CN114099763A - 一种钙离子交换多孔淀粉止血材料及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种钙离子交换多孔淀粉止血材料及其应用。本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料由淀粉经糊化、乳化、致孔、交联和钙离子交换制备得到，其原料包括：淀粉、油相、致孔剂、乳化剂、氯化钙、交联剂和余量水。该止血材料经乙醇碱法致孔以增大其比表面积，交联反应以增加其结构稳定性，反相微乳液法技术以控制其粒径分布，表面以钙离子修饰，从而增强其止血性能、降解性能和生物相容性。本发明提供的钙离子交换多孔淀粉止血材料主要原料来源丰富、安全性好、无残留，可广泛用于体内实质性脏器及弥漫性出血等不规则出血的止血应用，止血后不需清创，止血效果可延续至术后，术后可在人体降解吸收。

Description

一种钙离子交换多孔淀粉止血材料及其应用

本申请是2019年1月8日提交到中华人民共和国国家知识产权局的发明名称为“一种钙离子交换多孔淀粉止血材料及其制备方法和应用”、申请号为“201910015590.8”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，特别是涉及一种钙离子交换多孔淀粉止血材料及其应用。

背景技术

虽然近几年手术中的止血技术在不断提高，但是对于凝血功能障碍患者的术中及术后实质性脏器的不规则出血以及其他弥漫性出血情况，现有的止血技术和止血材料仍存在不足。一些可吸收的止血材料的出现，如纤维蛋白胶类、氧化再生纤维素类和微孔多聚糖类的可吸收止血材料虽然解决了部分上述难题，但还存在如下缺陷：

纤维蛋白胶类可吸收止血材料，来源于动物或人体的血浆，虽然在一些凝血功能障碍患者的肝肾损伤模型中有良好的止血效果，但是价格昂贵，存在异体排斥、免疫原性等问题(Fukushima et al.,2018)。

氧化再生纤维素类可吸收止血材料，是对纤维素的羟基进行选择性氧化制备而成。虽然市面上现如今有多种不同类型的氧化再生纤维素类的可吸收止血材料，但是其在体内降解吸收效果仍不够理想(Fukuzumi et al.,2011；Hutchinson et al.,2013)。

微孔多聚糖类可吸收止血材料，如美国已上市的Arista AH可吸收止血颗粒和国内已上市的欣速聆可吸收止血颗粒，不含有任何动物源或人源性的成分，可避免过敏风险。此外，Arista AH颗粒吸液溶胀，且溶胀迅速，吸收血液中水分后，血液中的固体成分得到浓缩，出血点附近凝血因子的浓度提高，凝血级联反应激活而达到止血目的。由于Arista AH的主要成分为淀粉，在体内可被淀粉酶降解，7-14天即可被完全吸收。因此，Arista AH已逐步成为国内外术中必备的新型可吸收止血材料之一。但Arista AH在具有凝血功能障碍小型猪肝损伤模型中，单纯依靠其通过吸收血液中的水分和自身溶胀的物理性止血，无化学性止血机制(Murat et al.,2006)，所以在较大动静脉出血及具有凝血功能障碍患者出血的止血上效果不佳。

多孔淀粉止血材料是微孔多聚糖类的一种，以淀粉为原料，经物理、化学或酶解等成孔法制备而成的、颗粒表面及内部具有多孔结构的可吸收止血材料。淀粉止血材料发挥止血效果的关键就在于其表面具有多孔结构，多孔结构发挥以下作用：一、可提高止血材料与水分子的接触面积，提高其吸液速率；二、有利于小分子物质吸附于止血材料表面，加快凝血级联反应；三、加快止血材料在人体体内被淀粉酶降解的速率，使其被快速降解吸收，从而提高了止血材料的生物相容性。

因此，淀粉类止血材料的止血效果很大程度上受其表面多孔结构形态的影响，多孔结构的形态则取决于成孔方法及其参数条件等。目前，淀粉止血材料的成孔方法主要有物理成孔法、化学成孔法和酶解成孔法；其中，物理成孔法制备的多孔淀粉对设备依赖性大，成本高。化学成孔法制备的多孔淀粉存在孔较脆弱，颗粒均匀度不够等问题。酶解成孔法制备的多孔淀粉存在反应时间长，成本高，反应条件苛刻而且难分离等缺点。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种止血效果好、体内降解吸收快的钙离子交换多孔淀粉止血材料，由淀粉经糊化、乳化、致孔、交联和钙离子交换制备得到，其原料按质量百分含量包括：

所述糊化淀粉液的乳化、致孔和交联是向乳化剂溶液中加入糊化淀粉溶液，搅拌进行乳化，乳化后加入致孔剂搅拌进行致孔，然后加入交联剂进行交联；交联剂为环氧氯丙烷；

优选的，所述乳化时的搅拌转速为200-1000rpm。

所述乳化剂溶液是由乳化剂和油相混合制得。

所述乳化剂的体积占油相体积的0.1-1.5％，优选0.5-1.0％。

所述乳化剂溶液与糊化后的糊化淀粉溶液的体积比为(0.5-8)：1，优选(1-4)：1。

所述致孔剂选自聚乙二醇、乙醇、甲醇等中的一种或几种。

所述淀粉选自马铃薯淀粉、甘薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、绿豆淀粉、菱角淀粉、藕淀粉、小麦淀粉等中的一种或几种；和/或

所述油相选自环己烷-氯仿混合物、液体石蜡、大豆油等中的一种或几种；和/或

所述乳化剂选自司班80、司班60、吐温20等中的一种或几种。

其制备方法包括淀粉的糊化；糊化淀粉溶液的乳化、致孔和交联；交联完成后还包括钙离子交换，所述钙离子交换是向交联后的反应液中加入饱和氯化钙溶液，过滤所得固体即为所述钙离子交换多孔淀粉止血材料；优选的，所述致孔时的搅拌转速为200rpm-1000rpm，搅拌时间为5-20min。

所述糊化淀粉液的乳化、致孔和交联具体为：将乳化剂加入油相中，搅拌至乳化剂与油相混匀，得到乳化剂溶液；加热乳化剂溶剂至40-60℃后，将糊化淀粉溶液加入乳化剂溶液中，200-1000rpm下进入乳化，然后加入致孔剂，200rpm-1000rpm搅拌5-20min后，加入交联剂进行交联反应2-8h。

所述淀粉的糊化具体为：向淀粉中加入水，配制得到淀粉浓度为2wt％-10wt％的淀粉水溶液，在50-300rpm、45-65℃下加热1-10min，然后冷却至20-30℃，冷却后调节pH至9.0-11.0，得到糊化淀粉溶液。

第二方面，本发明提供上述钙离子交换多孔淀粉止血材料在制备用于复杂伤口出血和/或凝血功能障碍患者出血的止血剂中的应用；优选的，所述复杂伤口出血为体内实质性脏器出血、或弥散性毛细血管出血、或炎症及脆弱组织出血等；或

优选的，所述钙离子交换多孔淀粉止血材料的粒径为50-1500μm，每100mg的所述止血材料30s内的吸水体积为0.2-1.2ml(优选0.5-1.2ml)，钙离子含量为0.1-15mg/g。

本发明提供的钙离子交换多孔淀粉止血材料是一种可应用于术中实质性脏器等复杂伤口出血的止血剂，或战时、民用紧急时刻较大动静脉出血的止血剂。本发明止血材料的主要原料为淀粉，来源丰富、安全无毒，经乙醇碱法、反相微乳液法、交联反应和钙离子交换等步骤处理，表面布满颗粒、内部粗糙多孔，显著增加止血材料的比表面积，增大了水分子与止血材料的接触面积，有利于止血材料吸附水分子，从而显著增加了止血材料吸附水分子的能力；本发明的止血材料内部具有孔洞结构，有利于水分子在止血材料内部的转移，从而增强了止血材料转移血液中水分子的能力，通过这两个方面的共同作用，提高了其快速吸液性能，浓缩了血液中的凝血成分，加快凝血进程，进行有效的物理性止血。与此同时，本发明的止血材料由于表面多孔，可增大与淀粉酶的吸附能力，从而有利于其在体内与淀粉酶等淀粉降解酶的接触，有效促进其在体内的快速降解。钙离子是唯一的无机凝血因子，可以促进内外源凝血系统，促进纤维蛋白的形成，由本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料释放进入血液，可显著促进内外源凝血级联反应、血小板粘附等凝血进程，利用化学性止血机制进行止血。使用本发明止血材料止血效果可延续至术后，术后可在人体降解吸收，止血后不需清创，既避免了对伤口的二次伤害，又防止清创后，伤口再次出血。

本发明提供的钙离子交换多孔淀粉止血材料生物相容性好、无细胞毒性、无致敏反应和急性毒性，比表面积大、吸液速率快、溶胀迅速，是一种止血效果优、安全性好的淀粉类止血材料。本发明采用乙醇碱法制备多孔淀粉类止血材料，能够得到具有颗粒表面和多孔状结构的淀粉微粒，制备过程中的后处理简单，经乙酸乙酯及无水乙醇洗涤后过滤干燥即可，得到的止血材料纯度高，不含杂质。

附图说明

图1所示为本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料的外观图；

图2所示为实施例1和实施例7的钙离子交换多孔淀粉止血材料的金属离子含量柱状图；

图3所示为实施例7的钙离子交换多孔淀粉止血材料的PBS吸液速率曲线图；

图4所示为实施例7的钙离子交换多孔淀粉止血材料的粒径分布图；

图5所示为本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料的微观结构图；

图6所示为实施例1和实施例7的钙离子交换多孔淀粉止血材料的体外全血凝固动力学曲线图；

图7所示为实施例7的钙离子交换多孔淀粉止血材料的细胞毒性柱状图；

图8所示为实施例7的钙离子交换多孔淀粉止血材料用于小鼠断尾止血量柱状图和止血效果照片。

具体实施方式

本发明提供的钙离子交换多孔淀粉止血材料，其原料按质量百分含量包括：

淀粉0.2wt％-6.5wt％；

油相15wt％-87wt％；

致孔剂0.2wt％-45wt％；

乳化剂0.01wt％-7.6wt％；

氯化钙0.01wt％-2wt％；

交联剂0.01wt％-3wt％；

水余量；

其中，淀粉可选自马铃薯淀粉、甘薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、绿豆淀粉、菱角淀粉、藕淀粉、小麦淀粉等中的一种或几种；油相可选自环己烷-氯仿混合物、液体石蜡、大豆油等中的一种或几种；乳化剂可选自司班80、司班60、吐温20等中的一种或几种；致孔剂可选自聚乙二醇、乙醇、甲醇等中的一种或几种。

本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料在组成选择和各原料含量上进行了大量实验的筛选，最终得到以上配方，使得制备出的止血材料既能形成合适粒径分布范围和粒径大小的淀粉颗粒，又保证了其具有快速的吸液性能。在筛选实验过程中，发明人发现：

所制备的钙离子交换多孔淀粉止血材料中，油相质量百分比若低于15％，则无法形成合适粒径大小和粒径分布范围的钙离子交换多孔淀粉止血材料微粒，油相质量百分比若高于87％，钙离子交换多孔交联淀粉止血材料吸液速率低，无法实现快速止血。

本发明还提供了制备上述钙离子交换多孔淀粉止血材料的方法，具体包括以下步骤：

1)糊化：向淀粉中加入水，配制得到淀粉浓度为2wt％-10wt％的淀粉水溶液，以50-300rpm转速进行机械搅拌，置于45-65℃温度下的水浴锅中加热1-10min，然后冷却至20-30℃，冷却后边搅拌边使用NaOH溶液调节pH至9.0-11.0，得到糊化淀粉溶液。

2)乳化、致孔和交联：将乳化剂加入油相中，机械搅拌2-20min至乳化剂与油相混匀，得到乳化剂溶液，将乳化剂溶剂放入水浴加热至40-60℃，将步骤1)得到的糊化淀粉溶液缓慢加入至乳化剂溶液中，在200-1000rpm的转速下进行乳化，待糊化淀粉溶液和乳化剂溶液乳化后再加入致孔剂，以200rpm-1000rpm转速机械搅拌5-20min后，加入交联剂，继续机械搅拌进行交联反应2-8h。其中，乳化剂体积为油相体积的0.1-1.5％，乳化剂溶液与糊化淀粉溶液的体积比为(0.5-8):1。

3)钙离子交换：交联反应结束后，40℃水浴，机械搅拌下向步骤2)的反应液中逐滴加入饱和氯化钙溶液，反应0.5-4h后过滤，将沉淀用乙酸乙酯和无水乙醇分别洗涤3次过滤得到白色颗粒，60℃烘箱烘干8h，得到白色粉末，见图1所示，即是本发明的钙离子交换多孔淀粉止血材料，Co⁶⁰灭菌，密封保存备用。

该钙离子交换多孔淀粉止血材料的粒径为50-1500μm，在扫描电子显微镜下观察可见本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料呈颗粒状，颗粒表面粗糙、崎岖不平，颗粒表面及内部粗糙多孔，有大小不一的多孔结构，显著增加了止血材料的比表面积，见图5，每100mg该止血材料30s内的吸水体积为0.2-1.2ml，钙离子含量为0.1-15mg/g。

本发明的制备方法是经过大量实验筛选出来的，在制备多孔淀粉类止血材料的过程中，首次将乙醇碱法、反相微乳液法和交联反应联用，利用乙醇碱法制备出表面粗糙多孔的淀粉类止血材料，利用反相微乳液法控制淀粉类止血材料的颗粒粒径大小和粒径分布范围；其次，当本发明选用乙醇作为致孔剂时，其加入量至关重要，加入量过少颗粒表面多孔结构少、粗糙度低、比表面积小，只有在本发明范围内时，得到的淀粉颗粒表面粗糙程度达到峰值，吸液速率也达到峰值；最后，本发明首次将钙离子交换至多孔淀粉中，除了发挥淀粉的物理性止血，同时还可以发挥钙离子的化学性止血，形成牢固的血凝块，更好地发挥止血效果。不仅如此，该制备方法的生产成本低。

其中，乙醇碱法致孔的原理为：淀粉在碱性环境中糊化，随着淀粉逐渐吸水溶胀，结晶结构被破坏，同时碱性环境使得淀粉分子链中羟基失去氢原子而带负电。带负电的淀粉分子链间相互排斥，更进一步促进淀粉分子的溶胀。糊化后的淀粉中加入致孔剂乙醇后，由于淀粉在无水乙醇中不溶，在致孔阶段，无水乙醇的瞬间加入，使得淀粉分子迅速析出。在这种瞬时的溶胀与析出作用下，淀粉颗粒表面出现凹凸不平的多孔状结构。

反相微乳液法是在超声或机械搅拌情况下，油相与水相在乳化剂作用下，形成油包水的小液滴的方法。反相指的是形成的液滴为油包水型，与水包油型对应。对本发明来说，糊化淀粉溶液为水相，油相在乳化剂的作用下将糊化淀粉溶液包裹成油包水型的小液滴。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

实施例1

1)糊化：取10g玉米淀粉加入500g水中得到浓度为2wt％的淀粉水溶液，在50rpm转速机械搅拌、45℃下加热1min后，冷却至20℃，加入NaOH溶液调节淀粉水溶液的pH至9.0，得到糊化淀粉溶液。

2)乳化、致孔和交联：取3g乳化剂Span80(司班80)加入至250ml液体石蜡中，搅拌10min至两者混合均匀后，加热至45℃，然后缓慢加入500mL步骤1)得到的糊化淀粉溶液，在500rpm的转速下进行乳化，待糊化淀粉溶液和乳化剂溶液乳化后再加入10ml无水乙醇，以500rpm转速机械搅拌15min后，加入0.5mL环氧氯丙烷，搅拌2h发生交联反应。

3)钙离子交换：交联反应结束后，40℃机械搅拌下，逐滴加入饱和氯化钙溶液0.2mL，反应2.5h，反应结束后，使用乙酸乙酯和无水乙醇分别抽提3次，60℃烘箱烘干8h，得到白色颗粒状的本发明止血材料，Co⁶⁰灭菌，密封保存备用。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围50-200μm，100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为0.5mL，钙离子含量：0.1-1mg/g。

实施例2

1)糊化：取2g马铃薯淀粉加入100g水中得到浓度为2wt％的淀粉水溶液，在100rpm转速机械搅拌、65℃下加热5min后，冷却至30℃，加入NaOH溶液调节淀粉水溶液的pH至9.0，得到糊化淀粉溶液。

2)乳化、致孔和交联：取1.6g乳化剂Span60(司班60)加入至200ml大豆油中，搅拌5min至两者混合均匀后，加热至50℃，然后缓慢加入100mL步骤1)得到的糊化淀粉溶液，在1000rpm的转速下进行乳化，待糊化淀粉溶液和乳化剂溶液乳化后再加入50ml聚乙二醇，以1000rpm转速机械搅拌20min后，加入0.5mL环氧氯丙烷，搅拌4h发生交联反应。

3)钙离子交换：交联反应结束后，40℃机械搅拌下，逐滴加入饱和氯化钙溶液10mL，反应2h，反应结束后，使用乙酸乙酯和无水乙醇分别抽提3次，60℃烘箱烘干8h，得到白色颗粒状的本发明止血材料，Co⁶⁰灭菌，密封保存备用。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围50-500μm，100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为0.7mL，钙离子含量：1-10mg/g。

实施例3

1)糊化：取10g甘薯淀粉加入200g水中得到浓度为5wt％的淀粉水溶液，在150rpm转速机械搅拌、60℃下加热3min后，冷却至30℃，加入NaOH溶液调节淀粉水溶液的pH至10.0，得到糊化淀粉溶液。

2)乳化、致孔和交联：取12g乳化剂Span60加入至800ml大豆油中，搅拌15min至两者混合均匀后，加热至60℃，然后缓慢加入200mL步骤1)得到的糊化淀粉溶液，在600rpm的转速下进行乳化，待糊化淀粉溶液和乳化剂溶液乳化后再加入200ml甲醇，以600rpm转速机械搅拌15min后，加入8.0mL环氧氯丙烷，搅拌8h发生交联反应。

3)钙离子交换：交联反应结束后，40℃机械搅拌下，逐滴加入饱和氯化钙溶液0.2mL，反应4h，反应结束后，使用乙酸乙酯和无水乙醇分别抽提3次，60℃烘箱烘干8h，得到白色颗粒状的本发明止血材料，Co⁶⁰灭菌，密封保存备用。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围50-200μm，100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为0.9mL，钙离子含量：0.1-1mg/g。

实施例4

1)糊化：取5g马铃薯淀粉加入50g水中得到浓度为10wt％的淀粉水溶液，在200rpm转速机械搅拌、55℃下加热7min后，冷却至20℃，加入NaOH溶液调节淀粉水溶液的pH至10.0，得到糊化淀粉溶液。

2)乳化、致孔和交联：取3g乳化剂Span80加入至300ml环己烷-氯仿混合物中，搅拌18min至两者混合均匀后，加热至55℃，然后缓慢加入50mL步骤1)得到的糊化淀粉溶液，在800rpm的转速下进行乳化，待糊化淀粉溶液和乳化剂溶液乳化后再加入50ml甲醇，以800rpm转速机械搅拌10min后，加入8.0mL环氧氯丙烷，搅拌5h发生交联反应。

3)钙离子交换：交联反应结束后，40℃机械搅拌下，逐滴加入饱和氯化钙溶液1mL，反应0.5h，反应结束后，使用乙酸乙酯和无水乙醇分别抽提3次，60℃烘箱烘干8h，得到白色颗粒状的本发明止血材料，Co⁶⁰灭菌，密封保存备用。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围500-1000μm，100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为0.5mL，钙离子含量：0.1-1mg/g。

实施例5

1)糊化：取10g木薯淀粉加入100g水中得到浓度为10wt％的淀粉水溶液，在250rpm转速机械搅拌、50℃下加热10min后，冷却至30℃，加入NaOH溶液调节淀粉水溶液的pH至11.0，得到糊化淀粉溶液。

2)乳化、致孔和交联：取4g乳化剂Span80加入至800ml环己烷-氯仿混合物中，搅拌20min至两者混合均匀后，加热至40℃，然后缓慢加入100mL步骤1)得到的糊化淀粉溶液，在400rpm的转速下进行乳化，待糊化淀粉溶液和乳化剂溶液乳化后再加入50ml聚乙二醇，以400rpm转速机械搅拌5min后，加入8.0mL环氧氯丙烷，搅拌2h发生交联反应。

3)钙离子交换：交联反应结束后，40℃机械搅拌下，逐滴加入饱和氯化钙溶液10mL，反应1.5h，反应结束后，使用乙酸乙酯和无水乙醇分别抽提3次，60℃烘箱烘干8h，得到白色颗粒状的本发明止血材料，Co⁶⁰灭菌，密封保存备用。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围50-150μm，100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为0.5mL，钙离子含量：1-10mg/g。

实施例6

1)糊化：取20g藕淀粉加入200g水中得到浓度为10wt％的淀粉水溶液，在300rpm转速机械搅拌、65℃下加热9min后，冷却至30℃，加入NaOH溶液调节淀粉水溶液的pH至11.0，得到糊化淀粉溶液。

2)乳化、致孔和交联：取0.2g乳化剂吐温20加入至200ml环己烷-氯仿混合物中，搅拌2min至两者混合均匀后，加热至40℃，然后缓慢加入200mL步骤1)得到的糊化淀粉溶液，在200rpm的转速下进行乳化，待糊化淀粉溶液和乳化剂溶液乳化后再加入200ml聚乙二醇，以200rpm转速机械搅拌10min后，加入0.2mL环氧氯丙烷，搅拌3h发生交联反应。

3)钙离子交换：交联反应结束后，40℃机械搅拌下，逐滴加入饱和氯化钙溶液1mL，反应3.5h，反应结束后，使用乙酸乙酯和无水乙醇分别抽提3次，60℃烘箱烘干8h，得到白色颗粒状的本发明止血材料，Co⁶⁰灭菌，密封保存备用。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围800-1000μm，100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为1.0mL，钙离子含量：1-10mg/g。

实施例7

1)糊化：取10g马铃薯淀粉加入200g水中得到浓度为5wt％的淀粉水溶液，在300rpm转速机械搅拌、65℃下加热10min后，冷却至30℃，加入NaOH溶液调节淀粉水溶液的pH至11.0，得到糊化淀粉溶液。

2)乳化、致孔和交联：取3.2g乳化剂span80加入至400ml液体石蜡中，搅拌2min至两者混合均匀后，加热至60℃，然后缓慢加入200mL步骤1)得到的糊化淀粉溶液，在500rpm的转速下进行乳化，待糊化淀粉溶液和乳化剂溶液乳化后再加入200ml无水乙醇，以500rpm转速机械搅拌10min后，加入0.2mL环氧氯丙烷，搅拌3h发生交联反应。

3)钙离子交换：交联反应结束后，40℃机械搅拌下，逐滴加入饱和氯化钙溶液1mL，反应3.5h，反应结束后，使用乙酸乙酯和无水乙醇分别抽提3次，60℃烘箱烘干8h，得到白色颗粒状的本发明止血材料，Co⁶⁰灭菌，密封保存备用。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围50-150μm，100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为1.2mL，钙离子含量：1-10mg/g。

比较例1

1)糊化：与实施例7相同。

2)乳化、致孔和交联：与实施例2相同，仅是在50rpm的转速下对步骤1)得到的糊化淀粉溶液和乳化剂溶液进行乳化。

3)钙离子交换：与实施例7相同。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围10-1000微米，粒径跨度较宽，说明颗粒粒径分布不均匀，材料在体内降解吸收效果差，生物相容性差；100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为0.3mL，钙离子含量：1-10mg/g。

比较例2

1)糊化：与实施例7相同。

2)乳化、致孔和交联：与实施例7相同，仅是在1200rpm的转速下对步骤1)得到的糊化淀粉溶液和乳化剂溶液进行乳化。

3)钙离子交换：与实施例7相同。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围30-45微米，粒径过小，颗粒流动性差，100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为0.1mL，吸水体积也因材料的流动性差而减小；钙离子含量：1-10mg/g。

比较例3

1)糊化：与实施例7相同。

2)乳化、致孔和交联：与实施例7相同，仅是致孔剂为无水乙醇，且加入体积为1000ml。

3)钙离子交换：与实施例7相同。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围50-500微米，100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为0.6mL，钙离子含量：0.1-1mg/g。致孔剂的加入量达到本发明上限后，随着无水乙醇用量的进一步增加，吸水速率无显著性加快、粒径分布也无显著性变化，考虑到生产成本，选择本发明的加入上限。

比较例4

1)糊化：与实施例7相同。

2)乳化、致孔和交联：与实施例7相同，仅是致孔剂为无水乙醇，且加入体积为1ml。

3)钙离子交换：与实施例7相同。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，其颗粒表面形貌图见图4中的C幅和D幅，图4的C和D幅表明致孔剂加入量过少，得到的颗粒表面粗糙度显著降低，表面多孔结构也显著减少，比表面积减小，30s的吸水体积减小，经过性能检测，颗粒粒径范围50-500微米，100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为0.1mL，钙离子含量：1-10mg/g。

比较例5

1)糊化：与实施例7相同。

2)乳化、致孔和交联：与实施例7相同，仅是糊化淀粉溶液的加入体积为500ml。

3)钙离子交换：与实施例7相同。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围1500-2000微米，粒径过大，材料在体内降解吸收效果差，生物相容性差；100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为0.5mL，钙离子含量：1-10mg/g。

比较例6

1)糊化：与实施例7相同。

2)乳化、致孔和交联：与实施例7相同，仅是糊化淀粉溶液的加入体积为50ml。

3)钙离子交换：与实施例7相同。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围30-70微米，粒径过小，颗粒流动性差，100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为0.1mL，吸水体积也因材料的流动性差而减小；钙离子含量：1-10mg/g。

比较例7

1)糊化：与实施例7相同。

2)乳化、致孔和交联：与实施例7相同。

3)钙离子交换：交联反应结束后，使用乙酸乙酯和无水乙醇分别抽提3次，60℃烘箱烘干8h，得到颗粒状的本发明止血材料，Co⁶⁰灭菌，密封保存备用。

所得钙离子交换多孔淀粉止血材料，经过性能检测，颗粒粒径范围50-150微米，100mg钙离子交换多孔淀粉止血材料30s内的吸水体积为0.8mL，钙离子含量：0mg/g。

实验1：本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料中金属离子含量的测定

精密称取原料淀粉(即空白组)、实施例1-7的钙离子交换多孔淀粉止血材料、比较例1-7的钙离子交换多孔淀粉止血材料0.02g分别置于离心管中；分别向其中加入1mL浓硝酸，盖紧，放入100℃水浴中消解2h；待溶液透明时，开盖，散气40min，4000rpm常温离心4min,取上清，用超纯水定容至10mL后，混匀得到待测样品。

用ICP-MS测定待测样品中钠镁钾钙四种金属离子的含量，以实施例1和实施例7的结果为例，结果见图2。仪器参数概括如下：射频功率：1550W，雾化器：同心雾化气，MicroMist采样深度：8mm，载气流速：0.75L/min，补偿气流速：0.40L/min，He气流速：3.3mL/min，等离子气流：15L/min，重复采集次数：3，采集模式：Nogas/He模式。使用5000μg·mL^-1的Na、Mg、K、Ca元素标准溶液，绘制Na、Mg、K、Ca元素标准曲线浓度：0、0.01、0.05、0.1、0.25、1、5、20μg·mL^-1。

图2的结果显示，与氯化钙饱和溶液加入量为0mL的钙离子交换多孔淀粉止血材料(即比较例7)相比，本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料中钙离子含量由0.26mg/g(空白组)分别增加至2.5mg/g和4.7mg/g，钙离子含量的增加同时，钠镁钾金属离子的含量均减少，说明在制备过程中钙离子与样品中的金属离子如钠、镁、钾离子发生离子交换反应。

其它实施例和比较例1-6的结果与实施例1无显著差异，在此不一一赘述。

实验2：本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料PBS吸液速率的测定

PBS吸液速率可用于评价淀粉止血材料在人体正常渗透压下吸收和转移水分子能力大小，并且快速的PBS吸液速率也是衡量淀粉止血材料的止血效果的重要评价指标之一。实验装置见图3中的左幅，2ml吸量管右接橡胶管，橡胶管另一端与沙漏(G1)连接，2mL吸量管水平放置与沙漏底端相平，2ml吸量管中储满PBS(pH＝7.40)。100mg Arista可吸收止血颗粒、实施例1-7和比较例1-7的钙离子交换多孔淀粉止血材料分别被快速放置于沙漏内部，开始计时，分别于10s、20s、30s、40s、60s、90s和120s记录吸量管中液体体积变化，以实施例7为例，结果见图3的右幅。

据图3所示，在20s内，本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料的快速吸液能力与Arista可吸收止血颗粒相当，20s之后，钙离子交换多孔淀粉止血材料吸液逐渐接近饱和。

其它实施例的结果比实施例7的吸液效果稍差，但无显著差异，在此不一一赘述。比较例1-7的结果比实施例7的吸液效果差且有显著性差异。

实验3：本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料颗的粒粒径分布检测

取0.2g实施例1-7和比较例1-7的钙离子交换多孔淀粉止血材料、原料淀粉，分别稀释悬浮于200mL无水乙醇中得到样品溶液，用马尔文2000激光粒度仪测定样品溶液中颗粒的粒径分布，以实施例7为例，结果见图4。

由图4可知，本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料颗粒粒径分布较均匀，平均粒径为78.13(d0.5)大于原料淀粉的平均粒径，用于止血粒径合适；粒径过大，不利于钙离子交换多孔淀粉止血材料在体内的降解吸收；过小，钙离子交换多孔淀粉止血材料的流动性差，吸液速率低。流动性差即：如果粒径较小，颗粒与颗粒之间由于某种相互作用会相互吸引力较大，不利于分散。

其它实施例的结果与实施例7无显著差异，在此不一一赘述。比较例1-7的止血材料粒径分布较实施例7不均匀。

实验4：本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料的细胞毒性实验

将实施例1-7和比较例1-7的钙离子交换多孔淀粉止血材料，经钴源照射灭菌处理后，分别浸入RPMI 1640培养液(不含血清，购于美国赛默飞世尔公司)中37℃浸提24h，过滤取上清得浸提液。将L929细胞(小鼠成纤维细胞，来源于国家实验细胞资源共享平台)接种于96孔板内(孔板内预置有完全培养基，含RPMI 1640培养液、胎牛血清)，每孔5×10⁴个，然后将96孔板放置于培养箱中37℃孵育24h。取出96孔板，弃去旧液，每孔分别加入100μL收集的100％浓度浸提液和50％浓度浸提液(50％浓度浸提液是由100％浓度浸提液与等体积RPMI 1640培养液混合得到)，继续放置培养箱中37℃培养。48h后取出，每孔加入5mg/mlMTT(噻唑蓝，购于北京京科宏达)水溶液20μL，继续放置培养箱中37℃反应4h。最后取出96孔板，小心将旧液弃掉，每孔加入DMSO(二甲基亚砜)150μL，震荡10min后，放置酶标仪中读取OD值。测试波长570nm，参比波长630nm。每种样品设6个复孔，空白培养液(步骤同实验组仅是不加止血材料)及0.5wt％苯酚水溶液分别作为阴性对照组与阳性对照组。相对增殖率(Relative growth rate，RGR％)如下计算：RGR％＝OD_样品/OD_阴性对照×100％，以实施例7为例，实验结果如图7所示。

结果表明：由图7可知，参照阴性对照组，本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料组的细胞相对增殖率大于100％，说明本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料，没有细胞毒性，此外该止血材料有一定程度的促细胞增殖的作用，可以在一定程度上促进伤口愈合。

其它实施例和比较例1-6的细胞相对增值率比实施例7无显著差异，在此不一一赘述。

实验5：本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料的全血凝固动力学测定

取健康成年Wistar大鼠180-220g，称重后按5mg/kg剂量腹腔注射3wt％戊巴比妥钠水溶液进行麻醉；大鼠麻醉后，仰卧位，心脏取血并按照全血与抗凝剂3.8wt％枸橼酸钠水溶液体积比1:9混合抗凝，得到抗凝全血。分别称取Arista、实施例1-7和比较例1-7的钙离子交换多孔淀粉止血材料各10mg，置于5mL离心管中，迅速使用微型移液器取100μL抗凝全血加入离心管中开始计时，分别于5，20，35，50min后加入3mL去离子水,裂解未被血凝块包裹的红细胞；静置5min后，取200μL上清，540nm下测定吸光度值，以实施例7为例，结果见图6。

结果表明：与Arista可吸收止血颗粒相比，本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料在体外有显著的促凝血效果。与比较例7相比，本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料体外的促凝血效果更是优异。

其它实施例体外的促凝血效果与实施例1相当，无显著差异，在此不一一赘述。比较例1-6体外的促凝血效果比实施例1差且有显著性差异，与Arista可吸收止血颗粒相当。

实验6：本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料的止血效果评价-小鼠断尾模型

纱布、Arista可吸收止血颗粒、实施例1-7和比较例1-7的钙离子交换多孔淀粉止血材料分别称取100mg，分别置于2mL离心管中作为样品。雄性，昆明小鼠33-39g左右，每组10只，按50mg/kg剂量腹腔注射3wt％戊巴比妥钠水溶液麻醉。将小鼠四肢固定于鼠板，量取尾巴长度，尾巴自由下垂，自尾尖，使用手术剪刀断尾1/2长度，自由出血30s(记录30s出血量)，后插入至样品中，轻轻按压。按压2分钟后，取出，如继续出血则插入另外一份样品中，同样止血2分钟，取出观察。鼠尾自然下垂，十分钟内，无活动性出血则记为止血成功；如两次按压止血后，仍未止住出血则记为止血失败，每只小鼠止血过程中最多按压两次；如第一次按压止血后便止血成功，则不再进行第二次按压止血。记录止血过程中的出血量、止血次数，以实施例7为例，结果见表1和图8。

表1钙离子交换多孔淀粉止血材料止血效果

结果表明：由表1和图8结果可知，本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料止血成功率为100％、止血次数和止血过程中的出血量均少于Arista可吸收止血颗粒和纱布，说明钙离子交换多孔淀粉止血材料在小鼠断尾出血模型中在止血成功率明显优于Arista可吸收止血颗粒。

在出血量方面，使用本发明钙离子交换多孔淀粉止血材料的小鼠出血量为0.05g，而使用Arista可吸收止血颗粒的小鼠出血量为0.11g，使用纱布的小鼠出血量为0.295g，使用本发明止血材料的小鼠出血量是使用Arista可吸收止血颗粒的不到一半，明显低于使用Arista可吸收止血颗粒和纱布。

其它实施例的出血量比实施例7稍高，但无显著差异，在此不一一赘述。比较例1-7的结果比实施例7的吸液效果差且有显著性差异，与Arista可吸收止血颗粒相当。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的内容。

Claims (10)

1.一种钙离子交换多孔淀粉止血材料，其特征在于，每100mg的所述止血材料30s内的吸水体积为0.2-1.2ml(优选0.5-1.2ml)，所述止血材料是由淀粉依次经糊化、乳化、致孔、交联和钙离子交换制备得到，制备中原料按质量百分含量包括：

水余量；

其中乳化是指向乳化剂溶液(由乳化剂和油相混合制得)中加入糊化淀粉溶液，搅拌进行乳化，搅拌转速优选200-1000rpm；乳化后加入致孔剂搅拌进行致孔，然后加入交联剂进行交联。

2.根据权利要求1所述钙离子交换多孔淀粉止血材料，其特征在于，其粒径为50-1500μm，钙离子含量为0.1-15mg/g。

3.根据权利要求1或2所述钙离子交换多孔淀粉止血材料，其特征在于，所述乳化剂的体积占油相体积的0.1-1.5％，优选0.5-1.0％。

4.根据权利要求1-3任一所述钙离子交换多孔淀粉止血材料，其特征在于，所述乳化剂溶液与糊化后的糊化淀粉溶液的体积比为(0.5-8)：1，优选(1-4)：1。

5.根据权利要求1或2所述钙离子交换多孔淀粉止血材料，其特征在于，所述致孔剂选自聚乙二醇、乙醇、甲醇等中的一种或几种。

6.根据权利要求1-5任一所述钙离子交换多孔淀粉止血材料，其特征在于，所述淀粉选自马铃薯淀粉、甘薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、绿豆淀粉、菱角淀粉、藕淀粉、小麦淀粉等中的一种或几种；和/或

所述油相选自环己烷-氯仿混合物、液体石蜡、大豆油等中的一种或几种；和/或

所述乳化剂选自司班80、司班60、吐温20等中的一种或几种。

7.根据权利要求1-6任一所述钙离子交换多孔淀粉止血材料，其特征在于，其制备方法包括淀粉的糊化；糊化淀粉溶液的乳化、致孔和交联；交联完成后还包括钙离子交换，所述钙离子交换是向交联后的反应液中加入饱和氯化钙溶液，过滤所得固体即为所述钙离子交换多孔淀粉止血材料；优选的，所述致孔时的搅拌转速为200rpm-1000rpm，搅拌时间为5-20min。

8.根据权利要求1-7任一所述钙离子交换多孔淀粉止血材料，其特征在于，所述糊化淀粉液的乳化、致孔和交联具体为：将乳化剂加入油相中，搅拌至乳化剂与油相混匀，得到乳化剂溶液；加热乳化剂溶剂至40-60℃后，将糊化淀粉溶液加入乳化剂溶液中，200-1000rpm下进入乳化，然后加入致孔剂，200rpm-1000rpm搅拌5-20min后，加入交联剂进行交联反应2-8h。

9.根据权利要求1-8任一所述钙离子交换多孔淀粉止血材料，其特征在于，所述淀粉的糊化具体为：向淀粉中加入水，配制得到淀粉浓度为2wt％-10wt％的淀粉水溶液，在50-300rpm、45-65℃下加热1-10min，然后冷却至20-30℃，冷却后调节pH至9.0-11.0，得到糊化淀粉溶液。

10.权利要求1-9任一所述钙离子交换多孔淀粉止血材料在制备用于复杂伤口出血和/或凝血功能障碍患者出血的止血剂中的应用；优选的，所述复杂伤口出血为体内实质性脏器出血、或弥散性毛细血管出血、或炎症及脆弱组织出血等；或

优选的，每100mg的所述止血材料30s内的吸水体积为0.2-1.2ml(优选0.5-1.2ml)；更有选的，所述钙离子交换多孔淀粉止血材料的粒径为50-1500μm，钙离子含量为0.1-15mg/g。

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