CN114099549B - 一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法，属于细胞因子技术领域。且所述制备方法包括以下步骤：S1、毛囊干细胞的获取；S2、毛囊干细胞活性因子的获取：将毛囊干细胞接入扩增培养基中进行传代培养，然后经富集、离心、超滤浓缩，得毛囊干细胞活性因子浓缩液；S3、混合和冻干：将毛囊干细胞活性因子浓缩液与辅助溶液在混合箱中混合后，得混合液；混合液经二次冻干后，得一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉。且本发明以毛囊干细胞活性因子冻干粉取代毛囊干细胞因子溶液，解决液态状态下的毛囊干细胞培养液在温室中保存时间短，不利于运输的问题。

Description

一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法
技术领域
本发明属于细胞因子技术领域，具体地，涉及一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法。
背景技术
近年来受环境、工作压力、遗传等多种因素的影响，脱发人群不断增加。脱发是由于许多内部因素引起的，例如衰老或荷尔蒙平衡紊乱，以及多种疾病以及严重的烧伤或伤口等，它通常伴有秃头部位皮肤变薄，这些症状是由于滤泡功能丧失所致。对于脱发、斑秃等毛囊相关疾病的治疗，目前常规治疗手段有基因治疗、药物治疗和植发等。对于上述治疗方法均存在缺点。如药物治疗脱发和斑秃会随着药物的停止使用而导致复发，如若持续使用会导致副作用累积。而植发虽能恢复头发生长，但手术费用高并且具有不方便性。因此，替代疗法对脱发至关重要。
随着社会发展，人们对具有保护与美观作用的毛发越来越重视。对毛囊周期性再生的研究具有现实且重要的意义。自日本研究人员采用导入外源基因的方法获得诱导多能干细胞(Induced pluripotent cells，iPSC)后，将干细胞的研究提升至新的高度。然而干细胞在治疗脱发的研究中也显得越来越重要。干细胞具有很高的再生潜能，以成体皮肤干细胞为种子细胞构建组织工程化皮肤是目前研究的发展方向。毛囊干细胞(Hairfolliclestemcell，HFSC)具有高增殖能力、位于体表易于获取、无再创伤性，并有向表皮及附属器分化的特性，因此毛囊干细胞作为新的种子细胞日益受到重视。毛囊干细胞分泌多种活性生长因子，主要含有成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β(TGF-β)等。目前毛囊干细胞已被证实它能修复受损毛囊，从根源上促进毛发再生，并为脱发提供有效的治疗策略。
但是干细胞本身会引起免疫排斥反应，而且存在一定的伦理问题。即使是采用自体干细胞，在干细胞的培养扩增过程中亦难免会引入外源性的蛋白(胎牛血清)，容易引起免疫排斥反应。所以，科学家们最近提出一种新干细胞应用方法，细胞培养上清活性因子液的应用。研究表明细胞培养上清液含有各种具有生物活性的细胞因子，它的应用可以避免干细胞在使用时所产生的免疫排斥反应。但是，液态的培养上清在常温保存时间短，这就阻碍了它的推广和应用。
针对上述问题，本发明提出了一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法，包括在体外毛囊干细胞的原代分离培养及传代培养、细胞上清的收集、过滤及超滤浓缩，得到含有所述毛囊干细胞活性因子的浓缩液，再采用冷冻干燥工艺，制备得到毛囊干细胞活性因子冻干粉。
以毛囊干细胞活性因子冻干粉取代毛囊干细胞因子溶液，用于解决以下问题：干细胞分泌的细胞因子在常温下或温度变化的条件下，会发生部分活性降低或丧失，达不到预期的效果；液态状态下的干细胞培养液在温室中保存时间短，不利于运输。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
S1、毛囊干细胞的获取：在无菌条件下，剪取毛发根部，得毛囊组织，再将毛囊组织放入含双抗的DPBS中清洗，然后剪碎，并接种于原代培养基中进行原代培养，然后消化、纯化，得毛囊干细胞；
S2、毛囊干细胞活性因子的获取：将毛囊干细胞接进行传代培养，然后经富集、离心、超滤浓缩，得毛囊干细胞活性因子浓缩液；
S3、混合和冻干：将毛囊干细胞活性因子浓缩液与辅助溶液在混合器中混合后，得混合液；混合液经二次冻干后，得一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉。
进一步地，步骤S1中双抗为青霉素和链霉素。
进一步地，步骤S1中原代培养基为含体积分数10％胎牛血清的HG-DMEM培养液，且在原代培养中每3天进行换液。
进一步地，步骤S1中消化具体操作为待细胞密度为70～85％时，得毛囊组织细胞，然后将中性蛋白酶、毛囊组织细胞和PBS缓冲液加入离心管中密封，并置于37℃摇床100r/min消化1.5～2h，2000rpm离心后舍弃上清液，再使用无菌PBS缓冲液漂洗2～3次，以洗去中性蛋白酶，再加入trypsin-EDTA溶液(0.125％：0.01％)，密封，并置于37℃摇床100r/min消化20～30min，加入含10％胎牛血清培养液终止消化，将消化后溶液过筛网，收集滤液，移入离心管中，1500rpm离心8～15min，得毛囊细胞悬浮液。
进一步地，步骤S1中纯化的具体操作为向毛囊细胞悬浮液加入培养液稀释(稀释倍数2～4倍)，然后接种于预先用Ⅳ型胶原包被的25mL培养瓶中，将已接种细胞的培养瓶使用十字法摇匀，以保证细胞均匀分布于整个培养瓶瓶底，并置于CO2培养箱中30min后取出，吸取其中培养液后，重新缓慢地向培养瓶中加入培养液继续培养，毛囊干细胞具有对Ⅳ型胶原粘附性较强的特点，我们利用这个特点可尽可能地去除杂细胞，此后每2～3d换液一次，待细胞密度为70～85％时，然后进行清洗、消化，即得原代毛囊干细胞。
进一步地，步骤S2中传代培养的具体操作为步骤S1中使用后的原代培养基和传代培养液按照质量比为3：1进行混合组成扩增培养基；并置于5％CO2、37℃饱和湿度条件下传代培养。
进一步地，所述传代培养液包括以下组分：5mg/L胰岛素、5mg/L转铁蛋白、0.4mg/L氢化可的松、20μg/LEGF、2.5mg/L两性霉素B、105IU/L青霉素、100mg/L链霉素和质量分数为20％的FBS。
进一步地，步骤S2中富集和离心的具体操作为取P3～P16代的细胞，待细胞长满至70-85％，收集细胞培养液于离心管离心，离心条件为800rpm，离心5min。
进一步地，步骤S2中超滤浓缩的具体操作为收集离心后的细胞上清液，将上清液在1.0bar压力下，先通过30KD的超滤膜进行超滤透析，取透析液；再将透析液通过3KD超滤膜，去除大分子和小分子杂质，收集液体，所得液体即为含有大量细胞因子浓缩液，得毛囊干细胞活性因子浓缩液。
进一步地，步骤S3中辅助溶液包括以下重量份组分：35～50份甘露醇、0.5～3份右旋糖苷、2～6.5份海藻糖、1.5～6.5份季铵盐壳聚糖，并通过以下方法制成：将甘露醇、右旋糖苷、海藻糖、季铵盐壳聚糖和水在800-1200r/min下搅拌30-50min，得辅助溶液。
进一步地，步骤S3中混合具体操作为将毛囊干细胞活性因子浓缩液加入浓缩液箱中，辅助溶液加入辅助溶液箱中，打开旋转电机、第一液体泵和第二液体泵，通过第一计量阀和第二计量阀控制辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液的流量，通过出口管内的电磁阀门控制辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液的混合时间，在旋转电机的作用下，混合箱旋转的过程中使得辅助溶液对毛囊干细胞活性因子浓缩液进行包裹，获得混合液液滴，混合液滴经出口管和环形导流开口进入收集箱中，被收集，得混合液。
进一步地，所述辅助溶液的流量为13-20mg/s，所述毛囊干细胞活性因子浓缩液的流量为6-10mg/s，混合时间的控制具体为用循环时间继电器控制电磁阀门开30s，关30s，因此，混合时间为30s。
进一步地，步骤S3中二次冻干为第一次冻干条件为-45～-55℃下冻干3-5h；第二次冻干条件为-30～-45℃下冻干30-50h。
本发明的有益效果：
1、本发明将辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液在混合器中混合，通过第一计量阀和第二计量阀分别控制辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液的流量，再结合出口管内的电磁阀门控制辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液的混合时间，以保证在混合箱旋转的过程中，辅助溶液对毛囊干细胞活性因子浓缩液的包裹，进而得混合液滴，明显地，该混合液滴为包裹有毛囊干细胞活性因子浓缩液的辅助溶液液滴，相比较传统的搅拌混合，采用本发明的混合器混合获得的混合液是由无数上述的混合液滴形成的，辅助溶液对毛囊干细胞活性因子浓缩液的包裹性能更好，且更加均匀，避免少量的毛囊干细胞活性因子未被包裹，在后续冻干过程中，更易保护毛囊干细胞活性因子的活性和稳定性；
2、本发明中利用的辅助溶液为甘露醇、右旋糖苷、海藻糖和季铵盐壳聚糖组成，其中海藻糖和季铵盐壳聚糖成膜性良好，可实现对毛囊干细胞活性因子浓缩液的包裹，对毛囊干细胞活性因子进行良好的保护，防止其被破坏，且海藻糖和季铵盐壳聚糖的组织相容性好、生物活性多样，且降解产物能被人体吸收，无副作用；
3、毛囊干细胞存在于毛囊之中，是成体干细胞的一种。其广泛地分布于身体的表皮，取材非常方便，操作比较简单且细胞数量巨大、来源充足；
4、本发明采用上述方法，通过辅助溶液制备得到毛囊干细胞活性因子冻干粉，制备方法比较简单、活性因子的性质更加稳定、也便于储存和运输。
因此，本发明提供的一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法，获得的冻干粉中的毛囊干细胞活性因子活性好且稳定，该冻干粉可用于治疗脱发、头皮再生。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法的流程图；
图2为本发明的混合器的结构示意图。
附图中，各标号所代表的部件列表如下：
10、混合箱；11、出口管；20、安装室；21、旋转电机；30、辅助溶液箱；31、第一进液管；32、第一液体泵；33、第一加液口；34、第一计量阀；40、浓缩液箱；41、第二进液管；42、第二液体泵；43、第二加液口；44、第二计量阀；50、收集箱；51、环形导流开口；52、支撑柱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1所示，本发明提供的毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
S1、毛囊干细胞的获取：在无菌条件下，剪取毛发根部，得毛囊组织，再将毛囊组织放入含双抗的DPBS中清洗，然后剪碎，并接种于原代培养基中进行原代培养，然后消化、纯化，得毛囊干细胞；
S2、毛囊干细胞活性因子的获取：将毛囊干细胞接进行传代培养，然后经富集、离心、超滤浓缩，得毛囊干细胞活性因子浓缩液；
S3、混合和冻干：将毛囊干细胞活性因子浓缩液与辅助溶液在混合器中混合后，得混合液；混合液经二次冻干后，得一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉。
请参阅图2所示，本发明的混合器包括混合箱10，混合箱10的底壁上设有安装室20，安装室20内固定安装有旋转电机21，旋转电机21的输出端固定连接有旋转轴，旋转轴的顶端贯穿安装室20的顶壁并与混合箱10的底壁固定连接，旋转电机21的旋转带动混合箱10的旋转；
混合箱10的两侧壁分别固定设有辅助溶液箱30和浓缩液箱40，辅助溶液箱30与混合箱10通过第一进液管31连通，第一进液管31上设有第一液体泵32，第一进液管31与混合箱10的接触处设有第一计量阀34，浓缩液箱40与混合箱10通过第二进液管41连通，第二进液管41上设有第二液体泵42，第二进液管41与混合箱10的接触处设有第二计量阀44，辅助溶液箱30的顶部设有第一加液口33，便于辅助溶液的补充，浓缩液箱40顶部设有第二加液口43，便于毛囊干细胞活性因子浓缩液的补充；
混合箱10的箱底固定设有出口管11，出口管11的内部设有电磁阀门，电磁阀门连接有循环时间继电器，循环时间继电器可以控制电磁阀门开30s，关30s，并循环往复；
安装室20的下方设有收集箱50，安装室20固定在收集箱50的顶壁中间位置，收集箱50的内部中间位置固定设有支撑柱52，用于支撑收集箱50的顶壁，收集箱50的顶壁上远离支撑柱52处设有环形导流开口51，在混合箱10的旋转过程中，出口管11的底端始终位于环形导流开口51的内部，在环形导流开口51的竖直侧壁的作用下，便于出口管11内的混合液滴滴落进入收集箱50内，避免混合液在旋转过程的飞溅，收集箱50的侧壁设有排液口；
本发明中混合器的工作原理：将毛囊干细胞活性因子浓缩液加入浓缩液箱40中，辅助溶液加入辅助溶液箱30中，打开旋转电机21、第一液体泵32和第二液体泵42，通过第一计量阀34和第二计量阀44分别控制辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液的流量，通过出口管11内的电磁阀门控制辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液的混合时间，在旋转电机21的作用下，混合箱10旋转的过程中使得辅助溶液对毛囊干细胞活性因子浓缩液进行包裹，形成混合液滴，混合液滴经出口管11和环形导流开口51进入收集箱50中，被收集，得混合液。
实施例1-1：
毛囊干细胞的获取：在无菌条件下，剪取毛发根部，得毛囊组织，再将毛囊组织放入含青霉素和链霉素的DPBS中清洗，然后剪碎(0.8mm3)，并接种于原代培养基中进行原代培养，然后消化、纯化，得毛囊干细胞；
其中，原代培养基为含体积分数10％胎牛血清的HG-DMEM培养液，且在原代培养中每3天进行换液；消化具体操作为待细胞密度为70～75％时，得毛囊组织细胞，然后将中性蛋白酶、毛囊组织细胞和PBS缓冲液加入离心管中密封，并置于37℃摇床100r/min消化1.5h，2000rpm离心后舍弃上清液，再使用无菌PBS缓冲液漂洗2次，以洗去中性蛋白酶，再加入0.01％trypsin-EDTA溶液，密封，并置于37℃摇床100r/min消化20min，加入含10％胎牛血清培养液终止消化，将消化后溶液过筛网，收集滤液，移入离心管中，1500rpm离心8min，得毛囊细胞悬浮液；纯化的具体操作为向毛囊细胞悬浮液加入培养液稀释(稀释倍数2倍)，然后接种于预先用Ⅳ型胶原包被的25mL培养瓶中，将已接种细胞的培养瓶使用十字法摇匀，以保证细胞均匀分布于整个培养瓶瓶底，并置于CO2培养箱中30min后取出，吸取其中培养液后，重新缓慢地向培养瓶中加入培养液继续培养，毛囊干细胞具有对Ⅳ型胶原粘附性较强的特点，利用这个特点可尽可能地去除杂细胞，此后每3d换液一次，待细胞密度为70～75％时，然后进行清洗、消化，即得原代毛囊干细胞。
实施例1-2：
毛囊干细胞的获取：在无菌条件下，剪取毛发根部，得毛囊组织，再将毛囊组织放入含青霉素和链霉素的DPBS中清洗，然后剪碎(0.8mm3)，并接种于原代培养基中进行原代培养，然后消化、纯化，得毛囊干细胞；
其中，原代培养基为含体积分数10％胎牛血清的HG-DMEM培养液，且在原代培养中每3天进行换液；消化具体操作为待细胞密度为75～85％时，得毛囊组织细胞，然后将中性蛋白酶、毛囊组织细胞和PBS缓冲液加入离心管中密封，并置于37℃摇床100r/min消化2h，2000rpm离心后舍弃上清液，再使用无菌PBS缓冲液漂洗2次，以洗去中性蛋白酶，再加入0.125％trypsin-EDTA溶液，密封，并置于37℃摇床100r/min消化30min，加入含10％胎牛血清培养液终止消化，将消化后溶液过筛网，收集滤液，移入离心管中，1500rpm离心13min，得毛囊细胞悬浮液；纯化的具体操作为向毛囊细胞悬浮液加入培养液稀释(稀释倍数2倍)，然后接种于预先用Ⅳ型胶原包被的25mL培养瓶中，将已接种细胞的培养瓶使用十字法摇匀，以保证细胞均匀分布于整个培养瓶瓶底，并置于CO2培养箱中30min后取出，吸取其中培养液后，重新缓慢地向培养瓶中加入培养液继续培养，毛囊干细胞具有对Ⅳ型胶原粘附性较强的特点，利用这个特点可尽可能地去除杂细胞，此后每3d换液一次，待细胞密度为75～80％时，然后进行清洗、消化，即得原代毛囊干细胞。
实施例2-1：
毛囊干细胞活性因子的获取：将实施例1-1获得的毛囊干细胞接进行传代培养，然后经富集、离心、超滤浓缩，得毛囊干细胞活性因子浓缩液；
其中，传代培养的具体操作为步骤S1中使用后的原代培养基和传代培养液按照质量比为3：1进行混合组成扩增培养基；并置于5％CO2、37℃饱和湿度条件下传代培养；所述传代培养液包括以下组分：5mg/L胰岛素、5mg/L转铁蛋白、0.4mg/L氢化可的松、20μg/LEGF、2.5mg/L两性霉素B、105IU/L青霉素、100mg/L链霉素和20％FBS；富集和离心的具体操作为取P3代的细胞，待细胞长满至70-80％，收集细胞培养液于离心管离心，在800rpm下离心5min；超滤浓缩的具体操作为收集离心后的细胞上清液，将上清液在1.0bar压力下，先通过30KD的超滤膜包进行超滤透析，取透析液；再将透析液通过3KD超滤膜，去除大分子和小分子杂质，收集液体，所得液体即为含有大量细胞因子浓缩液，得毛囊干细胞活性因子浓缩液。
实施例2-2：
毛囊干细胞活性因子的获取：将实施例1-2获得的毛囊干细胞接进行传代培养，然后经富集、离心、超滤浓缩，得毛囊干细胞活性因子浓缩液；
其中，传代培养的具体操作为步骤S1中使用后的原代培养基和传代培养液按照质量比为3：1进行混合组成扩增培养基；并置于5％CO2、37℃饱和湿度条件下传代培养；所述传代培养液包括以下组分：5mg/L胰岛素、5mg/L转铁蛋白、0.4mg/L氢化可的松、20μg/LEGF、2.5mg/L两性霉素B、105IU/L青霉素、100mg/L链霉素和20％FBS；富集和离心的具体操作为P16代的细胞，待细胞长满至75-85％，收集细胞培养液于离心管离心，在800rpm下离心5min；超滤浓缩的具体操作为收集离心后的细胞上清液，将上清液在1.0bar压力下，先通过30KD的超滤膜包进行超滤透析，取透析液；再将透析液通过3KD超滤膜，去除大分子和小分子杂质，收集液体，所得液体即为含有大量细胞因子浓缩液，得毛囊干细胞活性因子浓缩液。
实施例3-1：
一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉：
混合和冻干：将实施例2-1获得的毛囊干细胞活性因浓缩液与辅助溶液在混合器中混合后，得混合液；混合液在-45℃下冻干5h，再在-30℃下冻干50h，得一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉；
其中，辅助溶液包括以下重量组分：35g甘露醇、0.5g右旋糖苷、2g海藻糖、1.5g季铵盐壳聚糖、水10g，并通过以下方法制成：将甘露醇、右旋糖苷、海藻糖、季铵盐壳聚糖和水在800r/min下搅拌50min，得辅助溶液，其中，水为纯水；
混合具体操作为将毛囊干细胞活性因子浓缩液加入浓缩液箱40中，辅助溶液加入辅助溶液箱30中，打开旋转电机21、第一液体泵32和第二液体泵42，通过第一计量阀34和第二计量阀44分别控制辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液的流量，通过出口管11中的电磁阀门控制辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液的混合时间，在旋转电机21的作用下，混合箱10旋转的过程中使得辅助溶液对毛囊干细胞活性因子浓缩液进行包裹，得混合液滴，混合液滴经出口管11进入收集箱50中被收集，得混合液；所述辅助溶液的流量为13mg/s，所述毛囊干细胞活性因子浓缩液的流量为6mg/s，混合时间为30s。
实施例3-2：
一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉：
混合和冻干：将实施例2-2获得的毛囊干细胞活性因浓缩液与辅助溶液在混合器中混合后，得混合液；混合液在-55℃下冻干3h，再在-45℃下冻干30h，得一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉；
其中，辅助溶液包括以下重量组分：50g甘露醇、3g右旋糖苷、6.5g海藻糖、6.5g季铵盐壳聚糖、30g水，并通过以下方法制成：将甘露醇、右旋糖苷、海藻糖和季铵盐壳聚糖1200r/min下搅拌30min，得辅助溶液；
混合具体操作为将毛囊干细胞活性因子浓缩液加入浓缩液箱40中，辅助溶液加入辅助溶液箱30中，打开旋转电机21、第一液体泵32和第二液体泵42，通过第一计量阀34和第二计量阀44分别控制辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液的流量，通过出口管11中的电磁阀门控制辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液的混合时间，在旋转电机21的作用下，混合箱10旋转的过程中使得辅助溶液对毛囊干细胞活性因子浓缩液进行包裹，得混合液滴，混合液滴经出口管11进入收集箱50中被收集，得混合液；所述辅助溶液的流量为20mg/s，所述毛囊干细胞活性因子浓缩液的流量为10mg/s，混合时间为30s。
对比例1：
一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉：
混合和冻干：将实施例2-1获得的毛囊干细胞活性因浓缩液与辅助溶液在2000r/min下搅拌30min，得混合液；混合液在-45℃下冻干5h，再在-30℃下冻干50h，得一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉；
其中，辅助溶液同实施例3-1中的辅助溶液。
实施例4：
取实施例3-1、3-2和对比例1制备所得的冻干粉50μg，加入1mL无菌水振荡溶解，冻干粉外观和溶解状态见表1。
表1
Figure BDA0003300329020000121
Figure BDA0003300329020000131
从上述数据可以看出本发明获得的冻干粉具有良好的外观和溶解性。
实施例5：
安全性试验：
1、取20只小白鼠(雌雄各半，平均体重为25g)，给小鼠一次灌胃给予实施例3-1、3-2和对比例1制备得到的冻干粉10倍标示浓度的药量，观察其毒性反应，结果显示，小鼠没有出现任何不良反应，没有动物出现死亡，表明本发明制得的冻干粉安全性高。
2、取20只小白鼠(雌雄各半，平均体重为25g)，实验前24h用脱毛剂对用药区(背部两侧)进行脱毛处理，去毛范围左右各2cm×2cm。将小白鼠背部左侧定位为对照区，右侧定位为试验区，对照区给予生理盐水0.5mL，试验区给予实施例3-1、3-2和对比例1制备得到的冻干粉用生理盐水溶解后的溶液0.5mL，加纱布覆盖保护，用胶布固定，
24h后擦除受试物，温水洗净，观察1h，2h，4h，8h，12h涂敷部位有无红斑和水肿情况，结果显示，试验区和对照区均无出现红斑和水肿情况，表明本发明制得的冻干粉对皮肤刺激性小。
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、毛囊干细胞的获取：将毛囊组织剪碎，并接种于原代培养基中进行原代培养，然后消化、纯化，得毛囊干细胞；
S2、毛囊干细胞活性因子的获取：将毛囊干细胞接入扩增培养基中进行传代培养，然后经富集、离心、超滤浓缩，得毛囊干细胞活性因子浓缩液；
S3、混合和冻干：将毛囊干细胞活性因子浓缩液与辅助溶液在混合箱（10）中混合后，得混合液；混合液经二次冻干后，得一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉；
步骤S3中辅助溶液由以下重量份组分组成：35～50份甘露醇、1.5～3份右旋糖苷、0.5～4.5份海藻糖、1.5～3.5份季铵盐壳聚糖，其余为水；
步骤S3中混合具体操作如下：
将毛囊干细胞活性因子浓缩液加入浓缩液箱（40）中，辅助溶液加入辅助溶液箱（30）中，打开旋转电机（21）、第一液体泵（32）和第二液体泵（42），通过第一计量阀（34）和第二计量阀（44）分别控制辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液的流量，通过出口管（11）内的电磁阀门控制辅助溶液和毛囊干细胞活性因子浓缩液的混合时间，在旋转电机（21）的作用下辅助溶液对毛囊干细胞活性因子浓缩液进行包裹，得混合液滴，混合液滴经出口管（11）和环形导流开口（51）进入收集箱（50）中，得混合液；
所述辅助溶液的流量为13-20mg/s，所述毛囊干细胞活性因子浓缩液的流量为6-10mg/s，所述混合时间为30s。
2.根据权利要求1所述的一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述扩增培养基为步骤S1中使用后的原代培养基和传代培养液按照质量比为3：1进行混合组成。
3.根据权利要求2所述的一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：所述传代培养液包括以下组分：5mg/L胰岛素、5mg/L转铁蛋白、0.4mg/L氢化可的松、20g/LEGF、2.5mg/L两性霉B、105IU/L青霉素、100mg/L链霉素和20%FBS。
4.根据权利要求1所述的一种治疗脱发毛囊干细胞活性因子冻干粉的制备方法，其特征在于：步骤S3中二次冻干为第一次冻干在-45～-55℃下冻干3-5h；第二次冻干在-30～-45℃下冻干30-50h。
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