CN114145314B - 一种具有低温保护作用的青霉组合物、低温保护剂及其应用和提高漂浮育苗成活率的方法 - Google Patents

一种具有低温保护作用的青霉组合物、低温保护剂及其应用和提高漂浮育苗成活率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生产和生物技术领域，具体涉及一种具有低温保护作用的青霉组合物、低温保护剂及其应用和提高漂浮育苗成活率的方法。本发明提供了一种具有低温保护作用的青霉组合物，所述青霉组合物包括桔青霉、红色青霉、托姆青霉和宛氏拟青霉。利用本发明所述青霉组合物能够有效提高漂浮育苗的成活率和耐寒能力，具有成本低、操作简单的优势，而且本发明采用的是微生物，因此还具有安全性高、无污染的特点。

Description

一种具有低温保护作用的青霉组合物、低温保护剂及其应用 和提高漂浮育苗成活率的方法
技术领域
本发明属于农业生产和生物技术领域，具体涉及一种具有低温保护作用的青霉组合物、低温保护剂及其应用和提高漂浮育苗成活率的方法。
背景技术
烟草是我国重要的经济作物，育苗是烟草生产的重要环节。目前，我国采用漂浮育苗法开展烟草育苗，比如《烟草集约化育苗技术规程》(GB/T25241.1-2010)发布了育苗的方法和标准。然而，育苗需在冬季开展，而烟草是一种热带作物，喜温，对低温耐受性差，寒冷地区的烟苗易遭受冷害冻害，受损烟苗移栽后成苗期和生育期推迟，直接影响产量和品质。如果育苗时温度低于5℃，可直接导致烟苗死亡。目前，主要采用环境加温、覆盖遮蔽、添加化学制剂等方式预防育苗过程的低温伤害，但常伴随着成本高、操作繁琐、环境污染和食品安全等问题。由此可见，寻找一种有效提高烟草成活率的低温保护剂是有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有低温保护作用的青霉组合物、低温保护剂及其应用和提高漂浮育苗成活率的方法。利用本发明所述青霉组合物能够有效提高漂浮育苗的成活率和耐寒能力，具有成本低、操作简单的优势，而且本发明采用的是微生物，因此还具有安全性高、无污染的特点。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种具有低温保护作用的青霉组合物，所述青霉组合物包括桔青霉、红色青霉、托姆青霉和宛氏拟青霉。
本发明提供了一种低温保护剂，所述低温保护剂的有效成分包括权利要求1所述青霉组合物的代谢产物。
优选的，所述菌剂中桔青霉代谢产物、红色青霉代谢产物、托姆青霉代谢产物和宛氏拟青霉代谢产物的质量比为(20～40)：(20～40)：(10～50)：(20～40)。
优选的，所述代谢产物的制备方法，包括以下步骤：
将桔青霉、红色青霉、托姆青霉和宛氏拟青霉分别活化后培养，得各个青霉的菌液；
将上述所得菌剂依次进行高温灭活、干燥和粉碎后，得低温保护剂。
优选的，所述活化的温度为25～28℃，时间为2～5d。
优选的，所述培养的温度为25～30℃，时间为3～7d。
优选的，所述高温灭活的温度为130～150℃，时间为2～4h。
本发明提供了上述技术方案所述的青霉组合物或上述技术方案所述的低温保护剂在提高漂浮育苗成活率中的应用。
本发明提供了一种提高漂浮育苗成活率的方法，所述方法包括以下步骤：将种子置于含上述技术方案所述的低温保护剂和营养液的混合液中进行培养。
优选的，以所述营养液的质量计，所述菌剂的用量为5～20g/kg。
有益效果：
本发明提供了一种包括桔青霉、红色青霉、托姆青霉和宛氏拟青霉的具有低温保护作用的青霉组合物。利用本发明将桔青霉、红色青霉、托姆青霉和宛氏拟青霉混合使用能够有效提高漂浮育苗的成活率，具有成本低、操作简单、安全性高和无污染的优势。本发明具体实施例结果表明：利用本发明所述青霉组合物能够提高漂浮育苗的发芽率、幼苗鲜重、根系活力、MAD含量和SOD含量，缩短种子的萌发时间。
而且，本发明以四种青霉菌活化和培养后所得的发酵产物为原料，通过高温灭活的方法制备低温保护剂，该方法简单，成本低廉，且不含活体生物，具有环境安全的特点。此外，低温保护剂具有显著的保护植物免受冷害和冻害的效果。
具体实施方式
本发明提供了一种具有低温保护作用的青霉组合物，所述青霉组合物包括桔青霉、红色青霉、托姆青霉和宛氏拟青霉。本发明对所述青霉的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规购买所得即可。在本发明具体实施例中，所述青霉优选购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，其中，桔青霉的菌株保藏编号为CICC 4008，红色青霉的菌株保藏编号为CICC 4035，托姆青霉的菌株保藏编号为CICC 40694，宛氏拟青霉的菌株保藏编号为CICC 2442。
利用本发明所述将桔青霉、红色青霉、托姆青霉和宛氏拟青霉组合后得到的青霉组合物能够有效提高漂浮育苗的发芽率、幼苗鲜重、根系活力、MAD含量和SOD含量，缩短种子的萌发时间，具有成本低、操作简单、安全性高和无污染的优势。
本发明提供了一种低温保护剂，所述低温保护剂的有效成分包括上述技术方案所述青霉组合物的代谢产物。在本发明中，所述菌剂中桔青霉代谢产物、红色青霉代谢产物、托姆青霉代谢产物和宛氏拟青霉代谢产物的质量比优选为(20～40)：(20～40)：(10～50)：(20～40)，进一步优选为(25～35)：(23～37)：(15～45)：(24～36)，更优选为(27～33)：(27～32)：(20～42)：(30～35)。采用本发明所述比例下的低温保护剂能够进一步保证达到植物免受冷害和冻害的效果。
本发明所述菌剂以质量份计，本发明所述低温保护剂包括20～40份桔青霉代谢产物，优选为25～35份，更优选为27～33份。
以桔青霉的质量份为基准，本发明所述低温保护剂包括20～40份红色青霉代谢产物，优选为23～37份，更优选为27～32份。
以桔青霉的质量份为基准，本发明所述低温保护剂包括10～50份托姆青霉代谢产物，优选包括15～45份，更优选为20～42份。
以桔青霉的质量份为基准，本发明所述低温保护剂包括20～40份宛氏拟青霉代谢产物，优选为24～36份，更优选为30～35份。
本发明将这四种青霉混合使用，能够显著提高MAD(丙二醛)含量和SOD(超氧化物歧化酶)活性。
在本发明中，所述代谢产物的制备方法，优选包括以下步骤：
将桔青霉、红色青霉、托姆青霉和宛氏拟青霉分别活化后培养，得各个青霉的菌液；
将上述所得菌剂依次进行高温灭活、干燥和粉碎后，得低温保护剂。
本发明将桔青霉、红色青霉、托姆青霉和宛氏拟青霉分别活化后培养，得各个青霉的菌液。
在本发明中，当活化桔青霉时，优选包括无菌水活化和培养基活化。在本发明中，所述无菌水活化的过程优选为刮取桔青霉的菌落(采用竹签挑取一小块菌落即可)接种于盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中，于温度为28℃，转速为120r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开后，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液；所述培养基活化的过程优选为将无菌水活化得到的孢子悬浊液接种于察氏培养基培养；所述察氏培养基优选包括以下浓度的组分：蔗糖30.0g/L、NaNO33.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、KCl 0.5g/L、FeSO4·4H2O 0.01g/L和K2HPO41.0g/L。在本发明中，所述培养基活化时，接种量优选为察氏培养基体积的3％，所述培养基活化的温度优选为28℃；所述培养基活化的时间优选为2～5d，更优选为3～4d。在本发明中，所述培养基活化的程度优选为察氏培养基中布满菌球。在本发明中，所述活化的过程优选重复1～3次，即复壮的过程优选重复1～3次。
当活化红色青霉时，优选包括无菌水活化和培养基活化。在本发明中，所述无菌水活化的过程优选为刮取红色青霉的菌落(采用竹签挑取一小块菌落即可)接种于盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中，于温度为25℃，转速为120r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开后，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液；所述培养基活化的过程优选为将无菌水活化得到的孢子悬浊液接种于PDA培养基活化；所述PDA培养基优选包括以下浓度的组分：土豆200g/L和葡萄糖20g/L。在本发明中，所述培养基活化时，接种量优选为PDA培养基体积的3％，所述培养基活化的温度优选为25℃；所述培养基活化的时间优选为2～5d，更优选为3～4d。在本发明中，所述活化的过程优选重复1～3次，即复壮的过程优选重复1～3次。
当活化托姆青霉时，优选包括无菌水活化和培养基活化。在本发明中，所述无菌水活化的过程优选为刮取托姆青霉的菌落(采用竹签挑取一小块菌落即可)接种于盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中，于温度为25℃，转速为120r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开后，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液；所述培养基活化的过程优选为将无菌水活化得到的孢子悬浊液接种于麦芽膏培养基活化；所述麦芽膏培养基优选包括以下浓度的组分：麦芽膏20g/L。在本发明中，所述培养基活化时，接种量优选为麦芽膏培养基体积的3％，所述培养基活化的温度优选为25℃；所述培养基活化的时间优选为2～5d，更优选为3～4d。在本发明中，所述培养基活化的程度优选为麦芽膏培养基中布满菌球。在本发明中，所述活化的过程优选重复1～3次，即复壮的过程优选重复1～3次。
当活化宛氏拟青霉时，优选包括无菌水活化和培养基活化。在本发明中，所述无菌水活化的过程优选为刮取宛氏拟青霉的菌落(采用竹签挑取一小块菌落即可)接种于盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中，于温度为28℃，转速为120r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开后，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液；所述培养基活化的过程优选为将无菌水活化得到的孢子悬浊液接种于5°Bé(5波美度)麦芽汁培养基活化；所述5°Bé麦芽汁培养基优选包括1.0L的5°Bé麦芽汁。在本发明中，所述培养基活化时，接种量优选为5°Bé麦芽汁培养基体积的3％，所述培养基活化的温度优选为28℃；所述培养基活化的时间优选为2～5d，更优选为3～4d。在本发明中，所述培养基活化的程度优选为5°Bé麦芽汁培养基中布满菌球。在本发明中，所述活化的过程优选重复1～3次，即复壮的过程优选重复1～3次。
在本发明中，当培养桔青霉时，采用的培养基优选为察氏培养基，所述培养时，接种量优选为培养基体积的3％。在本发明中，所述培养的方式优选为摇床培养；所述培养的转速优选为120r/min，温度优选为28℃，培养的时间优选为3～7d，更优选为4～6d；培养所得桔青霉菌液中的活菌数优选为108cfu/mL～109cfu/mL。
当培养红色青霉时，采用的培养基优选为PDA培养基，所述培养时，接种量优选为培养基体积的3％。在本发明中，所述培养的方式优选为摇床培养；所述培养的转速优选为120r/min，温度优选为25℃，培养的时间优选为3～7d，更优选为4～6d；培养所得红色青霉菌液中的活菌数优选为108cfu/mL～109cfu/mL。
当培养托姆青霉时，采用的培养基优选为麦芽膏培养基，所述培养时，接种量优选为培养基体积的3％。在本发明中，所述培养的方式优选为摇床培养；所述培养的转速优选为120r/min，温度优选为25℃，培养的时间优选为3～7d，更优选为4～6d；培养所得托姆青霉菌液中的活菌数优选为108cfu/mL～109cfu/mL。
当培养宛氏拟青霉时，采用的培养基优选为5°Bé麦芽汁培养基，所述培养时，接种量优选为培养基体积的3％。在本发明中，所述培养的方式优选为摇床培养；所述培养的转速优选为120r/min，温度优选为28℃，培养的时间优选为3～7d，更优选为4～6d；培养所得宛氏拟青霉菌液中的活菌数优选为108cfu/mL～109cfu/mL。
得各个青霉的菌液后，本发明将上述所得菌剂依次进行高温灭活、干燥和粉碎后，得低温保护剂。在本发明中，所述高温灭活的温度优选为140℃，时间优选为3h。在本发明中，所述干燥的方式优选为烘干；所述干燥的时间为48h，温度优选为55℃；所述粉碎后所粉碎物料的粒径优选为25μm～150μm，进一步优选为35μm～130μm，还优选为45μm～110μm，更优选为55μm～90μm。
所述粉碎后，本发明还优选包括对粉碎物料进行混合。本发明对所述混合方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。
利用本发明所述青霉组合物能够有效提高漂浮育苗的成活率和耐寒能力，缩短种子的萌发时间，具有成本低、操作简单、安全性高和无污染的优势。因此，本发明所述青霉组合物或含有该青霉组合物的低温保护剂能够用于提高漂浮育苗成活率。
本发明提供了上述技术方案所述的青霉组合物或上述技术方案所述的低温保护剂在提高漂浮育苗成活率中的应用，进一步优选提高茄科植物漂浮育苗成活率中的应用。在本发明中，所述茄科植物优选包括烟草、番茄和马铃薯，但不限于烟草、番茄和马铃薯。本发明所述青霉组合物或低温保护剂能够有效提高漂浮育苗的发芽率、幼苗鲜重、根系活力、MAD含量和SOD含量，缩短种子的萌发时间，提高植物的耐寒能力，具有成本低、操作简单、安全性高和无污染的优势。
本发明提供了一种提高漂浮育苗成活率的方法，所述方法包括以下步骤：将种子置于含上述技术方案所述的低温保护剂和营养液的混合液中进行培养。
在本发明中，以所述营养液的质量计，所述菌剂的用量为5g/kg～20g/kg，进一步优选为10g/kg～15g/kg，更优选为15g/kg。在本发明中所述营养液优选为氨化硫酸钾复合肥溶液；所述营养液中氨化硫酸钾复合肥的浓度优选为20g/L，本发明对所述氨化硫酸钾复合肥的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规购买所得即可；在本发明具体实施例中，所述氨化硫酸钾复合肥优选购自安徽中元化肥股份有限公司，氮磷钾的比例为15-15-15。
在本发明中，所述混合液中还包括杀菌剂；所述杀菌剂的用量与营养液的质量比优选为(0.1～0.5)：(15～20)，进一步优选为(0.2～0.4)：(16～19)，更优选为(0.25～0.35)：(17～18)，所述杀菌剂优选为多菌灵，更优选为80％的优丽穗多菌灵可湿性粉剂。本发明对所述多菌灵的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的即可；在本发明具体实施例中，所述多菌灵优选购自四川稼得利科技开发有限公司。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种具有低温保护作用的青霉组合物、低温保护剂及其应用和提高漂浮育苗成活率的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)配制培养基：
察氏培养基(桔青霉)：蔗糖30.0g、NaNO33.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、KCl 0.5g、FeSO4·4H2O 0.01g、K2HPO41.0g，用蒸馏水定容至1.0L，pH 7.0～7.2；
PDA培养基(红色青霉)：土豆200g、葡萄糖20g，用去离子水定容至1000mL；
麦芽膏培养基(托姆青霉)：麦芽膏20.0g，用自来水定容至1.0L，自然pH；
5°Bé麦芽汁培养基(宛氏拟青霉)：5°Bé麦芽汁1.0L，自然pH。
将上述制备得到的培养基放入高压灭菌锅中121℃灭菌20min；
(2)活化及培养：刮取红色青霉的菌落(采用竹签挑取一小块菌落即可)接种于盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中，于温度为25℃，转速为120r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开后，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液；25℃上述得到的孢子悬浊液接种于含有100mL PDA培养基的三角瓶中，接种量为PDA培养基体积的3％，活化5d后，待PDA培养基中布满菌球再进行发酵培养，得活化菌株；将活化菌株接种到PDA培养基中，120r/min、25℃培养5d，得活菌数为108cfu/mL的红色青霉菌液；
刮取托姆青霉的菌落(采用竹签挑取一小块菌落即可)接种于盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中，于温度为25℃，转速为120r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开后，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液；将上述得到的孢子悬浊液接种于含有100mL麦芽膏培养基的三角瓶中，接种量为麦芽膏培养基体积的3％，活化5d后，待麦芽膏培养基中布满菌球再进行发酵培养，得活化菌株；将活化菌株接种到麦芽膏培养基中，120r/min、25℃培养4d，得活菌数为108cfu/mL的托姆青霉菌液；
刮取桔青霉的菌落(采用竹签挑取一小块菌落即可)接种于盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中，于温度为28℃，转速为120r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开后，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液；将上述得到的孢子悬浊液接种于含有100mL察氏培养基的三角瓶中，接种量为察氏培养基体积的3％，活化5d后，待察氏培养基中布满菌球再进行发酵培养，得活化菌株；将活化菌株；将活化菌株接种到察氏培养基中，120r/min、28℃培养7d，得活菌数为108cfu/mL的桔青霉菌液；
刮取宛氏拟青霉的菌落(采用竹签挑取一小块菌落即可)接种于盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中，于温度为28℃，转速为120r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开后，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液；将上述得到的孢子悬浊液接种于含有100mL 5°Bé麦芽汁培养基的三角瓶中，接种量为5°Bé麦芽汁培养基体积的3％，活化5d后，待5°Bé麦芽汁培养基中布满菌球再进行发酵培养，得活化菌株；将活化菌株接种到5°Bé麦芽汁培养基中，120r/min、28℃培养5d，得活菌数为108cfu/mL的宛氏拟青霉菌液；
(3)分别收集上述菌液，将收集所得菌液分别在140℃高温灭活3h后，放入55℃烘箱中烘干48h，磨碎后过200目筛，制成干粉，得红色青霉干粉、托姆青霉干粉、桔青霉干粉和宛氏拟青霉干粉；
(4)取桔青霉干粉20份(20g)，红色青霉干粉20份(20g)，托姆青霉干粉40份(40g)，宛氏拟青霉菌干粉20份(20g)进行混合，共100份，4种干粉的质量比为1:1:2:1，得到真菌代谢产物灭活干粉，即低温保护剂Ⅰ。
实施例2
烟草育苗的低温保护剂在烟草育苗中的应用方法：
(1)将实施例1制备得到的低温保护剂Ⅰ按15.00g/kg的浓度添加到漂浮育苗的营养液中，同时将杀菌剂(80％的优丽穗多菌灵可湿性粉剂，四川稼得利科技开发有限公司)按100mg/L的浓度添加到漂浮育苗的营养液中，得到混合液；其中营养液为氨化硫酸钾复合肥溶液，氨化硫酸钾复合肥溶液中氨化硫酸钾复合肥的浓度为20g/L(安徽中元化肥股份有限公司)；
(2)将烟草种子置于聚苯乙烯育苗盘漂浮中，共84粒种子，随后置于含有上述混合液的水槽中；
(3)4℃培养。
实施例2
与实施例1步骤相同，唯一不同之处在于，实施例1制备得到的低温保护剂Ⅰ按5.00g/kg的浓度添加到漂浮育苗的营养液中。
实施例3
与实施例1步骤相同，唯一不同之处在于，实施例1制备得到的低温保护剂Ⅰ按10.00g/kg的浓度添加到漂浮育苗的营养液中。
实施例4
与实施例1步骤相同，唯一不同之处在于，实施例1制备得到的低温保护剂Ⅰ按20.00g/kg的浓度添加到漂浮育苗的营养液中。
对比例1
与实施例1步骤相同，唯一不同之处在于，不添加实施例1制备得到的低温保护剂Ⅰ。
对比例2
(1)配制培养基：
察氏培养基(桔青霉)：蔗糖30.0g、NaNO33.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、KCl 0.5g、FeSO4·4H2O 0.01g、K2HPO41.0g和蒸馏水1.0L，pH 6.0～6.5；
PDA培养基(红色青霉、棘孢青霉)：土豆200g、葡萄糖20g，用去离子水定容至1000mL；
麦芽膏培养基(托姆青霉)：麦芽膏20.0g，自来水1.0L，自然pH。
将上述制备得到的培养基放入高压灭菌锅中121℃灭菌20min；
(2)活化及培养：刮取红色青霉的菌落(采用竹签挑取一小块菌落即可)接种于盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中，于温度为25℃，转速为120r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开后，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液；上述得到的孢子悬浊液接种于PDA培养基，接种量为PDA培养基体积的3％，25℃活化5d后分别接种到PDA培养基中，120r/min、25℃培养5d，得活菌数为108cfu/mL的红色青霉菌液；
刮取托姆青霉的菌落(采用竹签挑取一小块菌落即可)接种于盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中，于温度为25℃，转速为120r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开后，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液；上述得到的孢子悬浊液接种于麦芽膏培养基，接种量为麦芽膏培养基体积的3％，25℃活化5d后分别接种到麦芽膏培养基中，120r/min、25℃培养4d，得活菌数为108cfu/mL的托姆青霉菌液；
刮取桔青霉的菌落(采用竹签挑取一小块菌落即可)接种于盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中，于温度为28℃，转速为120r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开后，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液；上述得到的孢子悬浊液接种于察氏培养基，接种量为察氏培养基体积的3％，28℃活化5d后分别接种到察氏培养基中，120r/min、28℃培养7d，得活菌数为108cfu/mL的桔青霉菌液；
刮取棘孢青霉的菌落(采用竹签挑取一小块菌落即可)接种于盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中，于温度为28℃，转速为120r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开后，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108cfu/mL的孢子悬浮液；上述得到的孢子悬浊液接种于PDA培养基，接种量为PDA培养基体积的3％，28℃活化5d后分别接种到PDA培养基中，120r/min、28℃培养5d，得活菌数为108cfu/mL的宛氏拟青霉菌液；
(3)分别收集上述菌液，将收集所得菌液分别在140℃高温灭活3h后，放入55℃烘箱中烘48h，磨碎后过200目筛，制成干粉，得红色青霉干粉、托姆青霉干粉、桔青霉干粉和棘孢青霉干粉；
(4)取桔青霉干粉10份(10g)，红色青霉干粉10份(10g)，托姆青霉干粉60份(60g)，棘孢青霉干粉20份(20g)进行混合，共100份，4种干粉的质量比为1:1:6:2，得到真菌代谢产物灭活干粉，即低温保护剂Ⅱ；
(5)将上述制备得到的低温保护剂Ⅱ按15g/kg的浓度添加到漂浮育苗的营养液中，同时将杀菌剂(80％的优丽穗多菌灵可湿性粉剂，四川稼得利科技开发有限公司)按100mg/L的浓度添加到漂浮育苗的营养液中，得到混合液；其中营养液为氨化硫酸钾复合肥溶液，氨化硫酸钾复合肥溶液中氨化硫酸钾复合肥的浓度为20g/L(安徽中元化肥股份有限公司)。
(6)将烟草种子置于聚苯乙烯育苗盘漂浮中，共84粒种子，随后置于含有上述混合液的水槽中；
(7)4℃培养。
对实施例1～4和对比例1～2的中的种子，每24h记录种子发芽数，观察种子萌发时间，以胚根或胚芽突破种皮长于种子长度为发芽标准，直到种子连续3d不再发芽为止。并计算种子发芽率(％)，计算公式如下：发芽率(％)＝(正常发芽种子数/供试种子总数)×100。
待烟苗生长30d后，测量烟株鲜重，根系活力，丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)活性，检测低温保护剂对烟草种子萌发和烟苗生长的影响，具体检测方法如下：
鲜重：将烟株洗净后使用电子秤称量烟草幼苗的重量；根系活力：采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定；MDA含量：采用硫代巴比妥酸法测定；SOD活性：采用NBT光化还原法测定；检测结果见表1。
表1不同处理的检测结果
Figure BDA0003381908050000111
由表1记载的可知，与对比例1(不添加低温保护剂的处理)相比，本发明保护的低温保护剂虽然推迟了萌发时间，但提高了低温胁迫下的种子萌发率，幼苗鲜重，根系活力，MAD(丙二醛)含量和SOD(超氧化物歧化酶)活性，采用对比例2制备的得到的低温保护剂后，进行低温处理，不能使烟苗免受低温危害，表明15g/kg的低温保护剂浓度可以有效保护漂浮育苗过程中的烟草种子和幼苗免受低温危害。
由上述实施例记载的可知，利用本发明所述青霉组合物能够有效提高漂浮育苗的成活率和耐寒能力，具有成本低、操作简单的优势，而且本发明采用的是微生物，因此还具有安全性高、无污染的特点。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (1)

1.一种提高漂浮育苗成活率的方法，其特征在于，所述方法由以下步骤组成：将种子置于含低温保护剂和营养液的混合液中进行培养；
所述低温保护剂的有效成分为青霉组合物的代谢产物；
所述青霉组合物为桔青霉、红色青霉、托姆青霉和宛氏拟青霉；
所述宛氏拟青霉菌株保藏号为CICC2442；桔青霉的菌株保藏编号为CICC 4008，红色青霉的菌株保藏编号为CICC 4035，托姆青霉的菌株保藏编号为CICC 40694；
所述组合物应用于烟草；
所述低温保护剂中桔青霉代谢产物、红色青霉代谢产物、托姆青霉代谢产物和宛氏拟青霉代谢产物的质量比为(20～40)：(20～40)：(10～50)：(20～40)；
所述低温保护剂与营养液混合使用，所述营养液为氨化硫酸钾复合肥；
所述代谢产物的制备方法，由以下步骤组成：将桔青霉、红色青霉、托姆青霉和宛氏拟青霉分别活化后培养，得各个青霉的菌液；将上述所得菌剂依次进行高温灭活、干燥和粉碎后，得低温保护剂；
所述活化的温度为25～28℃，时间为2～5d；
所述培养的温度为25～30℃，时间为3～7d；
所述高温灭活的温度为130～150℃，时间为2～4h；
以所述营养液的质量计，所述菌剂的用量为15g/kg。
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