CN106167493B

CN106167493B - 新型千金藤素的制备方法及其在药物上的应用

Info

Publication number: CN106167493B
Application number: CN201610544059.6A
Authority: CN
Inventors: 朱华结; 赵丹; 曹飞; 李婉
Original assignee: Hebei University
Current assignee: Hebei University
Priority date: 2016-07-06
Filing date: 2016-07-06
Publication date: 2018-06-05
Anticipated expiration: 2036-07-06
Also published as: CN106167493A

Abstract

本发明涉及一类化学结构式1所示的(1R，1′R)‑千金藤素、其制备方法和用途：

Description

新型千金藤素的制备方法及其在药物上的应用

技术领域

本发明涉及一类新化合物的制备及其用途，具体是千金藤素及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

1938年Kondoh和Keimatsu第一次确定千金藤素的结构为(1R，1′S)-千金藤素(Cepharanthine)，双苄基喹啉类生物碱是防己科千金藤属植物中的主要成分，具有抗肿瘤，免疫调节、抑菌等作用，用于因放疗、化疗引起的粒细胞缺乏症或其他原因引起的白细胞减少症等[Moshe Rogosnitzky等，Pharmacological Reports，2011，63，337-347]。我们从地不容块根中提取得到新型千金藤素，其结构为(1R，1′R)-千金藤素，未见文献报道。

(+)-千金藤素(Cepharanthine)分子式为C₃₇H₃₈N₂O₆，分子量为606.71，平面结构如下图。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一类(1R，1′R)-千金藤素、其制备方法和用途。

为解决本发明的技术问题，本发明提供如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面是提供了一类如化学结构式I所示的(1R，1′R)-千金藤素：

本发明技术方案的第二方面是提供了从地不容块根中提取(1R，1′R)-千金藤素的方法，

本发明技术方案的第三方面是提供了第一方面所述的(1R，1′R)-千金藤素在制备抗肿瘤药中的应用。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明的(1R，1′R)-千金藤素是结构新颖的化合物，可用于制备抗肿瘤药物。

附图说明

图1是A：(1R，1′S)-1构型的理论计算的ECD光谱与实测值比较图；B：(1S，1′S)-1构型的理论计算的ECD光谱与实测值比较图；

图2是A：(1R，1′S)-1构型的理论计算的VCD光谱与实测值比较图；B：(1S，1′S)-1构型的理论计算的VCD光谱与实测值比较图；

图3是A：(1R，1′S)-1构型的理论计算的¹³C-NMR与实测值比较图；B：(1S，1′S)-1构型的理论计算的¹³C-NMR与实测值比较图；

具体实施方式

以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1

(1R，1′R)-千金藤素的提取制备：

从安国中药市场购买地不容块根5kg，粉碎，使用适量80％酒精萃取3次，45℃下减压浓缩得到提取粗浸膏80g，将粗浸膏溶于水中，用适量乙酸乙酯萃取5次，得浸膏50g。浸膏加入200-300目硅胶拌样，然后用石油醚/乙酸乙酯(4∶1、3∶2、2∶3、1∶4、纯乙酸乙酯)洗脱，粗分得到Fr.1-5个组分，组分Fr.3反复经过硅胶色谱柱、Sephadex LH-20凝胶色谱柱、RP-C18反相填料色谱柱分离得到10mg目标化合物。

实施例2

(1R，1′R)-千金藤素结构的鉴定：

实施例1所制化合物定性分析数据和图谱：

¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ：2.38-2.44，2.63-2.68(2m，2×2H，2×NCH₂)，2.56(s，3H，N-Me)，2.64(s，3H，N-Me)，2.76-2.79，2.84-2.87(m，2×2H，2×CH₂)，3.60(s，1H，CH)，3.68(s，3H，OMe)，2.98-3.31(m，4H，2×CH₂)，3.88(s，3H，OMe)，4.17(s，1H，CH)，5.59，5.55(ds，2H，OCH₂O)，5.47(s，1H，C₆H₃)，6.32(s，1H，C₆H₂)，6.64(s，1H，C₆H₂)，6.77(ds，2H，C₆H₃)，6.35(s，1H，C₆H₁)，7.03(s，1H，C₆H₄)，6.36(s，1H，C₆H₄)，6.95(s，1H，C₆H₄)，7.37(d，J＝7.9Hz，1H，C₆H₄)；

¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ：25.8(C-4′)，28.9(C-4)，37.9(C-a)，40.3(C-a′)，42.3(N-Me)，43.9(N-Me)，45.3(C-3′)，51.2(C-3)，55.0(OMe)，56.0(OMe)，61.9(C-1′)，64.2(C-1)，100.4(O-CH₂-O)，102.2(C-5′)，110.9(C-13)，111.1(C-5)，116.8(C-10)，118.5(C-8)，120.9(C-11′)，122.2(C-13′)，123.8(C-14)，126.5(C-8a′)，128.0(C-8a，C-14′)，130.8(C-4a)，131.7(C-10′)，132.8(C-9，C-4a′)，138.1(C-9′)，138.2(C-7′)，139.0(C-8′)，141.9(C-7)，147.0(C-12，C-6′)，148.7(C-6)，148.8(C-11)，152.3(C-12′)；

ESI-QTOFMS：[M+H]⁺607.2802。

通过与参考文献[陈江弢等.天然产物研究与开发，2005，17(5)：580-582.]比较，数据一致，确定其平面结构为6′，12′-Dimethoxy-2，2′-dimethyl-6，7-(methylenebis(oxy))-oxyacanthan。

绝对构型的确定：

(1)旋光

实验测得化合物[α]_D＝+230(C＝0.005CHCl₃)

利用量子化学理论(密度泛函)，B3LYP/6-311+G(d)//PCM//B3LYP/6-311+G(d)计算(1R，1′S)构型的旋光值为+60.1；(1S，1′S)构型的旋光值为-206.8，由此判断化合物1的绝对构型可能为(1S，1′S)的对映体(1R，1′R)。

(2)ECD

利用量子化学理论(密度泛函)，在B3LYP/6-311+G(d)//B3LYP/6-311+G(d)上分别计算(1R，1’S)-1、(1S，1’S)-1构型的ECD，并与实验结果进行比较。如附图1所示，发现实验测试时化合物1在243nm、291nm处有正的Cotton效应，在263nm处为负的Cotton效应，而计算结果显示(1R，1′S)-1在241nm、253nm、297nm处有负Cotton效应，在246nm、275nm处有正Cotton效应，与实验结果比较即不一致也不成镜像关系，因此化合物1构型不是(1R，1′S)。(1S，1′S)-1构型的计算结果显示在238nm，289nm处为负的Cotton效应，264nm处为正的Cotton效应，与实验结果成镜像关系，因此化合物1的绝对构型有可能是(1S，1′S)的对映体(1R，1′R)。

(3)VCD

使用B3LYP/6-31+G(d，p)//PCM/B3LYP/6-31+G(d，p)对(1R，1′S)-1、(1S，1′S)-1进行VCD计算，采用全电子能进行VCD光谱处理，并与实验值进行比较。如附图2所示，计算的两个构型的IR图谱和实验值都比较吻合。图2中(1R，1′S)构型的VCD信号有的和实验方向一致，有的和实验方向相反。例如1′、2′、5′、6′、8′、9′、10′、14′与1、2、5、6、8、9、10、14方向相反，而3′、4′、7′、11′、12′和3、4、7、11、12的方向一致，同样说明化合物1不是(1R，1′S)构型。图2中，计算的是(1S，1′S)构型的VCD，其1′-14′的信号均和实验所得信号方向相反。因此可以推测出化合物1的绝对构型应可能为(1S，1’S)的対映体(1R，1′R)。

(4)¹³C-NMR

采用B3LYP/6-311+G(d)//PCM/B3LYP/6-311+G(d)方法对(1R，1′S)-1、(1S，1′S)-1构型进行¹³C-NMR计算，并与实验结果比较。从附图3中可以看出，¹³C-NMR计算中，(1R，1′S)构型的有7个芳香碳化学位移差值超过了4ppm，分别是C-8a、C-9、C-10、C-7′、C-9′、C-12′、C-13′，相关系数为0.9965。而(1S，1′S)构型的计算结果中只有C-8与实验值相差4.7ppm，其余的都在4.0ppm范围内，其相关系数为0.9986，比(1R，1′S)构型更接近实验值。

因此综合OR、ECD、VCD、¹³C-NMR的结果可以确定化合物1的绝对构型应为(1S，1′S)的对映体(1R，1′R)。

实施例3

(1R，1′R)-千金藤素的抗肿瘤活性测定

1.抗肿瘤活性原理

MTT法，是一种检测细胞存活和生长的方法。以活细胞代谢物还原剂噻唑蓝[3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四氮唑，MTT]为基础。MTT是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲瓒(formazon)，而死细胞则无此功能。用DMSO溶解formazon后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，既可定量测出细胞的存活率。根据光密度值的变化观察样品对肿瘤细胞的抑制作用。

2.抗肿瘤活性实验

细胞系：人宫颈癌细胞(Hela)，人肺癌细胞(A549)，人乳腺癌细胞(MCF-7)(以上细胞株均由中国科学药物研究所提供，有本实验室传代保存。)。

试剂：噻唑蓝(MTT美国AMRESCO公司)、RPMI 1640培养液(北京索莱宝生命科技有限公司)、新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司产品)、抗生素(美国英杰生命技术公司)；胰酶(Trypsin 1：250：美国AMRESCO公司)；96孔培养板(Costar)；二甲基亚砜(北京索莱宝生命科技有限公司)；注射用顺铂(齐鲁制药有限公司)；DMEM(北京索莱宝生命科技有限公司)。

仪器：SW-CJ-2FD洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、Heal Force 90型二氧化碳培养箱(上海力申科学仪器有限公司)；CKX41SF型倒置显微镜(日本OlympusCorporation)；Synergy HT型酶标仪(美国Bio-Tek公司)；超纯水制备仪(湖南科尔顿水务有限公司制备)。

实验操作：试样对于癌细胞的测试。一次实验过程中，每种试样设置5个浓度梯度(100μmol/mL、50μmol/mL、25μmol/mL、12.5μmol/mL和6.25μmol/mL)，每个浓度四个平行试样，每组实验平行3次，并通过空白组对照得出结论。酶标仪检测各孔OD值，检测波长570nm。

3.抗肿瘤活性评价

1)细胞抑制率计算：

2)IC₅₀值计算

试样浓度对数值与细胞抑制率线性回归，利用软件SPSS计算试样对细胞的半数抑制浓度IC₅₀值。(1R，1′R)-千金藤素对癌细胞的IC₅₀见表1。

表1(1R，1′R)-千金藤素对癌细胞的IC₅₀(μM)

化合物	HELA	MCF-7	A549
				(1R，1′R)-千金藤素	9.15	3.5	5.40
顺铂	5.98	5.49	1.45

测试结果显示(1R，1′R)-千金藤素对人宫颈癌细胞(Hela)，人肺癌细胞(A549)，人乳腺癌细胞(MCF-7)有较好的抑制活性，可作为制备抗癌药的应用。

Claims

1.一种(1R，1′R)-千金藤素的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将5kg干燥的地不容块根粉碎后用80％的乙醇溶液加热条件下提取3次；

(2)在45℃下加压浓缩，得到粗浸膏80g；

(3)将粗浸膏溶于水中，用乙酸乙酯萃取5次，得浸膏50g；

(4)浸膏加入200-300目硅胶拌样，然后用石油醚/乙酸乙酯为4∶1、3∶2、2∶3、1∶4、纯乙酸乙酯洗脱，得到5个组分；

(5)将第3个组分反复经过硅胶色谱柱、Sephadex LH-20色谱柱和ODS反向色谱分离得到(1R，1′R)-千金藤素。