
5.根据权利要求4所述的嵌段共聚物载药胶束，其特征在于，所述药物活性成分为抗肿瘤药物、抗病毒药物或抗菌药物中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的嵌段共聚物载药胶束，其特征在于，所述药物活性成分为盐酸阿霉素、氨苄西林钠、苯唑西林、伐昔洛韦、环丙沙星、盐酸多西环素、、、/>、/>、、/>、中至少一种。
7.根据权利要求3所述嵌段共聚物载药胶束的制备方法，包括如下步骤：
将权利要求1或2所述的嵌段共聚物与药物活性成分在有机溶剂中与磷酸盐缓冲液混合进行反应，经透析后，即得到嵌段共聚物载药胶束。
8.根据权利要求7所述嵌段共聚物载药胶束的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环、丙酮或四氢呋喃中至少一种。
9.一种嵌段共聚物载药胶束制剂，其特征在于，包括权利要求3所述的嵌段共聚物载药胶束，以及药学上可接受的介质或辅料。
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