CN114085922A - 一种新冠病毒快速pcr检测引物组、检测装置及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，公开了一种新冠病毒快速PCR检测引物组、检测装置及其应用，其中的新冠病毒快速PCR检测引物包括F3、B3、FIP、BIP、LoopB五条引物，其中的新冠病毒快速PCR检测试剂盒包括采样拭子、PCR试剂管、裂解液试管、LAMP反应液试管、引物混合物试管、无色结晶紫溶液试管和包装盒，新冠病毒快速PCR检测引物放置在引物混合物试管中，包装盒中设置有六个存储凹槽。其中的病毒PCR快速检测装置包括包装盒、上盖板、PCR试剂管基座、PCR试剂管孔槽、上盖加热模块和基座加热模块，所述PCR试剂管基座安装在包装盒内。本发明能够实现病毒的快速裂解，便于快速进行核酸扩增反应，同时降低检测环境的要求，提高检测准确性。

Description

一种新冠病毒快速PCR检测引物组、检测装置及其应用

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种新冠病毒快速PCR检测引物 组、检测装置及其应用。

背景技术

病毒的快速、高效检测对于及早的发现及预防病毒传染具有重要意义。PCR 核酸分子诊断技术是病毒检测中的一种重要方法，其检测过程可以分为核酸提 取、PCR扩增反应、扩增产物定性、结果判定和出具完成报告单。对于呼吸道 感染疾病，病人较易自行采集的样本为咽拭子、鼻拭子、唾液痰液等。但是需 要在中心实验室对所采集的样品进行核酸提取纯化才能进行RT-PCR的检测。而 此过程相对繁琐耗时，且需要在相应等级的实验室进行操作。

此外PCR核酸分子诊断检测中需要满足一定的温度条件和检测时间，近些 年，尽管市场上出现了一些PCR自动化核酸分子诊断系统，如GeneXpert和 FilmArray，但这些系统的自动化运动组件和用于PCR扩增的精准温控模块都相 对复杂，普遍存在体积庞大、操作复杂且价格昂贵的问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新冠病毒快速PCR 检测引物组、检测装置及其应用，能够实现病毒的快速裂解，将其所含核酸快 速释放，便于快速进行核酸扩增反应，同时利用RAMP对样品中抑制剂的极高 耐受性及高检测灵敏度，降低检测环境的要求，提高检测准确性。

本发明采用如下技术方案实现：一种新冠病毒快速PCR检测引物，包括F3、 B3、FIP、BIP、Loop B五条引物，其中，F3为正向外引物，B3为反向外引物，FIP为正向内引物，BIP为反向内引物，Loop B为成环引物，各引物的核苷酸序 列分别如下所示：

F3：CGGCATGGTCAAGCCTCTTC、

B3：TTCGGCTCTCAAGCTGGTTCAA、

FIP：TCCCCTACTGCTGCATCTGGAGCGTTCCTCATCACGTAGTCG、

BIP：TTCTCCTGCTATCGAATGGCTGGCTCTGTCAAGCAGCAGCAAAG、 Loop B：AATGGCGGCTTGATGCTGCTCTCT。

一种新冠病毒快速PCR检测试剂盒，所述的试剂盒中使用所述的新冠病毒 快速PCR检测引物，所述的试剂盒包括采样拭子、PCR试剂管、裂解液试管、 LAMP反应液试管、引物混合物试管、无色结晶紫溶液(LCV)试管和包装盒， 所述新冠病毒快速PCR检测引物放置在引物混合物试管中，所述的包装盒中设 置有六个存储凹槽，所述采样拭子、PCR试剂管、裂解液试管、LAMP反应液 试管、引物混合物试管、无色结晶紫溶液(LCV)试管分别放置在六个存储凹 槽中。

一种病毒PCR快速检测装置，该检测装置使用所述的试剂盒和新冠病毒快 速PCR检测引物，病毒PCR快速检测装置包括包装盒、上盖板、PCR试剂管 基座、PCR试剂管孔槽、上盖加热模块和基座加热模块，所述PCR试剂管基座 安装在包装盒内，所述PCR试剂管基座上竖直设置有多排PCR试剂管孔槽，所 述包装盒的后部可开合的连接有上盖板，上盖板盖合在包装盒上后形成一个封 闭的盒体，所述上盖板内下部安装有上盖加热模块，所述PCR试剂管基座内位 于每个腔室均安装有基座加热模块。

进一步地，所述PCR试剂管基座内安装有基座温度传感器，所述上盖板下 端安装有上盖温度传感器，所述上盖板顶端安装有液晶显示屏和操作按键，所 述液晶显示屏、上盖温度传感器、基座温度传感器、操作按键均通过导线与主 控制板连接，所述主控制板安装在包装盒的底端，所述包装盒的后端设置有电 源接口，所述电源接口与液晶显示屏、上盖温度传感器、基座温度传感器、主 控制板连接为其供电。

进一步地，所述上盖板的后端还固定有蜂鸣器，所述蜂鸣器通过导线与主 控制板连接。

进一步地，所述包装盒的后端固定有包装盒连接座，所述上盖板的下端固 定有上盖连接座，所述包装盒连接座与连接座之间通过旋转轴可旋转的连接。

进一步地，所述PCR试剂管孔槽的数量至少有20个。

进一步地，PCR试剂管包括PCR试剂管体和PCR试剂管盖，PCR试剂管 盖盖合设置在PCR试剂管体顶端。

一种病毒PCR快速检测方法，该方法使用所述的检测试剂盒和所述的病毒 PCR快速检测装置，所述的方法包括如下的步骤：

1)裂解：采集被检测者的鼻咽拭子，放置在PCR试剂管中，在95℃热水浴 中加热一段时间，接着进行热裂解20min；

2)样本的RPA扩增：另取一个PCR试剂管，向其中分别依次加入LAMP 反应液15μL、引物混合物1.7μL、无色结晶紫溶液(LCV)5μL、热裂解产物 3.7μL，盖上PCR管管盖，再盖上装置的上盖板，设置程序，63℃扩增40min；

3)结果判读：反应液变成蓝色则表明新冠病毒检测阳性，否则病毒检测为阴 性。

进一步地，所述PCR试剂管孔槽中插放有PCR试剂管，所述PCR试剂管 包括PCR试剂管体和PCR试剂管盖，PCR试剂管盖铰接盖合设置在PCR试剂 管体顶端。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明的一种新冠病毒快速PCR检测引物，包括F3、B3、FIP、BIP、Loop B五条引物，其检测灵敏度能够达到5拷贝/微升，检测灵敏度及特异性高，准 确性高。

2.本发明的一种新冠病毒快速PCR检测试剂盒，检测试剂盒中设置有检测 所需要的采样拭子、PCR试剂管、裂解液试管、LAMP反应液试管、引物混合 物试管、无色结晶紫溶液(LCV)试管，能够与引物混合物配合实现检测样本 的快速配置，提高检测的速度，节约检测时间。

3.本发明的一种病毒PCR快速检测装置，能够在密闭的PCR试剂管内进行 样本的RPA预扩增及样本的扩增，保证了样本裂解后的整个扩增过程在一个封 闭体系内进行，避免了气溶胶污染造成的假阳性结果出现，提高了装置的检测 准确度，装置结构简单，操作便捷，整个检测过程时间短，能对病毒进行快速 筛查。

附图说明

图1是本发明中新冠病毒快速PCR检测试剂盒的结构示意图；

图2是本发明中新冠病毒快速PCR检测引物的敏感性试验结果；

图3是本发明中新冠病毒快速PCR检测引物对阳性样本和阴性样本的试验 结果；

图4是本发明的病毒PCR快速检测装置打开时的结构示意图；

图5是本发明的病毒PCR快速检测装置盖上上盖板后的主视图；

图6是本发明的病毒PCR快速检测装置中电路结构的连接框图；

图7是本发明的病毒PCR快速检测装置中PCR试剂管的结构示意图。

图中：1、包装盒；2、包装盒连接座；3、旋转轴；4、上盖连接座；5、上 盖板；7、PCR试剂管基座；8、PCR试剂管孔槽；9、PCR试剂管；11、上盖加 热模块；12、基座加热模块；13、电源接口；14、液晶显示屏；15、上盖温度 传感器；16、基座温度传感器；20、主控制板；21、操作按键；22、蜂鸣器； 81、采样拭子；83、裂解液试管；84、LAMP反应液试管；85、引物混合物试 管；86、无色结晶紫溶液试管；87、包装盒；91、PCR试剂管体；93、PCR试 剂管盖。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的 是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任 意组合形成新的实施例。

实施例1

一种新冠病毒快速PCR检测引物，包括F3、B3、FIP、BIP、Loop B五条 引物，其中，F3为正向外引物，B3为反向外引物，FIP为正向内引物，BIP为 反向内引物，Loop B为成环引物，各引物的核苷酸序列分别如下所示：

F3：CGGCATGGTCAAGCCTCTTC、

B3：TTCGGCTCTCAAGCTGGTTCAA、

FIP：TCCCCTACTGCTGCATCTGGAGCGTTCCTCATCACGTAGTCG、

BIP：TTCTCCTGCTATCGAATGGCTGGCTCTGTCAAGCAGCAGCAAAG、

Loop B：AATGGCGGCTTGATGCTGCTCTCT。

根据上述的新冠病毒快速PCR检测引物，本发明还提供了一种新冠病毒快 速PCR检测试剂盒，试剂盒用于使用上述的新冠病毒快速PCR检测引物进行新 冠病毒检测。试剂盒包括采样拭子81、PCR试剂管9、裂解液试管83、LAMP 反应液试管84、引物混合物试管85、无色结晶紫溶液(LCV)试管86和包装 盒87，裂解液放置在裂解液试管83中，本实施例中的裂解液使用纯净水，LAMP 反应液放置在LAMP反应液试管84中，本实施例中的LAMP反应液使用的是 现有技术中OptiGene品牌的Isothermal MasterMix，其主要成分包含快速DNA 聚合酶、无机焦磷酸酶、MgCl2、dNTPs。新冠病毒快速PCR检测引物放置在 引物混合物试管85中，无色结晶紫溶液(LCV)放置在无色结晶紫溶液(LCV) 试管86中。本实施例中的无色结晶紫溶液(LCV)配置过程如下：取30mmol 的亚硫酸钠1.8906g、5mmol的β-环糊精2.8375g、0.5mmol的结晶紫(CV) 0.102g称重后溶于500ml的二级纯化水中，溶解后分装至5ml离心管中置于-20℃ 冰箱长期保存。包装盒87中设置有六个存储凹槽，采样拭子81、PCR试剂管9、裂解液试管83、LAMP反应液试管84、引物混合物试管85、无色结晶紫溶液 (LCV)试管86分别放置在六个存储凹槽中。

引物混合物的组成如下表1所示，引物混合物利用20μL的dd H₂O将5μ L的F3引物、5μL的B3引物、40μL的FIP引物、40μL的BIP引物、20μL 的Loop B引物进行溶解混合，并保存在引物混合物试管85中。

表1：引物混合物组成表

引物类型	体积/μL
		F3	5
B3	5
		FIP	40
BIP	40
		Loop B	20
dd H<sub>2</sub>O	20

将使用的标准灭火新冠病毒DNA样本分别稀释至50000、5000、500、50、 5拷贝每微升，再设置一个阴性对照管，按照下表2中的反应体系加样。具体过 程为，采集标准灭火新冠病毒DNA样本2μL放入5ml的PCR试剂管9中，并 向其中加入3ml的裂解液，在95℃水浴中热裂解20min。另取一个200ul的PCR 管，向其中分别依次加入LAMP反应液15ul，引物混合物1.3ul，无色结晶紫溶 液6.7ul、热裂解产物3.7ul，使用实时荧光定量PCR仪在63℃时LAMP扩增40 分钟。

表2：新冠病毒LAMP扩增反应体系表

反应体系	体积/μL
		LAMP反应液	15
引物混合物	1.3
		新冠病毒DNA	2
无色结晶紫溶液(LCV)	6.7

新冠病毒快速PCR检测引物的敏感性试验结果如图2所示，由图可知标准 灭火新冠病毒DNA样本的浓度越高引物的敏感性越高，引物对50000拷贝每微 升的新冠病毒DNA(A组)敏感性明显高于5000拷贝每微升(B组)、500拷 贝每微升(C组)、50拷贝每微升(D组)、5拷贝每微升(E组)和0拷贝每微 升(F组)的新冠病毒DNA，同时即使是(E组)的新冠病毒DNA敏感性也显 著高于0拷贝每微升(F组)，说明本发明的检测引物灵敏度高。

B组检测引物(阳性样本)和F组(阴性样本)的试验检测结果如图3所 示，B组检测引物的反应液变成深蓝色，F组的反应液为淡蓝色(偏于无色)， 结果明显，便于观察。

实施例2

如图4至图7所示，本发明的一种病毒PCR快速检测装置，该检测装置使 用实施例1中的试剂盒和新冠病毒快速PCR检测引物。病毒PCR快速检测装置 包括包装盒1、上盖板5、PCR试剂管基座7、PCR试剂管孔槽8、上盖加热模 块11和基座加热模块12，PCR试剂管基座7安装在包装盒1内，PCR试剂管 基座7上竖直设置有多排PCR试剂管孔槽8，PCR试剂管孔槽8的数量至少有 20个，本实施例中设置有20个，包装盒1的后部可开合的连接有上盖板5，上盖板5盖合在包装盒1上后形成一个封闭的盒体，上盖板5内下部安装有上盖 加热模块11，PCR试剂管基座7内位于每个腔室均安装有基座加热模块12，进 一步地，在包装盒1的后端固定有包装盒连接座2，上盖板5的下端固定有上盖 连接座4，包装盒连接座2与连接座4之间通过旋转轴3可旋转的连接，上盖板 5盖合在包装盒1上后形成一个封闭的盒体。

在上盖板5内下部安装有上盖加热模块11，PCR试剂管基座7内位于每个 腔室均安装有基座加热模块12，本实施例中的上盖加热模块11和基座加热模块 12均使用外部包裹有保护管的12～24v直流加热丝，优选HAZY品牌的 XH-RS2090型号镍铬加热丝，其直径为0.4mm，最高加热温度可达400摄氏度， 其中上盖加热模块11水平布置在上盖板5下端，基座加热模块12竖直设置在 PCR试剂管基座7内，基座加热模块12位于PCR试剂管孔槽8的周围。PCR 试剂管基座7内安装有基座温度传感器16，上盖板5下端安装有上盖温度传感 器15，本实施例中的上盖温度传感器15、基座温度传感器16均选用PT1000铂 热电阻温度传感器，其测温范围为-10℃～300℃，工作电压为DC 12～24v，用于 测量上盖板5处及PCR试剂管基座7内的温度。上盖板5顶端安装有液晶显示 屏14和操作按键21，液晶显示屏使用84×48点阵单色屏，其能够进行串行通 讯，便于与STM32F103C8T6单片机进行连接开发。液晶显示屏14、上盖温度 传感器15、基座温度传感器16、操作按键21均通过导线与主控制板20连接，主控制板20安装在包装盒1的底端，主控制板20使用微处理器，本实施例中 的主控制板20使用STM32F103C8T6单片机，使用ARM3内核，其主频高达 72M，具备多种外设，包装盒1的后端设置有电源接口13，本实施例中的电源 接口13上插设有直流DC 24v电源适配器，其输入电压为交流AC100～240v， 频率50～60HZ，输出最大电流2A，输出电压精度5％，电源适配器输出的一路 直流24v电压为上盖加热模块11、基座加热模块12、上盖温度传感器15、基座温度传感器16供电，另一路通过朗战品牌的LM2596S型号DC24v-DC3.3v直流 降压模块后输出DC3.3v电压为液晶显示屏14、蜂鸣器22、STM32F103C8T6单 片机供电。本发明还在上盖板5的后端还固定有蜂鸣器22，蜂鸣器22通过导线 与主控制板20连接，本实施例中的蜂鸣器22使用Risym品牌的3.3v有源蜂鸣 器，用于提醒检测者预定的检测时间。PCR试剂管孔槽8用于检测时插放PCR 试剂管9，本实施例中的PCR试剂管9包括PCR试剂管体91和PCR试剂管盖 93，PCR试剂管盖93可开合的盖合设置在PCR试剂管体91顶端。

如图4至图7所示，现结合本发明的病毒PCR快速检测装置，以对新冠病 毒DNA检测为例，对本发明装置的结构和功能进一步地进行阐述。检测前首先 采集被检测者的鼻咽拭子，放置在PCR试剂管9中，在95℃热水浴中加热一段 时间，接着进行热裂解20min。

热裂解后使用本发明的病毒PCR快速检测装置进行样本的RPA预扩增。首 先，打开PCR试剂管管盖93，PCR试剂管管盖93上配备有RPA冻干粉，加入 5μL的RPA稀释液至PCR试剂管管盖93中进行溶解，再取2μL裂解后的样本 加入到RPA稀释液中，向PCR试剂管体91中加入70μL的LAMP稀释液，轻 轻盖上PCR试剂管管盖93，再盖上装置的上盖板5，然后启动上盖板5加热至 程序设置的38℃，主控制板20控制上盖加热模块11加热，通过上盖温度传感 器15与主控制板20联动，使得上盖板5加热至38℃后停止，达到指定的38℃ 温度后程序会计时15min，然后通过蜂鸣器提示用户程序运行完毕。在进行类似 病毒的检测时，需要不同的检测温度及加热时间，通过操作按键21与液晶显示 屏14配合可以调节设置不同的检测温度及工作加热时间。

最后进行样本的扩增，打开上盖板5，取出PCR试剂管9，将PCR试剂管 管盖93上的预扩增产物顺时离心至LAMP稀释液中，混匀后将PCR试剂管9 放入PCR试剂管孔槽8中，盖上装置的上盖板5，通过基座加热模块12加热至 65℃，达到指定温度后计时30min，然后通过蜂鸣器22提示用户程序运行完毕， 检测结束，取出PCR试剂管9。LAMP溶液中含有无色结晶紫核酸指示剂，最 终反应液变成蓝色则表明新冠病毒检测阳性。此步过程保证了样本裂解后的整 个扩增过程在一个封闭的PCR试剂管9内进行，避免了气溶胶污染造成的假阳 性结果的出现，提高了装置的检测准确度。装置操作简单，操作便捷，能对病 毒进行快速筛查，整个检测过程不超过1h。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施 方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见， 本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经 适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.一种新冠病毒快速PCR检测引物，其特征在于，包括F3、B3、FIP、BIP、Loop B五条引物，其中，F3为正向外引物，B3为反向外引物，FIP为正向内引物，BIP为反向内引物，Loop B为成环引物，各引物的核苷酸序列分别如下所示：

F3：CGGCATGGTCAAGCCTCTTC、

B3：TTCGGCTCTCAAGCTGGTTCAA、

FIP：TCCCCTACTGCTGCATCTGGAGCGTTCCTCATCACGTAGTCG、

BIP：TTCTCCTGCTATCGAATGGCTGGCTCTGTCAAGCAGCAGCAAAG、Loop B：AATGGCGGCTTGATGCTGCTCTCT。

2.一种新冠病毒快速PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中使用权利要求(1)所述的新冠病毒快速PCR检测引物，所述的试剂盒包括采样拭子(81)、PCR试剂管(9)、裂解液试管(83)、LAMP反应液试管(84)、引物混合物试管(85)、无色结晶紫溶液试管(86)和包装盒(87)，所述新冠病毒快速PCR检测引物放置在引物混合物试管(85)中，所述的包装盒(87)中设置有六个存储凹槽，所述采样拭子(81)、PCR试剂管(9)、裂解液试管(83)、LAMP反应液试管(84)、引物混合物试管(85)、无色结晶紫溶液试管(86)分别放置在六个存储凹槽中。

3.一种病毒PCR快速检测装置，其特征在于：该检测装置使用权利要求(2)中的试剂盒和新冠病毒快速PCR检测引物，病毒PCR快速检测装置包括包装盒(1)、上盖板(5)、PCR试剂管基座(7)、PCR试剂管孔槽(8)、上盖加热模块(11)和基座加热模块(12)，所述PCR试剂管基座(7)安装在包装盒(1)内，所述PCR试剂管基座(7)上竖直设置有多排PCR试剂管孔槽(8)，所述包装盒(1)的后部可开合的连接有上盖板(5)，上盖板(5)盖合在包装盒(1)上后形成一个封闭的盒体，所述上盖板(5)内下部安装有上盖加热模块(11)，所述PCR试剂管基座(7)内位于每个腔室均安装有基座加热模块(12)。

4.根据权利要求3所述的病毒PCR快速检测装置，其特征在于：所述PCR试剂管基座(7)内安装有基座温度传感器(16)，所述上盖板(5)下端安装有上盖温度传感器(15)，所述上盖板(5)顶端安装有液晶显示屏(14)和操作按键(21)，所述液晶显示屏(14)、上盖温度传感器(15)、基座温度传感器(16)、操作按键(21)均通过导线与主控制板(20)连接，所述主控制板(20)安装在包装盒(1)的底端，所述包装盒(1)的后端设置有电源接口(13)，所述电源接口(13)与液晶显示屏(14)、上盖温度传感器(15)、基座温度传感器(16)、主控制板(20)连接为其供电。

5.根据权利要求4所述的病毒PCR快速检测装置，其特征在于：所述上盖板(5)的后端还固定有蜂鸣器(22)，所述蜂鸣器(22)通过导线与主控制板(20)连接。

6.根据权利要求4或5所述的病毒PCR快速检测装置，其特征在于：所述包装盒(1)的后端固定有包装盒连接座(2)，所述上盖板(5)的下端固定有上盖连接座(4)，所述包装盒连接座(2)与连接座(4)之间通过旋转轴(3)可旋转的连接。

7.根据权利要求6所述的病毒PCR快速检测装置，其特征在于：所述PCR试剂管孔槽(8)的数量至少有20个。

8.根据权利要求3所述的病毒PCR快速检测装置，其特征在于：PCR试剂管(9)包括PCR试剂管体(91)和PCR试剂管盖(93)，PCR试剂管盖(93)盖合设置在PCR试剂管体(91)顶端。

9.一种病毒PCR快速检测方法，其特征在于，该方法使用权利要求8所述的病毒PCR快速检测装置，所述的方法包括如下的步骤：

1)裂解：采集被检测者的鼻咽拭子，放置在PCR试剂管(9)中，在95℃热水浴中加热一段时间，接着进行热裂解20min；

2)样本的RPA扩增：另取一个PCR试剂管(9)，向其中分别依次加入LAMP反应液15μL、引物混合物1.7μL、无色结晶紫溶液5μL、热裂解产物3.7μL，盖上PCR管管盖，再盖上装置的上盖板，设置程序，63℃扩增40min；

3)结果判读：反应液变成蓝色则表明新冠病毒检测阳性，否则病毒检测为阴性。

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