CN114085149A - 一种巨豆三烯酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用 - Google Patents

一种巨豆三烯酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114085149A
CN114085149A CN202110907892.3A CN202110907892A CN114085149A CN 114085149 A CN114085149 A CN 114085149A CN 202110907892 A CN202110907892 A CN 202110907892A CN 114085149 A CN114085149 A CN 114085149A
Authority
CN
China
Prior art keywords
megastigmatrienone
hapten
artificial antigen
antibody
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110907892.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114085149B (zh
Inventor
方松
刘雪
宁扬
孔凡玉
张义志
王大彬
邱军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS
Original Assignee
Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS filed Critical Qingzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Corp of Institute of Tobacco Research of CAAS
Priority to CN202110907892.3A priority Critical patent/CN114085149B/zh
Publication of CN114085149A publication Critical patent/CN114085149A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114085149B publication Critical patent/CN114085149B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/34—Esters of acyclic saturated polycarboxylic acids having an esterified carboxyl group bound to an acyclic carbon atom
    • C07C69/40—Succinic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C29/00—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring
    • C07C29/132—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by reduction of an oxygen containing functional group
    • C07C29/136—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by reduction of an oxygen containing functional group of >C=O containing groups, e.g. —COOH
    • C07C29/143—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by reduction of an oxygen containing functional group of >C=O containing groups, e.g. —COOH of ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C35/00—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C07C35/02—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring monocyclic
    • C07C35/08—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring monocyclic containing a six-membered rings
    • C07C35/18—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring monocyclic containing a six-membered rings with unsaturation at least in the ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/08—Preparation of carboxylic acid esters by reacting carboxylic acids or symmetrical anhydrides with the hydroxy or O-metal group of organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/34—Esters of acyclic saturated polycarboxylic acids having an esterified carboxyl group bound to an acyclic carbon atom
    • C07C69/42—Glutaric acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/34—Esters of acyclic saturated polycarboxylic acids having an esterified carboxyl group bound to an acyclic carbon atom
    • C07C69/44—Adipic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/16—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring the ring being unsaturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

本发明适用于质量检测技术领域，提供了一种巨豆三烯酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用，所述巨豆三烯酮半抗原的结构式如下所示：
Figure DDA0003202399560000011
其中，所述n为2‑4中的任一整数。本发明利用巨豆三烯酮上现有的酮基基团进行还原，并通过引入连接臂的方式，使其具备与载体蛋白偶联的羧基基团。一方面能最大限度的保留巨豆三烯酮的化学结构和特征，另一方面引入的羧基基团可直接与载体蛋白偶联，二者均为后续制备强特异性和高灵敏度抗体奠定了基础；具体地，以此巨豆三烯酮半抗原为基础制备巨豆三烯酮人工抗原，由该巨豆三烯酮人工抗原得到的抗体具有较高的效价、特异性和亲和力，能应用于烟叶中巨豆三烯酮快速、特异性检测。

Description

一种巨豆三烯酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用
技术领域
本发明属于质量检测技术领域，尤其涉及一种巨豆三烯酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用。
背景技术
巨豆三烯酮作为烟草中性香气成分中含量最高的类胡萝卜素降解产物，具有烟草香、花香、木香及辛香底蕴，也是我国烤烟重要的主体香味成分。巨豆三烯酮含量与烟叶香味品质、质量呈正相关关系，少量添加到卷烟中便可对烟香、吸味等有较大改善，大幅提升卷烟制品的香味品质，因而对烤烟品质的影响极为显著。巨豆三烯酮的含量会随烤烟品种、产地、生产工艺和贮存条件的不同而产生变化。因此，对巨豆三烯酮的准确测定需要简单、高效的检测方法。
目前，烟叶中巨豆三烯酮的检测主要采用气相色谱质谱法。李正等采用气相色谱质谱法测定了363个烤烟样品中巨豆三烯酮的含量，含量在11.24-148.50μg/g，平均含量为41.88μg/g。张仲文同样采用气相色谱质谱法测定了烤烟中巨豆三烯酮的含量，并研究了土壤理化性质与烤烟巨豆三烯酮的灰色关联度。杨靖等采用气相色谱质谱技术测定巨豆三烯酮在卷烟烟气中的含量，并结合嗅辨仪测定了巨豆三烯酮的嗅觉阈值。但气相色谱质谱方法需要昂贵的仪器、环境条件和人员操作水平要求高，不能现场、大批量检测。
由此可见，现有的巨豆三烯酮的检测方法存在有机试剂用量大、仪器昂贵、环境及操作人员水平要求较高的问题。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种巨豆三烯酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用，旨在解决现有的巨豆三烯酮的检测方法存在有机试剂用量大、仪器昂贵、环境及操作人员水平要求较高的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种巨豆三烯酮半抗原，所述巨豆三烯酮半抗原的结构式如下所示：
Figure BDA0003202399540000021
其中，所述n为2-4中的任一整数。
本发明实施例的另一目的在于一种上述的巨豆三烯酮半抗原的制备方法，包括：
将巨豆三烯酮溶于甲醇，并于冰浴条件下分批加入硼氢化钠进行冰浴反应，用饱和氯化铵水溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取有机相，经洗涤、干燥，过滤以及浓缩处理，得到化合物。
将所述化合物溶于二氯甲烷，并加入三乙胺以及在冰浴条件下分批加入二酸酐进行室温反应，用饱和食盐水淬灭反应，乙酸乙酯萃取有机相，经洗涤、干燥，过滤、浓缩以及纯化处理，即得。
本发明实施例的另一目的在于一种巨豆三烯酮人工抗原，所述巨豆三烯酮人工抗原为上述的巨豆三烯酮半抗原与载体蛋白反应得到的偶联物。
本发明实施例的另一目的在于一种巨豆三烯酮人工抗原的制备方法，其包括：
将上述的巨豆三烯酮半抗原与牛血清白蛋白通过碳二亚胺法偶联制备得到巨豆三烯酮人工抗原；
或者将上述的巨豆三烯酮半抗原与卵清蛋白通过混合酸酐法制备得到巨豆三烯酮人工抗原。
本发明实施例的另一目的在于一种巨豆三烯酮抗体，所述巨豆三烯酮抗体是由上述的巨豆三烯酮人工抗原经动物免疫得到。
本发明实施例的另一目的在于一种上述的巨豆三烯酮抗体在巨豆三烯酮免疫检测中的应用。
本发明实施例提供的巨豆三烯酮半抗原，利用巨豆三烯酮上现有的酮基基团进行还原，并通过引入连接臂的方式，使其具备与载体蛋白偶联的羧基基团。一方面能最大限度的保留巨豆三烯酮的化学结构和特征，另一方面引入的羧基基团可直接与载体蛋白偶联，二者均为后续制备强特异性和高灵敏度抗体奠定了基础；具体地，以此巨豆三烯酮半抗原为基础制备巨豆三烯酮人工抗原，由该巨豆三烯酮人工抗原得到的抗体具有较高的效价、特异性和亲和力，能应用于烟叶中巨豆三烯酮快速、特异性检测。
附图说明
图1是本发明实施例提供的巨豆三烯酮半抗原的核磁氢谱图；
图2是本发明实施例提供的巨豆三烯酮半抗原的液相色谱质谱图；
图3是本发明实施例提供的巨豆三烯酮间接竞争ELISA法标准曲线；
图4是本发明实施例提供的间接竞争ELISA法与液相色谱串联质谱法测定烟叶中巨豆三烯酮的结果相关分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
近年来，免疫学检测分析技术因具有高灵敏、高特异性、快速、操作简便等优点，已在农、兽、医药等检测领域广泛应用，并逐步扩展到农产品的特征化学成分检测中。而目前尚未有巨豆三烯酮半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用的相关报道，也未见巨豆三烯酮免疫检测方法的相关报道。针对现有技术中存在的不足之处，本发明实施例提供了巨豆三烯酮半抗原，其利用巨豆三烯酮上现有的酮基基团进行还原，并通过引入连接臂的方式，使其具备与载体蛋白偶联的羧基基团。一方面能最大限度的保留巨豆三烯酮的化学结构和特征，另一方面引入的羧基基团可直接与载体蛋白偶联，二者均为后续制备强特异性和高灵敏度抗体奠定了基础；具体地，以此巨豆三烯酮半抗原为基础制备巨豆三烯酮人工抗原，由该巨豆三烯酮人工抗原得到的抗体具有较高的效价、特异性和亲和力，能应用于烟叶中巨豆三烯酮快速、特异性检测。
在本发明实施例中，所述巨豆三烯酮半抗原的结构式如下所示：
Figure BDA0003202399540000041
其中，所述n为2-4中的任一整数。
在本发明一个优选实施例中，所述n为2。
本发明实施例提供的巨豆三烯酮半抗原是利用巨豆三烯酮上现有的酮基基团进行还原，并通过引入连接臂的方式，使其具备与载体蛋白偶联的羧基基团。一方面能最大限度的保留巨豆三烯酮的化学结构和特征，另一方面引入的羧基基团可直接与载体蛋白偶联，二者均为后续制备强特异性和高灵敏度抗体奠定了基础。
本发明实施例还提供了一种上述巨豆三烯酮半抗原的制备方法，包括：
步骤S1，将巨豆三烯酮溶于甲醇，并于冰浴条件下分批加入硼氢化钠进行冰浴反应，用饱和氯化铵水溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取有机相，经洗涤、干燥，过滤以及浓缩处理，得到化合物，无色液体。
步骤S2，将所述化合物溶于二氯甲烷，并加入三乙胺以及在冰浴条件下分批加入二酸酐进行室温反应，用饱和食盐水淬灭反应，乙酸乙酯萃取有机相，经洗涤、干燥，过滤、浓缩以及纯化处理，即得。
其中，所述巨豆三烯酮和二酸酐的摩尔质量比为1:2～5。
其中，所述二酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐中的一种；优选为丁二酸酐。
其中，所述冰浴反应时间为1小时。
其中，所述室温反应时间为5小时。
本发明实施例所涉及的巨豆三烯酮半抗原的合成方法步骤短，两步反应即可完成，工艺条件温和，无需高温高压，操作简单。
本发明实施例还提供了一种巨豆三烯酮人工抗原，所述巨豆三烯酮人工抗原为上述的巨豆三烯酮半抗原与载体蛋白反应得到的偶联物。所述巨豆三烯酮人工抗原可以作为巨豆三烯酮免疫抗原，也可以作为巨豆三烯酮包被抗原。
本发明实施例还提供了一种巨豆三烯酮人工抗原的制备方法，具体的，巨豆三烯酮免疫抗原采用上述的巨豆三烯酮半抗原与牛血清白蛋白(BSA)通过碳二亚胺法偶联制备得到；巨豆三烯酮包被抗原采用上述的巨豆三烯酮半抗原与卵清蛋白(OVA)通过混合酸酐法制备得到。
上述巨豆三烯酮半抗原分子量较小，不具有免疫原性。通过巨豆三烯酮半抗原与载体蛋白偶联，制备的人工抗原具有免疫原性，可在动物体内产生免疫反应。
本发明实施例还提供了一种巨豆三烯酮抗体，它是由上述的巨豆三烯酮人工抗原经动物免疫得到，其能与巨豆三烯酮发生特异性免疫反应。具体的，所述的巨豆三烯酮抗体为本领域免疫抗体常规方法制备的单克隆抗体或多克隆抗体，其能与巨豆三烯酮发生特异性免疫反应。
在本发明一个优选实施例中，所述巨豆三烯酮抗体为特异性针对上述巨豆三烯酮半抗原和巨豆三烯酮人工抗原的鼠源单克隆抗体。
经验证，本发明实施例采用上述的巨豆三烯酮人工抗原得到的巨豆三烯酮抗体的效价、特异性、亲和力都较好。
本发明实施例还提供了一种上述的巨豆三烯酮抗体在巨豆三烯酮免疫检测中的应用，具体地，在烟叶中巨豆三烯酮检测的应用。本发明实施例通过上述的巨豆三烯酮人工抗原诱导免疫动物产生抗体，从而用于巨豆三烯酮免疫检测中。
在本发明实施例中，所述巨豆三烯酮免疫检测目标包括但不限于烤烟、白肋烟、雪茄烟、地方晾晒烟等干、鲜烟叶；免疫检测方法包括但不限于间接竞争ELISA法、ELISA试剂盒、胶体金试纸条、时间分辨荧光试纸条。
以下给出本发明某些实施方式的实施例，其目的不在于对本发明的范围进行限定。
实施例1
该实施例提供了一种巨豆三烯酮半抗原，其结构式如下：
Figure BDA0003202399540000071
可以看出，本发明实施例提供的巨豆三烯酮半抗原通过巨豆三烯酮上的羟基基团直接引入羧基基团，最大限度的保留了巨豆三烯酮的化学结构和特征，并可直接与载体蛋白偶联，为后续制备高特异性高灵敏度巨豆三烯酮抗体奠定了基础。
实施例2
该实施例提供了一种巨豆三烯酮半抗原的制备方法，其步骤如下：
Figure BDA0003202399540000072
步骤S1：将巨豆三烯酮(化合物1，0.57g，3mmol)溶于甲醇(50mL)，冰浴条件下分批加入硼氢化钠(0.22g，6mmol)。冰浴下反应1小时，用饱和氯化铵水溶液(100mL)淬灭反应，乙酸乙酯(50mL，3次)萃取有机相，水洗涤有机相(20mL，3次)，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到化合物2，无色液体。
步骤S2：将化合物2(0.29g，1.5mmol)溶于干燥二氯甲烷(50mL)，加入三乙胺。冰浴下分批加入丁二酸酐(0.30g，1.5mmol)，室温反应5小时。用饱和食盐水(100mL)淬灭反应，乙酸乙酯(50mL，3次)萃取有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗产品。用HPLC高效液相色谱纯化制备得到半抗原(化合物3)，为浅棕色液体。
本发明中巨豆三烯酮半抗原的制备方法，反应步骤仅两步，反应操作简单，反应条件温和并易于控制，制备的巨豆三烯酮半抗原的纯度和产率较高。其中，图1-2分别为本发明实施例提供的巨豆三烯酮半抗原的核磁氢谱图以及液相色谱质谱图。
实施例3
该实施例提供了一种巨豆三烯酮人工抗原(免疫抗原)的制备方法，步骤如下：
取实施例2制备的巨豆三烯酮半抗原60.0mg(0.2mmol)，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)1mL溶解，然后在溶液中加入69.0mg(0.6mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，25℃条件下搅拌反应15min,随后，向反应液中加入62.7mg(0.3mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)，25℃下搅拌反应12h。反应液离心后取上清液0.5mL，在0.5h内缓慢加入到12mL浓度为10mg/mL的牛血清蛋白(BSA)的CBS缓冲溶液中(0.1M,pH 9.6),混合液搅拌反应4h。反应完成后的溶液装入预处理好的透析袋中，先用蒸馏水在4℃下透析6h(每2h换液1次)，随后用PBS缓冲溶液(0.01mol/L,pH 7.4)透析72h(每6h换液1次)，得到与BSA偶联的巨豆三烯酮免疫抗原，分装，-20℃保存。
实施例4
该实施例提供了一种巨豆三烯酮人工抗原(包被抗原)的制备方法，步骤如下：
取实施例1制备的巨豆三烯酮半抗原97.5mg(0.25mmol)，加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)1mL溶解，然后在搅拌调价下加入60μL三正丁胺和30μL氯甲酸异丁酯，25℃条件下搅拌反应1h。随后，将反应液中加入到，在0.5h内缓慢加入到15mL浓度为12mg/mL的卵清蛋白(OVA)的CBS缓冲溶液中(0.1mol/L,pH 9.6),混合液搅拌反应2h。反应完成后的溶液装入预处理好的透析袋中，先用蒸馏水在4℃下透析6h(每2h换液1次)，随后用PBS缓冲溶液(0.01mol/L,pH 7.4)透析72h(每6h换液1次)，得到与OVA偶联的巨豆三烯酮包被抗原，分装，-20℃保存。
实施例5
该实施例提供了一种巨豆三烯酮抗体的制备方法，由巨豆三烯酮人工抗原免疫动物、杂交瘤细胞融合筛选、腹水制备、抗体纯化等步骤得到，其能与巨豆三烯酮发生特异性免疫反应。本发明的巨豆三烯酮抗体具有较高的效价、特异性和亲和力。
该实施例中，所述抗体为特异性针对上述巨豆三烯酮半抗原和人工抗原的鼠源单克隆抗体。该巨豆三烯酮单克隆抗体的制备方法，步骤如下：
1.动物免疫
取健康的6～8周雌性BALB/c小鼠5只，采用腹腔注射免疫方法进行免疫，共免疫6次。初次免疫用PBS缓冲溶液(0.15mol/L，pH 7.4)稀释实施例3中巨豆三烯酮免疫抗原至1mg/mL，随后加入等体积的弗氏完全佐剂(FCA)充分乳化，每只小鼠腹腔注射200μL。初次免疫后两周，取与初次免疫相同的剂量的免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化，每只小鼠腹腔注射200μL进行加强免疫。此后，每隔两周加强免疫一次。在细胞融合实验前3天，取巨豆三烯酮免疫抗原直接进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射200μL。
表1巨豆三烯酮免疫小鼠程序
Figure BDA0003202399540000091
Figure BDA0003202399540000101
2.血清效价测定
三免、四免、五免后7d，采用断尾方式对小鼠采血，间接非竞争ELISA方法测定小鼠血清效价，具体步骤如下：
包被：用CBS缓冲液(0.05mol/L，pH 9.6)稀释实施例4中制备的巨豆三烯酮包被抗原，稀释倍数为1000倍，在96孔酶标板中加入100μL/孔，37℃孵育2h。甩掉包被液，用PBST(含0.05％Tween-20的PBS缓冲溶液)洗涤4次，吸水纸拍干；
封闭：每孔加入1％OVA的PBS封闭液(0.01mol/L，pH 7.4)200μL，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干；
加血清：每孔加入100μL以PBS缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)倍比稀释的小鼠抗血清，空白对照中只加入PBS缓冲溶液，37℃孵育1h。甩掉反应液，洗涤4次，拍干。
加酶标二抗：每孔加入100μL经PBS缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)稀释的辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干；
显色：每孔加入100μL新鲜配制的底物显色液，37℃孵育15min。
反应终止：每孔加入50μL的2mol/L硫酸溶液。
吸光度测定：酶标仪测定450nm波长处各孔的吸光值。以样品孔吸光值接近于1的稀释倍数作为阳性血清的效价。
3.杂交瘤细胞融合和筛选
选择效价最高的小鼠，进行小鼠免疫脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞的融合，步骤如下：
3.1骨髓瘤细胞制备
融合前7-10d，将SP2/0骨髓瘤细胞用含10％FBS(胎牛血清)RPMI-1640培养基在5％的CO2培养箱中培养。待SP2/0瘤细胞处于对数生长期，并且数量达到1-4×107时收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，制备瘤细胞悬浮液，计数待用。
3.2免疫脾细胞制备
选取效价最高的小鼠，摘眼球取血，并分离血清作为后续阳性对照。颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75％酒精中浸泡消毒10min，超净工作台中无菌操作取出小鼠脾脏，清除脾脏上结缔组织。用注射器针头刺穿脾脏后将脾脏置于120目尼龙滤网上，并用注射器的胶头适度研磨挤压，使脾细胞释放到10mL的RPMI-1640基础培养液中。用20mL的RPMI-1640培养液洗涤脾细胞和滤网三次，合并培养液，并使用胶头滴管吹打，经1000rpm离心10min，用30mL的RPMI-1640培养基悬浮，制成脾细胞悬浮液，计数待用。
3.3杂交瘤细胞融合
将瘤细胞和脾细胞按照数量比5-10：1混合，置于50mL离心管中，1000rpm离心10min，弃去上清。轻弹离心管底部，使细胞松散均匀。在37℃无菌水浴条件下转动离心管，先慢后快的加入1mL温浴处理的聚乙二醇(PEG)，30s内加完。静置1min。随后，先快后慢在5min内加入20mL温浴处理的RPMI-1640培养液，终止PEG融合反应。然后37℃静置10min。细胞融合液经800rpm离心10min，弃去上清液，轻缓的重悬入40mL含20％胎牛血清、2％的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5％的CO2培养箱中培养。
3.4杂交瘤细胞株的筛选
在杂交瘤细胞融合后的第d天，使用RPMI-1640筛选培养液半换液，第5d用含20％的胎牛血清，1％的100×HT的RPMI-1640过渡培养液全换液，在第7d取细胞上清进行筛选。先用间接非竞争ELISA筛选出阳性细胞孔，随后用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抗体竞争性筛选。选择对巨豆三烯酮均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得稳定分泌巨豆三烯酮单克隆抗体的细胞株。
4.小鼠腹水制备
取6-8周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油0.5mL致敏；7d后每只小鼠腹腔注射2×106杂交瘤细胞。7d后，待小鼠腹腔明显膨大后注射器抽取腹水，-20℃保存。待小鼠腹腔再次膨大，重复抽取腹水，每只小鼠重复抽取2-3次。
5.抗体纯化
采用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化，制备巨豆三烯酮单克隆抗体。抗体经冷冻干燥后，分装，-20℃保存。
6.抗体效价测定
参照血清效价测定步骤，用间接非竞争ELISA方法测定抗体的效价。结果表明，巨豆三烯酮单克隆抗体的效价＞200000，具有优异的特异性和高效性。
实施例6
该实施例提供了一种巨豆三烯酮间接竞争ELISA检测方法
1.间接竞争ELISA检测步骤
(1)包被：用CBS缓冲液(0.05mol/L，pH 9.6)稀释实施例4中制备的巨豆三烯酮包被抗原，稀释倍数为1000倍，在96孔酶标板中加入100μL/孔，37℃孵育2h。甩掉包被液，用PBST(含0.05％Tween-20的PBS缓冲溶液)洗涤4次，吸水纸拍干。
(2)封闭：每孔加入1％OVA的PBS缓冲液200μL，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干。
(3)加抗体和巨豆三烯酮样品或标准液：每孔加入50μL经含10％甲醇的PBS缓冲液稀释2000倍的单克隆抗体(实施例5制备)，空白对照中只加入含10％甲醇的PBS缓冲液。随后每孔加入50μL经10％甲醇PBS缓冲液稀释的巨豆三烯酮标准溶液或提取液，37℃孵育1h。甩掉反应液，洗涤4次，拍干。
(4)加酶标二抗：每孔加入100μL经PBS缓冲液稀释的辣根过氧化物酶-羊抗鼠抗体，37℃孵育1h。甩掉封闭液，洗涤4次，拍干；
(5)显色：每孔加入100μL新鲜配制的底物显色液，37℃孵育15min。
(6)反应终止：每孔加入50μL的2mol/L硫酸溶液。
(7)吸光度测定：酶标仪测定450nm波长处各孔的吸光值。
2.间接竞争ELISA检测方法检测性能
如图3所示，采用四参数logistic方程对巨豆三烯酮浓度和吸光值抑制率进行拟合，得到巨豆三烯酮间接竞争ELISA标准曲线为y＝-1.30+(96.73+1.30)/(1+(x/1.07)^0.98)，方法的抑制中浓度IC50为1.07μg/g，最低检测限IC20为0.26μg/g，线性范围(IC20-80)为0.26-4.36μg/g。
实施例7烟叶中巨豆三烯酮的间接竞争ELISA检测
1.烟叶巨豆三烯酮的提取
准确称取1g烟叶粉末样品或鲜烟叶匀浆液，加入10mL离心管中。随后加入5mL的50％甲醇水溶液，超声提取20min。静置5min后，吸取上清液1mL加入10mL离心管中，加入9mL含10％甲醇的PBS缓冲液(0.01mol/L，pH 7.4)，制成巨豆三烯酮提取液。
2.烟叶样品巨豆三烯酮检测
选取烤后烟叶样品10个，按照步骤1提取，分别采用实施例6巨豆三烯酮间接竞争ELISA检测方法和液相色谱串联质谱法进行检测。间接竞争ELISA与液相色谱串联质谱法的检测结果呈现良好相关性(图4),线性方程为y＝1.024x+1.1188,R2＝0.9844。结果表明间接竞争ELISA检测可用于烟叶中巨豆三烯酮的准确可靠检测。
综上，本发明实施例提供的巨豆三烯酮半抗原，利用巨豆三烯酮上现有的酮基基团进行还原，并通过引入连接臂的方式，使其具备与载体蛋白偶联的羧基基团。一方面能最大限度的保留巨豆三烯酮的化学结构和特征，另一方面引入的羧基基团可直接与载体蛋白偶联，二者均为后续制备强特异性和高灵敏度抗体奠定了基础；具体地，以此巨豆三烯酮半抗原为基础制备巨豆三烯酮人工抗原，由该巨豆三烯酮人工抗原得到的抗体具有较高的效价、特异性和亲和力，能应用于烟叶中巨豆三烯酮快速、特异性检测。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种巨豆三烯酮半抗原，其特征在于，所述巨豆三烯酮半抗原的结构式如下所示：
Figure FDA0003202399530000011
其中，所述n为2-4中的任一整数。
2.一种权利要求1所述的巨豆三烯酮半抗原的制备方法，其特征在于，包括：
将巨豆三烯酮溶于甲醇，并于冰浴条件下分批加入硼氢化钠进行冰浴反应，用饱和氯化铵水溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取有机相，经洗涤、干燥，过滤以及浓缩处理，得到化合物。
将所述化合物溶于二氯甲烷，并加入三乙胺以及在冰浴条件下分批加入二酸酐进行室温反应，用饱和食盐水淬灭反应，乙酸乙酯萃取有机相，经洗涤、干燥，过滤、浓缩以及纯化处理，即得。
3.根据权利要求2所述的巨豆三烯酮半抗原的制备方法，其特征在于，所述巨豆三烯酮和二酸酐的摩尔质量比为1:2～5。
4.根据权利要求2或3所述的巨豆三烯酮半抗原的制备方法，其特征在于，所述二酸酐为丁二酸酐、戊二酸酐、己二酸酐中的一种。
5.根据权利要求2所述的巨豆三烯酮半抗原的制备方法，其特征在于，所述冰浴反应时间为1小时。
6.根据权利要求2所述的巨豆三烯酮半抗原的制备方法，其特征在于，所述室温反应时间为5小时。
7.一种巨豆三烯酮人工抗原，其特征在于，所述巨豆三烯酮人工抗原为权利要求1所述的巨豆三烯酮半抗原与载体蛋白反应得到的偶联物。
8.一种巨豆三烯酮人工抗原的制备方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述的巨豆三烯酮半抗原与牛血清白蛋白通过碳二亚胺法偶联制备得到巨豆三烯酮人工抗原；
或者将权利要求1所述的巨豆三烯酮半抗原与卵清蛋白通过混合酸酐法制备得到巨豆三烯酮人工抗原。
9.一种巨豆三烯酮抗体，其特征在于，所述巨豆三烯酮抗体是由权利要求7所述的巨豆三烯酮人工抗原经动物免疫得到。
10.一种权利要求9所述的巨豆三烯酮抗体在巨豆三烯酮免疫检测中的应用。
CN202110907892.3A 2021-08-09 2021-08-09 一种巨豆三烯酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用 Active CN114085149B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110907892.3A CN114085149B (zh) 2021-08-09 2021-08-09 一种巨豆三烯酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110907892.3A CN114085149B (zh) 2021-08-09 2021-08-09 一种巨豆三烯酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114085149A true CN114085149A (zh) 2022-02-25
CN114085149B CN114085149B (zh) 2023-10-20

Family

ID=80296076

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110907892.3A Active CN114085149B (zh) 2021-08-09 2021-08-09 一种巨豆三烯酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114085149B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114671761A (zh) * 2022-04-18 2022-06-28 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种制备β-紫罗兰酮半抗原的方法、人工抗原和抗体
CN114671761B (zh) * 2022-04-18 2024-05-31 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种制备β-紫罗兰酮半抗原的方法、人工抗原和抗体

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080248493A1 (en) * 2007-04-09 2008-10-09 Mattingly Phillip G Acridinium phenyl esters useful in the analysis of biological samples
CN101357883A (zh) * 2007-07-30 2009-02-04 国鼎生物科技股份有限公司 治疗自体免疫疾病的牛樟芝环己烯酮化合物及医药组成物
CN107353200A (zh) * 2017-06-27 2017-11-17 苏州博源医疗科技有限公司 一种香草扁桃酸衍生物、其合成方法及一种香草扁桃酸免疫原、其制备方法及其应用
CN111646898A (zh) * 2020-08-06 2020-09-11 中国农业科学院蜜蜂研究所 木藜芦毒素iii半抗原、人工抗原及其制备方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080248493A1 (en) * 2007-04-09 2008-10-09 Mattingly Phillip G Acridinium phenyl esters useful in the analysis of biological samples
CN101357883A (zh) * 2007-07-30 2009-02-04 国鼎生物科技股份有限公司 治疗自体免疫疾病的牛樟芝环己烯酮化合物及医药组成物
CN107353200A (zh) * 2017-06-27 2017-11-17 苏州博源医疗科技有限公司 一种香草扁桃酸衍生物、其合成方法及一种香草扁桃酸免疫原、其制备方法及其应用
CN111646898A (zh) * 2020-08-06 2020-09-11 中国农业科学院蜜蜂研究所 木藜芦毒素iii半抗原、人工抗原及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
曹娟等: "脱二氧喹烯酮多克隆抗体的制备及其直接竞争ELISA检测方法的建立", 《化学与生物工程》, vol. 29, no. 07, pages 81 - 85 *
曹建敏等: "烤烟重要致香物质与评吸质量的相关性研究", 《中国烟草科学》, vol. 33, no. 06, pages 75 - 79 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114671761A (zh) * 2022-04-18 2022-06-28 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种制备β-紫罗兰酮半抗原的方法、人工抗原和抗体
CN114671761B (zh) * 2022-04-18 2024-05-31 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) 一种制备β-紫罗兰酮半抗原的方法、人工抗原和抗体

Also Published As

Publication number Publication date
CN114085149B (zh) 2023-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111943882B (zh) 腐霉利半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN113264834B (zh) 一种冷杉醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN110627726B (zh) 咪鲜胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN111333503A (zh) 三氯杀螨醇半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN112458062B (zh) 一株乙基麦芽酚单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN108840848B (zh) 一种香豆素半抗原与抗原的制备方法及应用
CN114276335A (zh) 一种苯醚甲环唑半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用
CN114316058A (zh) 一株分泌环酰菌胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株dcf及其应用
CN112574956B (zh) 一株分泌霜霉威单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN110927382A (zh) 一种检测喹乙醇的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其应用
CN114085149A (zh) 一种巨豆三烯酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用
CN108181463B (zh) 一种β-激动剂半抗原和人工抗体及其制备方法和应用
CN113563292B (zh) 一种莨菪亭半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体、应用
CN113717950B (zh) 一株分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN113024415B (zh) 氟氯氰菊酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN112480167B (zh) 水胺硫磷半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN114671761A (zh) 一种制备β-紫罗兰酮半抗原的方法、人工抗原和抗体
CN115322089B (zh) 一种覆盆子酮半抗原、人工抗原及其制备方法、抗体和应用
CN114671761B (zh) 一种制备β-紫罗兰酮半抗原的方法、人工抗原和抗体
CN111961002A (zh) 吡唑醚菌酯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN112358549A (zh) 二甲基异茨醇单克隆抗体的制备及其酶联免疫吸附分析方法
CN111875652A (zh) 多杀菌素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN113717948B (zh) 一株分泌抗菌核净单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN111825566B (zh) 六氯苯半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
CN114989144B (zh) 一种苯醚甲环唑半抗原、完全抗原、抗体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant