CN114163314A - 算盘七中Blestriarene B的提取方法及其抗肿瘤应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了算盘七中Blestriarene B的提取方法及其抗肿瘤应用。该提取方法条件温和，操作简单，成本低廉。经过本发明上述提取方法提取到产物经过结构鉴定为Blestriarene B，对Blestriarene B的抗肿瘤实验结果表明，Blestriarene B对乳腺癌细胞MCF‑7、肝癌细胞HepG2都具有一定的抑制作用，有望应用于上述肿瘤的药物开发工作中。

Description

算盘七中Blestriarene B的提取方法及其抗肿瘤应用

技术领域

本发明属于天然产物化学技术领域，具体涉及算盘七中Blestriarene B的提取方法及其抗肿瘤应用。

背景技术

肿瘤在中医病症中属于“癥瘕积聚”，主要是气滞而导致血瘀所致，中医治疗大多以消积，软坚，化痰，逐瘀，散结，消癥，解毒等方法，因此，具有“清热解毒、化痰散结”药性的中药常用于肿瘤疾病的治疗。以中医药理论为指导的中药，在肿瘤疾病的治疗中，具有多靶点，多途径，多效应，不易产生耐药性的优势，使其在肿瘤的治疗中越来越受到重视。

算盘七为兰科植物杜鹃兰Cremastra appendiculata(D.Don)Makina的干燥假鳞茎，多年生草本，叶如禾苗，花为紫红色穗状顶生，根块扁球形，形似算盘子故而得名，又因根块外披黄褐色皮毛，所以又名毛慈菇。根块呈不规则扁球形，高1.8～3cm，膨大部直径1～2cm，表面凹凸不平，有皱纹与纵沟，膨大部多数有三条微突起的环节，故民间又称“三条箍”；质坚硬，难折断，断面灰白色，气微、味淡，带粘性。算盘七为属于陕西七药中的一种，也是中药“山慈菇”的正品基源植物之一。山慈菇为常用抗肿瘤中药，始载于唐《本草拾遗》。我国2015年药典规定，山慈菇为兰科植物杜鹃兰Cremastra appendiculata(D.Don)Makino、独蒜兰Pleione bulbocodioides(Franch)Rolef和云南独蒜兰Pleione yunnanensisRolfe的干燥假鳞茎，具有清热解毒、化痰散结的功效，主要用于痈肿疔毒、瘰疬痰核、蛇虫咬伤、癓瘕痞块。临床多用以治疗肝癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤等多种肿瘤疾病。

目前从算盘七中分离得到的化学成分包括：菲类、二氢菲类、联苄类、黄酮类、生物碱类和萜类化合物等，此外，还含有少量蒽醌、甾体及其他类化学成分。并有研究对算盘七的甲醇提取物，乙醇提取物，乙酸乙酯萃取部位以及多糖等的抗肿瘤作用进行了评价，但并无关于Blestriarene B的提取方法和该化合物抗肿瘤作用的研究报道

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供算盘七中Blestriarene B的提取方法及其抗肿瘤应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了算盘七中Blestriarene B的提取方法，包括以下步骤：

1)提取及萃取：

将算盘七药材粉碎，按照1g：(1～10)mL的料液比，采用体积分数为90％的乙醇回流提取数次，过滤得到残渣，将残渣采用体积分数为60％的乙醇回流数次，合并所有醇提液，减压浓缩至无醇味，干燥得到浸膏，将浸膏用有机溶剂萃取后得到的萃取液继续浓缩、干燥，得到萃取物干浸膏；

2)硅胶柱色谱分离

将萃取物干浸膏采用中压硅胶色谱柱进行分离，以石油醚-乙酸乙酯系统和二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，等量收集洗脱液，根据显色情况合并洗脱液组分，并将其中按照二氯甲烷：甲醇＝20:1的比例洗脱的组分采用常压硅胶柱色谱进行分离，经二氯甲烷-甲醇系统洗脱，再在二氯甲烷：甲醇＝20:1的洗脱液中洗脱得单一成分，经重结晶处理，获得Blestriarene B。

优选地，步骤1)中，采用体积分数为90％的乙醇回流提取3次，每次2h；残渣采用体积分数为60％的乙醇回流3次，每次2h。

优选地，步骤1)中，将浸膏萃取具体操作如下：

将浸膏用适量水进行混悬，得到水溶液，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇作为萃取剂进行萃取，所述水溶液与萃取剂的体积比为1:1，每个萃取剂均萃取4次，分别得到石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层。

优选地，步骤2)中，中压硅胶色谱柱指的是压力为5MPa～15MPa；采用中压色谱柱分离时，石油醚-乙酸乙酯系统中石油醚和乙酸乙酯的体积比为100:0～5:1；二氯甲烷-甲醇系统中二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1～0:1。

进一步优选地，对组分9采用的二氯甲烷-甲醇系统中二氯甲烷和甲醇的体积比为100:0～5:1。

本发明还公开了采用上述的提取方法提取到的Blestriarene B在制备抗肿瘤药物中的应用，Blestriarene B的结构式如下：

优选地，所述的肿瘤为乳腺癌和肝癌。

优选地，所述的药物为抑制肿瘤细胞增殖的药物。

进一步优选地，所述的药物为通过诱导细胞凋亡、影响细胞周期抑制肿瘤细胞增殖的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明公开了算盘七中Blestriarene B的提取方法，该提取方法条件温和，操作简单，成本低廉，获得的Blestriarene B纯度可以达到98％以上。

经过本发明上述提取方法提取到产物经过结构鉴定为Blestriarene B，对Blestriarene B的抗肿瘤实验结果表明，Blestriarene B对乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2都具有一定的抑制作用，IC50分别14.97±1.66μmol/L和20.80±1.43μmol/L。在细胞克隆实验中，Blestriarene B对MCF-7细胞的长期增殖呈现出浓度依赖的抑制作用。通过细胞划痕实验可知其能够抑制肿瘤细胞迁移，并呈现浓度依赖性。流式细胞法(AnnexinV/PI双染法)研究结果表明Blestriarene B可诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡，且呈现浓度依赖性。利用PI染色结合流式细胞仪观察了细胞周期分布的变化，结果表明其可将乳腺癌细胞MCF-7的细胞周期阻滞于S期。以上研究结果提示我们，Blestriarene B抑制肿瘤细胞增殖的机制可能与诱导细胞凋亡和影响细胞周期有关。以上研究结果表明，Blestriarene B有望成为一种抗肿瘤候选化合物或前体药物。

附图说明

图1为Blestriarene B对MCF-7细胞长期增殖抑制作用结果图；

图2为Blestriarene B对MCF-7细胞集落形成数的影响结果图；

图3为Blestriarene B对MCF-7细胞的抑制迁移作用结果图；

图4为Blestriarene B在不同浓度下诱导MCF-7细胞的细胞凋亡结果；

图5为Blestriarene B在不同浓度下诱导MCF-7细胞的早期凋亡率和总凋亡率；

图6为Blestriarene B在不同浓度下对MCF-7的周期影响分析图；

图7为Blestriarene B在不同浓度下对MCF-7的周期比例分布图；

图8为化合物Blestriarene B红外谱图；

图9为化合物Blestriarene B的¹H-NMR；

图10为化合物Blestriarene B的¹³C-NMR。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

一、Blestriarene B的提取方法

1、提取及萃取：

算盘七干燥药材5kg，粉碎，用料液比为1:2的95％的乙醇回流提取3次(2h/次)，过滤得残渣再用60％的乙醇回流提取3次(2h/次)，合并所有的提取液，减压浓缩至无醇味，干燥后得粗提物浸膏346.5g。将浸膏用适量蒸馏水混悬，并依次使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行系统溶剂萃取，体积比为1:1，各溶剂分别萃取4次，萃取液减压浓缩至浸膏状，最后得石油醚层16.4g，氯仿层11.2g，乙酸乙酯层25.6g，正丁醇层75.4g，水层261.5g。

2、硅胶柱色谱分离：

算盘七氯仿萃取物所得的干浸膏共11.2g，采用中压硅胶柱色谱(300-400目)进行分离，以石油醚-乙酸乙酯(100:0～5:1)和二氯甲烷：甲醇(20:1～0:1)两个系统梯度洗脱，等量收集洗脱液。根据薄层色谱检测的荧光和显色情况，对所得组分进行合并，最终获得11个组分。其中组分9经常压硅胶柱色谱(300-400目)，二氯甲烷-甲醇(100:0～5:1)系统洗脱，在二氯甲烷-甲醇(20:1)洗脱液中得到一黄色结晶。经二氯甲烷-甲醇(20:1)重结晶得到Blestriarene B，经高效液相分析柱检测为一单峰。

3、结构鉴定

黄色结晶8.3mg(二氯甲烷-甲醇(20:1))，紫外254nm下有暗斑，365nm下有紫色荧光，10％硫酸-乙醇显色呈绿色。IR(cm^-1)中1589cm^-1和1458cm^-1的吸收峰，表明该结构含有芳香环。¹H-NMR氢谱中化学位移δ9.46(d,J＝9.6Hz,1H)，7.14(d,J＝2.8Hz,1H)，7.10(dd,J＝9.6,2.8Hz)以及化学位移δ8.11(d,J＝8.4Hz,1H,H-5′)，6.64(d,J＝2.8Hz,1H,H-8)，6.60(dd,J＝8.4,2.8Hz,H-6′)分别为两组AMX自旋偶合系统；化学位移为7.42(d,J＝9.2Hz,1H)，7.21(d,J＝9.1Hz,1H)为苯环上邻位偶合质子信号，即1,2,3,4-四取代的苯环，结合碳谱，推断其为稠环化合物。

氢谱中化学位移δ4.14(s,3H)、3.94(s,3H)的质子信号及¹³C-NMR碳谱δ为54.51和54.66的碳信号，表明有两个与苯环连接的甲氧基信号。氢谱中化学位移在δ2.50(m,2H)和2.29(m,2H)处推断其为9.10-脱氢菲类化合物。¹³C-NMR碳谱中共30个碳信号。结合以上数据及参考文献^[1,2]数据，最终鉴定该化合物为Blestriarene B。红外光谱(参见图8)、磁共振氢谱(参见图9)、碳谱(参见图10)数据及化学结构如下：

¹H-NMR(400MHz,MeOD)δ：9.46(d,J＝9.6Hz,1H,H-5)，8.11(d,J＝8.4Hz,1H,H-5′)，7.42(d,J＝9.2Hz,1H,H-9)，7.21(d,J＝9.2Hz,1H,H-10)，7.14(d,J＝2.8Hz,1H,H-8)，7.10(dd,J＝9.6,2.8Hz,H-6)，6.94(s,1H,H-3′)，6.67(s,1H,H-3)，6.64(d,J＝2.8Hz,1H,H-8′)，6.60(dd,J＝8.4,2.8Hz,H-6′)，4.14(s,3H,OCH₃-4′)，3.94(s,3H,OCH₃-4)，2.50(m,2H,H-9′)，2.29(m,2H,H-10′)。

¹³C-NMR(100MHz,MeOD)δ：26.8(C-10′)，29.60(C-9′)，54.51(4′-OCH₃)，54.66(4-OCH₃)，97.68(C-3′)，98.86(C-3)，110.12(C-8)，110.64(C-1)，112.05(C-6′)，113.30(C-8′)，114.27(C-4a)，115.55(C-1′)，115.90(C-4a′)，116.04(C-6)，124.37(C-5a′)，124.57(C-5a)，125.15(C-10)，127.04(C-9)，128,92(C-5′)，129.15(C-5)，133.16(C-8a)，134.05(C-10a)，139.36(C-8a′)，140.21(C-10a′)，153.19(C-2′)，153.97(C-2)，154.01(C-7′)，154.01(C-7)，157.03(C-4′)，159.10(C-4)。

结构式如下：

参考文献：

[1]Yamaki M,Li B,Inoue K,et al.Biphenanthrenes from Bletilla striata[J].Phytochemistry,1989,28(12):3503-3505.

[2]杨明惠，赵会然，郭洁，等.短瓣兰的化学成分研究[J].云南大学学报(自然科学版)，2015，37(4)：556-563.

二、Blestriarene B抗肿瘤活性测试

1、肿瘤细胞的增殖抑制实验

实验方法：取对数生长期的细胞，用0.25％胰酶消化并收集细胞，调整细胞密度至5×10⁴个/mL，接种于96孔培养板中，每孔0.1mL。过夜培养使细胞贴壁后，空白对照组加入不含血清也不含药的细胞培养液0.1mL，实验组加入不含血清但含不同浓度的各样品培养液0.1mL，在培养箱连续培养48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL MTT溶液，在37℃下孵育4h后，用1mL注射器吸弃去上清，加入150μL DMSO，振荡摇匀使蓝紫色结晶充分溶解，用酶标仪于490nm波长处测定OD值，计算细胞抑制率。

实验结果：由表1所显示的结果，可知Blestriarene B对人乳腺癌细胞株MCF-7和人肝癌细胞株HepG-2均显示良好的增殖抑制作用，IC₅₀分别为14.97±1.66和20.80±1.43μmol/L。

表1 Blestriarene B对MCF-7、HepG2细胞的抑制增殖作用的IC₅₀值(μmol/L，n＝3，mean±SD)

2、抑制MCF-7细胞克隆形成实验

实验方法：将处于指数生长期的乳腺癌细胞MCF-7消化后离心，细胞计数板计数，调整密度为每孔500个接种于12孔板中，待细胞贴壁后给药，给药浓度依次为20μmol/L、10μmol/L、0μmol/L，放入细胞培养箱连续培养，7天后，去掉上清，PBS润洗一遍，0.5％结晶紫染色，显微镜下观察计数，一个细胞集落的细胞数在2⁵以上计为一个克隆形成，在显微镜下每孔任选4个区域求平均值，得每孔的细胞克隆数。

实验结果：克隆形成实验结果表明，Blestriarene B在不同浓度下对MCF-7细胞的克隆形成均具有一定抑制作用，即对肿瘤细胞具有长期增殖抑制作用，且呈现浓度依赖关系。当样品浓度为20μmol/L时，细胞增殖受到强烈抑制，几乎没有克隆形成。当样品浓度为10μmol/L时，细胞增殖也受到较为强烈的抑制，仅有少量克隆形成。各样品组与空白组比较均有极显著差异(p<0.01)，提示化合物Blestriarene B对肿瘤细胞增殖具有较强的抑制作用。实验结果如图1及图2所示。

3、抑制MCF-7细胞迁移实验

实验方法：使用24孔板，铺板密度为每孔4-6万个细胞，调整铺板密度以次日细胞可铺满整个孔内为最佳密度。过夜，待细胞贴壁后，吸掉旧的培养基，用100μL枪头划线，将孔竖直一分为二(可事先在孔的背面标记，以便拍照时定位)。形成划痕后，PBS洗两遍以便显微镜下可观察到清晰划痕，加入含有1％胎牛血清的培养液为阴性对照，加入含不同浓度药物的1％胎牛血清培养液为给药组，每组3个复孔，放入5％CO₂培养箱中培养。分别取划痕0h、24h、36h后的不同处理组的痕道宽度。

实验结果：Blestriarene B在浓度为10μmol/L时，对MCF-7细胞作用0小时、24小时、36小时时对细胞横向迁移的影响结果如图3所示。该实验结果表明，对照组随着培养时间的延长，细胞迁移，划痕逐渐弥合，而加入样品后，肿瘤细胞的迁移受到显著抑制，划痕基本保持不变，提示该样品能够显著抑制肿瘤细胞的迁移。

4、MCF-7细胞凋亡实验

实验方法：

①将乳腺癌细胞MCF-7接种于6孔板中，每孔约2×10⁵个细胞，放入恒温箱中过夜培养，细胞贴壁后，分别用不同浓度的样品溶液处理细胞，培养48h；

②培养结束后，把细胞培养液吸出至离心管内(内含已经悬浮的凋亡或坏死细胞)，无菌PBS洗一次，加入适量0.25％的不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞。室温孵育待细胞变圆后，吸除胰酶，避免胰酶消化不够或消化过度。加入含有血清的培养基，轻轻吹打均匀，转移到离心管内，1000r/min转离心5min；

③弃上清，用1mL PBS轻轻重悬细胞并计数(细胞数量不少于10⁵)，1000r/min离心5分钟，收集细胞。此操作可重复两次；

④加入400μL×Binding Buffer轻轻重悬细胞；

⑤加入5μLAnnexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育30min；

⑥加入10μL PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置5min后，进行流式细胞仪检测。

实验结果：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的PS由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35～36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。PI是一种核酸染料，它对活细胞和凋亡早期细胞膜完好的细胞不染色，但能够透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞膜而使细胞核染红。将Annexin V标以荧光素(FITC)，结合PI，再利用流式细胞仪，既可检测细胞凋亡的发生，也能将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。在凋亡分布图中，左下象限显示不被Annexin V-FITC和PI染色的活细胞；右下象限显示仅被Annexin V-FITC染色的凋亡早期细胞；右上象限显示被Annexin V-FITC和PI同时染色的坏死细胞和凋亡晚期细胞。

在凋亡实验中，肿瘤细胞在中、高浓度Blestriarene B处理下存在大量死亡的情况，提示我们样品具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。因而采用Annexin-V—PI FITC双染法测定Blestriarene B在不同浓度下对MCF-7的诱导凋亡作用，并计算早期凋亡率和总凋亡率。由实验结果可得出，对照组中正常细胞占大多数，平均早期凋亡率及总凋亡率仅为1.46±0.25％和5.18±2.05％。而实验组中凋亡细胞数增多，且随着用药浓度增加，早期凋亡细胞和总凋亡细胞逐渐增加。在不同药物浓度下，平均早期凋亡率分别为4.27±0.88％、14.71±1.73％和47.66±1.97％，总凋亡率分别为8.40±1.75％、21.07±3.68％和70.0±5.14％。样品浓度为10及20μmol/L时，细胞早期凋亡率和总凋亡率与空白组比较均有极显著差异(p<0.01)，提示Blestriarene B抑制肿瘤作用与其诱导肿瘤细胞凋亡有关。测定结果如表2及图4、5所示。

表2 Blestriarene B在不同浓度下诱导MCF-7早期凋亡率和总凋亡率(

n＝3)

5、细胞周期实验

实验方法：

①将细胞接种于6孔板中，每孔加2mL含血清的培养基，接种细胞数约为2×10⁵/孔；

②待细胞长至40％后，加无血清培养基饥饿处理24h；

③加药，加入不同浓度的药物处理24h；

④回收细胞，消化后收集，1000r/min离心5min，弃上清，PBS洗涤2次，离心除去PBS，加入-20℃预冷的70％酒精，4℃过夜进行固定，离心除去酒精，PBS洗涤2次，加0.1mg/mL RNA酶和0.05mg/mL PI染液各150μl，4℃避光染色30min流式细胞仪检测。

实验结果：细胞周期是指连续分裂的细胞从上一次分裂结束开始到下一次分裂结束为止所经历的全过程，主要分为G1期，S期，G2期和M期。G1期是从有丝分裂完成到DNA复制前的间隙时间，细胞具有二倍体的DNA含量；S期是DNA复制时期，DNA含量介于G1和G2之间；G2期是DNA复制完成到有丝分裂开始前的一段时间，细胞具有四倍体的DNA含量；M期是细胞分裂到结束。经过酒精处理过的细胞，PI染色液能通过其细胞膜，与细胞内的DNA和RNA结合出现荧光。如果细胞用RNA酶处理后，它的荧光强度就可以直接反映细胞内DNA的含量。利用流式细胞仪结合PI染色法以及相关的Mod Fit 3.0软件就可以计算出各期间细胞的百分比，由此来检测细胞周期的分布情况。

Blestriarene B对MCF-7细胞具有抑制增殖作用和诱导凋亡作用，提示该化合物对细胞周期具有影响，因而采用流式细胞仪测定不同浓度样品处理后的肿瘤细胞所处的细胞周期。由测定结果可知，Blestriarene B作用于乳腺癌细胞MCF-7后，其细胞周期发生了变化，非药物处理组G1期细胞占细胞总数的48.58％；S期占39.74％；G2/M期占11.68％。药物处理组随着给药浓度的增加，G1期细胞数减少，S期细胞数增加。由此可以发现化合物Blestriarene B改变了MCF-7细胞的周期分布，使细胞分裂阻滞在细胞周期S期，并呈现浓度依赖关系。S期是DNA复制阶段，样品对S期的阻滞作用提示我们其可能具有DNA损伤作用，从而导致了细胞增殖的抑制和凋亡的增加。测定结果如图6、7及表3所示。

表3 Blestriarene B在不同浓度下对MCF-7的周期比例的影响结果(％)

综上所述，本发明提供了一种条件温和，操作简单，成本低廉的提取纯化方法，该方法可以应用于自陕西七药算盘七中提取纯化Blestriarene B。抗肿瘤实验结果表明，Blestriarene B对乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2都具有一定的抑制作用，IC₅₀分别14.97±1.66μmol/L和20.80±1.43μmol/L。在细胞克隆实验中，Blestriarene B对MCF-7细胞的长期增殖呈现出浓度依赖的抑制作用。通过细胞划痕实验可知其能够抑制肿瘤细胞迁移，并呈现浓度依赖性。流式细胞法(AnnexinV/PI双染法)研究结果表明Blestriarene B可诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡，且呈现浓度依赖性。利用PI染色结合流式细胞仪观察了细胞周期分布的变化，结果表明其可将乳腺癌细胞MCF-7的细胞周期阻滞于S期。以上研究结果提示我们，Blestriarene B抑制肿瘤细胞增殖的机制可能与诱导细胞凋亡和影响细胞周期有关。以上研究结果表明，Blestriarene B有望成为一种抗肿瘤候选化合物或前体药物。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (9)

1.算盘七中Blestriarene B的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取及萃取：

将算盘七药材粉碎，按照1g：(1～10)mL的料液比，采用体积分数为90％的乙醇回流提取数次，过滤得到残渣，将残渣采用体积分数为60％的乙醇回流数次，合并所有醇提液，减压浓缩至无醇味，干燥得到浸膏，将浸膏用有机溶剂萃取后得到的萃取液继续浓缩、干燥，得到萃取物干浸膏；

2)硅胶柱色谱分离

将萃取物干浸膏采用中压硅胶色谱柱进行分离，以石油醚-乙酸乙酯系统和二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，等量收集洗脱液，根据显色情况合并洗脱液组分，并将其中按照二氯甲烷：甲醇＝20:1的比例洗脱的组分采用常压硅胶柱色谱进行分离，经二氯甲烷-甲醇系统洗脱，再在二氯甲烷：甲醇＝20:1的洗脱液中洗脱得单一成分，经重结晶处理，获得Blestriarene B。

2.根据权利要求1所述的算盘七中Blestriarene B的提取方法，其特征在于，步骤1)中，采用体积分数为90％的乙醇回流提取3次，每次2h；残渣采用体积分数为60％的乙醇回流3次，每次2h。

3.根据权利要求1所述的算盘七中Blestriarene B的提取方法，其特征在于，步骤1)中，将浸膏萃取具体操作如下：

将浸膏用适量水进行混悬，得到水溶液，依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇作为萃取剂进行萃取，所述水溶液与萃取剂的体积比为1:1，每个萃取剂均萃取4次，分别得到石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层。

4.根据权利要求1所述的算盘七中Blestriarene B的提取方法，其特征在于，步骤2)中，中压硅胶色谱柱指的是压力为5MPa～15MPa；采用中压色谱柱分离时，石油醚-乙酸乙酯系统中石油醚和乙酸乙酯的体积比为100:0～5:1；二氯甲烷-甲醇系统中二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1～0:1。

5.根据权利要求4所述的算盘七中Blestriarene B的提取方法，其特征在于，对组分9采用的二氯甲烷-甲醇系统中二氯甲烷和甲醇的体积比为100:0～5:1。

6.采用权利要求1～5中任意一项所述的提取方法提取到的Blestriarene B在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，Blestriarene B的结构式如下：

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为乳腺癌和肝癌。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制肿瘤细胞增殖的药物。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过诱导细胞凋亡、影响细胞周期抑制肿瘤细胞增殖的药物。

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