CN114113392A - 丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱和应用 - Google Patents

丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱和应用，属于药物检测技术领域，所述构建方法是先配制供试品溶液和对照品溶液，然后再以乙腈（A）‑0.02wt%的磷酸水溶液（B）为流动相，对供试品溶液和对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，得丁香柿蒂散的指纹图谱；并利用所述构建方法获得丁香柿蒂散的标准指纹图谱，所述标准指纹图谱用于丁香柿蒂散的研究/开发/生产/临床应用全过程中质量评价或控制。本发明的丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，能够共同检出丁香柿蒂散全方中的全部药材成分；所提供的标准指纹图谱能够为全面建立丁香柿蒂散的质量控制标准提供科学依据。

Description

丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱和应用
技术领域
本发明涉及药物检测技术，尤其涉及一种丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱和应用。
背景技术
丁香柿蒂散是中医方剂名，出自清代杨栗山的《伤寒瘟疫条辨》，其含有丁香、柿蒂、生姜和人参四味中药，具有温中益气、降逆止呃的功效，主治胃气虚寒、胃失和降、气逆所导致的呃逆。同时还有研究表明丁香柿蒂散对心脏血管、血液流变学有十分积极的影响，也还具有一定抗炎、抗氧化损伤及抗病原微生物作用。
由于国际社会对药品的要求是“安全、有效、可控”，为研究、要想开发丁香柿蒂散，对其质量监控的研究就显得必不可少了。现行的中药质量标准，对中成药的质量控制是以传统的性状鉴别和显微鉴别确定真伪，以理化鉴别评价优劣，少数药味对其1～2个指标成分进行检测和控制。从传统中医药观点来看，检测任何一种活性成分均不能反映复方制剂所体现的整体疗效，中医辨证施治用的是药味而非某个化学成分。而指纹图谱是基于对中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱等技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，采用“共有峰”的方式来判断相似程度从而达到控制目的。利用指纹图谱表达成品的质量、实现对工艺操作和原药材的质控，追根溯源来寻找工艺操作中的问题和实现对原药材GAP的质量要求，是目前国际公认的中药制剂质量监控的重要手段。因此，对于丁香柿蒂散指纹图谱的构建是监控丁香柿蒂散质量的重中之重。
广东药科大学的刘荫贞在2017年发表的硕士学位论文《丁香柿蒂汤颗粒的研究与开发》中公开了一种丁香柿蒂汤颗粒的指纹图谱构建方法及其指纹图谱，它是以乙腈(A)-0.1wt％磷酸水溶液(B)为流动相，利用高效液相色谱技术，获得了具有11个共有特征峰的丁香柿蒂汤颗粒的指纹图谱，但其仅仅对这11个特征峰进行考察，且其余物质的稳定性不明确，无法很好的对丁香柿汤颗粒进行全方质量控制及定量研究。且该文献中所公开的标准指纹图谱仅仅对丁香柿蒂颗粒具有一定的指导意义，并不能对丁香柿蒂散及丁香柿蒂散所涉及的其它剂型起到全方位的指导作用。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱和应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
1)供试品溶液和对照品溶液的配制
取丁香柿蒂散制备供试品溶液；
取丁香酚、没食子酸和6-姜辣素制备对照品溶液；
2)分别取供试品溶液和对照品溶液进行高效液相色谱检测，得所述丁香柿蒂散指纹图谱；
所述高效液相色谱检测的流动相A为乙腈、流动相B为浓度为0.02wt％的磷酸水溶液。
进一步的，所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的洗脱条件为：
0～5min，3％流动相A，97％流动相B；
5～15min，3％→10％流动相A，97％→90％流动相B；
15～30min，10％→13％流动相A，90％→87％流动相B；
30～50min，13％→23％流动相A，87％→77％流动相B；
50～70min，23％→55％流动相A，77％→45％流动相B；
70～75min，55％→98％流动相A，45％→2％流动相B；
75～95min，98％流动相A，2％流动相B。
进一步的，所述高效液相色谱检测的检测波长为203nm或280nm。
进一步的，所述高效液相色谱检测的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；
十八烷基硅烷键合硅胶柱为CAPCELL PAK C18。
进一步的，所述高效液相色谱检测的柱温为20～28℃，柱温优先25℃，流速为1.0～1.2mL/min，流速优选1.0mL/min，进样量为10μL。
进一步的，所述供试品溶液是取丁香柿蒂散加至足够量的甲醇水溶液中，摇匀，再经超声提取、静置、放冷，然后用甲醇水溶液定容，摇匀，微孔滤膜过滤，制得；
所述甲醇水溶液的浓度为75wt％的甲醇水溶液；
所述微孔滤膜的孔径为0.22μm；
所述对照品溶液是取丁香酚、没食子酸和6-姜辣素加至甲醇溶解，定容后，制得。
进一步的，步骤1)中，所述丁香柿蒂散与供试品溶液的重量体积比为8mg∶1mL。
一种利用上述构建方法获得的丁香柿蒂散指纹图谱整合而成的标准指纹图谱，所得标准指纹图谱为203nm波长条件下的标准指纹图谱，包括38个共有特征峰，以4号峰没食子酸为参照峰，其共有特征峰的相对保留时间分别为：
1号峰：0.354～0.364，2号峰：0.392～0.414，3号峰：0.565～0.574，4号峰：1.000(S峰)，5号峰：1.542～1.577，6号峰：1.650～1.690，7号峰：1.796～1.842，8号峰：1.847～1.890，9号峰：1.902～1.952，10号峰：2.028～2.081，11号峰：2.112～2.169，12号峰：2.193～2.252，13号峰：2.301～2.448，14号峰：2.414～2.524，15号峰：2.491～2.596，16号峰：2.560～2.677，17号峰：2.637～2.868，18号峰：2.826～3.148，19号峰：3.099～3.485，20号峰：3.434～3.549，21号峰：3.495～3.792，22号峰：3.732～3.975，23号峰：3.975～4.252，24号峰：4.183～4.447，25号峰：4.375～4.502，26号峰：4.523～4.649，27号峰：4.687～4.873，28号峰：4.796～5.030，29号峰：4.947～5.088，30号峰：5.006～5.190，31号峰：5.272～5.537，32号峰：5.587～5.826，33号峰：5.689～5.852，34号峰：6.120～6.504，35号峰：6.391～6.776，36号峰：6.659～7.023，37号峰：6.900～7.220，38号峰：7.094～7.380；
所述203nm波长条件下的标准指纹图谱中4号峰为没食子酸、34号峰为丁香酚、35号峰为6-姜辣素；
其中，4号峰、14号峰及34号、36号峰峰属于丁香和柿蒂；
38号峰属于丁香、生姜和人参；
5号峰、7号峰、9号峰、10号峰、12号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰、22号峰、23号峰、24号峰、25号峰、26号峰、27号峰、29号峰、30号峰、31号峰、32号峰、33号峰及37号峰属于丁香；
11号峰属于柿蒂；
35号峰属于生姜；
2号峰及3号峰属于人参。
另一种利用上述构建方法获得的丁香柿蒂散指纹图谱整合而成的标准指纹图谱，所得标准指纹图谱为280nm波长条件下的标准指纹图谱，包括27个共有特征峰，以1号峰没食子酸为参照峰，其共有特征峰的相对保留时间分别为：
1号峰：10.677～11.025(S峰)，2号峰：12.316～12.662，3号峰：14.501～14.731，4号峰：16.875～17.031，5号峰：20.937～21.042，6号峰：22.295～22.408，7号峰：24.13～24.282，8号峰：26.196～26.393，9号峰：27.815～27.999，10号峰：28.673～28.866，11号峰：30.727～30.925，12号峰：33.696～33.926，13号峰：37.341～37.547，14号峰：38.039～38.2，15号峰：40.637～40.781，16号峰：42.596～42.737，17号峰：45.582～45.717，18号峰：47.674～47.834，19号峰：48.257～48.411，20号峰：49.834～49.994，21号峰：54.531～54.682，22号峰：55.629～55.771，23号峰：60.575～60.656，24号峰：62.213～62.299，25号峰：62.725～62.806，26号峰：69.704～69.799，27号峰：75.273～75.32；
所述280nm波长条件下的标准指纹图谱中1号峰为没食子酸、26号峰为丁香酚；
其中，1号峰及26号峰属于丁香和柿蒂；
其余2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、9号峰、10号峰、11号峰、12号峰、13号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰、22号峰、23号峰、25号峰、27号峰属于丁香。
一种标准指纹图谱在丁香柿蒂散的研究/开发/生产/临床应用全过程质量评价或控制中的应用。
本发明的丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱和应用的有益效果为：
本发明的丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，能够共同检出丁香柿蒂散全方中几乎所有的药材成分；
本发明通过改变洗脱体系，利用丁香柿蒂散中不同有效成分理化性质不同的特点，改变其在色谱柱中的流动速度，从而达到将丁香柿蒂散中不同有效成分很好分离的目的；
本发明通过调整流动相B，获得了分离度好、基准线较平稳，出峰较多且更能反映丁香柿蒂散质量的标准指纹图谱；
本发明通过调整梯度洗脱的洗脱条件，在保证丁香柿蒂散标准指纹图谱的前提下，有效降低了运行时间；
本发明的检测波长显著优于其它检测波长，通过本发明的检测波长能够获得出峰更好的丁香柿蒂散的标准指纹图谱；
本发明通过选择合适的色谱柱、柱温、流速等工艺条件，有效优化了分离条件，从而提高了丁香柿蒂散标准指纹图谱的出峰稳定性；
不同溶剂或不同浓度的同种溶剂，对于中药物质中有效成分的提取效率也有所不同，本发明通过选用合适的提取溶剂，从而提高了丁香柿蒂散的提取效率，进而构建了丁香柿蒂散的标准指纹图谱；
本发明的构建方法还具有良好的可行性、稳定性和重现性；
本发明所获得的丁香柿蒂散的203nm波长条件下的标准指纹图谱具有38个共有特征峰，280nm波长条件下的标准指纹图谱具有27个色谱峰，能够为后续丁香柿蒂散在研究、开发、生产、临床应用全过程中的质量监控提供有效保障；
利用本发明所获得的丁香柿蒂散的标准指纹图谱中共有特征峰的有无及特征，可以全面监控丁香柿蒂散原料药材、半成品和成品的质量，通过色谱指纹特征相似程度的比较，评价丁香柿蒂散的优劣、考察稳定性和一致性，弥补了现行质量控制方法的不足，同时还可以监控丁香柿蒂散生产工艺的稳定性，保证其质量的稳定、均一、可控；
本发明所获得的丁香柿蒂散的标准指纹图谱提高了丁香柿蒂散成品、半成品的质量监控标准，有效防止了产品伪造事件的发生，保证了丁香柿蒂散的正常生产、流通秩序；在本发明的基础上，还可以开展指纹图谱信息与药效活性信息的相关性研究，从而深入地阐明丁香柿蒂散的内在化学成分与该制剂疗效的相关性。
附图说明
图1是本发明实施例6中在203nm波长条件下17批丁香柿蒂散冻干粉的指纹图谱；
图2是本发明实验例6中所生成的203nm波长条件下丁香柿蒂散的标准指纹图谱；
图3是本发明实施例6中在280nm波长条件下17批丁香柿蒂散冻干粉的指纹图谱；
图4是本发明实验例6中所生成的280nm波长条件下丁香柿蒂散的标准指纹图谱；
图5是本发明实验例1中203nm波长下的精密度测定色谱图；
图6是本发明实验例1中280nm波长下的精密度测定色谱图；
图7是本发明实验例1中203nm波长下的重现性测定色谱图；
图8是本发明实验例1中280nm波长下的重现性测定色谱图；
图9是本发明实验例1中203nm波长下的稳定性测定色谱图；
图10是本发明实验例1中280nm波长下的稳定性测定色谱图；
图11是本发明实验例1中280nm波长下的丁香酚标准曲线图；
图12是本发明实验例1中280nm波长下的没食子酸标准曲线图；
图13是本发明实验例1中203nm波长下的6-姜辣素标准曲线图；
图14是本发明实验例1中缺丁香阴性对照溶液、全方供试品溶液、丁香药材溶液、丁香酚对照品溶液的对比色谱图；
图15是本发明实验例1中缺柿蒂阴性对照溶液、全方供试品溶液、柿蒂药材溶液、没食子酸对照品溶液的对比色谱图；
图16是本发明实验例1中缺生姜阴性对照溶液、全方供试品溶液、生姜药材溶液、6-姜辣素对照品溶液的对比色谱图；
图17是本发明实验例1中缺人参阴性对照溶液、全方供试品溶液、人参药材溶液、人参皂苷Rg1对照品溶液、人参皂苷Re对照品溶液及人参皂苷Rb1对照品溶液的对比色谱图；
图18是本发明实验例1中全方供试品溶液、生姜药材溶液、丁香药材溶液、柿蒂药材溶液及人参药材溶液的对比色谱图；
图19是本发明实验例2中测定的对比例1和实施例1的色谱图对比图；
图20是本发明实验例2中测定的不同检测波长下的保留时间-吸光度-波长3D图；
图21是本发明实验例2中测定的不同检测波长下的对比色谱图；
图22是本发明实验例2中203nm波长下测定的不同流动相的对比色谱图；
图23是本发明实验例2中280nm波长下测定的不同流动相的对比色谱图；
图24是本发明实验例2中203nm波长下测定的不同色谱柱的对比色谱图；
图25是本发明实验例2中280nm波长下测定的不同色谱柱的对比色谱图；
图26是本发明实验例2中203nm波长下测定的不同流速的对比色谱图；
图27是本发明实验例2中280nm波长下测定的不同流速的对比色谱图；
图28是本发明实验例2中203nm波长下测定的不同柱温的对比色谱图；
图29是本发明实验例2中280nm波长下测定的不同柱温的对比色谱图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1一种丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法
本实施例采用丁香柿蒂散冻干粉进行丁香柿蒂散指纹图谱的构建，具体丁香柿蒂散冻干粉的制备方法如下：
称取丁香7.46g、柿蒂7.46g、人参3.73g、生姜11.19g，加入到煎药壶中加纯净水300mL，浸泡30min后，加盖煎煮10min，用玻璃棒搅拌三次，趁热过滤100目筛，挤压滤渣。煎煮液冷冻干燥24～36h(温度：-50℃，真空度：10Pa～20Pa)，研磨过65目筛即得丁香柿蒂散冻干粉。
本实施例为一种丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，包括以下具体步骤：
1)供试品溶液和对照品溶液的配制
供试品溶液：精密称取200mg丁香柿蒂散冻干粉置于25mL容量瓶中，加入25mL浓度为75wt％的甲醇水溶液中，摇匀，再经超声提取30min(超声的频率为40KHz、功率300W)、静置、放冷，然后用浓度为75wt％的甲醇水溶液定容至刻度线，摇匀，再用0.22μm的微孔滤膜过滤，所得滤液即为供试品溶液；
需要注意的是摇匀超声前，加入的75wt％甲醇水溶液的量只要足够提取丁香柿蒂散冻干粉中有效成分即可，不必非要加入25mL，其它量也可以，如20mL。本实施例为描述清楚，仅采用了其中一种用量，应理解本发明所要求保护的构建方法中并不受本实施例中75wt％甲醇水溶液用量所限制。
对照品储备溶液：精密称取153.26mg丁香酚对照品(纯度99.6％)置于5mL容量瓶内，用甲醇溶解，定容摇匀，作为丁香酚对照品储备液(浓度为30.53mg/mL)；
用相同的方法分别精密称取31.35mg的没食子酸对照品(纯度90.8％)、52.19mg的6-姜辣素对照品(纯度99.9％)，分别配置成没食子酸对照品储备液(浓度为5.693mg/mL)、6-姜辣素对照品储备液(浓度为10.43mg/mL)。
对照品溶液：精密移取1mL丁香酚对照品储备液至25mL容量瓶内，甲醇稀释定容至刻度，摇匀，作为丁香酚对照品溶液(浓度为1221.2μg/mL)；
用相同的方法分别精密移取1.5mL没食子酸对照品储备液至25mL容量瓶内、0.2mL的6-姜辣素对照品储备液至50mL容量瓶内，分别配置为没食子酸对照品溶液(浓度为341.4μg/mL)、6-姜辣素对照品溶液(浓度为41.72μg/mL)。
2)分别取供试品溶液和三种对照品溶液进行高效液相色谱检测，得丁香柿蒂散的高效液相色谱图，即为丁香柿蒂散指纹图谱；
其中，高效液相色谱检测的检测条件为：
色谱柱为CAPCELL PAK C18；
检测波长为203nm；
柱温为25℃；
流速为1.0mL/min；
进样量为10μL；
流动相A为乙腈，流动相B为浓度为0.02wt％的磷酸水溶液；
洗脱方式为梯度洗脱，具体洗脱程序为：
0～5min，3％流动相A，97％流动相B；
5～15min，3％→10％流动相A，97％→90％流动相B；
15～30min，10％一13％流动相A，90％→87％流动相B；
30～50min，13％→23％流动相A，87％→77％流动相B；
50～70min，23％→55％流动相A，77％→45％流动相B；
70～75min，55％→98％流动相A，45％→2％流动相B；
75～95min，98％流动相A，2％流动相B。
实施例2～5丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法
实施例2～5分别为一种丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，它们的步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于工艺参数的不同，具体详见表1：
表1实施例2～5中各项工艺参数一览表
Figure BDA0003372779410000051
实施例2～5其它部分的内容，与实施例1相同。
实施例6丁香柿蒂散的标准指纹图谱
采用实施例1中丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，测定17批丁香柿蒂散冻干粉在203nm波长条件下的指纹图谱，参见图1，所得的各批次丁香柿蒂散冻干粉的指纹图谱中各峰的保留时间见表2，各峰的相对保留时间见表3；
采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”对上述17批丁香柿蒂散的指纹图谱进行合成，生成共有38个特征峰构成的203nm波长条件下丁香柿蒂散的标准指纹图谱，参见图2。其中，以4号峰没食子酸为参照峰，其共有特征峰的相对保留时间分别为：
1号峰：0.354～0.364，2号峰：0.392～0.414，3号峰：0.565～0.574，4号峰：1.000(S峰)，5号峰：1.542～1.577，6号峰：1.650～1.690，7号峰：1.796～1.842，8号峰：1.847～1.890，9号峰：1.902～1.952，10号峰：2.028～2.081，11号峰：2.112～2.169，12号峰：2.193～2.252，13号峰：2.301～2.448，14号峰：2.414～2.524，15号峰：2.491～2.596，16号峰：2.560～2.677，17号峰：2.637～2.868，18号峰：2.826～3.148，19号峰：3.099～3.485，20号峰：3.434～3.549，21号峰：3.495～3.792，22号峰：3.732～3.975，23号峰：3.975～4.252，24号峰：4.183～4.447，25号峰：4.375～4.502，26号峰：4.523～4.649，27号峰：4.687～4.873，28号峰：4.796～5.030，29号峰：4.947～5.088，30号峰：5.006～5.190，31号峰：5.272～5.537，32号峰：5.587～5.826，33号峰：5.689～5.852，34号峰：6.120～6.504，35号峰：6.391～6.776，36号峰：6.659～7.023，37号峰：6.900～7.220，38号峰：7.094～7.380；
所述203nm波长条件下的标准指纹图谱中4号峰为没食子酸、34号峰为丁香酚、35号峰为6-姜辣素；
其中，4号峰、14号峰及34号、36号峰峰属于丁香和柿蒂；
38号峰属于丁香、生姜和人参；
5号峰、7号峰、9号峰、10号峰、12号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰、22号峰、23号峰、24号峰、25号峰、26号峰、27号峰、29号峰、30号峰、31号峰、32号峰、33号峰及37号峰属于丁香；
11号峰属于柿蒂；
35号峰属于生姜；
2号峰及3号峰属于人参。
采用实施例2中丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，测定17批丁香柿蒂散冻干粉在280nm波长条件下的指纹图谱，参见图3，所得的各批次丁香柿蒂散冻干粉的指纹图谱中各峰的保留时间见表4，各峰的相对保留时间见表5；
采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)”对上述17批丁香柿蒂散的指纹图谱进行合成，生成共有27个特征峰构成的丁香柿蒂散的标准指纹图谱，参见图4，其中，以1号峰没食子酸为参照峰，其共有特征峰的相对保留时间分别为：
1号峰：10.677～11.025(S峰)，2号峰：12.316～12.662，3号峰：14.501～14.731，4号峰：16.875～17.031，5号峰：20.937～21.042，6号峰：22.295～22.408，7号峰：24.13～24.282，8号峰：26.196～26.393，9号峰：27.815～27.999，10号峰：28.673～28.866，11号峰：30.727～30.925，12号峰：33.696～33.926，13号峰：37.341～37.547，14号峰：38.039～38.2，15号峰：40.637～40.781，16号峰：42.596～42.737，17号峰：45.582～45.717，18号峰：47.674～47.834，19号峰：48.257～48.411，20号峰：49.834～49.994，21号峰：54.531～54.682，22号峰：55.629～55.771，23号峰：60.575～60.656，24号峰：62.213～62.299，25号峰：62.725～62.806，26号峰：69.704～69.799，27号峰：75.273～75.32；
所述280nm波长条件下的标准指纹图谱中1号峰为没食子酸、26号峰为丁香酚；
其中，1号峰及26号峰属于丁香和柿蒂；
其余2号峰、3号峰、4号峰、5号峰、6号峰、7号峰、9号峰、10号峰、11号峰、12号峰、13号峰、15号峰、16号峰、17号峰、18号峰、19号峰、20号峰、21号峰、22号峰、23号峰、25号峰、27号峰属于丁香。
本实施例所得两种丁香柿蒂散的标准指纹图谱均可以用于丁香柿蒂散的研究/开发/生产/临床应用全过程中的质量评价或控制。
Figure BDA0003372779410000071
Figure BDA0003372779410000081
Figure BDA0003372779410000091
Figure BDA0003372779410000101
Figure BDA0003372779410000111
实验例1指纹图谱方法学考察
实施例1与实施例2的区别仅在于检测波长不同，本实验例分别对实施例1和实施例2中丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法进行考察，具体考察方法参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术指南》，将所得的色谱图转换成AIA格式后输入相似度评价软件，通过对所得图谱相似度的比较进行方法学考察，主要考察该构建方法的专属性、精密度、重现性、稳定性、线性、加样回收率。
一、精密度
按实施例1和实施例2的构建方法分别取丁香柿蒂散冻干粉配制供试品溶液，连续进样6次进行指纹图谱检测，再将各实施例构建方法所得的6张色谱图分别输入相似度评价软件进行相应的相似度比较(即实施例1的构建方法所得的6张色谱图进行一次相似度比较，实施例2的构建方法所得的6张色谱图进行一次相似度比较)，再分别采用中位数法生成对应的精密度参照指纹图谱，实施例1的构建方法(检测波长为203nm)的精密度测定结果见图5、具体结果见表6～7，实施例2的构建方法(检测波长为280nm)的精密度测定结果见图6、具体结果见表8～9。
表6检测波长为203nm时相似度计算结果(精密度)
No 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
相似度 0.999 1.000 1.000 1.000 0.999 0.999 0.055
表7检测波长为203nm时精密度结果
序号 没食子酸峰面积 丁香酚峰面积 6-姜辣素峰面积
1 3509039 18363210 240394
2 3585608 18327090 242757
3 3590918 18346860 242222
4 3609860 18334850 243305
5 3524190 18368940 244781
6 3576882 18362200 245260
均值 3566083 18350525 243120
RSD％ 1.1 0.090 0.73
表8检测波长为280nm时相似度计算结果(精密度)
No 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
相似度 0.999 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.041
表9检测波长为280nm时精密度结果
序号 没食子酸峰面积 丁香酚峰面积
1 1672066 1704687
2 1676830 1703498
3 1686206 1706807
4 1691190 1706686
5 1690768 1709210
6 1688734 1707862
均值 1684299 1706458
RSD％ 0.47 0.12
由图5～6及表6～9可以看出，采用实施例1和实施例2的构建方法连续进样6次所得的色谱图相似度均大于0.95，且RSD值小于0.5％。其中，采用实施例1的构建方法(检测波长203nm)时，没食子酸峰面积、丁香酚峰面积及6-姜辣素峰面积这三个指标性成分峰面积RSD均小于1.1％；采用实施例2的构建方法(检测波长280nm)时，没食子酸峰面积、丁香酚峰面积及6-姜辣素峰面积这三个指标性成分相对峰面积RSD均小于0.47％，说明本发明的构建方法精密度良好，符合指纹图谱的要求。
二、重现性
按照实施例1中供试品溶液配制方法取同一批丁香柿蒂散冻干粉制备供试品溶液，平行操作6次，制备6份重现性供试品溶液，再分别按照实施例1和实施例2中的色谱条件进样分析，将各色谱条件下所得的色谱图输入相似度评价软件进行相应的相似度比较(即实施例1的色谱条件所得的6张色谱图进行一次相似度比较，实施例2的色谱条件所得的6张色谱图进行一次相似度比较)，再分别采用中位数法生成对应的重现性参照指纹图谱，实施例1的构建方法(检测波长为203nm)的重现性测定结果见图7、具体结果见表10～11，实施例2的构建方法(检测波长为280nm)的重现性测定结果见图8、具体结果见表12～13。
表10检测波长为203nm时相似度计算结果(重现性)
No 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
相似度 0.999 0.999 0.999 1.000 1.000 1.000 0.055
表11检测波长为203nm时重现性结果
序号 没食子酸峰面积 丁香酚峰面积 6-姜辣素峰面积
1 3572506 18890590 248051
2 3540834 18300370 244496
3 3481570 18153840 240870
4 3551197 18289220 242663
5 3522096 18203930 240829
6 3521591 18234710 241220
均值 3531632 18345443 243022
RSD％ 0.88 1.5 1.2
表12检测波长为280nm时相似度计算结果(重现性)
No 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
相似度 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0
表13检测波长为280nm时重现性结果
序号 没食子酸峰面积 丁香酚峰面积
1 1698234 1753986
2 1756380 1697419
3 1655905 1676222
4 1752223 1698065
5 1665550 1686122
6 1738552 1687150
均值 1711141 1699827
RSD％ 2.6 1.6
由图7～8及表10～13可以看出，采用实施例1和实施例2的色谱条件对6份重现性供试品溶液检测所得的色谱图相似度均大于0.95，且RSD值小于0.5％。其中，采用实施例1的色谱条件(检测波长203nm)时，没食子酸峰面积、丁香酚峰面积及6-姜辣素峰面积这三个指标性成分峰面积RSD均小于1.5％；采用实施例2的色谱条件(检测波长280nm)时，没食子酸峰面积、丁香酚峰面积及6-姜辣素峰面积这三个指标性成分相对峰面积RSD均小于2.6％，说明本发明的构建方法重现性良好，符合指纹图谱的要求。
三、稳定性
按照实施例1中供试品溶液配制方法取丁香柿蒂散冻干粉制备稳定性供试品溶液，分别在放置0、2、4、6、8、10、12、14、24h时，按照实施例1和实施例2中的色谱条件进样分析，将各色谱条件下所得的色谱图输入相似度评价软件进行相应的相似度比较(即实施例1的色谱条件所得的9张色谱图进行一次相似度比较，实施例2的色谱条件所得的9张色谱图进行一次相似度比较)，再分别采用中位数法生成对应的稳定性参照指纹图谱，实施例1的构建方法(检测波长为203nm)的稳定性测定结果见图9、具体结果见表14～15，实施例2的构建方法(检测波长为280nm)的稳定性测定结果见图10、具体结果见表14和表16。
表14相似度计算结果(稳定性)
Figure BDA0003372779410000131
Figure BDA0003372779410000141
表15检测波长为203nm时稳定性结果
序号 没食子酸峰面积 丁香酚峰面积 6-姜辣素峰面积
1 3533453 18115570 240652
2 3483914 17885420 239122
3 3541392 18119290 244008
4 3542071 18194590 244685
5 3537884 18108820 243884
6 3543861 18158340 244523
7 3538226 18145760 243084
8 3525301 18094810 241952
9 3548927 18127090 242135
均值 3532781 18105521 242672
RSD％ 0.55 0.48 0.78
表16检测波长为280nm时稳定性结果
序号 没食子酸峰面积 丁香酚峰面积
1 1671498 1672632
2 1728013 1643208
3 1763194 1677890
4 1766415 1684127
5 1672017 1673425
6 1679835 1678886
7 1677400 1677761
8 1670004 1672883
9 1750034 1675427
均值 1708712 1672915
RSD％ 2.5 0.70
由图9～10及表14～16可以看出，采用实施例1和实施例2的色谱条件对放置不同时间的稳定性供试品溶液检测所得的色谱图相似度均大于0.95，且RSD值小于0.53％。其中，采用实施例1的色谱条件(检测波长203nm)时，没食子酸峰面积、丁香酚峰面积及6-姜辣素峰面积这三个指标性成分峰面积RSD均小于0.78％；采用实施例2的色谱条件(检测波长280nm)时，没食子酸峰面积、丁香酚峰面积及6-姜辣素峰面积这三个指标性成分相对峰面积RSD均小于2.5％，说明本发明配制的供试品溶液能够24h内维持稳定，符合样品检测的要求。
四、线性考察
A)丁香酚线性考察
分别精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0mL浓度为1221.2μg/mL的丁香酚对照品溶液加至10mL容量瓶内，并用75wt％甲醇稀释定容至刻度，摇匀，得到7种不同浓度的丁香酚溶液，再分别按照实施例2中的色谱条件进行分析测定，检测波长为280nm，以丁香酚浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线图，参见图11，所得丁香酚的线性回归方程为Y＝9834.89X+31810.36，r＝0.9999，在61.06～610.6μg/mL范围内线性关系良好。
B)没食子酸线性考察
分别精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0mL浓度为341.4μg/mL的没食子酸对照品溶液加至10mL容量瓶内，并用75％甲醇稀释定容至刻度，摇匀，得到7种不同浓度的没食子酸溶液，再分别按照实施例2中的色谱条件进行分析测定，检测波长为280nm，以没食子酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线图，参见图12，所得没食子酸的线性回归方程为Y＝29529.26x-32341.34，r＝1.0000，在17.07-170.7μg/mL范围内线性关系良好。
C)6-姜辣素
分别精密量取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0mL浓度为41.72μg/mL的6-姜辣素对照品溶液加至10mL容量瓶内，并用75％甲醇稀释定容至刻度，摇匀，得到7种不同浓度的6-姜辣素溶液，再分别按照实施例1中的色谱条件进行分析测定，检测波长为203nm，以6-姜辣素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线图，参见图13，所得6-姜辣素的线性回归方程为Y＝62817.47X-16286.77，r＝0.9999，在2.09-20.86μg/mL范围内线性关系良好。
五、加样回收率考察
取6份已知丁香酚、没食子酸、6-姜辣素三种成分含量的丁香柿蒂散冻干粉(具体含量见表17中的原有量)，每份100mg，按照实施例1中供试品溶液配制方法制备待测溶液，再分别按照表17中的加标量加入丁香酚、没食子酸、6-姜辣素对照品，然后按照实施例1中的色谱条件进行分析测定，具体测定结果见下表：
表17加样回收率结果
Figure BDA0003372779410000151
由表17可以看出，通过计算加样回收率，可以看出丁香酚、没食子酸、6-姜辣素三种被测成分的回收率均在95.08～101.4％之间，RSD均在0.93～1.3％之间，表明本发明的构建方法的加样回收率良好。
六、阴性对照实验
需要注意，阴性对照实验所测的色谱图，只需能很好的显示出各特征峰即可，并不需要计算特征峰的峰面积，因此，对于阴性对照实验中的待测液浓度并没有特定的限制。
分别按照实施例1的方法制备全方供试品溶液、单味药材溶液(丁香药材溶液、柿蒂药材溶液、生姜药材溶液及人参药材溶液)、缺丁香阴性对照溶液、缺柿蒂阴性对照溶液、缺生姜阴性对照溶液、缺人参阴性对照溶液；
精密称定对照品丁香酚(纯度99.6％)58.35mg、没食子酸(纯度90.8％)10.25mg、6-姜辣素22.03mg(纯度99.9％)、人参皂苷Rg1(纯度93.6％)2.45mg、人参皂苷Re(纯度97.4％)0.38mg、人参皂苷Rb11.36mg(纯度91.2％)，分别加入甲醇溶解于5mL的容量瓶，制成相应的对照品溶液(丁香酚对照品溶液11.62mg/mL、没食子酸对照品溶液1.86mg/mL、6-姜辣素对照品溶液4.40mg/mL、人参皂苷Rg1对照品溶液0.46mg/mL、人参皂苷Re对照品溶液0.07mg/mL及人参皂苷Rb1对照品溶液0.25mg/mL)；
取缺丁香阴性对照溶液、全方供试品溶液、丁香药材溶液、丁香酚对照品溶液，按照实施例2中的色谱条件进行分析测定，测定结果参见图14，其中，图14中S1为缺丁香阴性对照溶液的色谱图、S2为全方供试品溶液、S3为丁香药材溶液、S4为丁香酚对照品溶液；
取缺柿蒂阴性对照溶液、全方供试品溶液、柿蒂药材溶液、没食子酸对照品溶液，按照实施例2中的色谱条件进行分析测定，测定结果参见图15，其中，图15中S1为柿蒂药材溶液、S2为全方供试品溶液、S3为缺丁香阴性对照溶液的色谱图、S4为没食子酸对照品溶液；
取缺生姜阴性对照溶液、全方供试品溶液、生姜药材溶液、6-姜辣素对照品溶液，按照实施例1中的色谱条件进行分析测定，测定结果参见图16，其中，图16中S1为缺生姜阴性对照溶液的色谱图、S2为全方供试品溶液、S3为生姜药材溶液、S4为6-姜辣素对照品溶液；
取缺人参阴性对照溶液、全方供试品溶液、人参药材溶液、人参皂苷Rg1对照品溶液、人参皂苷Re对照品溶液及人参皂苷Rb1对照品溶液，按照实施例1中的色谱条件进行分析测定，测定结果参见图17，其中，图17中S1为缺人参阴性对照溶液的色谱图、S2为全方供试品溶液、S3为人参药材溶液、S4为人参皂苷Rg1对照品溶液、S5为人参皂苷Re对照品溶液、S6人参皂苷Rb1对照品溶液；
取全方供试品溶液、生姜药材溶液、丁香药材溶液、柿蒂药材溶液及人参药材溶液，分别按照实施例1和实施例2中的色谱条件进行分析测定，测定结果参见图18，其中，图18中S1为全方供试品溶液、S2为生姜药材溶液、S3为丁香药材溶液、S4为柿蒂药材溶液、S5人参药材溶液；
通过对图14～18中的特征峰的保留时间进行对比，可以看出大部分特征峰来源于丁香，其中丁香酚色谱峰在全方色谱图中峰高最高，在70min处左右，且丁香、柿蒂中均含有没食子酸，在10.5min处；6-姜辣素来源于生姜，在72min处；在检测波长为203nm时，3～9min时间段内有人参的特征峰，但峰高相对较低。同时还可以看出，全方色谱图中丁香、柿蒂、人参、生姜四味药所具有的特征峰均有其特征峰呈现。
通过以上方法学的考察内容，可以看出本发明的构建方法的精密度、重现性、线性、样品的稳定性以及加样回收率均符合要求，且该方法还可以将丁香柿蒂散中的物质基准主要特征性成分丁香酚、没食子酸、6-姜辣素进行良好的分离和辨识，具有良好的专属性，因此可以用来建立丁香柿蒂散指纹图谱和用来测定丁香酚、没食子酸、6-姜辣素含量，并且丁香柿蒂散全方的标准指纹图谱也可以很好的呈现丁香、柿蒂、生姜、人参这四味药的色谱峰。
实验例2构建方法中各工艺参数考察
(1)色谱梯度条件考察
按照实施例1的构建方法，考察不同洗脱程序对色谱图的影响，对比例1与实施例1的区别仅在于将具体洗脱程序改为：
0～5min，3％流动相A，97％流动相B；
5～15min，3％→10％流动相A，97％→90％流动相B；
15～30min，10％→13％流动相A，90％→87％流动相B；
30～55min，13％→22％流动相A，87％→78％流动相B；
55～80min，22％→35％流动相A，78％→65％流动相B；
80～90min，35％→53％流动相A，65％→47％流动相B；
90～95min，53％→98％流动相A，65％→2％流动相B；
95～115min，98％流动相A，2％流动相B。
对比例1与实施例1的色谱图对比图如图19所示，图19中上图为对比例1的色谱图，下图为实施例1的色谱图，通过对比两种洗脱程序所对应的色谱图，可以看出，实施例1对应的色谱图不仅能够很好的将主要色谱峰分离开，并且运行时间为95min，相对时间较短，且基线比较平稳。
(2)检测波长的考察
按照实施例1的构建方法，分别考察不同检测波长对色谱图的影响，考察过程中仅改变检测波长，分别在检测波长为203nm、230nm、260nm、280nm时进行测定，获得供试品溶液的保留时间-吸光度-波长3D图，如图20所示，可以看出，随着检测波长的增大，色谱峰逐渐减少，203nm下色谱峰较多，并且吸光度较高，考虑到人参药材主要在203nm下进行检测，另外在此波长下，生姜中指标性成分6-姜辣素色谱峰信噪比较高，可用来定量，因此选用203nm作为主要的检测波长。结合供试品溶液在检测波长为203nm、230nm、260nm、280nm时的色谱图，如图21所示，203nm波长条件下，没食子酸和6-姜辣素色谱峰较其他波长下高，78min～88min比其它波长下多出3个峰；260nm和280nm下相对出峰较少，68～83min较203nm和230nm下少出3个峰。通过查阅文献和2020版《中国药典》丁香酚和没食子酸在280nm波长下色谱峰较好，可用于定量，因此以280nm也做为备选检测波长。最终选用203nm或280nm作为最终的检测波长。
(3)流动相考察
在丁香柿蒂散中包括药材人参，需要在203nm下检测，而甲醇在203nm下存在末端吸收，因此流动相A选用为乙腈。
又由于丁香柿蒂散中含有丁香酚、没食子酸、6-姜辣素(6-姜酚)等酸性成分，对不同pH值对最终色谱图的影响进行考察，分别以浓度为0.01wt％的磷酸水溶液(0.01％磷酸水)、浓度为0.02wt％的磷酸水溶液(0.02％磷酸水)、浓度为0.05wt％的磷酸水溶液(0.05％磷酸水)、浓度为0.1wt％的磷酸水溶液(0.1％磷酸水)及水作为流动相B进行考察。
分别按照实施例1和实施例2中的构建方法，除改变流动相B外不改变其它参数进行测定，得到在203nm、280nm波长下的色谱图，如图22和图23所示，图22和图23中从上到下依次为0.02％磷酸水、0.1％磷酸水、水、0.05％磷酸水、0.01％磷酸水，可以看出，203nm波长下纯水相出峰少，峰形差，没食子酸未出峰，不能以纯水相作为流动相B。浓度为0.1wt％的磷酸水溶液于75min较其它浓度的磷酸水溶液多出一个色谱峰，79min时色谱峰间分离度比较差，且该保留时间下的峰高也最低，同时在79min时，浓度为0.05wt％的磷酸水溶液的出峰高稍高，浓度为0.01wt％的磷酸水溶液出峰高较高，浓度为0.02wt％的磷酸水溶液出峰高最高，因此以浓度为0.02wt％的磷酸水溶液作为流动相B。并且，在280nm波长下，纯水作为流动相B的结果也不理想，其它四种浓度的磷酸水溶液的结果相似。因此，本发明以浓度为0.02wt％的磷酸水溶液作为流动相B，此时测定的色谱图的色谱峰的分离度较好，基线平稳，出峰较多。
(4)色谱柱考察
按照实施例1和实施例2的构建方法，分别考察不同色谱柱对色谱图的影响，考察过程中仅改变色谱柱，分别选用四个品牌6种不同型号的十八烷基硅烷键合硅胶柱在203nm和280nm波长下进行测定，具体十八烷基硅烷键合硅胶柱包括：a柱为SHISEIDO CAPCELLPAK C18(4.6×250mm，5μm)；b柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250mm，5μm)；c柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)；d柱为Agilent ZORBAX EclipsePlus C18(4.6×250mm，5μm)；e柱为Waters XBridge C18(4.6×150mm，5μm)；f柱为DikmaSpursil C18-EP(4.6×250mm，5μm)；
对于色谱柱的考察结果，如图24和图25所示，图24和图25中从上到下依次为依次为a柱、b柱、c柱、d柱、e柱、f柱，其中图24中，203nm波长条件下，f柱和c柱基线不稳；e柱没食子酸出峰与溶剂峰重叠；b柱46～66min峰分离效果较差，于78～79min色谱峰处出现肩峰；a柱与d柱相比，53～63min出峰较多。图25中，280nm波长条件下，c柱分离效果较好，其次是a、b柱，e柱和f柱出峰不均匀，且分离度不好。结合203nm和280nm下两种波长下的分离效果和出峰情况，SHISEIDO CAPCELL PAK C18(4.6×250mm，5μm)对峰的分离度较好，基线较为平稳，且出峰较多，优于其它的五根柱子，故选择该色谱柱进行指纹图谱研究。
(5)流速考察
按照实施例1和实施例2的构建方法，分别考察不同流速对色谱图的影响，考察过程中仅改变流速，分别在流速为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min时进行测定，实验结果如图26和图27，图26和图27中，自上到下依次为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min，可以看出，总体来说两种检测波长条件下的三种流速的出峰基本相似，但流速为0.8mL/min时，色谱图时间过长，均需延长时间以确保结束前5min无色谱峰。流速为1.2mL/min和1.0mL/min时，分离效果差别不大，综合柱压等因素，以1.0mL/min为最佳流速。
(6)柱温考察
按照实施例1和实施例2的构建方法，分别考察不同温度(20℃、25℃、30℃)对色谱图的影响，考察过程中仅改变柱温温度，分别在柱温为20℃、25℃、30℃时进行测定，实验结果如图28和图29，图28和图29中，自上到下依次为20℃、25℃、30℃，可以看出，柱温为30℃时分离效果较差，在203nm所出的色谱图中在保留时间34～53min处均出现两处色谱峰重叠；在280nm波长下，柱温20℃时保留时间有所延长，25℃时次之，30℃时最短。因此，柱温为25℃时为最佳柱温。
显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
1)供试品溶液和对照品溶液的配制
取丁香柿蒂散制备供试品溶液；
取丁香酚、没食子酸和6-姜辣素制备对照品溶液；
2)分别取供试品溶液和对照品溶液进行高效液相色谱检测，得所述丁香柿蒂散指纹图谱；
所述高效液相色谱检测的流动相A为乙腈、流动相B为浓度为0.02wt％的磷酸水溶液。
2.根据权利要求1所述的丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的洗脱方式为梯度洗脱；
所述梯度洗脱的洗脱条件为：
0～5min，3％流动相A，97％流动相B；
5～15min，3％→10％流动相A，97％→90％流动相B；
15～30min，10％→13％流动相A，90％→87％流动相B；
30～50min，13％→23％流动相A，87％→77％流动相B；
50～70min，23％→55％流动相A，77％→45％流动相B；
70～75min，55％→98％流动相A，45％→2％流动相B；
75～95min，98％流动相A，2％流动相B。
3.根据权利要求1或2所述的丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的检测波长为203nm或280nm。
4.根据权利要求1或2所述的丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
5.根据权利要求1或2所述的丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的柱温为20～28℃。
6.根据权利要求1或2所述的丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液是取丁香柿蒂散加至甲醇水溶液中，经超声提取、定容、过滤制得；
所述对照品溶液是取丁香酚、没食子酸和6-姜辣素加至甲醇溶解，定容制得。
7.根据权利要求1或2所述的丁香柿蒂散指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤1)中，所述丁香柿蒂散与供试品溶液的重量体积比为8mg：1mL。
8.利用权利要求1-7中任一项所述的构建方法获得的丁香柿蒂散的标准指纹图谱，其特征在于，所得标准指纹图谱为203nm波长条件下的标准指纹图谱，包括38个共有特征峰，以4号峰没食子酸为参照峰，其共有特征峰的相对保留时间分别为：
1号峰：0.354～0.364，2号峰：0.392～0.414，3号峰：0.565～0.574，4号峰：1.000，5号峰：1.542～1.577，6号峰：1.650～1.690，7号峰：1.796～1.842，8号峰：1.847～1.890，9号峰：1.902～1.952，10号峰：2.028～2.081，11号峰：2.112～2.169，12号峰：2.193～2.252，13号峰：2.301～2.448，14号峰：2.414～2.524，15号峰：2.491～2.596，16号峰：2.560～2.677，17号峰：2.637～2.868，18号峰：2.826～3.148，19号峰：3.099～3.485，20号峰：3.434～3.549，21号峰：3.495～3.792，22号峰：3.732～3.975，23号峰：3.975～4.252，24号峰：4.183～4.447，25号峰：4.375～4.502，26号峰：4.523～4.649，27号峰：4.687～4.873，28号峰：4.796～5.030，29号峰：4.947～5.088，30号峰：5.006～5.190，31号峰：5.272～5.537，32号峰：5.587～5.826，33号峰：5.689～5.852，34号峰：6.120～6.504，35号峰：6.391～6.776，36号峰：6.659～7.023，37号峰：6.900～7.220，38号峰：7.094～7.380。
9.利用权利要求1-7中任一项所述的构建方法获得的丁香柿蒂散的标准指纹图谱，其特征在于，所得标准指纹图谱为280nm波长条件下的标准指纹图谱，包括27个共有特征峰，以1号峰没食子酸为参照峰，其共有特征峰的相对保留时间分别为：
1号峰：10.677～11.025，2号峰：12.316～12.662，3号峰：14.501～14.731，4号峰：16.875～17.031，5号峰：20.937～21.042，6号峰：22.295～22.408，7号峰：24.13～24.282，8号峰：26.196～26.393，9号峰：27.815～27.999，10号峰：28.673～28.866，11号峰：30.727～30.925，12号峰：33.696～33.926，13号峰：37.341～37.547，14号峰：38.039～38.2，15号峰：40.637～40.781，16号峰：42.596～42.737，17号峰：45.582～45.717，18号峰：47.674～47.834，19号峰：48.257～48.411，20号峰：49.834～49.994，21号峰：54.531～54.682，22号峰：55.629～55.771，23号峰：60.575～60.656，24号峰：62.213～62.299，25号峰：62.725～62.806，26号峰：69.704～69.799，27号峰：75.273～75.32；所述280nm波长条件下的标准指纹图谱中1号峰为没食子酸、26号峰为丁香酚。
10.权利要求8或9所述的标准指纹图谱在丁香柿蒂散的研究/开发/生产/临床应用全过程质量评价或控制中的应用。
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