CN107011423A - 蛋白产品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

蛋白产品及其制备方法。本发明提供了一种从原料中富集α‑醇溶蛋白的方法，所述原料包含醇溶蛋白和非醇溶蛋白，并且任选包含大分子碳水化合物和/或油脂，其特征在于，所述方法不使用有机溶剂，并包括下述步骤：(1)将所述原料粉碎并调浆；(2)采用蛋白酶处理，将原料中的至少一部分β‑醇溶蛋白、γ‑醇溶蛋白和非醇溶蛋白进行完全水解或部分水解，并利用粒径差异过滤去除水解产物，从而得到α‑醇溶蛋白得以富集的粗产物；(3)将所述粗产物洗涤、脱水、干燥，得到最终产品。

Description

蛋白产品及其制备方法

技术领域

本发明涉及从原料中富集α-醇溶蛋白的方法以及提纯得到蛋白产品的方法，还涉及由上述方法得到的蛋白产品，属于农作物加工领域。

背景技术

玉米醇溶蛋白(玉米朊，zein)是一种从玉米或含玉米蛋白的物质、如玉米黄粉饲料(又称玉米蛋白粉，corn gluten meal)或玉米干酒糟及可溶物(DDGS)等产品中提取的产品。醇溶蛋白是玉米胚乳中含量最高的蛋白，占玉米胚乳蛋白中的44wt％～79wt％。玉米黄粉主要从玉米淀粉湿法生产中获得。在玉米湿法生产中，首先制备亚硫酸浸泡玉米，浸泡水与玉米分离后进行蒸发得到玉米浆，玉米随后进行一次和二次破碎分离出胚芽，接着胚乳经过精磨分离出纤维，并将淀粉乳经过预浓缩后在主分离步骤中将麸质分离出来，淀粉经过洗涤后经过脱水、干燥的成品；而上述的麸质经过浓缩、脱水、干燥后制得玉米黄粉；上述胚芽经过脱水、干燥并提取玉米油后得到胚芽粕，上述纤维经过脱水干燥后与胚芽粕分别喷玉米浆后得到纤维蛋白饲料、高粕饲料等产品。

玉米醇溶蛋白作为《中国药典(2010)》中的药用辅料，也获得了美国FDA批准，是公认安全(GRAS)的可直接加入食品中的物质。玉米蛋白质具有表面活性及独特的成膜特性，可作为药剂靶向疏松载体、食品保鲜涂膜、生物可降解包装材料、口香糖、蛋白纤维等，在食品、医药、化工等领域应用日趋广泛。

玉米醇溶蛋白属于醇溶性蛋白质，可以溶于乙醇、异丙醇或丙酮的水溶液，在纯水或无水乙醇中不溶。主要包含四种组分，即α-醇溶蛋白(约占玉米醇溶蛋白的70wt％～85wt％)、β-醇溶蛋白(约占1wt％～5wt％)、γ-醇溶蛋白(约占10wt％～20wt％)和δ-醇溶蛋白(约占1wt％～5wt％)(Cereal Chemistry,2011,88(2):159-173)。其中，α-醇溶蛋白是最主要的商业化玉米醇溶蛋白。加工制备玉米醇溶蛋白工艺主要利用不同醇溶蛋白组分在提取溶剂中的溶解度差别。上述在玉米湿磨工艺中产出的玉米黄粉，蛋白干基含量为约65wt％左右，还主要包含约15wt％～20wt％的淀粉、10wt％～13wt％的纤维以及约6wt％的脂肪，也是商业化玉米醇溶蛋白提取的主要原料之一。商业化工艺主要采用Swallen1941年的专利(US2287649A)和Carter与Reck 1970年的专利(US3535305)，如图3所示。用异丙醇或95％乙醇(v/v)在较高的pH值和温度(50-60℃)分批或连续处理玉米黄粉，提取物过滤或离心，再用过量的冷水或低温(-10℃～-25℃)沉淀醇溶蛋白，经真空干燥磨粉得成品。当然，制备玉米醇溶蛋白还有其他或改进工艺，但都是使用有机溶剂(US6602985B1；Cereal Chemistry Journal,2006,83(5):565-568；Cereal Chemistry,2011,88(4):356-362)或有机酸(Cereal Chemistry,2008,85(2):202-206)为提取剂的工艺方案。

也有研究者对蛋白原料的非蛋白杂质进行研究脱除，提高玉米总蛋白含量，或由此提高后续溶剂提取的效率。蔡木易等人在专利CN101390564中公开了一种使用碱热处理玉米黄粉从而使得部分淀粉、脂肪和色素变为可溶从而除去，从而获得以醇溶蛋白和谷蛋白为主的分离蛋白产品。但由于黄粉中存在与纤维或蛋白连接的淀粉，并且色素(主要是玉米黄质)嵌合于蛋白内部，所以很难通过单一糊化或皂化作用而除去。美国CPC公司及日本昭和产业株式会社采用冷冻脱色生产白色玉米朊(JP2004059537)，但该工艺涉及甲醇、丙酮等有安全隐患的试剂的使用。Sessa在专利US20080242842中公开一种使用沸石和活性炭对溶解于醇溶液的醇溶蛋白进行脱色和脱臭的方法。另外，也有人使用正己烷或者乙酸乙酯等溶剂对醇溶蛋白低水分原料或成品进行脱色脱臭。另外，通过溶剂或者脂肪酶等酶类脱除其中的脂肪从而进一步提高总蛋白纯度；以及通过化学试剂如臭氧、过硫酸或过氧化物或者酶(如脂肪氧合酶等)来脱色。但是，过高的加热温度还会导致来自蛋白中的氨基酸残基参与生成某些有害物质，如当温度大于100℃时，半胱氨酸和蛋氨酸会与葡萄糖反应形成有毒物质——丙烯酰胺(Food Chemistry，4th revisedand extended edition，H.-D.Belitz、W.Grosch和P.Schieberle编著，第25-29页)。Liaw等人(US5968585A)利用膜分离技术将胚乳中的淀粉与蛋白分开，得到蛋白干基含量在约70wt％的料液。目前制备玉米醇溶蛋白的有机溶剂或有机溶剂水溶液的各种提取工艺依然存在溶剂损失、使用成本高、溶剂废水处理难度大、大幅升降温操作能耗大的问题，需要进一步予以解决。另外，在提取过程中会发生的凝胶化是有机溶剂或有机溶剂水溶液提取分离工艺的另一个弊端，主要由于γ-醇溶蛋白的存在而引起(Journal of Agricultural and Food Chemistry 60(7):1742-1747)。有工艺方法将pH调节到11.5在70℃保温30min来防止凝胶，然而蛋白在强碱的环境中会发生部分肽键水解以及天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺或者巯基的破坏，另外在后期调酸步骤也会使得体系产生较多的盐分。也有研究使用90％乙酸-水溶液(v/v)提取醇溶蛋白，但是其中的含脂量高于醇提蛋白产品，并且作为材料的拉伸强度也较低(Selling G W,WoodsK K.Improved Isolation of Zein from Corn Gluten Meal Using Acetic Acidand Isolate Characterization as Solvent[J].Cereal Chemistry,2008,85(2):202-206)。也有技术通过化学处理将醇提的醇溶蛋白改性为水性应用的产品(CN103781796A)。但目前没有一种在完全不含有机溶剂(如乙醇、异丙醇等)或高含量有机酸(如90％乙酸)的水相体系中生产醇溶蛋白的工艺方法。

发明内容

寻找一种醇溶蛋白的新型生产工艺，同时更有效地利用相关原料中的其他组分资源成为摆在本领域技术人员面前的难题，但也最为可能成为降低生产成本有效途径。因此，提供一种从包含醇溶性蛋白的原料中在无有机溶剂的温和酸碱度(pH＝3～11)条件下分离出的醇溶蛋白产品将是十分有益的。提供生产该产品的方法也将是十分有益的。提供实施该方法的系统也将是十分有益的。

本发明人通过对玉米蛋白原料中的各组分，包括不同蛋白组分研究后首次发现：针对其中不同组分、尤其是蛋白组份，可使用相应的酶和分离方法，在完全不包含有机溶剂的水相环境(具有温和的酸碱度，pH＝3～11)中即可达到纯化玉米醇溶蛋白、尤其是α-醇溶蛋白的效果，并且可以控制β-/γ-醇溶蛋白的在产品中的含量；同时形成多种有用的副产品，从而给淀粉或乙醇生产企业对玉米蛋白的深度开发利用带来良好的契机。

本发明的第一方面涉及一种从原料中富集α-醇溶蛋白的方法，所述原料包含醇溶蛋白和非醇溶蛋白，并且任选包含大分子碳水化合物(本发明中的大分子碳水化合物主要包括淀粉和纤维素)和/或油脂，其特征在于，所述方法不使用有机溶剂，并包括下述步骤：

(1)将所述原料粉碎并调浆；

(2)采用蛋白酶处理，将原料中的至少一部分β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白和非醇溶蛋白进行完全水解或部分水解，并利用粒径差异过滤去除水解产物，从而得到α-醇溶蛋白得以富集的粗产物；

(3)将所述粗产物洗涤、脱水、干燥，得到最终产品。

本发明的第二方面涉及一种从原料中提纯得到蛋白产品的方法，所述原料包含β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白和非醇溶蛋白，并且任选包含大分子碳水化合物和/或油脂，其特征在于，所述方法不使用有机溶剂，并包括下述步骤：

(1)将所述原料粉碎并调浆；

(2)采用水解酶处理，对原料中的至少一部分大分子碳水化合物进行完全水解或部分水解，并利用粒径差异过滤去除水解产物，从而得到蛋白粗产物；

(3)将所述蛋白粗产物洗涤、脱水、干燥，得到最终的蛋白产品。

本发明的第三方面涉及根据本发明的上述方面制得的蛋白产品，所述蛋白产品包含醇溶蛋白和碳水化合物，其特征在于，所述醇溶蛋白占蛋白干基的70wt％以上；同时，α-醇溶蛋白占所述醇溶蛋白的75wt％以上，β-醇溶蛋白占所述醇溶蛋白的20wt％以下，γ-醇溶蛋白占所述醇溶蛋白的6wt％以下。

在本发明上述方面优选的实施方式中，原料选自于由玉米黄粉、玉米胚乳发酵醪和酒糟所组成的组。

在本发明上述方面优选的实施方式中，蛋白酶为选自于由羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、巯基蛋白酶所组成的组中的一种或多种。优选地，所述羧基蛋白酶为霉菌羧基蛋白酶，优选曲霉羧基蛋白酶，更优选米曲霉羧基内切蛋白酶；所述丝氨酸蛋白酶为芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶，优选枯草杆菌的丝氨酸内切蛋白酶；所述金属蛋白酶为霉菌或芽孢杆菌的金属蛋白酶，优选米曲霉金属内切蛋白酶或枯草芽孢杆菌金属内切蛋白酶；所述巯基蛋白酶为来源于植物的巯基蛋白酶，优选菠萝蛋白酶和/或木瓜蛋白酶。

在本发明上述方面优选的实施方式中，水解酶选自于由α淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、普鲁兰酶、木聚糖酶、果胶酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶所组成的组中的一种或多种。优选地，所述α淀粉酶为霉菌或细菌的α淀粉酶，优选霉菌α淀粉酶，更优选曲霉α淀粉酶；所述糖化酶为霉菌葡萄糖淀粉酶，优选曲霉或木霉葡萄糖淀粉酶；所述纤维素酶为霉菌纤维素酶，优选木霉纤维素酶；所述β-葡聚糖酶为真菌或细菌β-葡聚糖酶；所述普鲁兰酶为杆菌普鲁兰酶。

在本发明上述方面优选的实施方式中，在进行所述蛋白酶处理或水解酶处理时，任选加入试剂组合物对酶进行调节，所述试剂组合物为选自于由以下物质所组成的组中的一种或多种：能够打开蛋白中的二硫键的化合物，例如含磷化合物或含硫化合物，其中含磷化合物优选三(2-羧乙基)膦，含硫化合物优选含自由巯基的化合物和/或可提供亚硫酸根的化合物，更优选巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸及包含半胱氨酸的寡肽(由2-10个氨基酸组成的肽)、亚硫酸盐、亚硫酸、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐；金属离子，优选碱金属离子、碱土金属离子、二价过渡金属离子，更优选钠离子、钾离子、镁离子、钙离子、锰离子、钴离子、锌离子；金属螯合剂，优选EDTA、EGTA。

在本发明上述方面优选的实施方式中，蛋白酶处理在下述条件下进行：pH 3.5～10.5，优选3.8～10；处理温度20℃～65℃，优选35℃～55℃；处理时间0.2h～10h，优选0.5h～5h。更优选地，所述条件选自于：pH4.8、45℃；pH7.5、52℃；pH3.8、35℃；pH8.3、52℃；pH8.5、65℃；pH6.5、45℃；pH8.0、45℃；pH10.2、45℃；pH4.2、35℃；pH6.5、45℃；pH4.8、55℃；pH4.8、53℃；pH7.2、53℃；pH7.5、25℃；pH10.1、55℃。

在本发明上述方面优选的实施方式中，水解酶处理在如下条件下进行：pH 3～8，优选3.3～7.5，更优选4～6.5，最优选4.5～5.5；处理温度30℃～72℃，优选35℃～63℃，更优选40℃～60℃，最优选45℃～55℃；处理时间0.5h～12h，优选1h～10h，更优选2h～8h，最优选2h～7h；更优选地，上述水解酶处理条件选自于：pH5.0、63℃；pH5.5、50℃；pH3.0、35℃；pH6.5、45℃；pH4.0、40℃；pH6.5、45℃；pH4.5、60℃；pH8、45℃；pH5、55℃；pH7.5、50℃；pH3.5、30℃；pH5.6、50℃。

在本发明上述方面优选的实施方式中，过滤采用1μm～80μm、优选10μm～50μm的过滤孔径进行，或者采用10nm～10μm、优选20nm～1μm的膜过滤孔径进行。

在本发明上述方面优选的实施方式中，醇溶蛋白占所述蛋白干基的74wt％以上、优选80wt％以上、更优选85wt％以上、进一步优选90wt％以上、进一步更优选95wt％以上、最优选97wt％以上，α-醇溶蛋白占所述醇溶蛋白的77wt％以上、优选85wt％以上、更优选90wt％以上、进一步优选95wt％以上、最优选100wt％，β-醇溶蛋白占所述醇溶蛋白的10wt％以下、优选5wt％以下、更优选3wt％以下、进一步优选2wt％以下、最优选0％，γ-醇溶蛋白占所述醇溶蛋白的10wt％以下、优选5wt％以下、更优选2wt％以下、最优选0％，蛋白干基占所述蛋白产品的85wt％以上、优选90wt％以上、更优选94wt％以上、最优选99wt％以上。

与现有技术醇溶蛋白制备的方法相比，本申请所涉及的技术方案具有如下优点：

本发明所述的醇溶蛋白产品中的总蛋白含量以及α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白的含量与使用乙醇、异丙醇等其他有机溶剂按照传统提取方法所得产品无明显差别。α-醇溶蛋白是提供产品成膜性等功能性的最主要蛋白组分。本发明所述的醇溶蛋白产品中的α-醇溶蛋白在总蛋白中的含量可以高于传统工艺制备的产品。

在无须进行单独的脱色工艺的情况下，本发明所述的醇溶蛋白产品的色泽比传统方法制备的黄色醇溶蛋白产品的颜色更浅，且可接近白色，亦比传统方法制得的产品具有更低的玉米特征性气味，产品的应用范围更宽和单食品样品用量可以更大而不影响原食品表观和风味。

本发明所述的醇溶蛋白产品与使用乙醇、异丙醇等其他有机溶剂按照传统提取方法所得产品在如醇溶液溶解性、成膜性、成纤维性、成型性、制备微球特性、可降解性等功能特性方面无明显差别，有些特性、如微球水溶液稳定性等甚至优于传统工艺制备的产品。

本发明所述的醇溶蛋白产品的制备方法可以一步实现在专一性保留α-醇溶蛋白的同时任意调节β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白在产品中的含量，而不需要按照传统制备方法中使用有机溶剂的水溶液，并且通过调节有机溶剂的浓度来分步分离α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白和γ-醇溶蛋白。

本发明所述的醇溶蛋白产品的制备方法，由于在全水相体系中进行，即便保留γ-醇溶蛋白也可完全避免制备过程中的物料凝胶化的发生，即可产出保留有γ-醇溶蛋白的产品，从而大大拓宽了醇溶蛋白产品的类型。

本发明所述的醇溶蛋白产品的制备方法，在淀粉低度降解(DE值<40)或淀粉非糊化状态的条件下，即可实现淀粉及其衍生品与醇溶蛋白的分离。

本发明所述的醇溶蛋白产品的制备方法在产出醇溶蛋白产品同时，可联产粗糖产品或寡糖、二糖、单糖产品的精制原料、其他饲料级或食品级蛋白类副产品。

本发明所述的醇溶蛋白产品的制备方法相比传统制备方法，无须专门脱色、脱臭工艺即可获得色泽明亮、乳白，原有特征性气味平淡的醇溶蛋白产品。

就本发明所述的醇溶蛋白产品的制备方法所涉及的过程而言，由于整个过程只使用水为媒介，而不使用传统提取工艺中所使用的乙醇、丙酮、正己烷、乙酸乙酯等属于火灾危险性甲类的溶剂，因此车间防爆等级较低，生产过程安全性好。

本发明所述的醇溶蛋白产品的制备方法所涉及的设备为化工过程、食品药品加工常用设备，设备投入成本较低。并且，所用原料不需要脱水干燥即可进行制备，可降低部分能耗。

附图说明

图1是本发明所述的醇溶蛋白生产工艺的工艺流程示意图。

图2A和2B是本发明所述的实施醇溶蛋白生产工艺的生产设备示意图。

图3为现有技术中的玉米醇溶蛋白的主要加工工艺。

图4A-4E为示例的原料和不同玉米蛋白产品中的蛋白质组分在进行还原性十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳后的电泳图(下)及光密度值分析图(上)。其中，A为原料；B为乙醇提取(传统方法)的α-醇溶蛋白产品；C为本专利方法得到的α-醇溶蛋白产品；D和E均为本专利方法得到的醇溶蛋白组合物产品。

图5为玉米醇溶蛋白为实施例1-6与对比例所得的玉米醇溶蛋白制得的膜的拉断应力表。

具体实施方式

下面结合附图对本发明所提供的玉米蛋白及其制备方法作进一步的详细说明。

图1为从玉米醇溶蛋白原料中提取醇溶蛋白的工艺流程示意图。将原料102加水调节104后进行磨浆106，通过108得到大小合适的物料颗粒，含该物料颗粒的浆液进入分别由酶解系统112和分离系统114通过串联、并联或串并联组成的酶解分离系统110中，在110中降解物料中的一部分如淀粉、纤维等的碳水化合物以及降解或/和修饰非醇溶蛋白组份并将组分分离。通过110得到富含醇溶蛋白的分离物116进入洗涤系统124，而后将得到富含醇溶蛋白的分离物126进行干燥128后得到醇溶蛋白产品。通过110还可得到富含蛋白分离物118，进入干燥系统132或进行精制130后进入干燥系统132，得到蛋白类产品。通过110还可得到富含碳水化合物分离物120，可进入碳水化合物回收系统132进行利用。酶解分离系统110产出的废水和洗涤系统产生的洗涤水进入水处理系统136。

玉米醇溶蛋白生产工艺在实施过程中所用的设备在图2中进行示例性的说明。基本相同的设备用于不同的原料(如玉米黄粉、玉米胚乳发酵醪、干酒糟)和目的物(包含β-和γ-醇溶蛋白并富含α-醇溶蛋白的醇溶蛋白、包含β-醇溶蛋白并富含α-醇溶蛋白的醇溶蛋白、α-醇溶蛋白)。根据一个示例性的实施方式，所用的原料为玉米黄粉浆。根据另一个实施方式，所用的原料可为玉米胚乳发酵醪干粉。

图2A为从玉米黄粉浆中提取醇溶蛋白的工艺流程示意图。根据一个示例性的实施方式，将玉米黄粉浆202加水在调节罐204混合后进入粉碎机206中，例如可使用胶体磨。

根据一个示例性的实施方式，将204中的物料水分调节到95％；根据一个优选的实施方式，将水分调节到75％～90％。

如图所示，料液通过过滤器208后与酶(如复合纤维素酶)、试剂组合物(如氢氧化钠、焦亚硫酸钠)、水、蒸汽等进入第一酶解反应器210。完毕后依次进入第一分离器212和214，如旋流分离器，所得醇溶蛋白的物料与酶(如蛋白酶)、试剂组合物(如氢氧化钠、二价锰离子、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na))、水、蒸汽等进入第二酶解反应器216反应，而后进入离心机218，如三相碟式离心机。

根据一个示例性的实施方式，216中的物料使用氢氧化钠调节pH至7.5，添加占蛋白重量0.3％的枯草杆菌中性蛋白酶和0.5％的枯草杆菌碱性蛋白酶、0.1mM Mn²⁺在55℃下进行1.5小时后添加0.05mMEDTA-2Na。

如图所示，离心机218所得醇溶蛋白的物料与酶(如淀粉酶)、试剂组合物(如盐酸)、水、蒸汽等进入第三酶解反应器220。反应完毕后依次进入过滤装置222和224，并在224中实现洗涤后进入干燥器228得到醇溶蛋白成品。

根据示例性的实施方式，装置222(例如可以是微滤膜装置)和224(例如可以是板框压滤机)可实现非醇溶蛋白组份与醇溶蛋白的最终分离。

如图所示，离心机218所得的非醇溶蛋白的蛋白组分可以与酶(如蛋白酶)、试剂组合物(如盐酸)、水、蒸汽等进入酶解反应器230进一步处理后通过过滤机组232(如100nm～20nm超滤膜组)选择透过并浓缩后，通过色谱柱234(如离子交换柱)精制后干燥得蛋白产品。212、214含碳水化合物料液可进行回收；218的第三相料液和224的洗涤水可进入水处理系统。

图2B为从玉米胚乳发酵醪干粉中提取高纯度α-醇溶蛋白的工艺流程示意图。根据一个示例性的实施方式，将玉米黄粉通过粉碎机240粉碎后(如辊压机)，进入调节罐242加水混合，打入磨浆机244中，通过过滤器246后进入反应器248中。

根据示例性的实施方式，过滤器246可具有例如200目的过滤孔径。

如图所示，料液与酶(如复合纤维素/淀粉酶)、试剂组合物(如氢氧化钾)、水、蒸汽等进入第一反应器248反应完毕后打入过滤器250中。

根据示例性的实施方式，过滤器250可具有例如300目的过滤孔径。

如图所示，通过250的物料进入到分离机252(如卧螺离心机)中进行分离，所得含醇溶蛋白的重相物料与酶(如蛋白酶)、试剂组合物(如氢氧化钠、二价钙离子)、水、蒸汽等进入第二酶解反应器254中反应。过滤器250的截留物和分离机252的清液可进行碳水化合物回收。

根据示例性的实施方式，254还可以是两个串联的酶反应器组(254-1和254-2)，在254-1反应器中物料使用盐酸调节pH至4.2，添加占蛋白重量0.8％的真菌酸中性蛋白酶、蛋白重量1％的三(2-羧乙基)膦，在45℃下进行2小时。而后进入254-1反应器使用氢氧化钾调节pH至8.3，添加占蛋白重量0.3％的枯草杆菌碱性蛋白酶和0.1mM Ca²⁺在50℃下进行0.5小时反应。

如图所示，254打出的物料进入到过滤器256中进行分离，截留物料进入过滤机258，进行水洗(260)后进入干燥机262(如冷冻干燥机)，粉碎机264粉碎后得到高纯度α-醇溶蛋白产品。过滤器256中透过物料进入过滤机266中，截留物料经过洗涤(268)后进入干燥器270(如管束干燥及)干燥，并由粉碎机272(如锤式粉碎机)粉碎后得蛋白饲料产品。过滤机258和266的透过料液排入水处理系统。

根据示例性的实施方式，过滤机258可具有例如500目的过滤孔径。

下表1中列出了玉米醇溶蛋白提取的工作参数，其为各个操作步骤提供了典型范围、优选范围。原料粉碎粒径的典型范围为2～150μm。原料粉碎粒径的优选范围为10～100μm(粒径与目数可查表换算)。原料的水分调节的典型范围为含水50％～95％。原料的水分调节的优选范围为含水75％～90％。蛋白酶添加量的典型范围为原料中蛋白重量的0.01wt％～10wt％。蛋白酶添加量的优选范围为原料中蛋白重量的0.1wt％～3wt％。蛋白酶酶解pH的典型范围为3.5～10.5。蛋白酶酶解pH的优选范围为3.8～10。蛋白酶酶解温度的典型范围为20℃～65℃。蛋白酶酶解温度的优选范围为35℃～55℃。蛋白酶酶解时间的典型范围为0.2h～10h。蛋白酶酶解时间的优选范围为0.5h～5h。淀粉酶添加量的典型范围为原料中淀粉重量的0.05wt％～20wt％。淀粉酶添加量的优选范围为原料中淀粉重量的0.25wt％～15wt％。淀粉酶酶解pH的典型范围为3～8。淀粉酶酶解pH的优选范围为3.3～7.5。淀粉酶酶解温度的典型范围为30℃～72℃。淀粉酶酶解温度的优选范围为35℃～63℃。淀粉酶酶解时间的典型范围为1h～10h。淀粉酶酶解时间的优选范围为2h～7h。纤维水解酶添加量的典型范围为原料中纤维重量的0.2wt％～30wt％。纤维水解酶添加量的优选范围为原料中纤维重量的0.5wt％～20wt％。纤维水解酶pH的典型范围为4～6.5。纤维水解酶pH的优选范围为4.5～5.5。纤维水解酶温度的典型范围为40℃～60℃。纤维水解酶温度的优选范围为45℃～55℃。纤维水解酶时间的典型范围为0.5h～12h。纤维水解酶时间的优选范围为2h～8h。碱包括氢氧化钠、氢氧化钾。碱添加量根据反应pH确定。酸包括盐酸、硫酸、亚硫酸、有机酸(包括乳酸、柠檬酸、苹果酸)。酸添加量根据反应pH确定。体系中的试剂组合物在料液中的添加情况(浓度为料液所含水部分的摩尔浓度)：含硫化合物添加量的典型范围为1mM～50mM。含硫化合物添加量的优选范围为5mM～30mM。含磷化合物添加量的典型范围为0.5mM～60mM。含磷化合物添加量的优选范围为2mM～40mM。钠离子、钾离子、二价碱土金属离子、二价过渡金属离子的添加量的典型范围为0.01mM～20mM。钠离子、钾离子、二价碱土金属离子、二价过渡金属离子的添加量的优选范围为0.1mM～12mM。金属螯合剂添加量的典型范围为0mM～35mM。金属螯合剂添加量的优选范围为0.1mM～18mM。反应容器内工作压力典型范围为-0.1MPa～0.3MPa。离心力的典型范围为200g～150000g。离心力的优选范围为1000g～7000g。过滤孔径的典型范围为1μm～80μm。过滤孔径的优选范围为10μm～50μm。膜过滤孔径的典型范围为10nm～10um。膜过滤孔径的优选范围为20nm～1μm。

在本发明的水解体系中，酸、碱作为pH调节剂，用于调节使反应处于合适的酸碱环境，并且也用于调节组分的溶解状态。含硫化合物、含磷化合物和金属离子主要用于调节蛋白底物的结构，具体而言其作用为打开蛋白底物中的二硫键，因此理论上可以选用任何合适的能够打开蛋白中的二硫键的化合物。金属离子和螯合剂用于调节蛋白酶、碳水化合物酶等酶的活性或稳定性。

表1：用于提取醇溶蛋白的工作参数表

应当指出的是，以下实施例中记载的提取原料的组成以及蛋白成品组成等数值并不用于将所涉及的提取原料和蛋白成品限定为具体的特定产品，而仅是用于描述提取原料或蛋白成品的客观参数。

在本发明中，根据《食品安全国家标准GB5009.5-2010--食品中蛋白质的测定》中的“第一法”测定产品中的蛋白含量，蛋白换算系数为6.24。根据GB/T5009.6的方法测定产品中脂肪含量。根据GB/T5009.3的方法测定产品中的水分含量。根据GB5009.12、GB5009.17和GB5009.11的方法测定产品中铅含量。根据的方法测定产品中汞含量。根据的方法测定产品中砷含量。根据GB5009.23的方法测定产品中黄曲霉毒素含量。根据GB4789.2、GB4789.3、GB4789.15和GB4789.4的方法分别测定产品中菌落总数、大肠菌群、霉菌和致病菌的量。

在本发明中，通过以下方法测定蛋白质的光密度值(如图4所示)：采用浓度为15％(w/v)的分离胶对所制备的添加有10％(v/v)β-巯基乙醇的样品进行还原性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，对电泳后的凝胶进行考马斯亮蓝染色(图4A–E中的下部图)。使用Quantity One软件对凝胶中条带进行光密度分析可产生信号峰(图4A–E中的上部图)。信号峰的面积为该组分蛋白的光密度值与蛋白含量呈函数关系。具体而言，将不同醇溶蛋白组分的光密度值记为Di(i＝1,2,3,…,n)，对醇溶蛋白各组分占醇溶蛋白的百分比光密度值之比进行计算，即Di/D0％。

根据示例性的实施方式，本发明所用到的含醇溶蛋白的提取原料可具有例如图4A包含α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白和δ-醇溶蛋白的电泳谱图和其光密度图谱。

根据示例性的实施方式，本发明的醇溶蛋白产品可具有例如图4C的包含α-醇溶蛋白的电泳谱图和其光密度图谱。

根据示例性的实施方式，本发明的醇溶蛋白产品可具有例如图4D的包含α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白和γ-醇溶蛋白的电泳谱图和其光密度图谱。

根据示例性的实施方式，本发明的醇溶蛋白产品可具有例如图4A的包含α-醇溶蛋白和β-醇溶蛋白的电泳谱图和其光密度图谱。

根据示例性的实施方式，本发明所使用的碱性蛋白酶为芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶。根据示例性的实施方式，本发明所使用的酸性蛋白酶为霉菌羧基蛋白酶。根据示例性的实施方式，本发明所使用的中性蛋白酶为霉菌或芽孢杆菌的金属蛋白酶。根据示例性的实施方式，本发明所使用的巯基蛋白酶为来源于植物(如菠萝的果茎、叶、皮和木瓜果实)的巯基蛋白酶，例如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。

在上表1中所列的试剂组合物中，酸、碱用于调节使反应处于合适的酸碱环境，并且也用于调节组分的溶解状态。含硫化合物、含磷化合物和金属离子主要用于调节蛋白底物的结构；金属离子和螯合剂用于调节蛋白酶、碳水化合物酶等酶的活性或稳定性。本领域技术人员根据本发明的教导，完全有能力理解应当如何根据实际所使用的酶以及相应的底物来选择合适的试剂组合物及其浓度，以实现本发明的目的(例如，本领域技术人员可以适当地对酶处理时间进行选择，并通过本领域普通技术知识控制水解时间，使得底物达到所希望的水解程度，以实现本发明所强调的利用粒径差异过滤去除水解产物)。

实施例

除另有说明以外，本发明中所指明的百分含量均为重量百分含量。在以下实施例中，在加入相关试剂时若仅指明浓度，则表示该试剂在加入到体系中后所达到的浓度。如无特别说明，所有反应均在常压下进行。

实施例1

将含水8.9％、蛋白64％(干基)的玉米黄粉调节水分含量至70％后打入酶解罐调节至pH4.8、45℃，并添加占所含蛋白量的4.8％的酸性蛋白酶(MA-SD，阿玛诺天野酶制剂有限公司)、60mM三(2-羧乙基)膦反应1.2小时后调节至pH7.5、52℃，添加2.6％的碱性蛋白酶(2709，庞博生物工程有限公司)和2％的中性蛋白酶(SUKAPro NE，苏柯汉生物工程股份有限公司)、1mM巯基乙醇反应0.5小时后离心，洗涤并收集沉淀。所得产品中总蛋白干基含量61.1％，蛋白中的醇溶蛋白含量大于74％，且α-醇溶蛋白含量为95％，β-醇溶蛋白含量为2％。

实施例2

将含水62.4％、蛋白70％(干基)的玉米黄粉加水调节到75％后打入酶解罐调节至pH3.8、35℃，并添加所含蛋白重量0.38％的酸性蛋白酶(SUKAPro AC苏柯汉生物工程股份有限公司)、0.26％的菠萝蛋白酶(食品级，庞博生物工程有限公司)、50mM焦亚硫酸钠、0.5mM三(2-羧乙基)膦、4mM锰离子先反应10小时，再升温到50℃维持0.5小时，然后调节至pH8.3、52℃，并添加0.33％的碱性蛋白酶(2709，庞博生物工程有限公司)反应1小时后添加10mM EDTA并离心，洗涤并收集沉淀。所得产品中总蛋白干基含量54.1％，蛋白中的醇溶蛋白含量97.55％，其中含95.85％的α-醇溶蛋白、1.9％的β-醇溶蛋白和0.95％的γ-醇溶蛋白。

实施例3

将含水89.9％、蛋白68％(干基)的玉米黄粉物料调节水分含量至80％后，打入酶解罐调节至pH6.5、45℃，添加所含蛋白重量0.01％的木瓜蛋白酶(食品级，庞博生物工程有限公司)、20mM巯基乙醇和0.01mM的钴离子反应1.5小时后，再调节至pH10.2、45℃，并添加0.01％的碱性蛋白酶(Protex 6L，杰能科生物工程有限公司)反应2小时后离心，洗涤并收集沉淀。所得产品中总蛋白干基含量55.9％，蛋白中的醇溶蛋白含量大于90.66％，其中含85.54％的α-醇溶蛋白、9.91％的β-醇溶蛋白和4.34％的γ-醇溶蛋白。

实施例4

将含水9.0％、蛋白28％(干基)的干酒糟(DDG)调节水分至80％后打入酶解罐，在pH4.2、35℃下添加所含蛋白重量0.8％的酸性蛋白酶(MA-SD，阿玛诺天野酶制剂有限公司)、40mM三(2-羧乙基)膦反应6小时，调节pH至6.5、45℃，加入0.5％的中性蛋白酶(1398，庞博生物工程有限公司)和1.7％的木瓜蛋白酶(食品级，庞博生物工程有限公司)、5mM巯基乙醇、0.1mM锌离子反应0.5小时后离心，洗涤并收集沉淀。所得产品中总蛋白干基含量23.9％，蛋白中的醇溶蛋白含量81.30％，其中含94.5％的α-醇溶蛋白、1.95％的β-醇溶蛋白和0.04％的γ-醇溶蛋白。

实施例5

将含水11.0％、蛋白30％(干基)的干酒糟和可溶物(DDGS)加水调制并水洗两次后调节水分含量至95％，在pH4.8、55℃下加入所含蛋白重量0.23wt％的酸性蛋白酶(SUKAPro AC苏柯汉生物工程股份有限公司)和2mM三(2-羧乙基)膦反应0.5小时后，在pH4.8、53℃下添加所含蛋白重量0.3％的菠萝蛋白酶(食品级，庞博生物工程有限公司)反应2.8小时，再调节pH至7.2并在53℃下加入0.5％的中性蛋白酶(1398，庞博生物工程有限公司)、6mM钙离子、15mM巯基乙醇和15mM半胱氨酸反应3.1小时后离心，洗涤并收集沉淀。所得产品中总蛋白干基含量24.3％，蛋白中含87.5％的α-醇溶蛋白、3.1％的β-醇溶蛋白和5.1％的γ-醇溶蛋白。

实施例6

将含水31.0％、蛋白32％(干基)的湿酒糟(WDG)加水调节水分含量至80％，在pH7.5、25℃下添加所含蛋白重量0.04wt％的中性蛋白酶(SUKAPro NE，苏柯汉生物工程股份有限公司)、2mM镁离子、2mM钙离子和20mM巯基乙醇反应4.5小时，再调节pH至10.1维持0.2小时。使用1μm孔径滤膜过滤得到第一透过液和截留液，调节截留液水分至80％，打回酶解罐调节pH至10.1、55℃后添加物料所含蛋白重量0.02wt％的碱性蛋白酶(2709，庞博生物工程有限公司)保温0.5小时后离心，洗涤并收集沉淀。所得产品中总蛋白干基含量25.7％，蛋白中醇溶蛋白含量大于93.1％，其中含77.9％的α-醇溶蛋白、17.2％的β-醇溶蛋白和1.3％的γ-醇溶蛋白。

实施例7-12均使用含水量为80％的玉米黄粉并在pH4.2、35℃下添加所含蛋白重量2％的酸性蛋白酶(MA-SD，阿玛诺天野酶制剂有限公司)、10mM三(2-羧乙基)膦反应3小时，调节pH至6.5、45℃，加入0.5％的中性蛋白酶(1398，庞博生物工程有限公司)和1.7％的木瓜蛋白酶(食品级，庞博生物工程有限公司)反应1小时后的物料。

实施例7

将上述物料用胶体磨(MagicLab，IKA公司)粉碎(磨盘间隙约40μm)后，打入酶解罐调节至pH5.0、63℃，并加入所含淀粉重量8wt％的α淀粉酶(Spezyme Fred，杰能科生物工程有限公司)和4％的糖化酶(Spirizyme Ultra，诺维信酶制剂有限公司)反应2小时；200g离心15min(ALLEGRA 30R，美国贝克曼库尔特有限公司)，收集沉淀调节水分含量至70％而后打入第二酶解罐调节至pH5.5、50℃，并添加所含纤维重量的3.0％的纤维素酶(SUKAZYM-SUKACell，苏柯汉生物工程股份有限公司)和2％的包含阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、木聚糖酶等酶的复合酶(Viscozyme L，诺维信酶制剂有限公司)、10mM钙离子、10mM钾离子反应2小时后，使用50μm孔径滤布过滤(含蛋白的目标相平均粒径约100μm，非目标相粒径不同组分的平均粒径大都小于30μm(含可溶物))得到第一滤饼，将其调节至水分含量70％、pH7.5、55℃，并加入35mM EDTA后，通过10μm膜过滤(含蛋白的目标相平均粒径约15μm，非目标相大都为可溶物)后得到第二滤液和滤饼，对所得滤饼经过洗涤、干燥后得到蛋白干基含量为88.4％的玉米蛋白产品。

实施例8

将上述物料用胶体磨(MagicLab，IKA公司)粉碎(磨盘间隙约2μm)后加水调节到75％打入第一酶解罐调节至pH3.0、35℃，并加入所含淀粉重量1wt％的α淀粉酶(Liquozyme SCDS诺维信酶制剂有限公司)和1wt％包含糖化酶和普鲁兰酶的复合淀粉酶(Novozyme NS 50013，诺维信酶制剂有限公司)反应7小时，使用1μm孔径滤网过滤(含蛋白的目标相平均粒径约150μm，非目标相不同组分的平均粒径大都小于2μm(含可溶物))得到第一滤饼，调节水分含量至75％；物料打入第三酶解罐调节至pH6.5、45℃，并加入纤维重量12％的纤维素酶、5％的β-葡聚糖酶(Ultraflo诺维信酶制剂有限公司，主要包含β-葡聚糖酶，还包含木聚糖酶等)和13％的复合酶(Viscozyme L诺维信酶制剂有限公司)反应4小时后添加10mM EDTA并调节pH至5.0，使用40μm孔径滤布过滤(含蛋白的目标相平均粒径约110μm，非目标相不同组分的平均大都小于30μm(含可溶物))得到第二滤液和滤饼，滤饼经过洗涤、干燥后得到蛋白干基含量为99.2％的玉米蛋白产品。

实施例9

将上述物料用胶体磨(MagicLab，IKA公司)粉碎(磨盘间隙约10μm)后，打入第一酶解罐调节至pH4.0、40℃，加入所含纤维重量0.2wt％的纤维素酶(Celluclast，诺维信酶制剂有限公司)、0.4％的复合酶(ViscozymeL诺维信酶制剂有限公司)和0.01mM的钾离子反应8小时。使用80μm孔径滤布过滤(含蛋白的目标相平均粒径约140μm，非目标相不同组分的平均粒径大都小于9μm(含可溶物))得到第一滤液和滤饼，第一滤饼调节水分含量至80％后，打入第二酶解罐调节至pH6.5、45℃，再加入所含淀粉重量0.1％的α淀粉酶(Spezyme Fred，杰能科生物工程有限公司)、0.05％的糖化酶(Spirizyme Ultra，诺维信酶制剂有限公司)、0.1％的普鲁兰酶(Promozyme D2诺维信酶制剂有限公司)，并升温到72℃维持5小时后调节至pH10.5后使用20nm孔径滤膜过滤(含蛋白的目标相平均粒径约0.5μm，非目标相大都为可溶物)得到第二透过液和截留液，将截留液洗涤、脱水干燥后得到蛋白干基含量为85.7％的玉米蛋白产品。

实施例10

将上述物料用胶体磨(MagicLab，IKA公司)粉碎(磨盘间隙约100μm)后调节水分至80％，打入第一酶解罐，在pH4.5、60℃下加入所含纤维重量0.2wt％的复合纤维素酶(Viscozyme L诺维信酶制剂有限公司)、0.1mM EDTA，反应12小时后离心分离，水洗一次后调节水分至80％；调节pH至8在45℃添加所含淀粉重量0.05％的复合淀粉酶(Spirizyme Excel，诺维信酶制剂有限公司)维持10小时后使用80μm孔径滤布过滤(含蛋白的目标相平均粒径约5μm，非目标相不同组分的平均粒径大都大于90μm)得到第一滤液和滤饼，第一滤液再通过100nm的微滤膜(含蛋白的目标相平均粒径约5μm，非目标相大都为可溶物)得到第二滤液。第二截留液在1000g下离心10min得到沉淀经过洗涤、脱水干燥后得到蛋白干基含量为75.8％的玉米蛋白产品。

实施例11

将上述物料用胶体磨(MagicLab，IKA公司)粉碎(磨盘间隙约150μm)后，打入第一酶解罐，在pH5、55℃下加入所含纤维重量12wt％的纤维素酶(Celluclast，诺维信酶制剂有限公司)、8wt％的β-葡聚糖酶(Ultraflo诺维信酶制剂有限公司)、12mM钙离子，反应0.5小时；使用10μm孔径滤膜过滤(含蛋白的目标相平均粒径约110μm，非目标相为可溶物)得到第一透过液和截留液，调节截留液水分至85％后打入第二酶解罐，再调节pH至7.5并在50℃下加入所含淀粉重量1％的α淀粉酶(Spezyme Fred，杰能科生物工程有限公司)、1％的糖化酶(SpirizymeUltra，诺维信酶制剂有限公司)和3％的复合淀粉酶(Spirizyme Excel，诺维信酶制剂有限公司)18mM EGTA反应3.5小时后使用50μm孔径滤布过滤(含蛋白的目标相平均粒径约15μm及可溶物，非目标相不同组分的平均粒径大都大于140μm)得到第二透过液和滤饼，透过液在2000g下离心10min所得固相经过洗涤、脱水干燥后得到蛋白干基含量为80.0.％的玉米蛋白产品。

实施例12

将上述物料粉碎粒径至约30μm，打入第一酶解罐，在pH3.5、30℃下加入所含淀粉重量5wt％的α淀粉酶(Liquozyme SCDS，诺维信酶制剂有限公司)、3wt％的糖化酶(Spirizyme Ultra，诺维信酶制剂有限公司)、2wt％的普鲁兰酶(Promozyme D2诺维信酶制剂有限公司)、10％复合淀粉酶(Novozyme NS50013，诺维信酶制剂有限公司)、2mM钙离子反应1小时；而后调节pH至5.6并在50℃下加入所含纤维重量10％的复合纤维水解酶(GC 518，杰能科生物工程有限公司)反应5小时；使用1μm孔径滤膜过滤(含蛋白的目标相平均粒径大都大于100μm，非目标相为可溶物)得到第一透过液和截留液，调节截留液水分至80％，打入调浆罐，调节pH至10、55℃后通过20μm的滤网(含蛋白的目标相平均粒径约1μm，非目标相不同组分的平均粒径为约29μm及可溶物)得到第二滤液和截留液，将滤液脱水干燥后得到蛋白干基含量为95.0％的玉米蛋白产品。

实施例13、14中的原料均使用含水80％的玉米黄粉，调节pH至5.6并在50℃下加入所含纤维重量8％的复合纤维水解酶和2.0％的纤维素酶反应2小时，或是用其他条件使降解的纤维量约占原纤维量的十分之一。

实施例13

将上述物料通过磨盘间隙为20μm的胶体磨，并将研磨物料的pH分别调节至3、4和6.2，并使用孔径为10μm的滤膜得到过滤截留液，并将截留液离心并干燥后，分别得到蛋白含量为71.25％、70.76％和70.36％的产品；当使用孔径为48μm的滤网过滤得到滤饼，并将滤饼脱水干燥后，分别得到蛋白含量为77.7％、76.8％和76.3％的产品。当使用孔径为0.1μm的滤膜或孔径为75μm、150μm的滤网处理本实施例中的pH4的物料后，所得截留液或滤饼进一步脱水并干燥，分别得到蛋白含量为69.9％、76.4％和71.9％的蛋白产品。

实施例14

将上述物料的pH分别调节至6.9、8和10.5，并使用孔径为1μm的滤膜得到透过液，将透过液离心并干燥后，分别得到蛋白含量为93.2％、96.0％和97.5％的蛋白产品；当使用孔径为75μm的滤网过滤得到滤饼，并将滤饼脱水干燥后，分别得到蛋白含量为76.9％、78.8％和79.7％的产品。当使用孔径为0.1μm的滤膜或孔径为38μm、150μm的滤网处理本实施例中的pH8的物料后，所得截留液或滤饼进一步脱水并干燥，分别得到蛋白含量为99.5％、87.2％和72.2％的蛋白产品。

实施例15、16中的原料均使用含水80％的玉米黄粉，调节至pH6.5、45℃，再加入所含淀粉重量2％的α淀粉酶、1％的糖化酶、2％的普鲁兰酶，并升温到72℃维持2.5小时，或使用其他条件使液化的淀粉量约占原淀粉的一半，调节pH至5.6并在50℃下加入所含纤维重量8％的复合纤维水解酶和2.0％的纤维素酶反应2小时，或是用其他条件使降解的纤维量约占原纤维量的十分之一。

实施例15

将上述物料通过磨盘间隙为20μm的胶体磨，并将研磨物料的pH分别调节至3、4和6.2，并使用孔径为10μm的滤膜得到过滤截留液，并将截留液离心并干燥后，分别得到蛋白含量为79.0％、78.7％和78.3％的产品；当使用孔径为48μm的滤网过滤得到滤饼，并将滤饼脱水干燥后，分别得到蛋白含量为83.6％、83.0％和82.63％的产品。当使用孔径为0.1μm的滤膜或孔径为75μm、150μm的滤网处理本实施例中的pH4的物料后，所得截留液或滤饼进一步脱水并干燥，分别得到蛋白含量为78.0％、82.7％和79.4％的蛋白产品。

实施例16

将上述物料的pH分别调节至6.9、8和10.5，并使用孔径为1μm的滤膜得到透过液，将透过液离心并干燥后，分别得到蛋白含量为95.9％、97.4％和98.2％的蛋白产品；当使用孔径为75μm的滤网过滤得到滤饼，并将滤饼脱水干燥后，分别得到蛋白含量为84.8％、86.1％和86.8％的产品。当使用孔径为0.1μm的滤膜或孔径为38μm、150μm的滤网处理本实施例中的pH8的物料后，所得截留液或滤饼进一步脱水并干燥，分别得到蛋白含量为99.5％、92.3％和80.0％的蛋白产品。

实施例17

将含水8.9％的玉米黄粉使用气流粉碎机(FQS15型，上海致凯粉体机械制造有限公司)粉碎粒径至约40μm后加水调节到50％充分水化后，进入酶解和分离系统：物料首先进入第一酶解罐调节至pH5.0、63℃，并加入所含淀粉重量8wt％的α淀粉酶(Spezyme Fred，杰能科生物工程有限公司)和4％的糖化酶(Spirizyme Ultra，诺维信酶制剂有限公司)反应2小时；200g离心15min(ALLEGRA 30R，美国贝克曼库尔特有限公司)，收集沉淀调节水分含量至70％而后打入第二酶解罐调节至pH5.5、50℃，并添加所含纤维重量的3.0％的纤维素酶(SUKAZYM-SUKACell，苏柯汉生物工程股份有限公司)和2％的复合酶(Viscozyme L，诺维信酶制剂有限公司)、10mM钙离子、10mM钾离子反应2小时后，使用50μm孔径滤布过滤得到第一滤饼，将其调节水分含量至70％后打入第三酶解罐调节至pH4.8、35℃，并添加所含蛋白量的5％的酸性蛋白酶(羧基蛋白酶MA-SD，阿玛诺天野酶制剂有限公司)、60mM三(2-羧乙基)膦反应1.5小时后调节至pH7.5、55℃，添加3％的碱性蛋白酶(丝氨酸蛋白酶2709，庞博生物工程有限公司)和2％的中性蛋白酶(金属蛋白酶SUKAPro NE，苏柯汉生物工程股份有限公司)、1mM巯基乙醇反应0.5小时后加入35mM EDTA，通过10μm膜过滤后得到第二滤液和滤饼。所得滤饼进行洗涤、干燥后得到蛋白干基含量为90％的玉米醇溶蛋白产品，蛋白中的醇溶蛋白含量大于74％，且全部为α-醇溶蛋白(100％)，脂肪和灰分干基含量分别为1.04％和4.01％。另外，第二滤液通过1μm的微滤膜过滤，截留液精制并脱水干燥后得到蛋白干基含量86％的产品。

实施例18

将含水62.4％的玉米黄粉使用辊压机(S120，常州自力化工机械有限公司)粉碎(辊子间隙约2μm)后加水调节到75％后，进入酶解和分离系统：物料首先进入第一酶解罐调节至pH3.0、35℃，并加入所含淀粉重量1wt％的α淀粉酶(Liquozyme SCDS诺维信酶制剂有限公司)和1wt％包含糖化酶和普鲁兰酶的复合淀粉酶(Novozyme NS 50013，诺维信酶制剂有限公司)反应7小时，使用1μm孔径滤网过滤得到第一滤饼，将其调节水分含量至75％；打入第二酶解罐调节至pH3.8、35℃，并添加所含蛋白重量0.4％的酸性蛋白酶(羧基蛋白酶SUKAPro AC苏柯汉生物工程股份有限公司)、0.3％的菠萝蛋白酶(食品级，庞博生物工程有限公司)、50mM焦亚硫酸钠、0.5mM三(2-羧乙基)膦、4mM锰离子先反应10小时，再升温到50℃维持0.5小时，然后调节至pH8.5、65℃，并添加0.3％的碱性蛋白酶(丝氨酸蛋白酶2709，庞博生物工程有限公司)反应1小时后150000g离心10s(Optima^TM XE，美国贝克曼库尔特有限公司)，收集沉淀调节水分含量至75％；物料打入第三酶解罐调节至pH6.5、45℃，并加入纤维重量12％的纤维素酶、5％的β-葡聚糖酶(Ultraflo诺维信酶制剂有限公司)和13％的复合酶(Viscozyme L诺维信酶制剂有限公司)反应4小时后添加10mM EDTA并调节至pH至5.0，使用40μm孔径滤布过滤得到第二滤液和滤饼，滤饼经过洗涤、干燥后得到蛋白干基含量为99.1％的玉米醇溶蛋白产品，蛋白中的醇溶蛋白含量大于98.4％，其中含97％的α-醇溶蛋白、2％的β-醇溶蛋白和1％的γ-醇溶蛋白，脂肪和灰分干基含量分别为0.5％和0.2％。另外，第二滤液通过1μm的微滤膜过滤，截留液精制并脱水干燥后得到蛋白干基含量75.1％的产品。

实施例19

将含水89.9％的玉米黄粉使用胶体磨(MagicLab，IKA公司)粉碎(磨盘间隙约10μm)，打入酶解和分离系统：物料首先进入第一酶解罐调节至pH4.0、40℃后，加入所含纤维重量0.2wt％的纤维素酶(Celluclast，诺维信酶制剂有限公司)、0.4％的复合酶(Viscozyme L诺维信酶制剂有限公司)和0.01mM的钾离子反应8小时。使用80μm孔径滤布过滤得到第一滤液和滤饼，第一滤液再通过1μm的微滤膜得到第二滤液，第二滤液通过10nm的超滤膜，得到第三截留液，将第一滤饼和第三截留液合并并调节水分含量至80％后，打入第二酶解罐调节至pH8.0、45℃，添加所含蛋白重量0.4％的碱性蛋白酶(Protex 6L，杰能科生物工程有限公司)、20mM巯基乙醇反应1.5小时，再加入所含淀粉重量0.1％的α淀粉酶(Spezyme Fred，杰能科生物工程有限公司)、0.05％的糖化酶(Spirizyme Ultra，诺维信酶制剂有限公司)、0.1％的普鲁兰酶(Promozyme D2诺维信酶制剂有限公司)，并升温到72℃维持5小时；物料打入第三酶解罐调节至pH10.5、45℃反应0.5小时后使用20nm孔径滤膜过滤得到第四透过液和截留液，将截留液洗涤、脱水干燥后得到蛋白干基含量为85％的玉米醇溶蛋白产品，蛋白中的醇溶蛋白含量大于92％，其中含91％的α-醇溶蛋白、7％的β-醇溶蛋白和2％的γ-醇溶蛋白，脂肪和灰分干基含量分别为3.2％和1.52％。另外，第四透过液精制后得到蛋白干基含量94.7％的产品。

实施例20

将含水9.0％的干酒糟(DDG)使用气流粉碎机(FQS15型，上海致凯粉体机械制造有限公司)粉碎粒径至约100μm后调节水分至80％，打入酶解和分离系统：物料首先进入第一酶解罐，在pH4.5、60℃下加入所含纤维重量0.2wt％的复合纤维素酶(Viscozyme L诺维信酶制剂有限公司)、0.1mM EDTA，反应12小时后离心分离，水洗一次后调节水分至80％；将物料打入第二酶解罐，在pH4.2、35℃下添加所含蛋白重量1％的酸性蛋白酶(MA-SD，阿玛诺天野酶制剂有限公司)、40mM三(2-羧乙基)膦反应6小时，调节pH至6.5、45℃，加入0.5％的中性蛋白酶(1398，庞博生物工程有限公司)和1.5％的木瓜蛋白酶(食品级，庞博生物工程有限公司)、5mM巯基乙醇、0.1mM锌离子反应0.5小时后调节pH至8在45℃添加所含淀粉重量0.05％的复合淀粉酶(Spirizyme Excel，诺维信酶制剂有限公司)维持10小时后使用80μm孔径滤布过滤得到第一滤液和滤饼，第一滤液再通过100nm的微滤膜得到第二滤液。第二截留液在1000g下离心10min得到沉淀经过洗涤、脱水干燥后得到蛋白干基含量为75％的玉米醇溶蛋白产品，蛋白中的醇溶蛋白含量大于81.50％，其中含98％的α-醇溶蛋白、1.99％的β-醇溶蛋白和0.03％的γ-醇溶蛋白，脂肪和灰分干基含量分别为4.98％和2.11％。另外，第二透过液和第一滤饼合并并干燥后得到蛋白干基含量50％的产品。

实施例21

将含水11.0％的干酒糟和可溶物(DDGS)加水调制并水洗两次后调节水分含量至95％，使用胶体磨(MagicLab，IKA公司)粉碎(磨盘间隙约150μm)，打入酶解和分离系统：物料首先进入第一酶解罐，在pH5、55℃下加入所含纤维重量12wt％的纤维素酶(Celluclast，诺维信酶制剂有限公司)、8wt％的β-葡聚糖酶(Ultraflo诺维信酶制剂有限公司)、12mM钙离子、所含蛋白重量0.2wt％的酸性蛋白酶(SUKAPro AC苏柯汉生物工程股份有限公司)和2mM三(2-羧乙基)膦)反应0.5小时；使用10μm孔径滤膜过滤得到第一透过液和截留液，调节截留液水分至85％后打入第二酶解罐，在pH5、50℃下添加所含蛋白重量0.3％的菠萝蛋白酶(食品级，庞博生物工程有限公司)反应3小时，再调节pH至7.5并在50℃下加入0.5％的中性蛋白酶(1398，庞博生物工程有限公司)、所含淀粉重量1％的α淀粉酶(Spezyme Fred，杰能科生物工程有限公司)、1％的糖化酶(Spirizyme Ultra，诺维信酶制剂有限公司)和3％的复合淀粉酶(Spirizyme Excel，诺维信酶制剂有限公司)、15mM巯基乙醇和15mM半胱氨酸和18mM EGTA反应3.5小时后使用50μm孔径滤布过滤得到第二透过液和滤饼，透过液在2000g下离心10min所得固相经过洗涤、脱水干燥后得到蛋白干基含量为79％的玉米醇溶蛋白产品，蛋白中的醇溶蛋白含量大于85.60％，其中含87.5％的α-醇溶蛋白、3.1％的β-醇溶蛋白和5.1％的γ-醇溶蛋白，脂肪和灰分干基含量分别为1.16％和0.51％。另外，第二滤饼干燥后得到蛋白干基含量49％的产品。

实施例22

将含水31.0％的湿酒糟(WDG)加水调节水分含量至80％，使用胶体磨(MagicLab，IKA公司)粉碎(磨盘间隙约30μm)，打入酶解和分离系统：物料首先进入第一酶解罐，在pH3.5、30℃下加入所含淀粉重量5wt％的α淀粉酶(Liquozyme SCDS，诺维信酶制剂有限公司)、3wt％的糖化酶(Spirizyme Ultra，诺维信酶制剂有限公司)、2wt％的普鲁兰酶(Promozyme D2诺维信酶制剂有限公司)、10％复合淀粉酶(NovozymeNS50013，诺维信酶制剂有限公司)、2mM镁离子和2mM钙离子反应1小时；而后调节pH至5.6并在50℃下加入所含纤维重量10％的复合纤维水解酶(GC 518，杰能科生物工程有限公司)反应5小时；将物料打入第二酶解罐，在pH8、20℃下添加所含蛋白重量0.03wt％的中性蛋白酶(SUKAPro NE，苏柯汉生物工程股份有限公司)和20mM巯基乙醇反应5小时，再调节pH至10维持0.2小时。使用1μm孔径滤膜过滤得到第一透过液和截留液，调节截留液水分至80％，打入第三酶解罐，调节pH至10、55℃后添加物料所含蛋白重量0.02wt％的碱性蛋白酶(2709，庞博生物工程有限公司)保温0.5小时，而后通过20μm的滤网得到第二滤液和截留液，将滤液脱水干燥后得到蛋白干基含量为94.8％的玉米醇溶蛋白产品，蛋白中的醇溶蛋白含量大于93.7％，其中含81.1％的α-醇溶蛋白、17.6％的β-醇溶蛋白和1.3％的γ-醇溶蛋白，脂肪和灰分干基含量分别为2.48％和0.70％。另外，第二截留液干燥后得到蛋白干基含量55％的产品。

对比例

将含水9.0％的干酒糟(DDG)使用气流粉碎机(FQS15型，上海致凯粉体机械制造有限公司)粉碎粒径至约100μm后加入70％乙醇和3.5％的氢氧化钠溶液在70℃提取30min。其中，乙醇溶液占料液总重的83％。而后使用离心机(ALLEGRA 30R，美国贝克曼库尔特有限公司)分离出清液(2000g，10min)，将清液使用孔径为1微米的滤膜过滤，滤液再通过截留分子量为10kDa的滤膜进行浓缩后在真空干燥箱(DZF-6210，上海一恒科学仪器有限公司)中干燥后粉碎为150目的蛋白干基含量为86.4％的产品。

表2：实施例17-22的产品组成

粒径分析

粒径的测定采用英国Malvern Instrument公司的Mastersizer 3000激光粒度仪测试，测试采用水为介质，取一定量的产品于介质中，机械搅拌使其充分分散在介质里，粒度仪测定可给出平均粒径。

醇溶蛋白产品颜色的测定

取150目的使用实施例17-22和对比例方法制备的醇溶蛋白样品以及市售的醇溶蛋白样品(蛋白干基含量89％，购于珠海市荣宁贸易有限公司)。在色差仪(CR2400，日本柯尼卡美能达色差仪)上记录粉体表面颜色的L(亮度值)、a(红度值)和b(黄度值)值。

由下表3可见，与市售的和对比例方法制备的醇溶蛋白样品相比，实施例17-22中的醇溶蛋白产品的黄度值(b)有明显降低，最少可降低约20％，最大可降低约78％。说明本发明工艺还具有很好的脱色效果。本发明产品作为配料对原有应用体系(如食品或药品)颜色的影响更低。

表3：LAB颜色测定结果

醇溶蛋白产气味感官评定

取实施例17-22和对比例方法制备的醇溶蛋白样品以及市售的醇溶蛋白样品(蛋白干基含量89％，购于珠海市荣宁贸易有限公司)各25g。在室温20～22℃，相对湿度保持在55％—65％左右。样品在黄色光源照射下，进行玉米醇溶蛋白特征气味评测。按照气味强度分为7档，分别为1-没有，2-基本没有，3-较为不明显，4-一般，5-较为明显，6-明显，7-非常明显。测试人数为25人。结果为平均值取整。

由下表4可见，实施例17-22中的醇溶蛋白产品的特征性气味均为一般(4)到基本没有(2)之间，工艺本身兼具脱臭的效果。本发明产品作为配料对原有应用体系(如食品或药品)气味的影响更低。

表4：气味感官评定结果

醇溶蛋白产品成膜性能比较

取实施例17-22中样品、对比例方法制备的醇溶蛋白样品以及市售的醇溶蛋白样品进行对比试验。称取一定量的上述醇溶蛋白样品，加入75％乙醇溶液，配制成10wt％蛋白质溶液，搅拌混合均匀，滤纸或滤膜过滤后，分别加入20％甘油和聚乙二醇-400(与蛋白质量比)，搅拌20min，放入80℃恒温水浴加热搅拌15min后取出，将一定体积的蛋白成膜液注入成膜托盘，50℃空气加热干燥成膜，2h后揭膜，在45％相对湿度和室温环境中平衡24h后测定机械性能。将质地均一的玉米醇溶蛋白膜裁成15mm×50mm的尺寸，参照GB/T6672—2001方法测定其厚度.在蛋白膜样品上对称选取5个点测量厚度，取平均值。膜的机械性能用质构仪(TA-XT2i，英国Stable Micro Systems公司)测定.测定时拉伸速度为1mm/s，膜的有效测定长度是80mm。抗拉强度(TS)为拉伸过程中膜断裂时单位横截面上的力，计算公式如下：

式中：TS为抗拉强度，MPa；F为最大拉力(N)；δ为膜的厚度(mm)，mm；W为膜样品的宽度(W＝15mm)。

由图5可见，与市售样品相比，实施例17-22中的醇溶蛋白产品同样均具有直接成膜性。蛋白膜的抗拉强度与样品中醇溶蛋白含量呈线性关系，拟合良好(R²＝0.8766)。同等醇溶蛋白含量下，本发明的样品(如实施例22)蛋白膜的抗拉强度还会略优于参比的市售玉米醇溶蛋白制成的膜。

醇溶蛋白微球稳定性比较

为比较实施例17-22中样品所含醇溶蛋白的微囊稳定性，将除实施例18以外的实施例样品中的一个(如实施例17)和对比例样品再使用80％的乙醇溶液在65℃提取30min，得到醇溶蛋白干基含量大于85％的样品。将实施例2的样品、市售样品(蛋白干基含量89％，购于珠海市荣宁贸易有限公司)连同新制备的实施例17、实施例19-22、对比例样品一起，分别取适量溶解于体积分数为80％的乙醇溶液中，制备出醇溶蛋白乙醇溶液，质量分数控制为3％。在高速搅拌速率为12000rpm下，将上述zein乙醇溶液注入适量的高纯水中，通过膜分离控制最终体系的醇溶蛋白质量分数为1％得到醇溶蛋白微球溶液。经过减压低温蒸发使该溶液中醇溶蛋白质量为3％左右。将该微球溶液至于刻度容器中并在冷藏条件(4℃)下保存，储存期间记录发生明显聚沉时间(即沉淀层体积大于总溶液体积的5％)。

由下表5可见，本发明的醇溶蛋白产品(实施例18)或从产品中再次提取的二次醇溶蛋白产品(实施例17)制备的微球溶液具有良好的稳定性。同时与现有一次溶剂提取工艺(即直接从原料中使用乙醇或其他有机溶剂提取)所制备的醇溶蛋白产品(如对比例和市售产品)相比，具有更长的稳定时间。

表5：微球稳定性

	实施例17	实施例18	对比例	市售玉米醇溶蛋白
					聚沉时间(天)	112	105	90	92

考虑到示例性的方法和设备，参照各图的流程图将更好地理解可根据本公开的主体实施的方法，但为了简化解释的目的，以一系列框图显示和描述方法，应当并且可以理解，因为一些框图可能会与所描绘和叙述的不同的顺序发生和/或与其他框图同时发生，要求保护的主题不被框图的顺序所限制。此外，并不是所有说明的框图都是在实施方法中所需的。

Claims (9)

1.一种从原料中富集α-醇溶蛋白的方法，所述原料包含醇溶蛋白和非醇溶蛋白，并且任选包含大分子碳水化合物和/或油脂，其特征在于，所述方法不使用有机溶剂，并包括下述步骤：

(1)将所述原料粉碎并调浆；

(2)采用蛋白酶处理，将原料中的至少一部分β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白和非醇溶蛋白进行完全水解或部分水解，并利用粒径差异过滤去除水解产物，从而得到α-醇溶蛋白得以富集的粗产物；

(3)将所述粗产物洗涤、脱水、干燥，得到最终产品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原料选自于由玉米黄粉、玉米胚乳发酵醪和酒糟所组成的组。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶为选自于由羧基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、巯基蛋白酶所组成的组中的一种或多种。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述羧基蛋白酶为霉菌羧基蛋白酶，优选曲霉羧基蛋白酶，更优选米曲霉羧基内切蛋白酶；所述丝氨酸蛋白酶为芽孢杆菌的丝氨酸蛋白酶，优选枯草杆菌的丝氨酸内切蛋白酶；所述金属蛋白酶为霉菌或芽孢杆菌的金属蛋白酶，优选米曲霉金属内切蛋白酶或枯草芽孢杆菌金属内切蛋白酶；所述巯基蛋白酶为来源于植物的巯基蛋白酶，优选菠萝蛋白酶和/或木瓜蛋白酶。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在进行所述蛋白酶处理时，任选加入试剂组合物对酶进行调节，所述试剂组合物为选自于由以下物质所组成的组中的一种或多种：能够打开蛋白中的二硫键的化合物，例如含磷化合物或含硫化合物，其中含磷化合物优选三(2-羧乙基)膦，含硫化合物优选含自由巯基的化合物和/或可提供亚硫酸根的化合物，更优选巯基乙醇、二硫苏糖醇、半胱氨酸及包含半胱氨酸的寡肽(由2-10个氨基酸组成的肽)、亚硫酸盐、亚硫酸、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐；金属离子，优选碱金属离子、碱土金属离子、二价过渡金属离子，更优选钠离子、钾离子、镁离子、钙离子、锰离子、钴离子、锌离子；金属螯合剂，优选EDTA、EGTA。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶处理在下述条件下进行：pH 3.5～10.5，优选3.8～10；处理温度20℃～65℃，优选35℃～55℃；处理时间0.2h～10h，优选0.5h～5h；

优选地，所述条件选自于：pH4.8、45℃；pH7.5、52℃；pH3.8、35℃；pH8.3、52℃；pH8.5、65℃；pH6.5、45℃；pH8.0、45℃；pH10.2、45℃；pH4.2、35℃；pH6.5、45℃；pH4.8、55℃；pH4.8、53℃；pH7.2、53℃；pH7.5、25℃；pH10.1、55℃。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述过滤采用1μm～80μm、优选10μm～50μm的过滤孔径进行，或者采用10nm～10μm、优选20nm～1μm的膜过滤孔径进行。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(2)的同时、之前或之后，采用水解酶处理，对原料中的至少一部分大分子碳水化合物进行完全水解或部分水解，并利用粒径差异过滤去除水解产物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述水解酶选自于由α淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、普鲁兰酶、木聚糖酶、果胶酶、阿拉伯聚糖酶、半纤维素酶所组成的组中的一种或多种；

优选地，所述α淀粉酶为霉菌或细菌的α淀粉酶，优选霉菌α淀粉酶，更优选曲霉α淀粉酶；所述糖化酶为霉菌葡萄糖淀粉酶，优选曲霉或木霉葡萄糖淀粉酶；所述纤维素酶为霉菌纤维素酶，优选木霉纤维素酶；所述β-葡聚糖酶为真菌或细菌β-葡聚糖酶；所述普鲁兰酶为杆菌普鲁兰酶；

优选地，在进行所述水解酶处理时，任选加入试剂组合物对酶进行调节，所述试剂组合物为选自于由以下物质所组成的组中的一种或多种：金属离子，优选碱金属离子、碱土金属离子、二价过渡金属离子，更优选钠离子、钾离子、镁离子、钙离子、锰离子、钴离子、锌离子；金属螯合剂，优选EDTA、EGTA；

优选地，所述水解酶处理在如下条件下进行：pH 3～8，优选3.3～7.5，更优选4～6.5，最优选4.5～5.5；处理温度30℃～72℃，优选35℃～63℃，更优选40℃～60℃，最优选45℃～55℃；处理时间0.5h～12h，优选1h～10h，更优选2h～8h，最优选2h～7h；

更优选地，上述水解酶处理条件选自于：pH5.0、63℃；pH5.5、50℃；pH3.0、35℃；pH6.5、45℃；pH4.0、40℃；pH6.5、45℃；pH4.5、60℃；pH8、45℃；pH5、55℃；pH7.5、50℃；pH3.5、30℃；pH5.6、50℃。