CN114097926A - 一种快速降解植物蛋白的生物酶制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体是涉及一种快速降解植物蛋白的生物酶制剂及其制备方法。本发明中的快速降解植物蛋白的生物酶制剂包括复合生物酶、营养基质以及微生物混合菌剂，且按重量份计，所述生物酶制剂中包括复合生物酶35～60份、营养基质56～90份以及微生物混合菌剂8～17份。本发明中的生物酶制剂利用了酶酶之间、菌菌之间和菌酶之间的协同作用，可以快速分解植物蛋白，尤其是对含有较多醇溶蛋白的植物原料具有快速分解的效果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体是涉及一种快速降解植物蛋白的生物酶制剂及其制备方法。
背景技术
全球饲料资源的紧缺以及大宗饲料原料价格的攀升给饲料行业带来了巨大的压力，植物蛋白质原料因其具有蛋白质含量高、氨基酸种类齐全、来源广和成本低等优点而被广泛应用。高粱、小麦、大麦、玉米、小麦蛋白粉和玉米蛋白粉等植物蛋白原料，因其营养价值全、产量大、价格低廉和安全性好而被广泛应用，这些原料通常用来替代豆粕和动物蛋白原料，但是，在这些植物蛋白原料中含有较多的非淀粉多糖以及一类难于被消化的蛋白，例如，醇溶蛋白，大大限制了此类原料的应用。其中，高粱、大麦和小麦中的醇溶蛋白质量百分比均为总蛋白的40～50％以上，小麦蛋白粉和玉米蛋白粉中醇溶蛋白质量百分比高达68％以上。醇溶蛋白又称醇溶谷蛋白，其不溶于水，可溶于50％～90％的乙醇，大部分醇溶蛋白不能被动物所吸收利用，同时醇溶蛋白的存在也大大降低了淀粉的消化利用率，降低了原料的利用价值。
近年来，为提高植物蛋白的营养价值，发酵食品和饲料制造业对生产加工过程进行了一系列改进，例如，寻找能降解醇溶蛋白的菌或添加蛋白酶制剂降解醇溶蛋白，以提高谷物蛋白质和淀粉等营养成分的消化率，但是，上述方法存在醇溶蛋白的降解效率不稳定的缺点。因此，寻找一种快速降解植物蛋白的方法，尤其寻找一种针对降解醇溶蛋白的方法是至关重要的。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种快速降解植物蛋白的生物酶制剂及其制备方法，该生物酶制剂可以快速降解植物蛋白，尤其是针对植物中的醇溶蛋白，可以提高植物蛋白的消化利用率，达到植物蛋白快速分解的效果，产生可被动物直接吸收和利用的小肽和氨基酸。
本发明的第一个方面，提供了一种生物酶制剂，该生物酶制剂包括复合生物酶、营养基质以及微生物混合菌剂。
根据本发明的第一方面的内容，在本发明的一些实施方式中，所述复合生物酶包括：中性蛋白酶、碱性蛋白酶、中温α-淀粉酶、普鲁兰酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶和果胶酶。
在本发明的一些实施方式中，所述营养基质包括：小球藻多糖、蒙脱石粉、乳糖、琼脂培养基以及麦麸。
在本发明的一些实施方式中，所述微生物混合菌剂包括：植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述生物酶制剂中的原料按重量份计，包括复合生物酶35～60份、营养基质56～90份以及微生物混合菌剂8～17份。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述生物酶制剂中的原料按重量份计，包括复合生物酶40～55份、营养基质62～85份以及微生物混合菌剂13～16份。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述生物酶制剂中的原料按重量份计，包括复合生物酶48份、营养基质69份以及微生物混合菌剂15份。
在本发明中的一些优选实施方式中，按照重量份数计，所述复合生物酶包括：中性蛋白酶20～30份、碱性蛋白酶18～25份、中温α-淀粉酶15～25份、普鲁兰酶10～15份、木聚糖酶8～13份、甘露聚糖酶5～9份、葡聚糖酶12～17份、纤维素酶10～15份和果胶酶11～15份。
在本发明中的一些更优选实施方式中，按照重量份数计，所述复合生物酶包括：中性蛋白酶25份、碱性蛋白酶21份、中温α-淀粉酶18份、普鲁兰酶12份、木聚糖酶10份、甘露聚糖酶7份、葡聚糖酶14份、纤维素酶13份和果胶酶12份。
本发明中，一方面，中性蛋白酶和碱性蛋白酶组合可以快速降解植物蛋白，尤其是植物蛋白中占比较高的醇溶蛋白，为发酵过程中微生物菌剂的生长提供营养物质，使得微生物快速生长，形成种间优势，可以抑制发酵过程中杂菌的生长，提高原料发酵效率。另一方面，中温α-淀粉酶和普鲁兰酶能够快速的降解植物原料中的直链与支链的淀粉，同时与蛋白酶(中性蛋白酶和碱性蛋白酶)协同作用，可以加速淀粉与醇溶蛋白交联结构的快速分解，使得蛋白和淀粉得到充分降解而被有效利用。而且本发明中利用纤维素酶可以破坏植物原料纤维，促进木质素类物质的分解，为微生物的快速生长以及分解有机物提供有利的条件。
此外，本发明中复合生物酶酶解植物蛋白所生成的小分子肽、氨基酸和寡糖等多种营养混合物是植物乳杆菌快速生长的增殖剂；酶解后的多种小分子营养物质可以显著提高植物乳杆菌发酵菌的含量，同时保证发酵时间尽可能缩短，产生的大量有机酸，可以抑制有害杂菌的生长，同时也保证了发酵的风味。
在本发明的一些优选实施方式中，按重量份计，所述营养基质包括：小球藻多糖35～47份、蒙脱石粉36～43份、乳糖10～15份、琼脂培养基22～27份以及麦麸0.45～0.6份。
在本发明的一些更优选实施方式中，按重量份计，所述营养基质包括：小球藻多糖40份、蒙脱石粉39份、乳糖12份、琼脂培养基25份以及麦麸0.5份。
在本发明中的一些优选实施方式中，按照重量份数计，所述植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌的质量份数比为(2～7)：(1～4)：(1～5)：(1～4)：(1～4)。
在本发明中的一些更优选实施方式中，按重量份计，所述植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌的质量份数比为5：2：4：3：3。
在本发明的一些优选实施例中，所述植物乳杆菌有效活菌数为20.34～38.28亿cfu/克，酵母菌有效活菌数为6.75～9.45亿cfu/克，凝结芽孢杆菌有效活菌数为17.84～26.37亿cfu/克，地衣芽孢杆菌有效活菌数为6.38～15.62亿cfu/克，短芽孢杆菌有效活菌数为8.76～15.54亿cfu/克。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述植物乳杆菌有效活菌数为28亿cfu/克，酵母菌有效活菌数为8.15亿cfu/克，凝结芽孢杆菌有效活菌数为20.89亿cfu/克，地衣芽孢杆菌有效活菌数为6.38亿cfu/克，短芽孢杆菌有效活菌数为8.76亿cfu/克。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述生物酶制剂中水含量为5％～15％。
一方面，考虑到原料发酵中期，发酵温度升高，此时整体的反应环境处于温度较高且氧较少的状态，此时，需要依靠厌氧和耐高温的菌种对原料进行分解，以便为其他菌种快速生长提供有利的条件。本发明的生物酶制剂中含有植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌，通过这两种菌在低氧、温度较高的条件下生长产酸，抑制其他有害菌的生长，从而为进一步分解植物原料提供条件。另一方面，本发明中的短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌具有快速生长的能力，上述3种菌剂利用植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌生产的营养物质快速发展，协同植物乳杆菌的分解作用，对植物原料中抗营养因子进一步分解，大大提高植物原料蛋白的降解速率。
本发明的第二个方面，提供了一种本发明的第一方面所述的生物酶制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)按照本发明的第一方面的重量份，将中性蛋白酶、碱性蛋白酶、中温α-淀粉酶、普鲁兰酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶和果胶酶混合，得到复合生物酶；将小球藻多糖、蒙脱石粉、乳糖、琼脂培养基以及麦麸混合得到营养基质；将植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌混合，按照(5～10):1的重量比加入乳糖，孵育20h～30h，得到微生物混合菌剂；
(2)按相应重量份混合步骤(1)中得到复合生物酶和微生物混合菌剂，得到复合生物酶和微生物混合菌剂的混合物；
(3)按相应重量份将步骤(2)中得到的混合物与步骤(1)中制备的营养基质混合，干燥后得到所述生物酶制剂。
根据本发明第二方面的内容，在本发明的一些实施方式中，所述生物酶制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)按相应重量份，制备复合生物酶、营养基质以及微生物混合菌剂备用，具体步骤如下：
a、复合生物酶的制备：称取相应质量份数的酶，置于卧式混合搅拌机中搅拌混合，混合时间为2～5分钟，混合搅拌均匀后备用；
b、营养基质的制备：称取相应质量份数的各原料，置于卧式混合搅拌机中搅拌混合，混合时间为5～10分钟，混合搅拌均匀后备用；
c、微生物混合菌剂的制备：将培养好的各微生物菌剂在无菌条件下称取相应份数，放置于发酵罐中，进行混合培养，并在混合培养8～12h后向微生物混合菌剂中按照(5～10):1的重量比加入乳糖，继续培养到20～30h。
(2)按相应重量份数称取步骤(1)中制备好的复合生物酶和在微生物混合菌剂，置于搅拌罐中搅拌混合，混合时间为3～5分钟，得到复合生物酶和微生物混合菌剂的混合物；
(3)按相应重量份，将步骤(2)得到的混合物与(1)中制备的营养基质置于卧式混合搅拌机中搅拌混合，混合时间为5～10分钟，混合好后干燥后即得所述生物酶制剂。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述生物酶制剂中的原料按重量份计，包括复合生物酶35～60份、营养基质56～90份以及微生物混合菌剂8～17份。
在本发明的一些更优选的实施方式中，所述生物酶制剂中的原料按重量份计，包括复合生物酶40～55份、营养基质62～85份以及微生物混合菌剂13～16份。
在本发明中的一些优选实施方式中，步骤(1)中步骤a所述复合生物酶包括：中性蛋白酶、碱性蛋白酶、中温中温α-淀粉酶、普鲁兰酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶和果胶酶。
在本发明中的一些更优选实施方式中，步骤(1)中步骤a所述复合生物酶包括：中性蛋白酶20～30份、碱性蛋白酶18～25份、中α-温淀粉酶15～25份、普鲁兰酶10～15份、木聚糖酶8～13份、甘露聚糖酶5～9份、葡聚糖酶12～17份、纤维素酶10～15份和果胶酶11～15份。
在本发明中的一些更优选实施方式中，按照重量份数计，步骤(1)中步骤a所述复合生物酶包括：中性蛋白酶25份、碱性蛋白酶21份、中温α-淀粉酶18份、普鲁兰酶12份、木聚糖酶10份、甘露聚糖酶7份、葡聚糖酶14份、纤维素酶13份和果胶酶12份。
在本发明中的一些更优选的实施方式中，所述各生物酶的活力至少为5万U/g。
在本发明中的一些更优选的实施方式中，步骤(1)中步骤b所述营养基质采用本领域的常规技术手段制得。
在本发明中的一些优选的实施方式中，按照重量份数计，步骤(1)中步骤b所述营养基质包括：小球藻藻多糖35～47份、蒙脱石粉36～43份、乳糖10～15份、琼脂培养基22～27份、麦麸0.45～0.6份。
在本发明中的一些更优选的实施方式中，按照重量份数计，步骤(1)中步骤b所述营养基质包括：小球藻多糖40份、蒙脱石粉39份、乳糖12份、琼脂培养基25份、麦麸0.5份。
在本发明的一些优选的实施方式中，步骤(1)中步骤c所述的微生物混合菌剂包括植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌。
在本发明中的一些更优选实施例中，按照重量份数计，步骤(1)中步骤c所述的微生物混合菌剂中植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌的质量份数比为(2～7)：(1～4)：(1～5)：(1～4)：(1～4)。
在本发明中的一些更优选实施例中，按照重量份数计，步骤(1)中步骤c所述的微生物混合菌剂中植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌的质量比为5：2：4：3：3。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(1)中步骤c微生物混合菌剂的制备过程中，混合培养的温度为34℃。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(1)中步骤c微生物混合菌剂的制备过程中，微生物混合菌剂和乳糖的质量比为9：1。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(1)中步骤c微生物混合菌剂的制备过程中，微生物混合菌剂的有效活菌总数为50亿cfu/克以上。
在本发明中的一些更优选实施例中，步骤(1)中步骤c所述的微生物混合菌剂中植物乳杆菌有效活菌数为20.34～38.28亿cfu/克，酵母菌有效活菌数为6.75～9.45亿cfu/克，凝结芽孢杆菌有效活菌数为17.84～26.37亿cfu/克，地衣芽孢杆菌有效活菌数为6.38～15.62亿cfu/克，短芽孢杆菌有效活菌数为8.76～15.54亿cfu/克。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤(1)中步骤c所述的微生物混合菌剂中植物乳杆菌有效活菌数为28亿cfu/克，酵母菌有效活菌数为8.15亿cfu/克；凝结芽孢杆菌有效活菌数为20.89亿cfu/克，地衣芽孢杆菌有效活菌数为6.38亿cfu/克，短芽孢杆菌有效活菌数为8.76亿cfu/克。
在本发明的一些更优选的实施方式中，步骤(1)中步骤c中的各微生物菌剂的培养可以采用本领域中的常规技术手段进行培养，其中，培养基成分以及适合的生长条件如下：
(a)植物乳杆菌的培养基，按照重量份数计包含：牛肉膏2％～5％、蛋白胨2％～5％、酵母膏2％～3％、葡萄糖2％～4％、柠檬酸氢二铵0.5％～2％、吐温80 0.1％～0.2％、碳酸钙3％～4％和溴甲酚绿0.015％～0.030％，生长温度控制在34℃。
(b)酵母菌的培养基，按照重量份数计包含：酵母膏2％～5％、蛋白胨3％～4％、葡萄糖3％～5％和琼脂1.5％～2％，生长温度控制在30℃。
(c)凝结芽孢杆菌的培养基，按照重量份数计包含：葡萄糖2％～5％、玉米浆1％～1.5％g、淀粉2％～3％、硝酸钠1％～2％、磷酸氢二钠1％～2％、磷酸氢二钾0.5％～1％、磷酸二氢钾0.3％～0.5％、硫酸镁0.4％～0.5％和氯化钠0.3％～0.5％，生长温度控制在41℃。
(d)地衣芽孢杆菌的培养基，按照重量份数计包含：牛肉膏0.5～3％，蛋白胨1～5％，氯化钠0.5～1％和琼脂1.5～2％，pH 7.2～7.5；生长温度控制在37℃。
(e)短芽孢杆菌的培养基，按照重量份数计包含：蔗糖1～3％，蛋白胨1～2.5％，酵母粉0.55～2％和琼脂1.5～2％，pH 7.0，生长温度控制在40℃。
在本发明的一些更优选的实施方式中，上述培养基的成分以及适合的生长条件如下：
(a)植入乳杆菌的培养基，按照重量份数计包含：牛肉膏4.1％、蛋白胨3.8％、酵母膏2.5％、葡萄糖3.3％、柠檬酸氢二铵1％、吐温80 0.15％、碳酸钙3.5％、溴甲酚绿0.02％和琼脂2％，生长温度控制在34℃。
(b)酵母菌的培养基，按照重量份数计包含：酵母提取物3％、蛋白胨3.5％、葡萄糖3.8％和琼脂1.5％，生长温度控制在30℃。
(c)凝结芽孢杆菌的培养基，按照重量份数计包含：葡萄糖4％、玉米浆1.2％g、淀粉2.5％、硝酸钠1.5％、磷酸氢二钠1.2％、磷酸氢二钾0.7％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.4％和氯化钠0.4％，生长温度控制在41℃。
(d)地衣芽孢杆菌的培养基，按照重量份数计包含：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％和琼脂1.5％，pH 7.2～7.5；生长温度控制在37℃。
(e)短芽孢杆菌的培养基，按照重量份数计包含：蔗糖2％，蛋白胨2％，酵母粉1％和琼脂1.5％，pH 7.0，生长温度控制在40℃。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(3)中所述干燥温度为40～70℃。
本发明的第三个方面，提供了一种降解植物蛋白的方法，具体步骤为向所述植物蛋白中加入本发明的第一方面中的生物酶制剂，在30～40℃下进行酶解。
根据本发明第三方面的内容，在本发明的一些实施方式中，所述生物酶制剂和植物蛋白的质量比为(1～5)：1000。
在本发明的一些优选实施方式中，在酶解之前，将植物蛋白原料加入30℃的温水进行溶解，使其初始含水率为45％。
在本发明的一些优选实施方式中，酶解的详细步骤为：将生物酶制剂以适当水量稀释为液态，无稀释浓度要求，使其溶解在水里搅拌均匀即可，生物酶制剂和植物蛋白原料的质量比为(1～5)：1000。将稀释好的生物酶制剂喷洒于植物蛋白原料上，进行翻抛均匀后，装入酶解罐中，酶解温度为35℃。
在本发明的一些更优选实施方式中，生物酶制剂和植物蛋白原料的质量比为3：1000。
在本发明的一些更优选实施方式中，酶解的时间为2～3天。
在本发明的一些优选实施方式中，所述植物蛋白原料包括玉米蛋白粉、小麦蛋白粉、酒糟蛋白饲料(DDGS)、豌豆粉、菜籽粕、棉籽粕、小麦和大麦中的一种或几种。
本发明的第四个方面，提供了一种本发明第一个方面所述的生物酶制剂在降解植物蛋白原料中的应用，其中，所述植物蛋白原料包括玉米蛋白粉、小麦蛋白粉、酒糟蛋白饲料(DDGS)、豌豆粉、菜籽粕、棉籽粕、小麦和大麦中的一种或几种。
在本发明的一些优选实施方式中，生物酶制剂和植物蛋白原料的质量比为(1～5)：1000。
使用本发明生物酶制剂发酵过程中，减少了翻料的过程。这是因为在本发明的实施例方式中，微生物混合菌剂中各菌群的母株都是通过预培养筛选出活性最强的菌株。所以在发酵过程中，各菌群均可持续繁殖。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明中的生物酶制剂中利用了菌菌之间的协同作用，植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌在低氧和温度较高的条件下生长产酸，可以抑制其他有害菌的生长，且本发明中的短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌利用植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌生产的营养物质快速发展，协同植物乳杆菌共同发挥分解植物原料的作用，并且对植物原料中抗营养因子进一步分解。
2、本发明中利用了酶酶之间的协同作用，中性蛋白酶和碱性蛋白酶组合可以快速降解植物蛋白，尤其是植物蛋白中占比较高的醇溶蛋白，使得在发酵过程中原料得到充分的分解和利用。中温α-淀粉酶和普鲁兰酶能够快速降解植物原料中的直链与支链的淀粉，同时与蛋白酶(中性蛋白酶、碱性蛋白酶)协同作用，可以使得淀粉与醇溶蛋白交联的结构被快速分解，使得蛋白和淀粉得到充分降解而被有效利用。而且本发明中的纤维素酶可以破坏植物原料纤维，从而促进木质素类物质的分解。
3、本发明中利用了酶菌之间的协同作用，一方面，本发明中的生物酶制剂中的复合生物酶酶解可以产生小肽和还原糖等营养物质，有利于促进微生物菌剂的快速生长，另一方面，本发明提供的菌群可以对植物原料发酵过程中的有害菌进行强有力的抑制，通过菌酶之间的协同作用可以快速高效得分解植物蛋白原料，同时，还可以产生可被动物直接吸收和利用的小肽和氨基酸。
4、本发明中的生物酶制剂的制备方法简单，生物酶制剂配方精准高效，对植物蛋白原料尤其是针对含有较多醇溶蛋白的植物蛋白原料具有显著的酶解效果。
5、本发明中的生物酶制剂酶解过程稳定，重现性好，无需高含水量，在较短的时间就能达到快速降解植物蛋白原料的效果。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
表1为本发明实施例中所用到的菌株的具体信息。
表1本发明实施例中所用的菌株的具体信息
实施例1
微生物混合菌剂的制备
微生物混合菌剂的具体制备过程为：
(1)分别将植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌进行预培养，并筛选出各菌种的高效生长菌株。将植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌在各自的培养基中培养至高菌数含量状态，作为菌种备用。其中，各菌种在各自的培养基中的培养可以采用本领域的常规技术手段进行，各单一微生物所选择的培养基成分以及适合生长的条件如下：
(a)植物乳杆菌的培养基，按照重量份数计包含：牛肉膏4.1％、蛋白胨3.8％、酵母膏2.5％、葡萄糖3.3％、柠檬酸氢二铵1％、吐温80 0.15％、碳酸钙3.5％、溴甲酚绿0.02％和琼脂2％，生长温度控制在34℃；
(b)酵母菌的培养基，按照重量份数计包含：酵母提取物3％、蛋白胨3.5％、葡萄糖3.8％和琼脂1.5％，生长温度控制在30℃。
(c)凝结芽孢杆菌的培养基，按照重量份数计包含：葡萄糖4％、玉米浆1.2％g、淀粉2.5％、硝酸钠1.5％、磷酸氢二钠1.2％、磷酸氢二钾0.7％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.4％和氯化钠0.4％，生长温度控制在41℃。
(d)地衣芽孢杆菌的培养基，按照重量份数计包含：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％和琼脂1.5％，pH 7.2，生长温度控制在37℃。
(e)短芽孢杆菌的培养基，按照重量份数计包含：蔗糖2％，蛋白胨2％，酵母粉1％和琼脂1.5％，pH 7.0，生长温度控制在40℃。
(2)在无菌的条件下，将步骤(1)培养的植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌按重量份数比5：2：4：3：3称量，置于发酵罐中，于34℃下进行混合培养，并在混合培养8h后向微生物混合菌剂中按照9:1的重量比加入乳糖，继续培养到20h，有效活菌总数50亿cfu/克以上。
其中，微生物混合菌剂中：植物乳杆菌有效活菌数为28亿cfu/克，酵母菌有效活菌数为8.15亿cfu/克，凝结芽孢杆菌有效活菌数为20.89亿cfu/克，地衣芽孢杆菌有效活菌数为6.38亿cfu/克，短芽孢杆菌有效活菌数为8.76亿cfu/克。
实施例2
生物酶制剂的制备
本实施例中的生物酶制剂按照重量份数计包括复合生物酶48克、营养基质69克以及微生物混合菌剂15克。
生物酶制剂的制备方法，具体步骤为：
(1)按照上述相应重量份数，制备复合生物酶、营养基质以及微生物混合菌剂；
a、复合生物酶的制备：称取相应重量份数的酶，置于卧式混合搅拌机中搅拌混合，混合时间为2分钟，混合搅拌均匀后备用；其中，复合生物酶包括：中性蛋白酶25份、碱性蛋白酶21份、中温α-淀粉酶18份、普鲁兰酶12份、木聚糖酶10份、甘露聚糖酶7份、葡聚糖酶14份、纤维素酶13份和果胶酶12份；
b、营养基质制备：按重量份数计称取营养基质中各原料，置于卧式混合搅拌机中搅拌混合，混合时间为5分钟，混合搅拌均匀后备用；其中，营养基质中包含小球藻多糖40份、蒙脱石粉39份、乳糖12份、琼脂培养基25份和麦麸0.5份；
c、微生物混合菌剂按照实施例1中所制备方法制得。
(2)按相应重量份数称取步骤(1)中制备好的复合生物酶和微生物混合菌剂，置于搅拌罐中搅拌混合，混合时间为5分钟，得到生物酶和微生物混合菌剂的混合物；
(3)按相应重量份，将步骤(2)中得到的混合物与步骤(1)中制备的营养基质置于卧式混合搅拌机中搅拌混合，混合时间8分钟，混合好后在60℃下干燥至含水量为7％，即得生物酶制剂。
实施例3
本实施例中的生物酶制剂的制备方法同实施例2，区别在于，本实施例中的生物酶制剂包括复合生物酶35克、营养基质90克以及微生物混合菌剂17克。
本实施例中的复合生物酶包括：中性蛋白酶20份、碱性蛋白酶25份、中温α-淀粉酶15份、普鲁兰酶10份、木聚糖酶13份、甘露聚糖酶9份、葡聚糖酶12份、纤维素酶10份和果胶酶15份。
本实施例中的营养基质包括：小球藻多糖35份、蒙脱石43份、乳糖10份、琼脂培养基22份和麦麸0.6份。
本实施例中的微生物混合菌剂按照实施例1中所制备方法制得。
本实施例中的微生物混合菌剂中植物乳杆菌有效活菌数为38.28亿cfu/克，酵母菌有效活菌数为6.75亿cfu/克，凝结芽孢杆菌有效活菌数为26.37亿cfu/克，地衣芽孢杆菌有效活菌数为7.18亿cfu/克，短芽孢杆菌有效活菌数为10.63亿cfu/克。
实施例4
本实施例中的生物酶制剂的制备方法同实施例2，区别在于，本实施例中的生物酶制剂包括复合生物酶60克、营养基质56克以及微生物混合菌剂8克。
本实施例中的复合生物酶包括：中性蛋白酶30份、碱性蛋白酶18份、中温α-淀粉酶25份、普鲁兰酶15份、木聚糖酶8份、甘露聚糖酶5份、葡聚糖酶17份、纤维素酶15份和果胶酶11份。
本实施例中的营养基质包括：小球藻多糖47份、蒙脱石粉36份、乳糖15份、琼脂培养基27份和麦麸0.45份。
本实施例中的微生物混合菌剂按照实施例1中所制备方法制得。
本实施例中的微生物混合菌剂中植物乳杆菌有效活菌数为20.34亿cfu/克，酵母菌有效活菌数为9.45亿cfu/克，凝结芽孢杆菌有效活菌数为17.84亿cfu/克，地衣芽孢杆菌有效活菌数为15.62亿cfu/克，短芽孢杆菌有效活菌数为15.54亿cfu/克。
对比例1
对比例1采用的是市面上针对植物蛋白溶解的生物酶制剂(名称：植物蛋白水解复合酶，厂家：南宁庞博生物工程有限公司)。
对比例2
对比例2中的生物酶制剂的制备方法同实施例2，区别在于对比例2中的微生物混合菌剂中去除植物乳杆菌(缺少的质量用营养基质补齐)。
对比例3
对比例3中的生物酶制剂的制备方法同实施例2，区别在于对比例3中微生物混合菌剂中去除凝结芽孢杆菌(缺少的质量用营养基质补齐)。
对比例4
对比例4中的生物酶制剂的制备方法同实施例2，区别在于对比例4中微生物混合菌剂中去除地衣芽孢杆菌(缺少的质量用营养基质补齐)。
对比例5
对比例5中的生物酶制剂的制备方法同实施例2，区别在于对比例5中去除中α-温淀粉酶和普鲁兰酶(缺少的质量用营养基质补齐)。
对比例6
对比例6中的生物酶制剂的制备方法同实施例2，区别在于对比例6中去除中性蛋白酶和碱性蛋白酶(缺少的质量用营养基质补齐)。
实施例5试验例
玉米蛋白粉、小麦蛋白粉和DDGS分解试验
具体步骤为：
(1)将植物原料磨碎，加入30℃的温水，使其初始含水率为45％；
(2)将生物酶制剂以适当水量稀释为液态，无稀释浓度要求，使其溶解在水里搅拌均匀即可，按照重量份数计，本实施例中的生物酶制剂和植物原料的质量比为3：1000，将稀释好的生物酶制剂喷洒于植物蛋白原料上，翻抛均匀后，装入酶解罐中，酶解温度为35℃，酶解时间3天，酶解后测试醇溶蛋白的降解率和酸溶蛋白的含量。
其中，醇溶蛋白的降解率测试方法：
(1)醇溶蛋白的提取：称取一定量酶解后的产物于100mL碘量瓶中，按照固液比1:8(质量份)加入对应提取剂(玉米蛋白粉的提取剂为60％异丙醇，小麦蛋白粉的提取剂为60％正丙醇，DDGS的提取剂为异丙醇)，混合均匀，30℃振荡12h。在铺有快速滤纸的布氏漏斗上抽滤，将瓶中残渣全部洗至滤纸，用对应提取剂冲洗三遍。所得残渣105℃烘干1h，称取残渣质量。按照GB/T6432-2018中的检测粗蛋白含量的方法。
(2)植物原料醇溶蛋白降解率(％)＝(未酶解植物原料醇溶蛋白含量-酶解后植物残渣中醇溶蛋白含量)/未酶解植物原料醇溶蛋白含量×100。
其中，酸溶蛋白含量的检测方法：测定方法参考轻工业标准QB/T2653-2004
选取实施例2～4、对比例1～6中的生物酶制剂按实施例5中的方法对玉米蛋白粉、小麦蛋白粉和DDGS进行酶解实验。测试实施例2～4、对比例1～6中的生物酶制剂酶解植物蛋白原料后酸溶蛋白的含量，实验结果如表2所示：
表2实施例2～4、对比例1～6中生物酶制剂酶解植物蛋白原料后酸溶蛋白的含量(质量百分比％)(以占蛋白计)
从表2中实施例2～4、对比例1～6中的生物酶制剂酶解植物蛋白原料后酸溶蛋白的含量的结果可以看出，无论所选取的植物蛋白原料是玉米蛋白粉、小麦蛋白粉还是DDGS，使用实施例2～4中的生物酶制剂酶解植物蛋白原料后所产生的酸溶蛋白(以占蛋白计)的质量百分数均在70％以上。而对比例1～6中的生物酶制剂酶解植物蛋白原料后所产生的酸溶蛋白(以占蛋白计)的质量百分数则远远低于实施例2～4中的生物酶制剂酶解植物蛋白原料后所产生的酸溶蛋白(以占蛋白计)的含量。以上结果表明，使用本发明实施例2～4中的生物酶制剂相比于目前市面上针对植物蛋白溶解的生物酶制剂产品具有较好的降解植物蛋白原料的效果，且本发明实施例2～4中的生物酶制剂中充分利用了酶酶之间、酶菌之间和菌菌之间的协同作用，缺少任一成分都会影响本发明实施例中的生物酶制剂对植物蛋白原料的降解效果。
选取实施例2～4、对比例1～6中的生物酶制剂按实施例5中的方法对玉米蛋白粉、小麦蛋白粉和DDGS进行酶解实验。测试实施例2～4、对比例1～6中的生物酶制剂酶解植物蛋白原料后对醇溶蛋白的降解情况，实验结果如表3所示：
表3实施例2～4、对比例1～6中的生物酶制剂酶解植物原料后醇溶蛋白的降解率(％)
从表3中实施例2～4、对比例1～6中生物酶制剂酶解植物原料后醇溶蛋白的降解率结果可以看出，无论所选取的植物蛋白原料是玉米蛋白粉、小麦蛋白粉还是DDGS，使用实施例2～4中的生物酶制剂的醇溶蛋白降解率均在80％以上。相反，对比例1～6中的生物酶制剂酶解植物原料的醇溶蛋白的降解率较低，基本上都在50％以下。上述结果表明本发明实施例2～4中的生物酶制剂具有较好的降解植物原料蛋白的作用，尤其是对醇溶蛋白具有较好的降解效果。同样，本发明实施例中的生物酶制剂，充分利用了酶酶之间、酶菌之间和菌菌之间的协同作用，缺少任一成分都会影响本发明实施例中的生物酶制剂对植物原料中的醇溶蛋白的降解效果。
植物蛋白原料中所含有的醇溶蛋白具有一些特殊的物理化学性质使其不能被动物内源酶消化。研究表明，醇溶蛋白不溶于水，一般仅溶于50％～90％的醇溶剂中，还可以溶于强碱、十二烷基硫酸钠(SDS)、丙二醇和醋酸等有机溶剂，中性及碱性条件下不稳定而容易分解，酸性条件下稳定，而且其分子组成、形状与结构也具特殊性。醇溶蛋白中含有大量疏水性氨基酸，在分子内部以二硫键、氢键相结合，并在多肽主链上形成α—螺旋体。所以当饲料中添加大量含有醇溶蛋白的原料时，需要考虑醇溶蛋白的消化利用问题，使资源能充分利用。
对比例7
对比例7和实施例3的生物酶制剂的组成和制备步骤相同，区别在于对比例7中没有加混合微生物菌剂(缺少的质量用营养基质补齐)。
对比例8
对比例8和实施例3中的生物酶制剂的组成和制备步骤相同，区别在于对比例8中改变了复合生物酶和微生物混合菌剂的比例。对比例8中的生物制剂包括复合生物酶35克、营养基质90克及微生物混合菌剂2克(缺少的质量用营养基质补齐)。
对比例9
对比例9和实施例3中的生物酶制剂的组成和制备步骤相同，区别在于对比例9中改变了复合生物酶的配比。
所述复合生物酶包括：中性蛋白酶10份、碱性蛋白酶35份、中温α-淀粉酶35份、普鲁兰酶5份、木聚糖酶20份、甘露聚糖酶15份、葡聚糖酶5份、纤维素酶20份和果胶酶5份。
对比例10
对比例10和实施例3中的生物酶制剂的组成和制备步骤相同，区别在于对比例10中改变了微生物混合菌剂的配比。
微生物混合菌剂：植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌按1：5：7：0.5：6的质量比进行混合培养。
实施例6试验例
采用实施例5中的测试方法，将实施例3、对比例7～10中的生物酶制剂做小麦蛋白粉的酶解实验，实验结果如表4所示：
表4实施例3、对比例7～10中的生物酶制剂分解小麦蛋白粉后酸溶蛋白的含量(质量百分比％)(以占蛋白计)以及醇溶蛋白的降解率(％)
| 原料 | 酸溶蛋白含量(％) | 醇溶蛋白降解率(％) |
| 实施例3 | 73.12 | 80.36 |
| 对比例7 | 42.96 | 45.87 |
| 对比例8 | 46.14 | 50.08 |
| 对比例9 | 59.04 | 51.25 |
| 对比例10 | 61.03 | 56.79 |
表4为本发明实施例3和对比例7～10中的生物酶制剂酶解小麦蛋白粉后酸溶蛋白的含量及醇溶蛋白降解率情况，从表4可以看出，实施例3中的生物酶制剂对小麦蛋白粉具有较好的分解作用，且对醇溶蛋白的降解率较高，而对比例7～10中的生物酶制剂对小麦蛋白粉的分解作用较差，且对醇溶蛋白的降解率较低。以上实验结果表明，本发明实施例中的生物酶制剂中的成分以及各成分的配比对本发明实施例中制备的生物酶制剂对植物原料蛋白的酶解效果有很大的影响。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (10)
1.一种生物酶制剂，其特征在于，所述生物酶制剂包括复合生物酶、营养基质以及微生物混合菌剂；
所述复合生物酶包括：中性蛋白酶、碱性蛋白酶、中温α-淀粉酶、普鲁兰酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶和果胶酶；
所述营养基质包括：小球藻多糖、蒙脱石粉、乳糖、琼脂培养基以及麦麸；
所述微生物混合菌剂包括：植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌。
2.根据权利要求1所述的生物酶制剂，其特征在于，按重量份计，所述生物酶制剂中包括复合生物酶35～60份、营养基质56～90份以及微生物混合菌剂8～17份；优选的，所述生物酶制剂中包括复合生物酶40～55份、营养基质62～85份以及微生物混合菌剂13～16份。
3.根据权利要求1所述的生物酶制剂，其特征在于，按重量份计，所述复合生物酶包括：中性蛋白酶20～30份、碱性蛋白酶18～25份、中温α-淀粉酶15～25份、普鲁兰酶10～15份、木聚糖酶8～13份、甘露聚糖酶5～9份、葡聚糖酶12～17份、纤维素酶10～15份和果胶酶11～15份。
4.根据权利要求1所述的生物酶制剂，其特征在于，按重量份计，所述营养基质包括：小球藻多糖35～47份、蒙脱石粉36～43份、乳糖10～15份、琼脂培养基22～27份以及麦麸0.45～0.6份。
5.根据权利要求1所述的微生物混合菌剂，其特征在于，按重量份计，所述微生物混合菌剂中植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌的质量份数比为(2～7)：(1～4)：(1～5)：(1～4)：(1～4)。
6.根据权利要求1所述的生物酶制剂，其特征在于，所述生物酶制剂中水含量为5％～15％。
7.一种权利要求1～6任一项所述的生物酶制剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)按照权利要求2～5中的重量份，将中性蛋白酶、碱性蛋白酶、中温α-淀粉酶、普鲁兰酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、纤维素酶和果胶酶混合，得到复合生物酶；将小球藻多糖、蒙脱石粉、乳糖、琼脂培养基以及麦麸混合得到营养基质；将植物乳杆菌、酵母菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短芽孢杆菌混合，按照(5～10):1的重量比加入乳糖，孵育20h～30h，得到微生物混合菌剂；
(2)按相应重量份混合步骤(1)中得到复合生物酶和微生物混合菌剂，得到复合生物酶和微生物混合菌剂的混合物；
(3)按相应重量份将步骤(2)中得到的混合物与步骤(1)中制备的营养基质混合，干燥后得到所述生物酶制剂。
8.一种降解植物蛋白的方法，其特征在于，向所述植物蛋白中加入权利要求1～6中任意一项所述的生物酶制剂，在30～40℃下进行酶解；所述生物酶制剂和植物蛋白的质量比为(1～5)：1000。
9.权利要求1～6中任一项所述的生物酶制剂在降解植物蛋白原料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物蛋白原料包括玉米蛋白粉、小麦蛋白粉、酒糟蛋白饲料、豌豆粉、菜籽粕、棉籽粕、小麦和大麦中的一种或几种。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117362084A (zh) * | 2023-10-27 | 2024-01-09 | 中山市承铭农业技术开发有限公司 | 一种利用黄豆制作氨基酸水溶肥及生产工艺 |
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| CN114097926B (zh) | 2023-02-28 |
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Denomination of invention: A biological enzyme preparation for rapid degradation of plant protein and its preparation method Granted publication date: 20230228 Pledgee: Ganzhou Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: Boon Group Co.,Ltd. Registration number: Y2024980014223 |