CN114107323A - KIbB1基因在植物抗逆性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了KIbB1基因在植物抗逆性中的应用，属于生物技术领域。本发明所述KIbB1基因的核酸序列如SEQ ID No.1所示。将KIbB1基因构建到植物表达载体中，并转化拟南芥，能够显著提高拟南芥的耐低钾胁迫、耐高盐胁迫和耐干旱胁迫的性质，因而KIbB1基因在提高植物抗逆性领域具有较好的应用前景。

Description

KIbB1基因在植物抗逆性中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种KIbB1基因在植物抗逆性中的应用。
背景技术
生物在自然环境中经常要面对各种不利条件(如干旱、高盐、低温、低钾等)胁迫；这些不利条件能够抑制生物的生长，甚至导致生物体死亡。随着环境的不断恶化，高盐等逆境胁迫已经成为世界性的问题，培育具有多种抗逆性的生物新品种已成为广大育种家研究的主要目标之一。
当前发展迅速的基因工程技术为生物遗传改良提供了新的途径，利用在盐胁迫应答中起重要作用的基因进行遗传转化是获得耐盐新种质的重要手段。
发明内容
本发明的目的在于提供KIbB1基因在植物抗逆性中的应用。
为了达到上述目的，采用如下技术方案：
KIbB1基因在植物抗逆性中的应用，所述KIbB1基因的核酸序列如SEQ ID No.1所示。
在一个具体的实施例中，所述的抗逆性为耐低钾胁迫、耐高盐胁迫、耐干旱胁迫中的至少一种。
在一个具体的实施例中，所述的植物为甘薯或拟南芥。
一种提高植物抗逆性的表达载体，所述表达载体携带有如SEQ ID No.1所示的KIbB1基因的核酸序列；在一个具体的实施例中，所述的抗逆性为耐低钾胁迫、耐高盐胁迫、耐干旱胁迫中的至少一种。
一种提高植物抗逆性的重组菌，所述的重组菌转化有上述的表达载体。
一种提高植物抗逆性的方法，是将携带KIbB1基因的表达载体转化到植物中，使其在植物中过表达KIbB1基因；所述的KIbB1基因的核酸序列如SEQ ID No.1所示。在一个具体的实施例中，所述的抗逆性为耐低钾胁迫、耐高盐胁迫、耐干旱胁迫中的至少一种。在一个具体的实施例中，所述的植物为甘薯或拟南芥。
本发明技术方案的优点：
1、本发明从甘薯中克隆到一条抗逆性基因，测序结果表明该基因编码序列包含990个核苷酸，其编码的蛋白质包含329个氨基酸，将其命名为KIbB1。
2、构建KIbB1基因的植物表达载体，并转化拟南芥；结果表明：转入KIbB1基因的拟南芥植株形态发育正常，转KIbB1基因拟南芥苗至少可以抗50μM K+的低钾胁迫或125mMNaCl的高盐胁迫或300mM的甘露醇胁迫；KIbB1基因在拟南芥中表达可显著提高其耐低钾、耐高盐性和耐干旱性。
附图说明
图1 KIbB1基因在甘薯低钾胁迫处理后的相对表达情况；
图2过表达KIbB1基因的拟南芥的耐低钾性测定；
图3过表达KIbB1基因的拟南芥的耐高盐性和耐干旱性测定；
图4过表达KIbB1基因的拟南芥耐低钾性与耐盐性机理。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
KIbB1基因的克隆
以甘薯(商薯19号)的RNA反转录获得的cDNA为模板，以P1和P2为引物进行扩增；反应体系为50μL；反应条件为95℃、5min；95℃、50s，55℃、50s，72℃、1min，40个循环；72℃、10min。
克隆获得KIbB1基因的核酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因编码序列包含990个核苷酸。
SEQ ID No.1：
Figure BDA0003420604920000021
Figure BDA0003420604920000031
P1：5'-ATGCAGATGCAGTACAAGAATC-3'(SEQ ID No.2)；
P2：5'-CTAGCGATAAGAATCTGGGC-3'(SEQ ID No.3)。
实施例2
KIbB1在甘薯低钾胁迫处理后的表达情况分析
(1)用包含0mM或20mM K+的霍格兰溶液处理“商薯19号”和“渝紫7号”幼苗，甘薯品种“商薯19号”(耐低钾型)和“渝紫7号”(低钾敏感型)为国内甘薯广泛品种；其中，浓度为0mM K+的霍格兰溶液为低钾胁迫处理组，浓度为20mM K+的霍格兰溶液为正常钾处理组，处理方式为浸泡幼苗根部；在处理后0h、6h、12h、24h、48h分别取幼苗地上部和地下部，立即在液氮中冷冻处理后备用。取不同时间段胁迫处理的“商薯19号”和“渝紫 7号”的地上部和地下部各0.1g，液氮速冻并研磨成粉末状，用RNA提取试剂盒提取RNA。抽提后的总RNA用DNaseI处理，进行纯化，并进行反转录获得cDNA。
(2)将上述处理后的各个样品的cDNA作为模板，在QuantStudio 3型荧光定量PCR仪上进行反应，以测定KIbB1基因在不同时间段不同处理下的表达情况。20μL反应体系包括： 10μL 2×SybrGreen qPCR Master Mix，20μmol/L正反向引物各0.25μL，20ng反转录产物。扩增程序为：先94℃预变性2min；接着进入40个循环反应，每个循环中94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s；循环结束后，缓慢升至94℃，制备熔解曲线。每个反应设3个复孔。结果如图1。
KIbB1基因定量PCR引物为：
P3：5'-ACCCGATAGTAGGTTTGCAC-3'(SEQ ID No.4)；
P4：5'-AATCTGGGCGCTTTGG-3'(SEQ ID No.5)。
内标基因Actin引物序列为：
P5：5'-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC-3'(SEQ ID No.6)；
P6：5'-TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC-3'(SEQ ID No.7)。
由图1可知，KIbB1基因在低钾胁迫处理前后的相对表达量在耐低钾品种中显著高于低钾敏感型品种，表明其表达与低钾胁迫抗性相关。
实施例3
过表达KIbB1基因的拟南芥的获得
根癌农杆菌菌株GV3101购自上海唯地生物技术有限公司；
转基因的受体材料为拟南芥哥伦比亚野生型品种由青岛农业大学甘薯研究中心提供。
1、KIbB1基因植物表达载体的构建
以甘薯品种“商薯19号”的cDNA为模板，在扩增时分别在上下游引物中加入SacI和XbaI酶切位点，所采用的引物为P7和P8。
P7：5'-CGAGCTCATGCAGATGCAGTACAAGAATC-3'(SEQ ID No.8)；
P8：5'-GCTCTAGACTAGCGATAAGAATCTGGGC-3'(SEQ ID No.9)
通过PCR和上述引物扩增了两端分别携带SacI和XbaI酶切位点的KIbB1基因的编码区，回收PCR产物，并在T4 DNA连接酶作用下与克隆载体pMD18-T(购买于TaKaRa)进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α获得了抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用SacI和XbaI进行双酶切，回收含KIbB1基因编码序列的酶切片段，并克隆到植物表达载体Super1300的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体Super1300-KIbB1。
2、表达载体转化拟南芥
(1)农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备：将Super1300-KIbB1重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株GV3101感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到LB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)液体培养基中，28℃、180rpm 培养至OD600＝0.5～0.8时，取2mL菌液转移到50mL LB(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L) 培养基中，培养到OD600＝0.6～0.8。将菌液于5000rpm离心15min后，用相同体积的液体1/2MS(0.02％silwet L-77)悬浮备用。
(2)拟南芥的种植：将拟南芥种子在1％NaClO中浸泡5min，无菌水冲洗4-6次。点种到基质土上。
(3)农杆菌介导的遗传转化：选取初果期健壮的拟南芥植株，带盆钵一起倒扣于盛有步骤(1)制备的农杆菌悬浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时，保持一定的湿度(相对湿度60％)。24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条件下使其正常生长，收获种子。
3、转基因植株的PCR检测
将收获的转基因拟南芥种子接种到20mL MS(潮霉素30mg/L)培养基中，22℃培养1w 左右，选取鲜绿健壮的拟南芥幼苗，移植于基质土。提取转基因植株的基因组DNA，利用上述载体序列设计引物进行PCR扩增。PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、50s，55℃、50s， 72℃、1min，32个循环；72℃、10min。鉴定正确的即为过表达KIbB1基因的拟南芥。
转基因植株鉴定引物为
P9：5'-GGTCGCGGAGGCTATGGATGC-3'(SEQ ID No.10)；
P10：5'-GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT-3'(SEQ ID No.11)。
对PCR鉴定为阳性的T1代植株收获种子，收获的转基因拟南芥种子接种到20mL MS(潮霉素30mg/L)培养基上，每个株系中阳性植株与阴性植株的比例约为3:1。选取能够正常在筛选培养基上健壮生长拟南芥幼苗，移植于基质土并单株收获种子，获得T2代转基因植株。单株收获的转基因拟南芥种子接种到20mL MS(潮霉素30mg/L)培养基上，选取全部种子均能在筛选培养基上发芽生长的转基因植株为纯合株系，移植于基质土并单株收获种子，获得纯合T3代转基因植。
实施例4
过表达KIbB1基因的拟南芥的耐低钾性测定
将实施例3方法获得的过表达KIbB1基因的拟南芥与哥伦比亚野生型拟南芥种子接种于 1/2MS培养基发芽，1w后将幼苗转移至含50μM K+或10mM K+的1/2MS培养基。22℃倒置培养10天左右，观察幼苗的生长情况。
结果如图2所示：在正常钾(10mM K+，CK)条件下，过表达KIbB1基因的拟南芥幼苗(OE1，OE2)和哥伦比亚野生型拟南芥幼苗(WT)均能正常生根，在低钾(50μM K+，LK) 条件下，过表达KIbB1基因的拟南芥幼苗(OE1，OE2)和哥伦比亚野生型拟南芥幼苗(WT) 生根均受到抑制，但是过表达KIbB1基因的拟南芥幼苗(OE1，OE2)的新生根数目和长度均显著优于哥伦比亚野生型拟南芥幼苗(WT)，所以过表达KIbB1基因的拟南芥幼苗至少能抗50μM K+低钾胁迫。
实施例5
过表达KIbB1基因的拟南芥的耐高盐性和耐干旱性测定
将实施例3方法获得的过表达KIbB1基因的拟南芥与哥伦比亚野生型拟南芥种子接种于 1/2MS培养基发芽，1周后将幼苗转移至含125mM NaCl(模拟高盐胁迫)或300mM甘露醇 (模拟干旱胁迫)的1/2MS培养基。22℃培养2周左右，观察幼苗的生长情况。
结果如图3所示，在高盐或者干旱胁迫条件下过表达KIbB1基因的拟南芥幼苗(OE1， OE2)生长及生根情况显著优于哥伦比亚野生型拟南芥幼苗(WT)，所以过表达KIbB1基因的拟南芥幼苗的抗盐浓度为125mM或以上，抗旱浓度为300mM甘露醇或以上。
实施例6
过表达KIbB1基因的拟南芥耐低钾性与耐盐性机理
以实施例4低钾胁迫方法处理的过表达KIbB1基因的拟南芥幼苗和以实施例5高盐胁迫方法处理的过表达KIbB1基因的拟南芥幼苗为材料，测定不同处理条件下过表达KIbB1基因的拟南芥和哥伦比亚野生型拟南芥的钠钾离子的含量。按照地上部和地下部分别取不同处理条件下的过表达KIbB1基因的拟南芥和哥伦比亚野生型拟南芥植株，106℃鼓风干燥机烘干至无水分。加入10mL HNO3(优级纯)和2mL HCIO4(优级纯)，静置过夜。次日在控温电热板上消解，逐渐加热至保持微沸状态，加热至棕色气体消失并有白烟冒出。样品溶液呈浅黄色或无色透明液体时，加热剩至1mL溶液为止。取下后加入10mL去离子水，再放入消解仪中加热赶酸，微沸15分钟左右。将试样溶液无损失转移到25mL(依据称样量决定定容体积)容量瓶中，用去离子水少量多次润洗三角瓶，倒入容量瓶中，冷却定容，利用电感耦合等离子体发射光谱仪测定样品中的钾离子和钠离子含量，根据样品质量计算浓度。
测定结果如图4所示：在低钾或高盐条件下，过表达KIbB1基因的拟南芥(OE1，OE2)的钾离子含量显著高于哥伦比亚野生型拟南芥(WT)，钠离子含量显著低于哥伦比亚野生型拟南芥(WT)，相应过表达KIbB1基因的拟南芥(OE1，OE2)的钾钠比显著高于哥伦比亚野生型拟南芥(WT)。对地上部钾和地下部钾的测定结果显示，在低钾条件下过表达KIbB1 基因的拟南芥(OE1，OE2)地上部与地下部钾的比值显著高于哥伦比亚野生型拟南芥(WT)，但是在高盐条件下过表达KIbB1基因的拟南芥(OE1，OE2)地上部与地下部钾的比值与哥伦比亚野生型拟南芥(WT)基本相似。以上结果表明过表达KIbB1基因的拟南芥通过吸钾排钠及促进钾离子从地下部向地上部的运输提高植物对低钾胁迫的抗性，通过吸钾排钠提高植物的耐盐性。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> KIbB1基因在植物抗逆性中的应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 990
<212> DNA
<213> 甘薯(Dioscorea esculenta Lour. Burkill)
<400> 1
atgcagatgc agtacaagaa tctgggcaga tccgggctga aagtgtccca gctctcattc 60
ggcgcctggg tcacattcgg caaccagctc gacgtgaagg aagccaagtc catcctgcag 120
tgctgccgcg accacggcgt gaatttcttc gacaacgccg aggtgtacgc gaatggccgc 180
gccgaggaga tcatggggca ggccatccgg gagctgggat ggaagcgctc cgacatcgtc 240
atctccacca agatcttctg gggcgggccg gggcccaatg acaagggttt gtcccggaaa 300
cacatcgtgg agggcaccaa ggcgtcgctc aagaggctgg atatggatta tgtggacttg 360
atctactgtc accgccccga taccagtact ccgattgagg agacggttag ggctatgaac 420
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atcactgagg cgtggagtgt ggctcagcga ttggatctcg ttggaccgat tgttgagcag 540
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<210> 2
<211> 22
<212> DNA
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<400> 2
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<211> 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgagctcatg cagatgcagt acaagaatc 29
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctctagact agcgataaga atctgggc 28
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtcgcggag gctatggatg c 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcttctgcgg gcgatttgtg t 21

Claims (9)

1.KIbB1基因在植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述KIbB1基因的核酸序列如SEQID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗逆性为耐低钾胁迫、耐高盐胁迫、耐干旱胁迫中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的植物为甘薯或拟南芥。
4.一种提高植物抗逆性的表达载体，其特征在于，所述表达载体携带有如SEQ ID No.1所示的KIbB1基因的核酸序列。
5.根据权利要求4所述提高植物抗逆性的表达载体，其特征在于，所述的抗逆性为耐低钾胁迫、耐高盐胁迫、耐干旱胁迫中的至少一种。
6.一种提高植物抗逆性的重组菌，其特征在于，所述的重组菌转化有权利要求4所述的表达载体。
7.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，将携带KIbB1基因的表达载体转化到植物中，使其在植物中过表达KIbB1基因；所述的KIbB1基因的核酸序列如SEQ ID No.1所示。
8.根据权利要求7所述提高植物抗逆性的方法，其特征在于，所述的抗逆性为耐低钾胁迫、耐高盐胁迫、耐干旱胁迫中的至少一种。
9.根据权利要求7或8所述提高植物抗逆性的方法，其特征在于，所述的植物为甘薯或拟南芥。
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