CN114113630A - Serpinb3/b4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用 - Google Patents

Serpinb3/b4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用，首先通过ELISA、免疫组化、qRT‑PCR、免疫荧光等手段明确SERPINB3/B4在玫瑰痤疮患者和银屑病患者皮损中的表达及Serpinb3a在LL37诱导的玫瑰痤疮样小鼠模型及咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型皮损中的表达情况，通过siRNA皮内注射，局部敲降小鼠表皮细胞内Serpinb3a的表达，观察其对炎症模型皮损表型及组织病理学的影响，体外研究主要在人HaCaT细胞中进行，通过构建质粒在人HaCaT细胞中过表达或敲降SERPINB3/B4，并联合RNA‑seq和免疫印迹、免疫荧光等方法进一步明确SERPINB3/B4体外在炎症性皮肤病中的具体分子作用机制。

Description

SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物 中的应用
技术领域
本发明涉及炎症性皮肤病治疗药技术领域，具体为SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用。
背景技术
玫瑰痤疮和银屑病是较常见的慢性炎症性皮肤疾病，发病率较高，且临床上易反复发作，给患者带来极大的痛苦，关于二者的发病机制尚未完全阐明，大多数研究认为免疫系统功能紊乱在二者的发病中占重要地位。目前针对玫瑰痤疮和银屑病的治疗方案仍需完善，因此进一步明确两种疾病发病机制及寻找新的治疗方案具有重大意义，蛋白酶功能在维持皮肤结构和调节皮肤对病原体及过敏源反应中起到重要作用，在前期对玫瑰痤疮发病机制的研究过程中，对玫瑰痤疮患者皮损总量RNA进行全转录组测序，发现在玫瑰痤疮患者皮损中SERPINB3/B4明显上调，因此探讨SERPINB3/B4在炎症性皮肤疾病发病过程中的具体作用机制具有重要意义。
现有技术中炎症性皮肤病治疗药中的应用存在的缺陷是：
1、传统的药物的应用不具备抑制质量过程中出现的并发性沿着，不方便使用者判断炎症发作的反应。
发明内容
本发明的目的在于提供SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用，首先通过ELISA、免疫组化、qRT-PCR、免疫荧光等手段明确SERPINB3/B4在玫瑰痤疮患者和银屑病患者血清、皮损中的表达及Serpinb3a在LL37诱导的玫瑰痤疮样小鼠模型及咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型皮损中的表达情况；
通过siRNA皮内注射，局部敲降小鼠表皮细胞内Serpinb3a的表达，观察其对炎症模型皮损表型及组织病理学的影响，体外研究主要在人HaCaT细胞中进行，通过构建质粒在人HaCaT细胞中过表达或敲降SERPINB3/B4，并联合RNA-seq和免疫印迹、免疫荧光等方法明确其与NF-κB信号通路的关系；
最后，选择SC75741(一种强效NF-κB信号通路抑制剂)抑制小鼠表皮内NF-κB信号通路明确NF-κB信号通路在玫瑰痤疮发病过程中的作用；且运用CCK8和流式分析选择SC75741的合适浓度进行体外研究，进一步明确SERPINB3/B4与NF-κB信号通路在玫瑰痤疮及银屑病发病机制中的相互作用。
优选的，本发明收集正常对照和玫瑰痤疮患者皮损，提取总RNA，检测SERPINB3/B4mRNA水平在两组之间的表达情况，结果发现在正常对照皮损内二者几乎不表达，而玫瑰患者面部皮损中SERPINB3/B4在mRNA表达水平明显高于健康对照者(如图2A,B)，同样，本发明对玫瑰痤疮患者皮损的丘疹或脓疱个数及皮肤红斑进行IGA评分，并与玫瑰痤疮患者皮损中SERPINB3/B4mRNA表达水平进行相关性分析，结果显示随着SERPINB3 mRNA表达水平的增加，皮损IGA评分明显上调，结果表明SERPINB3 mRNA表达水平与IGA评分呈明显正相关(如图2C)，此外，本发明结果显示随着SERPINB4 mRNA表达水平的增加，皮损IGA评分均明显上调，结果表明SERPINB4 mRNA表达水平与皮损严重程度呈正相关关系(如图2D)，
同时本发明收集玫瑰痤疮患者面部皮损皮肤组织，进行免疫组织化学染色，结果显示与正常健康对照者比较，玫瑰痤疮患者皮损表皮角质形成细胞全层均可检测到高丰度SERPINB3/B4表达，且其主要表达于细胞浆，而健康对照者皮肤全层几乎无表达(如图2E-F)，综上结果表明玫瑰痤疮患者皮损中SERPINB3/B4较健康对照明显高表达，
为进一步明确SERPINB3/B4在银屑病皮损中表达情况，相似的，本发明首先收取健康对照和银屑病患者的皮损，提取皮损总量RNA，通过qRT-PCR检测皮肤中SERPINB3/B4mRNA水平在两组之间的差异，如图2G-H可见相较健康对照者皮肤银屑病患者皮损的SERPINB3/B4在mRNA水平表达明显升高，同时对皮损进行SERPINB3/B4免疫组化染色，结果如图2I-J可见银屑病皮损较正常皮肤的表皮层明显增厚，且表达更高丰度的SERPINB3/B4，上述结果均表明，SERPINB3/B4在银屑病患者皮损中被激活，
为进一步研究SERPINB3/B4在玫瑰痤疮发病过程中发挥的作用，本发明根据先前研究所用的造模方式，建立了抗菌肽LL37诱导的玫瑰痤疮样小鼠模型，该模型皮损表现与炎症反应模式与人类玫瑰痤疮高度相似，本发明选取7-8周BALB/c雌性小鼠，剔除小鼠背部毛发，1天后每只小鼠背部皮内注射50μl(320μM)剂量LL37，每间隔12小时注射一次，对照组小鼠给与等剂量无菌1×PBS溶液，连续注射2日，共4次，模型建立成功后观察皮肤大体表型并进行取材，其次本发明收取小鼠皮损组织并提取总量RNA，检测玫瑰痤疮样小鼠皮损中Serpinb3a的mRNA表达情况，结果可见玫瑰痤疮样小鼠皮损较实验对照组Serpinb3a在mRNA水平表达明显上调(如图2K)，差异具有统计学意义,其中Serpinb3a为SERPINB3/B4的类似物，本发明进一步通过免疫荧光检测了玫瑰痤疮样小鼠模型皮损中Serpinb3a蛋白水平表达情况，结果显示玫瑰痤疮样小鼠模型皮损中Serpinb3a表达与人类玫瑰痤疮皮损SERPINB3/B4表达类似，玫瑰痤疮样小鼠模型皮损中毛囊周围和表皮全层Serpinb3a表达明显增强，为细胞浆表达(如图2L)，综上结果表明玫瑰痤疮样小鼠皮损Serpinb3a表达水平明显上调，
同样，本发明根据先前研究所用的造模方式，即连续外用咪喹莫特6天，建造银屑病样小鼠模型，收取小鼠皮损进行取材，收取小鼠皮损组织提取总量RNA，通过qRT-PCR检测银屑病样小鼠皮损中Serpinb3a的mRNA表达情况，结果可见银屑病样小鼠皮损较实验对照组Serpinb3a在mRNA水平表达明显上调(如图2M)，进一步收取小鼠皮损，进行免疫荧光染色，可见银屑病样小鼠皮损中明显高表达Serpinb3a(如图2N)，
为进一步探讨表皮中SERPINB3/B4在玫瑰痤疮及银屑病发病过程中的重要机制，本发明通过siRNA构建特异性敲降小鼠表皮Serpinb3a的小鼠模型，并对其进行LL37皮内注射及咪喹莫特外用，建立玫瑰痤疮样及银屑病样小鼠模型，观察表皮敲降Serpinb3a后对玫瑰痤疮样小鼠及银屑病样小鼠表型的影响。
优选的，本发明将阴性对照序列及2条siRNA序列分别命名为Scr RNA、siRNA#1和siRNA#2进行接下来的研究，首先探讨表皮内敲降Serpinb3a对玫瑰痤疮样小鼠表型的影响，如图3A模式图所示，7-8周龄BALB/c野生型雌性小鼠，将其背部毛发剃去，前1天进行siRNA皮内注射，实验对照组皮内注射对应的阴性对照序列，随后按照前述方法进行表皮内LL37注射诱导玫瑰痤疮样小鼠模型，在注射第2次LL37前进行第2次siRNA注射，加强敲降效果，造模完成后，观察并比较三组小鼠(Scr siRNA，siRNA#1和siRNA#2)表型之间的差异并进行取材，图2B为LL37造模两日后Scr siRNA和另外2条siRNA的Control组和LL37组玫瑰痤疮样皮炎的表现，可见LL37造模后Scr siRNA组小鼠皮损部位出现明显的炎症反应，包括红斑和毛细血管扩张，而在2条siRNA敲降组小鼠皮损的炎症反应明显减轻，本发明利用ImageJ软件对每组玫瑰痤疮样小鼠皮损处的面积大小进行测量，结果显示Scr siRNA组LL37造模后红斑面积明显增加，2条siRNA的LL37组红斑面积较Scr的LL37组明显减小(如图3C)，其次对玫瑰痤疮样皮损红斑严重程度进行评分，结果显示Scr siRNA的LL37组造模后红斑评分明显增加，造模后2条siRNA的LL37组红斑评分明显减轻(如图3D)，
此外本发明比较了LL37造模后各组小鼠皮损部位的组织学情况，取造模部位皮损，石蜡包埋切片后进行HE染色，显微镜下观察并统计小鼠真皮层炎症细胞浸润数量，如图3E可见，Scr siRNA的LL37组真皮部位浸润的炎症细胞数量较Control组明显增加，2条siRNA的LL37组造模后真皮层浸润的炎症细胞数量较Scr siRNA的LL37组明显减少，同时本发明通过Prism9软件对浸润的炎症细胞数量进行统计分析，结果可见敲降Serpinb3a后2条siRNA的LL37组浸润的炎症细胞较Scr的LL37组明显减少(如图3F)，差异具有统计学意义，最后本发明收取小鼠皮损，提取总量RNA，通过qRT-PCR比较了上述各组小鼠皮损中玫瑰痤疮相关基因在mRNA表达水平上的差异，如图3G-H所示，Scr siRNA的LL37组较Control组的Il6和Tnf-α基因表达增加，而在敲降Serpinb3a后，2条siRNA的LL37组较Scr siRNA的LL37组上述两个基因表达水平明显回降，且差异具有统计学意义，以上结果表明，表皮内Serpinb3a的缺失从皮损炎症反应表现、组织病理学情况以及mRNA表达层面均能够明显改善LL37诱导的玫瑰痤疮样小鼠模型中玫瑰痤疮的发展。
优选的，本发明为明确表皮内敲降Serpinb3a对银屑病样小鼠表型的影响，选择前述的两条siRNA，进行小鼠耳部皮内注射，表皮内敲降Serpinb3a，按照既往已有研究方法外用咪喹莫特进行银屑病样小鼠模型建造，如图4A模式图所示，外用咪喹莫特前1天(记作day-1)进行siRNA皮内注射，实验对照组皮内注射对应的阴性对照序列，其后每日一次咪喹莫特乳膏外用，第2天进行第2次siRNA注射，加强敲降效果，第6天造模完成后，为明确表皮内敲降Serpinb3a后对银屑病样小鼠皮损表型的影响，本发明造模第6天观察并比较三组小鼠(Scr siRNA，siRNA#1和siRNA#2)表型之间的差异并进行取材，根据既往研究[77]方法对小鼠皮损进行PASI评分及耳部厚度进行测量，可见siRNA的咪喹莫特组小鼠较Scr RNA咪喹莫特组小鼠皮损的红斑、鳞屑明显改善(如图4B)，PASI评分明显下降(如图4C)，耳部皮肤厚度亦明显下降(如图4D)，其次对各组小鼠皮损进行HE染色，结果可见，Scr siRNA咪喹莫特组表皮厚度明显增加，真皮层炎症细胞浸润明显，而两条siRNA的咪喹模特组表皮厚度及真皮层炎症细胞浸润程度明显改善(如图4E)，并对表皮层厚度、浸润的炎症细胞进行统计分析，发现二者在两条siRNA的咪喹莫特组较Scr siRNA的咪喹莫特组明显下降(如图4F-G)，为进一步明确Serpinb3a对银屑病相关基因分子水平的影响，本发明收取小鼠皮损，提取总量RNA，通过qRT-PCR比较了上述各组小鼠皮损中银屑病相关基因在mRNA表达水平上的差异，如图4H-I所示，Scr siRNA的咪喹莫特组较Control组Il6和Il-1β基因表达增加2条siRNA的咪喹莫特组中上述两个基因表达水平较Scr siRNA的咪喹莫特组有明显回降，差异具有统计学意义，以上结果表明，耳部表皮内Serpinb3a的缺失从皮损炎症反应表现、组织病理学情况以及mRNA表达层面均能够明显改善咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型中炎症疾病的发展，
综上所述，在小鼠表皮内敲降serpinb3a后，能够明显改善玫瑰痤疮样及银屑病样小鼠皮损处炎症反应。
优选的，为了更进一步明确SERPINB3/B4在体外对玫瑰痤疮中具体分子作用机制，本发明体外构建SERPINB3/B4过表达质粒，并通过转染试剂将过表达质粒转染人HaCaT细胞，72小时后收取细胞RNA，进行全转录组测序，并通过体内外实验对测序结果进行验证，
本发明对过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞中的差异基因表达值进行聚类分析，进而对基因表达值进行均一化处理从而得到如图5A，如图中的每一个小方格代表一个基因，蓝色表示基因表达下调，红色表示基因表达上调，颜色越深，表达的差异越明显，每一列表示每个样本不同基因的表达情况，每一行表示每个基因在不同样本中的表达情况，如图结果可见过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞较正常对照之间基因表达差异显著，结果表明，在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4后基因表达较正常对照组模式发生明显变化，
为进一步明确过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞中信号通路的变化，本发明对过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞和对照组细胞所有的基因表达量进行基因富集分析(GeneSet Enrichment Analysis，GSEA)，基于玫瑰痤疮为皮肤炎症性疾病及先前研究，炎症相关信号通路在玫瑰痤疮发生发展中发挥关键作用，所以本次研究着重关注与炎症相关联的信号通路，NF-κB信号通路几乎存在于所用的动物细胞中，参与细胞对外界刺激的各种反应，包括应激、细胞因子、自由基、微生物感染和紫外线照射等，既往研究发现此信号通路调控大量与炎症相关的基因表达，在本次研究中富集的炎症相关信号通路中NF-κB信号通路在过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞中较对照组细胞系明显富集(如图5B-E)，这提示该信号通路可能参与了SERPINB3/B4调控玫瑰痤疮的发病，
为明确在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4后在蛋白水平对NF-κB信号通路的影响，本发明通过转染试剂将过表达质粒转染人HaCaT细胞系72小时后收取细胞蛋白，免疫印迹法检测在人HaCaT细胞系中表达SERPINB3/B4后对p65/NF-κB的磷酸化水平(p-p65)，同时应用Image J软件对p-p65灰度进行扫描量化，如图5F所示，本发明发现在人HaCaT细胞系中表达SERPINB3/B4后p-p65表达明显上调，p65表达无明显差异，p-p65/p65上调，结果表明NF-κB信号通路激活，同时，为了更加直观地了解表达SERPINB3/B4后对NF-κB信号通路的影响，本发明通过细胞爬片实验及免疫荧光检测过表达质粒转染人HaCaT细胞系72小时后对p65表达的影响，结果如图5G所示，在人HaCaT细胞中表达SERPINB3/B4后p65入核的细胞数目较对照组明显增多上述结果表明在在人HaCaT细胞中表达SERPINB3/B4在蛋白水平激活NF-κB信号通路，
既往研究发现，TNF-α可强烈诱导NF-κB信号的活化，为明确SERPINB3/B4对TNF-α诱导NF-κB信号活化的影响，本发明体外构建SERPINB3/B4的shRNA，建立稳定敲降SERPINB3/B4的人HaCaT细胞系，TNF-α孵育30分钟后，免疫印迹法检测敲降SERPINB3/B4后对TNF-α诱导NF-κB信号活化的影响，结果可见，构建稳定敲降SERPINB3/B4的人HaCaT细胞系对SERPINB3/B4的敲降效果明显，在正常对照组细胞中，TNF-α孵育后p-p65表达明显上调，而敲降SERPINB3/B4后，TNF-α诱导p-p65上调的情况明显改善，同时本发明对其条带灰度进行扫描，结果统计发现差异具有明显统计学意义(如图5H-I)，结果提示，人HaCaT细胞系中SERPINB3/B4的缺失阻止了TNF-α诱导的NF-κB信号的活化，同样，本发明通过细胞爬片实验及免疫荧光检测稳定敲降SERPINB3/B4对TNF-α诱导的p65入核情况的影响，如图5J-K可见在正常对照的人HaCaT细胞系中，TNF-α孵育后30分钟后p65几乎完全入核，而敲降SERPINB3/B4后p65入核的细胞数目较对照组明显减少，同时本发明对入核细胞数目进行统计，差异明显，具有统计学意义，
综上结果表明，体外过表达SERPINB3/B4后诱导NF-κB信号通路下游分子上调，体外敲降SERPINB3/B4后能够阻止TNF-α诱导的NF-κB信号的活化。
优选的，炎症相关的趋化因子及细胞因子在炎症发生及进展中起到极其重要的作用，前期一系列的结果表明SERPINB3/B4能够调控NF-κB信号通路，为进一步明确趋化因子及细胞因子在SERPINB3/B4调控玫瑰痤疮发病中的具体作用，本发明进一步对在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4后RNA-seq的结果进行分析，如图6A-B所示，趋化因子及细胞因子信号通路在SERPINB3/B4过表达的人HaCaT细胞中高度富集，同时本发明对样本的趋化因子及细胞因子相关的差异的表达值进行聚类分析，并对基因表达值进行均一化处理得到如图6C所示的如图，与正常对照相比，SERPINB3/B4过表达的人HaCaT细胞中炎症相关的趋化因子(CCL2，CCL5，CCL20，CXCL1，CXCL2，CXCL5，CXCL8，CXCL10，CXCL11)及细胞因子(IL1A，IL1B，IL6，TNFA)表达明显上调，
为进一步明确上述细胞因子在SERPINB3/B4过表达的人HaCaT细胞中的表达水平，本发明利用qRT-PCR的方法检测人HaCaT细胞过表达SERPINB3/B4后上述基因的表达情况，结果(如图6D)可见，在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4后，趋化因子CCL2，CCL5，CCL20，CXCL2，CXCL9，CXCL10，CXCL11及细胞因子IL1B，IL6，TNF-α表达明显上调，结果表明在人HaCaT细胞过表达SERPINB3/B4后能够明显诱导炎症相关的趋化因子及细胞因子的表达上调，
通过小鼠皮内敲降Serpinb3a能够降低LL37诱导的玫瑰痤疮相关细胞因子(Il6，Tnf-α)的表达水平，为进一步明确玫瑰痤疮样小鼠表皮内敲降Serpinb3a对炎症相关的趋化因子及细胞因子的影响，本发明应用qRT-PCR的方法检测了上述相关因子的表达水平，结果如图6E可见，敲降Serpinb3a后，LL37诱导的Ccl5，Cxcl9，Cxcl10，Cxcl11及Il1β表达水平受到明显抑制，本发明应用同样的方法检测了敲降serpinb3a后银屑病样小鼠皮损中上述趋化因子变化情况，结果如图6F所示，可见敲降Serpinb3a后，IMQ诱导的Ccl5，Ccl20，Cxcl9，Cxcl10，Cxcl11表达水平受到明显抑制，
同样的方法检测相关趋化因子及细胞因子的表达水平，结果5G如图所示，SERPINB3/B4诱导趋化因子CCL2，CCL5，CXCL9，CXCL10，CXCL11及细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α明显上调，而加用SC75741共同孵育后上述趋化因子及细胞因子的表达水平明显回降，上述结果表明SC75741能够通过抑制SERPINB3/B4对NF-κB信号通路的诱导激活下调相关趋化因子及细胞因子的表达水平。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明首次报道了SERPINB3/B4在玫瑰痤疮和银屑病患者皮损中的表达情况，及其与疾病严重程度的相关性；本发明以玫瑰痤疮和银屑病两种慢性炎症性皮肤疾病为研究对象阐明了SERPINB3/B4通过NF-κB信号通路促进炎症反应的发生，本发明发现应用SC75741(NF-κB信号通路强效抑制剂)能够明显改善LL37诱导的玫瑰痤疮样小鼠皮损处炎症反应，同时明显抑制SERPINB3/B4诱导的NF-κB信号通路的激活。因此本发明为玫瑰痤疮和银屑病的发病提供了新的解释，且为两种慢性炎症性皮肤疾病的治疗提供了新的思路。
附图说明
图1为本发明的工作流程图；
图2为为本发明的A健康对照和玫瑰痤疮患者皮损中SERPINB3mRNA表达水平；
B玫瑰痤疮患者IGA评分与皮损中SERPINB3mRNA表达水平的相关性分析；
C健康对照和玫瑰痤疮患者皮损中SERPINB4mRNA表达水平；
D玫瑰痤疮患者IGA评分与皮损中SERPINB4mRNA表达水平的相关性分析；
E-F免疫组化染色(IHC)检测玫瑰痤疮患者皮损皮肤相对健康对照者正常皮肤切片中SERPINB3/B4的表达情况；Epi表示表皮；Der表示真皮；
G-H健康对照者皮肤和银屑病患者皮肤中SERPINB3，SERPINB4的mRNA表达水平；HS为健康对照组，Psoriasis为银屑病组；
I-J免疫组化检测银屑病患者皮损和健康对照者正常皮肤中SERPINB3的表达情况；D免疫组化检测银屑病患者皮损和健康对照者正常皮肤中SERPINB4的表达情况；
K对照组和LL37组小鼠皮损中Serpinb3a的mRNA表达结果；
L对照组小鼠和LL37组小鼠皮损中Serpinb3a的免疫荧光染色结果，Serpinb3a(红色)定位于胞浆，DAPI染色(蓝色)为细胞核定位；
M对照组和IMQ组小鼠皮损中Serpinb3a的mRNA表达结果；
N对照组小鼠和IMQ组小鼠皮损中Serpinb3a的免疫荧光染色结果，Serpinb3a(红色)定位于胞浆，DAPI染色(蓝色)为细胞核定位；标尺：50μm；
图3为本发明的A本次小鼠体内实验模式图；
B上图为LL37诱导的玫瑰痤疮样小鼠模型皮损的代表性大体图；下图为体视镜放大结果图；
C各组小鼠红斑面积统计结果；
D各组小鼠红斑严重程度评分后统计分析结果；
E为D图对应的皮损组织HE染色结果；
F每组小鼠皮损中浸润的炎症细胞进行统计分析结果；
G-HqRT-PCR检测各组小鼠皮损中Il6，Tnf-α的mRNA表达；
图4：A本次小鼠体内实验模式图；
B各组小鼠模型皮损的体视镜放大结果图，IMQ为咪喹莫特组；
C各组小鼠皮损处PASI评分；
D各组小鼠耳朵厚度统计结果，长度单位：毫米；
E为C图对应的皮损组织HE染色结果，标尺：50μm；
F各组小鼠皮损中浸润的炎症细胞统计分析的结果；
G显微镜下对各组小鼠HE染色结果进行表皮层厚度测量，并统计分析，长度单位：微米；
H-I各组小鼠皮损中Il6，Il-1β的mRNA表达水平的qRT-PCR结果图；
图5为本发明的AHaCaT细胞过表达SERPINB3/B4较空白对照组细胞转录组数据差异基因的聚类分析，每组3次转染的细胞；其中，红色代表基因高表达，蓝色代表基因低表达；
B-EGSEA分析结果显示：在人HaCaT细胞中过表SERPINB3/B4与VECTOR组比较，重叠的差异表达基因所富集的KEGG通路的排名，其中，NF-κB信号通路以红色框表示；
F免疫印迹检测过人HaCaT细胞转染SERPINB3/B4过表达质粒72小时后p-p65蛋白水平变化情况；通过ImageJ软件对蛋白水平进行定量分析；
G左图为免疫荧光检测人HaCaT细胞转染SERPINB3/B4过表达质粒72小时后p65的表达和定位；箭头出表示p65入核，DAPI染色(蓝色)表示细胞核定位，标尺：50μm；右图：对p65入核的阳性细胞进行统计分析，差异具有统计学意义；
H-I左图为体外建立敲降SERPINB3/B4的人HaCaT细胞，100ng/mlTNF-α孵育细胞系30分钟，免疫印迹检测敲降组较对照组蛋白水平p-p65表达量的变化；右图为：通过ImageJ软件对p-p65灰度进行统计分析，差异具有统计学意义；
J-K体外建立敲降SERPINB3/B4的人HaCaT细胞，100ng/mlTNF-α孵育细胞系30分钟，免疫荧光检测敲降组较对照组蛋白水平p65的表达和定位，并对p65入核的阳性细胞数据进行统计分析，差异具有统计学意义；p65(红色)膜表达，激活时入核，为核表达，DAPI染色(蓝色)表示细胞核定位，标尺：50μm；
图6为本发明的A-BGSEA分析结果显示：在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4与VECTOR空白对照组比较，趋化因子及细胞因子信号通路在SERPINB3/B4过表达的人HaCaT细胞中高度富集；
CHaCaT细胞过表达SERPINB3/B4较空白对照组细胞转录组数据差异基因的聚类分析，每组3次转染的细胞；其中，红色代表基因高表达，蓝色代表基因低表达；
DqRT-PCR检测趋化因子CCL2，CCL5，CCL20，CXCL2，CXCL9，CXCL10，CXCL11及细胞因子IL1B，IL6，TNF-α表达水平；
E-FqRT-PCR检测敲降Serpinb3a后玫瑰痤疮样小鼠模型及银屑病样小鼠模型皮损中趋化因子变化；
GqRT-PCR检测炎症因子mRNA水平。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所述的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
请参阅图1-图6，本发明提供的一种实施例：SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用；
实施例一，SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用，首先通过ELISA、免疫组化、qRT-PCR、免疫荧光等手段明确SERPINB3/B4在玫瑰痤疮患者和银屑病患者血清、皮损中的表达及Serpinb3a在LL37诱导的玫瑰痤疮样小鼠模型及咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型皮损中的表达情况；
通过siRNA皮内注射，局部敲降小鼠表皮细胞内Serpinb3a的表达，观察其对炎症模型皮损表型及组织病理学的影响，体外研究主要在人HaCaT细胞中进行，通过构建质粒在人HaCaT细胞中过表达或敲降SERPINB3/B4，并联合RNA-seq和免疫印迹、免疫荧光等方法明确其与NF-κB信号通路的关系；
最后，选择SC75741(一种强效NF-κB信号通路抑制剂)抑制小鼠表皮内NF-κB信号通路明确NF-κB信号通路在玫瑰痤疮发病过程中的作用；且运用CCK8和流式分析选择SC75741的合适浓度进行体外研究，进一步明确SERPINB3/B4与NF-κB信号通路在玫瑰痤疮及银屑病发病机制中的相互作用。
实施例2，本发明收集正常对照和玫瑰痤疮患者皮损，提取总RNA，检测SERPINB3/B4 mRNA水平在两组之间的表达情况，结果发现在正常对照皮损内二者几乎不表达，而玫瑰患者面部皮损中SERPINB3/B4在mRNA表达水平明显高于健康对照者(如图2A,B)，同样，本发明对玫瑰痤疮患者皮损的丘疹或脓疱个数及皮肤红斑进行IGA评分，并与玫瑰痤疮患者皮损中SERPINB3/B4mRNA表达水平进行相关性分析，结果显示随着SERPINB3 mRNA表达水平的增加，皮损IGA评分明显上调，结果表明SERPINB3 mRNA表达水平与IGA评分呈明显正相关(如图2C)，此外，本发明结果显示随着SERPINB4 mRNA表达水平的增加，皮损IGA评分均明显上调，结果表明SERPINB4 mRNA表达水平与皮损严重程度呈正相关关系(如图2D)，
同时本发明收集玫瑰痤疮患者面部皮损皮肤组织，进行免疫组织化学染色，结果显示与正常健康对照者比较，玫瑰痤疮患者皮损表皮角质形成细胞全层均可检测到高丰度SERPINB3/B4表达，且其主要表达于细胞浆，而健康对照者皮肤全层几乎无表达(如图2E-F)，综上结果表明玫瑰痤疮患者皮损中SERPINB3/B4较健康对照明显高表达，
为进一步明确SERPINB3/B4在银屑病皮损中表达情况，相似的，本发明首先收取健康对照和银屑病患者的皮损，提取皮损总量RNA，通过qRT-PCR检测皮肤中SERPINB3/B4mRNA水平在两组之间的差异，如图2G-H可见相较健康对照者皮肤银屑病患者皮损的SERPINB3/B4在mRNA水平表达明显升高，同时对皮损进行SERPINB3/B4免疫组化染色，结果如图2I-J可见银屑病皮损较正常皮肤的表皮层明显增厚，且表达更高丰度的SERPINB3/B4，上述结果均表明，SERPINB3/B4在银屑病患者皮损中被激活，
为进一步研究SERPINB3/B4在玫瑰痤疮发病过程中发挥的作用，本发明根据先前研究所用的造模方式，建立了抗菌肽LL37诱导的玫瑰痤疮样小鼠模型，该模型皮损表现与炎症反应模式与人类玫瑰痤疮高度相似，本发明选取7-8周BALB/c雌性小鼠，剔除小鼠背部毛发，1天后每只小鼠背部皮内注射50μl(320μM)剂量LL37，每间隔12小时注射一次，对照组小鼠给与等剂量无菌1×PBS溶液，连续注射2日，共4次，模型建立成功后观察皮肤大体表型并进行取材，其次本发明收取小鼠皮损组织并提取总量RNA，检测玫瑰痤疮样小鼠皮损中Serpinb3a的mRNA表达情况，结果可见玫瑰痤疮样小鼠皮损较实验对照组Serpinb3a在mRNA水平表达明显上调(如图2K)，差异具有统计学意义,其中Serpinb3a为SERPINB3/B4的类似物，本发明进一步通过免疫荧光检测了玫瑰痤疮样小鼠模型皮损中Serpinb3a蛋白水平表达情况，结果显示玫瑰痤疮样小鼠模型皮损中Serpinb3a表达与人类玫瑰痤疮皮损SERPINB3/B4表达类似，玫瑰痤疮样小鼠模型皮损中毛囊周围和表皮全层Serpinb3a表达明显增强，为细胞浆表达(如图2L)，综上结果表明玫瑰痤疮样小鼠皮损Serpinb3a表达水平明显上调，
同样，本发明根据先前研究所用的造模方式，即连续外用咪喹莫特6天，建造银屑病样小鼠模型，收取小鼠皮损进行取材，收取小鼠皮损组织提取总量RNA，通过qRT-PCR检测银屑病样小鼠皮损中Serpinb3a的mRNA表达情况，结果可见银屑病样小鼠皮损较实验对照组Serpinb3a在mRNA水平表达明显上调(如图2M)，进一步收取小鼠皮损，进行免疫荧光染色，可见银屑病样小鼠皮损中明显高表达Serpinb3a(如图2N)，
为进一步探讨表皮中SERPINB3/B4在玫瑰痤疮及银屑病发病过程中的重要机制，本发明通过siRNA构建特异性敲降小鼠表皮Serpinb3a的小鼠模型，并对其进行LL37皮内注射及咪喹莫特外用，建立玫瑰痤疮样及银屑病样小鼠模型，观察表皮敲降Serpinb3a后对玫瑰痤疮样小鼠及银屑病样小鼠表型的影响。
实施例三，本发明将阴性对照序列及2条siRNA序列分别命名为Scr RNA、siRNA#1和siRNA#2进行接下来的研究，首先探讨表皮内敲降Serpinb3a对玫瑰痤疮样小鼠表型的影响，如图3A模式图所示，7-8周龄BALB/c野生型雌性小鼠，将其背部毛发剃去，前1天进行siRNA皮内注射，实验对照组皮内注射对应的阴性对照序列，随后按照前述方法进行表皮内LL37注射诱导玫瑰痤疮样小鼠模型，在注射第2次LL37前进行第2次siRNA注射，加强敲降效果，造模完成后，观察并比较三组小鼠(Scr siRNA，siRNA#1和siRNA#2)表型之间的差异并进行取材，图2B为LL37造模两日后Scr siRNA和另外2条siRNA的Control组和LL37组玫瑰痤疮样皮炎的表现，可见LL37造模后Scr siRNA组小鼠皮损部位出现明显的炎症反应，包括红斑和毛细血管扩张，而在2条siRNA敲降组小鼠皮损的炎症反应明显减轻，本发明利用ImageJ软件对每组玫瑰痤疮样小鼠皮损处的面积大小进行测量，结果显示Scr siRNA组LL37造模后红斑面积明显增加，2条siRNA的LL37组红斑面积较Scr的LL37组明显减小(如图3C)，其次对玫瑰痤疮样皮损红斑严重程度进行评分，结果显示Scr siRNA的LL37组造模后红斑评分明显增加，造模后2条siRNA的LL37组红斑评分明显减轻(如图3D)，
此外本发明比较了LL37造模后各组小鼠皮损部位的组织学情况，取造模部位皮损，石蜡包埋切片后进行HE染色，显微镜下观察并统计小鼠真皮层炎症细胞浸润数量，如图3E可见，Scr siRNA的LL37组真皮部位浸润的炎症细胞数量较Control组明显增加，2条siRNA的LL37组造模后真皮层浸润的炎症细胞数量较Scr siRNA的LL37组明显减少，同时本发明通过Prism9软件对浸润的炎症细胞数量进行统计分析，结果可见敲降Serpinb3a后2条siRNA的LL37组浸润的炎症细胞较Scr的LL37组明显减少(如图3F)，差异具有统计学意义，最后本发明收取小鼠皮损，提取总量RNA，通过qRT-PCR比较了上述各组小鼠皮损中玫瑰痤疮相关基因在mRNA表达水平上的差异，如图3G-H所示，Scr siRNA的LL37组较Control组的Il6和Tnf-α基因表达增加，而在敲降Serpinb3a后，2条siRNA的LL37组较Scr siRNA的LL37组上述两个基因表达水平明显回降，且差异具有统计学意义，以上结果表明，表皮内Serpinb3a的缺失从皮损炎症反应表现、组织病理学情况以及mRNA表达层面均能够明显改善LL37诱导的玫瑰痤疮样小鼠模型中玫瑰痤疮的发展。
实施例四，本发明为明确表皮内敲降Serpinb3a对银屑病样小鼠表型的影响，选择前述的两条siRNA，进行小鼠耳部皮内注射，表皮内敲降Serpinb3a，按照既往已有研究方法外用咪喹莫特进行银屑病样小鼠模型建造，如图4A模式图所示，外用咪喹莫特前1天(记作day-1)进行siRNA皮内注射，实验对照组皮内注射对应的阴性对照序列，其后每日一次咪喹莫特乳膏外用，第2天进行第2次siRNA注射，加强敲降效果，第6天造模完成后，为明确表皮内敲降Serpinb3a后对银屑病样小鼠皮损表型的影响，本发明造模第6天观察并比较三组小鼠(Scr siRNA，siRNA#1和siRNA#2)表型之间的差异并进行取材，根据既往研究[77]方法对小鼠皮损进行PASI评分及耳部厚度进行测量，可见siRNA的咪喹莫特组小鼠较Scr RNA咪喹莫特组小鼠皮损的红斑、鳞屑明显改善(如图4B)，PASI评分明显下降(如图4C)，耳部皮肤厚度亦明显下降(如图4D)，其次对各组小鼠皮损进行HE染色，结果可见，Scr siRNA咪喹莫特组表皮厚度明显增加，真皮层炎症细胞浸润明显，而两条siRNA的咪喹模特组表皮厚度及真皮层炎症细胞浸润程度明显改善(如图4E)，并对表皮层厚度、浸润的炎症细胞进行统计分析，发现二者在两条siRNA的咪喹莫特组较Scr siRNA的咪喹莫特组明显下降(如图4F-G)，为进一步明确Serpinb3a对银屑病相关基因分子水平的影响，本发明收取小鼠皮损，提取总量RNA，通过qRT-PCR比较了上述各组小鼠皮损中银屑病相关基因在mRNA表达水平上的差异，如图4H-I所示，Scr siRNA的咪喹莫特组较Control组Il6和Il-1β基因表达增加2条siRNA的咪喹莫特组中上述两个基因表达水平较Scr siRNA的咪喹莫特组有明显回降，差异具有统计学意义，以上结果表明，耳部表皮内Serpinb3a的缺失从皮损炎症反应表现、组织病理学情况以及mRNA表达层面均能够明显改善咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型中炎症疾病的发展，
综上所述，在小鼠表皮内敲降serpinb3a后，能够明显改善玫瑰痤疮样及银屑病样小鼠皮损处炎症反应。
实施例五，为了更进一步明确SERPINB3/B4在体外对玫瑰痤疮中具体分子作用机制，本发明体外构建SERPINB3/B4过表达质粒，并通过转染试剂将过表达质粒转染人HaCaT细胞，72小时后收取细胞RNA，进行全转录组测序，并通过体内外实验对测序结果进行验证，
本发明对过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞中的差异基因表达值进行聚类分析，进而对基因表达值进行均一化处理从而得到如图5A，如图中的每一个小方格代表一个基因，蓝色表示基因表达下调，红色表示基因表达上调，颜色越深，表达的差异越明显，每一列表示每个样本不同基因的表达情况，每一行表示每个基因在不同样本中的表达情况，如图结果可见过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞较正常对照之间基因表达差异显著，结果表明，在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4后基因表达较正常对照组模式发生明显变化，
为进一步明确过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞中信号通路的变化，本发明对过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞和对照组细胞所有的基因表达量进行基因富集分析(GeneSet Enrichment Analysis，GSEA)，基于玫瑰痤疮为皮肤炎症性疾病及先前研究，炎症相关信号通路在玫瑰痤疮发生发展中发挥关键作用，所以本次研究着重关注与炎症相关联的信号通路，NF-κB信号通路几乎存在于所用的动物细胞中，参与细胞对外界刺激的各种反应，包括应激、细胞因子、自由基、微生物感染和紫外线照射等，既往研究发现此信号通路调控大量与炎症相关的基因表达，在本次研究中富集的炎症相关信号通路中NF-κB信号通路在过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞中较对照组细胞系明显富集(如图5B-E)，这提示该信号通路可能参与了SERPINB3/B4调控玫瑰痤疮的发病，
为明确在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4后在蛋白水平对NF-κB信号通路的影响，本发明通过转染试剂将过表达质粒转染人HaCaT细胞系72小时后收取细胞蛋白，免疫印迹法检测在人HaCaT细胞系中表达SERPINB3/B4后对p65/NF-κB的磷酸化水平(p-p65)，同时应用Image J软件对p-p65灰度进行扫描量化，如图5F所示，本发明发现在人HaCaT细胞系中表达SERPINB3/B4后p-p65表达明显上调，p65表达无明显差异，p-p65/p65上调，结果表明NF-κB信号通路激活，同时，为了更加直观地了解表达SERPINB3/B4后对NF-κB信号通路的影响，本发明通过细胞爬片实验及免疫荧光检测过表达质粒转染人HaCaT细胞系72小时后对p65表达的影响，结果如图5G所示，在人HaCaT细胞中表达SERPINB3/B4后p65入核的细胞数目较对照组明显增多上述结果表明在在人HaCaT细胞中表达SERPINB3/B4在蛋白水平激活NF-κB信号通路，
既往研究发现，TNF-α可强烈诱导NF-κB信号的活化，为明确SERPINB3/B4对TNF-α诱导NF-κB信号活化的影响，本发明体外构建SERPINB3/B4的shRNA，建立稳定敲降SERPINB3/B4的人HaCaT细胞系，TNF-α孵育30分钟后，免疫印迹法检测敲降SERPINB3/B4后对TNF-α诱导NF-κB信号活化的影响，结果可见，构建稳定敲降SERPINB3/B4的人HaCaT细胞系对SERPINB3/B4的敲降效果明显，在正常对照组细胞中，TNF-α孵育后p-p65表达明显上调，而敲降SERPINB3/B4后，TNF-α诱导p-p65上调的情况明显改善，同时本发明对其条带灰度进行扫描，结果统计发现差异具有明显统计学意义(如图5H-I)，结果提示，人HaCaT细胞系中SERPINB3/B4的缺失阻止了TNF-α诱导的NF-κB信号的活化，同样，本发明通过细胞爬片实验及免疫荧光检测稳定敲降SERPINB3/B4对TNF-α诱导的p65入核情况的影响，如图5J-K可见在正常对照的人HaCaT细胞系中，TNF-α孵育后30分钟后p65几乎完全入核，而敲降SERPINB3/B4后p65入核的细胞数目较对照组明显减少，同时本发明对入核细胞数目进行统计，差异明显，具有统计学意义，
综上结果表明，体外过表达SERPINB3/B4后诱导NF-κB信号通路下游分子上调，体外敲降SERPINB3/B4后能够阻止TNF-α诱导的NF-κB信号的活化。
实施例六，炎症相关的趋化因子及细胞因子在炎症发生及进展中起到极其重要的作用，前期一系列的结果表明SERPINB3/B4能够调控NF-κB信号通路，为进一步明确趋化因子及细胞因子在SERPINB3/B4调控玫瑰痤疮发病中的具体作用，本发明进一步对在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4后RNA-seq的结果进行分析，如图6A-B所示，趋化因子及细胞因子信号通路在SERPINB3/B4过表达的人HaCaT细胞中高度富集，同时本发明对样本的趋化因子及细胞因子相关的差异的表达值进行聚类分析，并对基因表达值进行均一化处理得到如图6C所示的如图，与正常对照相比，SERPINB3/B4过表达的人HaCaT细胞中炎症相关的趋化因子(CCL2，CCL5，CCL20，CXCL1，CXCL2，CXCL5，CXCL8，CXCL10，CXCL11)及细胞因子(IL1A，IL1B，IL6，TNFA)表达明显上调，
为进一步明确上述细胞因子在SERPINB3/B4过表达的人HaCaT细胞中的表达水平，本发明利用qRT-PCR的方法检测人HaCaT细胞过表达SERPINB3/B4后上述基因的表达情况，结果(如图6D)可见，在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4后，趋化因子CCL2，CCL5，CCL20，CXCL2，CXCL9，CXCL10，CXCL11及细胞因子IL1B，IL6，TNF-α表达明显上调，结果表明在人HaCaT细胞过表达SERPINB3/B4后能够明显诱导炎症相关的趋化因子及细胞因子的表达上调，
通过小鼠皮内敲降Serpinb3a能够降低LL37诱导的玫瑰痤疮相关细胞因子(Il6，Tnf-α)的表达水平，为进一步明确玫瑰痤疮样小鼠表皮内敲降Serpinb3a对炎症相关的趋化因子及细胞因子的影响，本发明应用qRT-PCR的方法检测了上述相关因子的表达水平，结果如图6E可见，敲降Serpinb3a后，LL37诱导的Ccl5，Cxcl9，Cxcl10，Cxcl11及Il1β表达水平受到明显抑制，本发明应用同样的方法检测了敲降serpinb3a后银屑病样小鼠皮损中上述趋化因子变化情况，结果如图6F所示，可见敲降Serpinb3a后，IMQ诱导的Ccl5，Ccl20，Cxcl9，Cxcl10，Cxcl11表达水平受到明显抑制，
同样的方法检测相关趋化因子及细胞因子的表达水平，结果5G如图所示，SERPINB3/B4诱导趋化因子CCL2，CCL5，CXCL9，CXCL10，CXCL11及细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α明显上调，而加用SC75741共同孵育后上述趋化因子及细胞因子的表达水平明显回降，上述结果表明SC75741能够通过抑制SERPINB3/B4对NF-κB信号通路的诱导激活下调相关趋化因子及细胞因子的表达水平。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (6)

1.SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用，其特征在于：首先通过ELISA、免疫组化、qRT-PCR、免疫荧光等手段明确SERPINB3/B4在玫瑰痤疮患者和银屑病患者血清、皮损中的表达及Serpinb3a在LL37诱导的玫瑰痤疮样小鼠模型及咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型皮损中的表达情况；
再通过siRNA皮内注射，局部敲降小鼠表皮细胞内Serpinb3a的表达，观察其对炎症模型皮损表型及组织病理学的影响，体外研究主要在人HaCaT细胞中进行，通过构建质粒在人HaCaT细胞中过表达或敲降SERPINB3/B4，并联合RNA-seq和免疫印迹、免疫荧光等方法明确其与NF-κB信号通路的关系；
最后选择SC75741(一种强效NF-κB信号通路抑制剂)抑制小鼠表皮内NF-κB信号通路明确NF-κB信号通路在玫瑰痤疮发病过程中的作用；且运用CCK8和流式分析选择SC75741的合适浓度进行体外研究，进一步明确SERPINB3/B4与NF-κB信号通路在玫瑰痤疮及银屑病发病机制中的相互作用。
2.根据权利要求1所述的SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用，其特征在于：本发明收集正常对照和玫瑰痤疮患者皮损，提取总RNA，检测SERPINB3/B4 mRNA水平在两组之间的表达情况，结果发现在正常对照皮损内二者几乎不表达，而玫瑰患者面部皮损中SERPINB3/B4在mRNA表达水平明显高于健康对照者(如图2A,B)，同样，本发明对玫瑰痤疮患者皮损的丘疹或脓疱个数及皮肤红斑进行IGA评分，并与玫瑰痤疮患者皮损中SERPINB3/B4 mRNA表达水平进行相关性分析，结果显示随着SERPINB3 mRNA表达水平的增加，皮损IGA评分明显上调，结果表明SERPINB3 mRNA表达水平与IGA评分呈明显正相关(如图2C)，此外，本发明结果显示随着SERPINB4 mRNA表达水平的增加，皮损IGA评分均明显上调，结果表明SERPINB4 mRNA表达水平与皮损严重程度呈正相关关系(如图2D)，
同时本发明收集玫瑰痤疮患者面部皮损皮肤组织，进行免疫组织化学染色，结果显示与正常健康对照者比较，玫瑰痤疮患者皮损表皮角质形成细胞全层均可检测到高丰度SERPINB3/B4表达，且其主要表达于细胞浆，而健康对照者皮肤全层几乎无表达(如图2E-F)，综上结果表明玫瑰痤疮患者皮损中SERPINB3/B4较健康对照明显高表达，
为进一步明确SERPINB3/B4在银屑病皮损中表达情况，相似的，本发明首先收取健康对照和银屑病患者的皮损，提取皮损总量RNA，通过qRT-PCR检测皮肤中SERPINB3/B4 mRNA水平在两组之间的差异，如图2G-H可见相较健康对照者皮肤银屑病患者皮损的SERPINB3/B4在mRNA水平表达明显升高，同时对皮损进行SERPINB3/B4免疫组化染色，结果如图2I-J可见银屑病皮损较正常皮肤的表皮层明显增厚，且表达更高丰度的SERPINB3/B4，上述结果均表明，SERPINB3/B4在银屑病患者皮损中被激活，
为进一步研究SERPINB3/B4在玫瑰痤疮发病过程中发挥的作用，本发明根据先前研究所用的造模方式，建立了抗菌肽LL37诱导的玫瑰痤疮样小鼠模型，该模型皮损表现与炎症反应模式与人类玫瑰痤疮高度相似，本发明选取7-8周BALB/c雌性小鼠，剔除小鼠背部毛发，1天后每只小鼠背部皮内注射50μl(320μM)剂量LL37，每间隔12小时注射一次，对照组小鼠给与等剂量无菌1×PBS溶液，连续注射2日，共4次，模型建立成功后观察皮肤大体表型并进行取材，其次本发明收取小鼠皮损组织并提取总量RNA，检测玫瑰痤疮样小鼠皮损中Serpinb3a的mRNA表达情况，结果可见玫瑰痤疮样小鼠皮损较实验对照组Serpinb3a在mRNA水平表达明显上调(如图2K)，差异具有统计学意义,其中Serpinb3a为SERPINB3/B4的类似物，本发明进一步通过免疫荧光检测了玫瑰痤疮样小鼠模型皮损中Serpinb3a蛋白水平表达情况，结果显示玫瑰痤疮样小鼠模型皮损中Serpinb3a表达与人类玫瑰痤疮皮损SERPINB3/B4表达类似，玫瑰痤疮样小鼠模型皮损中毛囊周围和表皮全层Serpinb3a表达明显增强，为细胞浆表达(如图2L)，综上结果表明玫瑰痤疮样小鼠皮损Serpinb3a表达水平明显上调，
同样，本发明根据先前研究所用的造模方式，即连续外用咪喹莫特6天，建造银屑病样小鼠模型，收取小鼠皮损进行取材，收取小鼠皮损组织提取总量RNA，通过qRT-PCR检测银屑病样小鼠皮损中Serpinb3a的mRNA表达情况，结果可见银屑病样小鼠皮损较实验对照组Serpinb3a在mRNA水平表达明显上调(如图2M)，进一步收取小鼠皮损，进行免疫荧光染色，可见银屑病样小鼠皮损中明显高表达Serpinb3a(如图2N)，
为进一步探讨表皮中SERPINB3/B4在玫瑰痤疮及银屑病发病过程中的重要机制，本发明通过siRNA构建特异性敲降小鼠表皮Serpinb3a的小鼠模型，并对其进行LL37皮内注射及咪喹莫特外用，建立玫瑰痤疮样及银屑病样小鼠模型，观察表皮敲降Serpinb3a后对玫瑰痤疮样小鼠及银屑病样小鼠表型的影响。
3.根据权利要求1所述的SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用，其特征在于：本发明将阴性对照序列及2条siRNA序列分别命名为Scr RNA、siRNA#1和siRNA#2进行接下来的研究，首先探讨表皮内敲降Serpinb3a对玫瑰痤疮样小鼠表型的影响，如图3A模式图所示，7-8周龄BALB/c野生型雌性小鼠，将其背部毛发剃去，前1天进行siRNA皮内注射，实验对照组皮内注射对应的阴性对照序列，随后按照前述方法进行表皮内LL37注射诱导玫瑰痤疮样小鼠模型，在注射第2次LL37前进行第2次siRNA注射，加强敲降效果，造模完成后，观察并比较三组小鼠(Scr siRNA，siRNA#1和siRNA#2)表型之间的差异并进行取材，图2B为LL37造模两日后Scr siRNA和另外2条siRNA的Control组和LL37组玫瑰痤疮样皮炎的表现，可见LL37造模后Scr siRNA组小鼠皮损部位出现明显的炎症反应，包括红斑和毛细血管扩张，而在2条siRNA敲降组小鼠皮损的炎症反应明显减轻，本发明利用Image J软件对每组玫瑰痤疮样小鼠皮损处的面积大小进行测量，结果显示Scr siRNA组LL37造模后红斑面积明显增加，2条siRNA的LL37组红斑面积较Scr的LL37组明显减小(如图3C)，其次对玫瑰痤疮样皮损红斑严重程度进行评分，结果显示Scr siRNA的LL37组造模后红斑评分明显增加，造模后2条siRNA的LL37组红斑评分明显减轻(如图3D)，
此外本发明比较了LL37造模后各组小鼠皮损部位的组织学情况，取造模部位皮损，石蜡包埋切片后进行HE染色，显微镜下观察并统计小鼠真皮层炎症细胞浸润数量，如图3E可见，Scr siRNA的LL37组真皮部位浸润的炎症细胞数量较Control组明显增加，2条siRNA的LL37组造模后真皮层浸润的炎症细胞数量较Scr siRNA的LL37组明显减少，同时本发明通过Prism9软件对浸润的炎症细胞数量进行统计分析，结果可见敲降Serpinb3a后2条siRNA的LL37组浸润的炎症细胞较Scr的LL37组明显减少(如图3F)，差异具有统计学意义，最后本发明收取小鼠皮损，提取总量RNA，通过qRT-PCR比较了上述各组小鼠皮损中玫瑰痤疮相关基因在mRNA表达水平上的差异，如图3G-H所示，Scr siRNA的LL37组较Control组的Il6和Tnf-α基因表达增加，而在敲降Serpinb3a后，2条siRNA的LL37组较Scr siRNA的LL37组上述两个基因表达水平明显回降，且差异具有统计学意义，以上结果表明，表皮内Serpinb3a的缺失从皮损炎症反应表现、组织病理学情况以及mRNA表达层面均能够明显改善LL37诱导的玫瑰痤疮样小鼠模型中玫瑰痤疮的发展。
4.根据权利要求1所述的SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用，其特征在于：本发明为明确表皮内敲降Serpinb3a对银屑病样小鼠表型的影响，选择前述的两条siRNA，进行小鼠耳部皮内注射，表皮内敲降Serpinb3a，按照既往已有研究方法外用咪喹莫特进行银屑病样小鼠模型建造，如图4A模式图所示，外用咪喹莫特前1天(记作day-1)进行siRNA皮内注射，实验对照组皮内注射对应的阴性对照序列，其后每日一次咪喹莫特乳膏外用，第2天进行第2次siRNA注射，加强敲降效果，第6天造模完成后，为明确表皮内敲降Serpinb3a后对银屑病样小鼠皮损表型的影响，本发明造模第6天观察并比较三组小鼠(Scr siRNA，siRNA#1和siRNA#2)表型之间的差异并进行取材，根据既往研究[77]方法对小鼠皮损进行PASI评分及耳部厚度进行测量，可见siRNA的咪喹莫特组小鼠较ScrRNA咪喹莫特组小鼠皮损的红斑、鳞屑明显改善(如图4B)，PASI评分明显下降(如图4C)，耳部皮肤厚度亦明显下降(如图4D)，其次对各组小鼠皮损进行HE染色，结果可见，Scr siRNA咪喹莫特组表皮厚度明显增加，真皮层炎症细胞浸润明显，而两条siRNA的咪喹模特组表皮厚度及真皮层炎症细胞浸润程度明显改善(如图4E)，并对表皮层厚度、浸润的炎症细胞进行统计分析，发现二者在两条siRNA的咪喹莫特组较Scr siRNA的咪喹莫特组明显下降(如图4F-G)，为进一步明确Serpinb3a对银屑病相关基因分子水平的影响，本发明收取小鼠皮损，提取总量RNA，通过qRT-PCR比较了上述各组小鼠皮损中银屑病相关基因在mRNA表达水平上的差异，如图4H-I所示，Scr siRNA的咪喹莫特组较Control组Il6和Il-1β基因表达增加2条siRNA的咪喹莫特组中上述两个基因表达水平较Scr siRNA的咪喹莫特组有明显回降，差异具有统计学意义，以上结果表明，耳部表皮内Serpinb3a的缺失从皮损炎症反应表现、组织病理学情况以及mRNA表达层面均能够明显改善咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠模型中炎症疾病的发展，
综上所述，在小鼠表皮内敲降serpinb3a后，能够明显改善玫瑰痤疮样及银屑病样小鼠皮损处炎症反应。
5.根据权利要求1所述的SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用，其特征在于：为了更进一步明确SERPINB3/B4在体外对玫瑰痤疮中具体分子作用机制，本发明体外构建SERPINB3/B4过表达质粒，并通过转染试剂将过表达质粒转染人HaCaT细胞，72小时后收取细胞RNA，进行全转录组测序，并通过体内外实验对测序结果进行验证，
本发明对过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞中的差异基因表达值进行聚类分析，进而对基因表达值进行均一化处理从而得到如图5A，如图中的每一个小方格代表一个基因，蓝色表示基因表达下调，红色表示基因表达上调，颜色越深，表达的差异越明显，每一列表示每个样本不同基因的表达情况，每一行表示每个基因在不同样本中的表达情况，如图结果可见过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞较正常对照之间基因表达差异显著，结果表明，在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4后基因表达较正常对照组模式发生明显变化，
为进一步明确过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞中信号通路的变化，本发明对过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞和对照组细胞所有的基因表达量进行基因富集分析(Gene SetEnrichment Analysis，GSEA)，基于玫瑰痤疮为皮肤炎症性疾病及先前研究，炎症相关信号通路在玫瑰痤疮发生发展中发挥关键作用，所以本次研究着重关注与炎症相关联的信号通路，NF-κB信号通路几乎存在于所用的动物细胞中，参与细胞对外界刺激的各种反应，包括应激、细胞因子、自由基、微生物感染和紫外线照射等，既往研究发现此信号通路调控大量与炎症相关的基因表达，在本次研究中富集的炎症相关信号通路中NF-κB信号通路在过表达SERPINB3/B4的人HaCaT细胞中较对照组细胞系明显富集(如图5B-E)，这提示该信号通路可能参与了SERPINB3/B4调控玫瑰痤疮的发病，
为明确在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4后在蛋白水平对NF-κB信号通路的影响，本发明通过转染试剂将过表达质粒转染人HaCaT细胞系72小时后收取细胞蛋白，免疫印迹法检测在人HaCaT细胞系中表达SERPINB3/B4后对p65/NF-κB的磷酸化水平(p-p65)，同时应用Image J软件对p-p65灰度进行扫描量化，如图5F所示，本发明发现在人HaCaT细胞系中表达SERPINB3/B4后p-p65表达明显上调，p65表达无明显差异，p-p65/p65上调，结果表明NF-κB信号通路激活，同时，为了更加直观地了解表达SERPINB3/B4后对NF-κB信号通路的影响，本发明通过细胞爬片实验及免疫荧光检测过表达质粒转染人HaCaT细胞系72小时后对p65表达的影响，结果如图5G所示，在人HaCaT细胞中表达SERPINB3/B4后p65入核的细胞数目较对照组明显增多上述结果表明在在人HaCaT细胞中表达SERPINB3/B4在蛋白水平激活NF-κB信号通路，
既往研究发现，TNF-α可强烈诱导NF-κB信号的活化，为明确SERPINB3/B4对TNF-α诱导NF-κB信号活化的影响，本发明体外构建SERPINB3/B4的shRNA，建立稳定敲降SERPINB3/B4的人HaCaT细胞系，TNF-α孵育30分钟后，免疫印迹法检测敲降SERPINB3/B4后对TNF-α诱导NF-κB信号活化的影响，结果可见，构建稳定敲降SERPINB3/B4的人HaCaT细胞系对SERPINB3/B4的敲降效果明显，在正常对照组细胞中，TNF-α孵育后p-p65表达明显上调，而敲降SERPINB3/B4后，TNF-α诱导p-p65上调的情况明显改善，同时本发明对其条带灰度进行扫描，结果统计发现差异具有明显统计学意义(如图5H-I)，结果提示，人HaCaT细胞系中SERPINB3/B4的缺失阻止了TNF-α诱导的NF-κB信号的活化，同样，本发明通过细胞爬片实验及免疫荧光检测稳定敲降SERPINB3/B4对TNF-α诱导的p65入核情况的影响，如图5J-K可见在正常对照的人HaCaT细胞系中，TNF-α孵育后30分钟后p65几乎完全入核，而敲降SERPINB3/B4后p65入核的细胞数目较对照组明显减少，同时本发明对入核细胞数目进行统计，差异明显，具有统计学意义，
综上结果表明，体外过表达SERPINB3/B4后诱导NF-κB信号通路下游分子上调，体外敲降SERPINB3/B4后能够阻止TNF-α诱导的NF-κB信号的活化。
6.根据权利要求1所述的SERPINB3/B4作为靶点在玫瑰痤疮等炎症性皮肤病治疗药物中的应用，其特征在于：炎症相关的趋化因子及细胞因子在炎症发生及进展中起到极其重要的作用，前期一系列的结果表明SERPINB3/B4能够调控NF-κB信号通路，为进一步明确趋化因子及细胞因子在SERPINB3/B4调控玫瑰痤疮发病中的具体作用，本发明进一步对在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4后RNA-seq的结果进行分析，如图6A-B所示，趋化因子及细胞因子信号通路在SERPINB3/B4过表达的人HaCaT细胞中高度富集，同时本发明对样本的趋化因子及细胞因子相关的差异的表达值进行聚类分析，并对基因表达值进行均一化处理得到如图6C所示的如图，与正常对照相比，SERPINB3/B4过表达的人HaCaT细胞中炎症相关的趋化因子(CCL2，CCL5，CCL20，CXCL1，CXCL2，CXCL5，CXCL8，CXCL10，CXCL11)及细胞因子(IL1A，IL1B，IL6，TNFA)表达明显上调，
为进一步明确上述细胞因子在SERPINB3/B4过表达的人HaCaT细胞中的表达水平，本发明利用qRT-PCR的方法检测人HaCaT细胞过表达SERPINB3/B4后上述基因的表达情况，结果(如图6D)可见，在人HaCaT细胞中过表达SERPINB3/B4后，趋化因子CCL2，CCL5，CCL20，CXCL2，CXCL9，CXCL10，CXCL11及细胞因子IL1B，IL6，TNF-α表达明显上调，结果表明在人HaCaT细胞过表达SERPINB3/B4后能够明显诱导炎症相关的趋化因子及细胞因子的表达上调，
通过小鼠皮内敲降Serpinb3a能够降低LL37诱导的玫瑰痤疮相关细胞因子(Il6，Tnf-α)的表达水平，为进一步明确玫瑰痤疮样小鼠表皮内敲降Serpinb3a对炎症相关的趋化因子及细胞因子的影响，本发明应用qRT-PCR的方法检测了上述相关因子的表达水平，结果如图6E可见，敲降Serpinb3a后，LL37诱导的Ccl5，Cxcl9，Cxcl10，Cxcl11及Il1β表达水平受到明显抑制，本发明应用同样的方法检测了敲降serpinb3a后银屑病样小鼠皮损中上述趋化因子变化情况，结果如图6F所示，可见敲降Serpinb3a后，IMQ诱导的Ccl5，Ccl20，Cxcl9，Cxcl10，Cxcl11表达水平受到明显抑制，
同样的方法检测相关趋化因子及细胞因子的表达水平，结果5G如图所示，SERPINB3/B4诱导趋化因子CCL2，CCL5，CXCL9，CXCL10，CXCL11及细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α明显上调，而加用SC75741共同孵育后上述趋化因子及细胞因子的表达水平明显回降，上述结果表明SC75741能够通过抑制SERPINB3/B4对NF-κB信号通路的诱导激活下调相关趋化因子及细胞因子的表达水平。
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