CN114058660A - 一种α-熊果苷的固定化酶转化合成方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了α‑熊果苷的固定化酶转化合成方法及应用,该固定化酶转化合成方法,包括下述步骤:(1)将固定化细胞装柱,组成固定化酶柱;(2)将双糖、氢醌溶于水中,混合料液调pH至酸性条件后流加入固定化酶柱中,与柱中固定化酶进行反应,收集流出液,即得。该转化方法将反应料液与固定化酶柱中的固定化酶进行反应,同一固定化酶柱重复使用,可以实现90批次α‑熊果苷的高效转化(转化率>97%),且酶活性仍维持大于588u/g的较高活性、氢醌残留≤2g/L,实现了α‑熊果苷的持续高效转化,提高了生产的效率;采用上述固定化酶转化合成方法制备的α‑熊果苷转化液,其中α‑熊果苷含量可高达205.63g/L,且氢醌含量<1g/L,可用于制备的α‑熊果苷成品。
Description
技术领域
本发明属于生物合成技术领域,具体涉及一种α-熊果苷的固定化酶转化合成方法及应用。
背景技术
熊果苷,又名熊果素或对苯二酚葡萄糖苷,是一种酪氨酸酶抑制剂,主要阻断多巴及多巴醌的合成,从而遏制黑色素的生成,减少皮肤色素沉积,可作为药物和化妆品添加剂使用。熊果苷是一种新兴的无刺激、无过敏、配伍性强的天然美白活性物质,具有显著的皮肤增白作用,20世纪90年代由日本的株式会社资生堂作为化妆品美白剂首先推出,目前熊果苷已垄断发达国家的美白护肤市场。
熊果苷不仅对皮肤的雀斑、老人斑、黄褐斑有消褪作用,而且对皮肤的滋润、皮肤灼伤后的愈合等也颇有疗效。目前已知的熊果苷有α-熊果苷、β-熊果苷和脱氧熊果苷(D-Arbutin),其中,α-熊果苷的美白活性是β-熊果苷的十倍,而且α熊果苷对黑色素细胞不产生毒害性、刺激性、致敏性等副作用,同时还有杀菌、消炎的作用,与β-熊果苷和脱氧熊果苷相比,具有更好的光稳定性和溶解度。
氢醌作为酶法生产α-熊果苷的主要原料,在α-熊果苷产品中有残留。氢醌在世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单的3类致癌物中,同时《Q/JSB 001-2016化妆品用原料α-熊果苷质量标准》对氢醌的含量进行了规定,限定在10ppm以内,而且当氢醌应用于食品级、医药级原料时,质量要求会更高。α-熊果苷常通过生物酶转化法生产,常见的生物酶转化法是将反应物(糖基供体和糖基受体)按一定比例与生物酶混合进行酶转化反应,在酶转化反应过程中常产生一些副产物,如果糖等,这些副产物会抑制酶反应的正向进行,降低系统中酶的活性,随着副产物的不断积累,更是会严重影响产物的转化率,降低酶的利用率,不利于生产的进行。
为了提高生产效率和酶的利用率,亟需提出一种新的生产α-熊果苷的酶转化工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种α-熊果苷的固定化酶转化合成方法,包括下述步骤:
(1)将固定化细胞装柱,组成固定化酶柱;
(2)将双糖、氢醌溶于水中,混合料液调pH至酸性条件后流加入固定化酶柱中,与柱中固定化酶进行反应,收集流出液,即得。
本发明的优选技术方案,步骤(1)中,固定化细胞装柱的方法,包括下述步骤:向柱中注入生理盐水,由柱顶部流入固定化细胞颗粒至浸没在生理盐水中,在柱底部的支撑网板作用下,形成固定化酶柱。
本发明的优选技术方案,所述固定化细胞颗粒为固定化含生物酶细胞,优选为固定化含双糖酶细胞,更优选为固定化含蔗糖酶细胞。
本发明的优选技术方案,所述固定化细胞颗粒粒径大于柱底部的支撑网板孔径;优选地,固定化细胞颗粒粒径为1-4mm;更优选地,固定化细胞颗粒粒径为2-3mm。
本发明的优选技术方案,所述固定化细胞颗粒的制备方法,包括下述步骤:将菌泥与生理盐水充分混合,然后降温至冷藏温度后,依次搅拌加入载体和交联剂,交联料液于设定温度下进行搅拌交联反应;交联产物经抽滤、滤饼洗涤、粉碎,得到固定化细胞颗粒。
本发明的优选技术方案,所述菌泥与生理盐水的质量/体积比为1:8-12,优选为1:9-11,更优选为1:10。
本发明的优选技术方案,所述菌泥为大肠杆菌菌泥。
本发明的优选技术方案,所述冷藏温度为3-10℃,优选为4-8℃,更优选为4-6℃。
本发明的优选技术方案,所述载体为硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料中的任一种,优选为硅藻土,更优选为改性硅藻土。
本发明的优选技术方案,所述载体在交联料液中的质量浓度为10%-40%,优选为15%-35%,更优选为20%-30%。
本发明的优选技术方案,所述交联剂包括戊二醛和聚乙烯亚胺;优选地,所述交联剂为戊二醛和聚乙烯亚胺。
本发明的优选技术方案,所述交联剂在交联料液中的质量浓度为9-15%;优选地,所述交联剂为质量浓度2%-6%的聚乙烯亚胺和质量浓度为7%-9%的戊二醛。
本发明的优选技术方案,所述交联反应为20-40℃下搅拌交联维持2-8h,优选为25-35℃下搅拌交联维持3-7h,更优选为30℃下搅拌交联维持5h。
本发明的优选技术方案,步骤(2)中,所述双糖、氢醌、水的质量比为2-4:1:10-14,优选为2-3:1:11-13,更优选为2:1:12。
本发明的优选技术方案,所述双糖选自蔗糖、麦芽糖、乳糖中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案,所述酸性条件为pH3.0-6.5,优选为pH3.5-6.0,更优选为pH5.0-6.0。
本发明的优选技术方案,步骤(2)中,在流入固定化酶柱前,混合料液的温度控制在20-50℃,优选为25-45℃,更优选为30-40℃。
本发明的优选技术方案,步骤(2)中,混合料液流加到固定化酶柱的流速为0.2-1.5BV/h,优选为0.4-1.2BV/h,更优选为0.6-1BV/h。
本发明的优选技术方案,所述固定化酶柱至少为一根,优选为两根以上,且固定化酶柱之间并联连接。
本发明的优选技术方案,采用两根以上并联连接的固定化酶柱进行α-熊果苷的固定化酶连续转化合成,包括下述步骤:
将混合料液从一根固定化酶柱流入,使混合料液与柱中固定化酶进行反应;在反应过程中实时检测该根固定化酶柱出料口的流出液含量,计算α-熊果苷转化率;当α-熊果苷转化率低于设定的工艺水平时,切换固定化酶柱,使混合料液流入其他任一根固定化酶柱中继续进行酶转化反应。
本发明的优选技术方案,在混合料液流入其他任一根固定化酶柱进行酶转化时,使用过的固定化酶柱进行柱内固定化酶更新。
本发明的优选技术方案,使用过的固定化酶柱进行柱内固定化酶更新,包括下述步骤:
a、将使用过的固定化酶柱中的旧固定化细胞洗脱;
b、将新固定化细胞装柱。
本发明的优选技术方案,步骤a中,旧固定化细胞的洗脱包括下述步骤:打开柱旁路管道,向柱中流加洗脱液,以对柱中旧固定化细胞进行洗脱;洗脱结束,从柱顶部喷洒水进行柱内清洗。
本发明的优选技术方案,步骤b中,新固定化细胞装柱的方法与步骤(1)中固定化细胞装柱的方法相同。
本发明的优选技术方案,步骤a中,洗脱液为酸溶液或碱溶液。
本发明的优选技术方案,所述酸溶液为磷酸、盐酸、硫酸、硝酸溶液中的任一种。
本发明的优选技术方案,所述碱溶液为氢氧化钠溶液、氢氧化钙溶液中的任一种。
本发明的优选技术方案,氢醌转化率≥87%,优选≥90%,更优选≥93%,再优选≥96%,再优选≥99%。
本发明的优选技术方案,混合物料与固定化酶反应结束后,固定化酶柱中固定化酶的活性≥400u/g,优选≥500u/g,更优选≥600u/g,再优选≥700u/g,再优选≥800u/g,再优选≥840u/g。
本发明的另一目的在于提供一种α-熊果苷转化液,其中,α-熊果苷含量≥170g/L,优选≥180g/L,更优选≥190g/L,再优选≥200g/L,最优选≥205g/L。
本发明的优选技术方案,所述α-熊果苷转化液中氢醌含量<11g/L,优选<9g/L,更有选<7g/L,再优选<5g/L,还优选<3g/L,还优选≤2g/L,最优选为<1g/L。
本发明的另一目的还在于提供一种本发明的α-熊果苷转化液在制备α-熊果苷中的应用。
本发明的优选技术方案,以α-熊果苷转化液为原料,制备α-熊果苷。
本发明的优选技术方案,α-熊果苷由α-熊果苷转化液经过滤、分离纯化、结晶、分离得到。
除非另有说明,本发明涉及液体与液体之间的百分比时,所述的百分比为体积/体积百分比;本发明涉及液体与固体之间的百分比时,所述百分比为体积/重量百分比;本发明涉及固体与液体之间的百分比时,所述百分比为重量/体积百分比;其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比,本发明具有下述有益技术效果:
1、本发明提供了一种α-熊果苷的固定化酶转化合成方法,该转化方法将反应料液(糖基供体和糖基受体)按一定比例投入至固定化酶系统(pH、温度、流速适宜)中,与固定化酶柱中的固定化酶进行反应,在不进行固定化酶柱再生的情况下,同一固定化酶柱可以实现90批次α-熊果苷的高效转化(转化率>97%),且酶活性仍维持较高活性(酶活性>588u/g),而氢醌残留≤2g/L,实现了α-熊果苷的持续高效转化,提高了生物酶的利用率,增加了转化率,减少了生产成本;而氢醌的低残留则大大减少了后续纯化(如浓缩结晶或降温结晶)的次数或难度,缩短了生产周期,降低了生产成本。
2、本发明采用多根并联的固定化酶柱进行α-熊果苷的固定化酶转化合成,在混合物料流入新的固定化酶柱进行酶转化时,使用过的固定化酶柱可同步进行旧酶的洗脱和新酶的重新固定,实现了α-熊果苷的连续化生产,减少了酶再生后再使用的耗时,大大提高了生产效率。
3、本发明通过向柱中流加洗脱液即可实现固定化酶柱中旧固定化细胞的洗脱,洗脱方便,缩短了固定化酶柱的再生处理周期,而且洗脱液选用酸碱溶液,可避免使用有机溶剂,减少了有毒三废的产生,更加绿色环保。
附图说明
图1本发明实施例的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所用的试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
制备例1
将30g菌泥与300mL生理盐水(质量/体积比约为1:10)充分混合(pH为7),然后降温至4℃,搅拌加入110g改性硅藻土,并加入25g聚乙烯亚胺,然后加入35g戊二醛进行交联,25℃搅拌交联维持7h;将交联产物进行抽滤,滤饼用纯水洗涤后,机械粉碎成颗粒,得粒径为2mm的固定化细胞颗粒。
制备例2
将30g菌泥与300mL生理盐水充分混合(pH为7),然后降温至6℃,搅拌加入100g改性硅藻土,并加入30g聚乙烯亚胺,然后加入40g戊二醛进行交联,30℃搅拌交联维持5h;将交联产物进行抽滤,滤饼用纯水洗涤后,机械粉碎成颗粒,得粒径为2mm的固定化细胞颗粒。
实施例1
参阅图1,旁路管道的进出液口分别位于柱的进出料口上下方,且进液阀设置于进料阀与柱进料口之间,出液阀设置于出料阀与柱出料口之间(进出料阀、进出液阀可选用市售的截止阀);工作时,先关闭进出料阀和旁路管道出液阀,打开旁路管道进液阀,向柱1中泵入400mL生理盐水,再通过柱1顶部流入制备例1的固定化细胞颗粒至生理盐水上液面处于柱1的500mL体积刻度处(固定化细胞颗粒浸没在生理盐水中),在柱1底部孔径为1mm的支撑网板作用下,形成固定化酶柱;
将500g蔗糖与250g氢醌混合溶于3L纯水中,调节混合料液pH至3.5,温度控制在20℃,然后按0.4BV/h流速流入装有固定化细胞的柱1中,与柱1中的固定化酶进行反应,由柱1的出料口收集产物(流出液),得α-熊果苷转化液。
实施例2
参阅实施例1,向柱1中泵入400mL生理盐水,再通过柱1顶部流入制备的例2固定化细胞颗粒至生理盐水上液面处于柱1的500mL体积刻度处(固定化细胞颗粒浸没在生理盐水中),在柱1底部支撑网板作用下,形成固定化酶柱;
将500g蔗糖与250g氢醌混合溶于3L纯水中,调节混合料液pH至3.5,温度控制在20℃,然后按0.4BV/h流速流入装有固定化细胞的柱1中,与柱1中的固定化酶进行反应,由柱1的出料口收集产物,得α-熊果苷转化液。
实施例3
按照实施例2制备固定化酶柱;
将500g蔗糖与250g氢醌混合溶于3L纯水中,调节混合料液pH至4,温度控制在30℃,然后按0.6BV/h流速流入装有固定化细胞的柱1中,与柱1中的固定化酶进行反应,由柱1的出料口收集产物,得α-熊果苷转化液。
实施例4
按照实施例2制备固定化酶柱;
将500g蔗糖与250g氢醌混合溶于3L纯水中,调节混合料液pH至5,温度控制在40℃,然后按1.0BV/h流速流入装有固定化细胞的柱1中,与柱1中的固定化酶进行反应,由柱1的出料口收集产物,得α-熊果苷转化液。
实施例5
按照实施例2制备固定化酶柱;
将500g蔗糖与250g氢醌混合溶于3L纯水中,调节混合料液pH至5,温度控制在40℃,按1.0BV/h流速流入装有固定化细胞的柱1,与柱1中的固定化酶进行反应,由柱1的出料口收集第一批产物,检测第一批产物含量,计算α-熊果苷转化率、α-熊果苷含量、氢醌残量及柱1中固定化细胞酶活性(第一批);
参照上述步骤,重复使用该固定化酶柱(固定化细胞未再生),进行多批次酶转化反应(混合料液添加量及反应条件同第一批次酶转化反应),并计算每批次产物中α-熊果苷转化率、α-熊果苷含量、氢醌残量及各批次转化后柱1中固定化细胞酶活性,结果如表1所示。
表1
实施例6
参阅图1,向柱1中泵入400mL生理盐水,再通过柱1顶部流入制备例2的固定化细胞颗粒至生理盐水上液面处于柱1的500mL体积刻度处(固定化细胞颗粒浸没在生理盐水中),在柱1底部支撑网板作用下,形成固定化酶柱1;
参照柱1中固定化细胞的装柱方法,向柱2(与柱1规格相同)中装入等量的固定化细胞颗粒,并形成固定化酶柱2;
将500g蔗糖与250g氢醌混合溶于3L纯水中,调节混合料液pH至5,温度控制在40℃,然后按1.0BV/h流速流入固定化酶柱1,与固定化酶柱1中的固定化酶进行反应,实时检测固定化酶柱1出料口的产物含量,计算α-熊果苷转化率;当α-熊果苷转化率低于设定的工艺水平如95%时,说明固定化酶柱1中的固定化细胞酶活性开始明显下降,无法满足生产需求;此时,切换固定化酶柱1的进料和出料阀,打开固定化酶柱2的进料和出料阀,开始利用固定化酶柱2进行下一批次酶转化反应;与此同时,通过旁路管道将柱1中使用过的旧固定化细胞进行洗脱,再将新固定化细胞进行装柱,实现旧酶的洗脱和新酶的重新固定;如此往复,实现固定化酶连续转化合成α-熊果苷。
其中,并联的固定化酶柱不限于2个,还可为3个及以上固定化酶柱并联工作。
其中,旧酶的洗脱包括下述步骤:
打开柱1的旁路管道,向柱1中流加盐酸溶液,以对柱1中的旧固定化细胞进行洗脱;洗脱结束(柱1中的固定化细胞全部由旁路管道的出液口流出),通过柱1顶部的喷淋器从柱顶部喷洒纯水进行清洗。
其中,新酶的重新固定参照上述固定化酶柱1或固定化酶柱2的装柱步骤完成。
对比例1
将500g蔗糖与250g氢醌混合溶于3L纯水中,调节混合料液pH至5,温度控制在40℃,再加入30g大肠杆菌菌泥,控制反应6h,得到α-熊果苷转化液。
试验例1
通过高效液相色谱法(HPLC)分别检测实施例1-4的柱1出料口的产物含量,计算氢醌转化率、氢醌残留量及柱1中细胞的酶活性;计算对比例1的α-熊果苷转化率、氢醌残留量及母液中酶活性,结果如表2所示。
表2
酶活性:通过酶活力表示,其中每分钟生成1微摩尔α-熊果苷的酶量定义为1个酶活力单位(U);U/g表示1g细胞所具有的酶活力;对于固定化细胞,换算成实际细胞量计算。
以上仅是本发明的优选实施方式,本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例,凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰,应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种α-熊果苷的固定化酶转化合成方法,包括下述步骤:
(1)将固定化细胞装柱,组成固定化酶柱;
(2)将双糖、氢醌溶于水中,混合料液调pH至酸性条件后流加入固定化酶柱中,与柱中固定化酶进行反应,收集流出液,即得。
2.根据权利要求1所述的α-熊果苷的固定化酶转化合成方法,其中,步骤(1)中,固定化细胞装柱的方法,包括下述步骤:向柱中注入生理盐水,由柱顶部流入固定化细胞颗粒至浸没在生理盐水中,在柱底部的支撑网板作用下,形成固定化酶柱。
3.根据权利要求1-2任一项所述的α-熊果苷的固定化酶转化合成方法,其中,所述固定化细胞颗粒为固定化含生物酶细胞,优选为固定化含双糖酶细胞,更优选为固定化含蔗糖酶细胞。
4.根据权利要求1-3任一项所述的α-熊果苷的固定化酶转化合成方法,其中,所述固定化细胞颗粒粒径大于柱底部的支撑网板孔径;优选地,固定化细胞颗粒粒径为1-4mm;更优选地,固定化细胞颗粒粒径为2-3mm。
5.根据权利要求1-4任一项所述的α-熊果苷的固定化酶转化合成方法,其中,所述双糖、氢醌、水的质量比为2-4:1:10-14,优选为2-3:1:11-13,更优选为2:1:12。
6.根据权利要求1-5任一项所述的α-熊果苷的固定化酶转化合成方法,其中,步骤(2)中,在流入固定化酶柱前,混合料液的温度控制在20-50℃,优选为25-45℃,更优选为30-40℃。
7.根据权利要求1-6任一项所述的α-熊果苷的固定化酶转化合成方法,其中,步骤(2)中,混合料液流加到固定化酶柱的流速为0.2-1.5BV/h,优选为0.4-1.2BV/h,更优选为0.6-1BV/h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的α-熊果苷的固定化酶转化合成方法,其中,所述固定化酶柱至少为一根,优选为两根以上,且固定化酶柱之间并联连接。
9.一种采用权利要求1-8任一项所述α-熊果苷的固定化酶转化合成方法所得的α-熊果苷转化液,其中,α-熊果苷含量≥170g/L,优选≥180g/L,更优选≥190g/L,再优选≥200g/L,最优选≥205g/L。
10.一种采用权利要求1-8任一项所述α-熊果苷的固定化酶转化合成方法所得α-熊果苷转化液或权利要求9所述α-熊果苷转化液在制备α-熊果苷中的应用。
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