CN114032185A - 一种葡萄汁有孢汉逊酵母培养基及培养方法 - Google Patents

一种葡萄汁有孢汉逊酵母培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种葡萄汁有孢汉逊酵母培养基，其由以下原料组成：葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏、磷酸二氢钾及金属离子，其中，葡萄糖35～37g/L，酵母浸粉4～5g/L，牛肉膏18～19g/L，磷酸二氢钾5.5～5.8g/L。本发明还公开了一种葡萄汁有孢汉逊酵母培养方法。本发明以营养物质丰富的牛肉膏代替了基础培养基中的蛋白胨，且添加了磷酸二氢钾，并且对其营养物质含量进行了调整，以达到增殖培养的效果，且这些成分来源方便，制作简单，能够起到增菌效果。实验证明，将葡萄汁有孢汉逊酵母接入该培养基进行培养，活菌数可达到5*109cfu/mL，与相同处理的常规培养基相比，活菌数得到了提高，比增殖培养前高出一个数量级，增殖效果显著，且配方简单，生产简单易行。

Description

一种葡萄汁有孢汉逊酵母培养基及培养方法
技术领域
本发明涉及微生物培养领域，具体涉及了一种葡萄汁有孢汉逊酵母培养基及培养方法。
背景技术
酵母是一种单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。而是一种肉眼看不见的微小单细胞真核微生物，能将糖类发酵成酒精和二氧化碳，广泛分布于自然界，是一种典型的异养或兼性厌氧微生物，在有氧和无氧条件下都能够存活，是一种天然发酵菌剂，除此之外，酵母细胞含有丰富的蛋白质、维生素以及各种酶等，是医药、化工和食品发酵工业的重要原料。
发酵菌剂是影响发酵产品质量的关键因素，伴随着食品加工技术的发展，浓缩型发酵菌剂因其活菌数高，保藏期长，使用方便而更受欢迎。但研制浓缩型酵母菌发酵剂首先需要获得大量活性菌体。因此，有必要对其进行增殖培养，既可以提高菌体密度，又能降低生产设备成本。
酵母菌作为一种对人类有益的菌种，在许多时候，需要其快速生长繁殖，这就要求提供它所需要的生长环境，营养丰富的培养基正是其中的关键，经研究发现碳源、氮源、生长因子、无机盐等是酵母生长的主要营养物质。已有研究表明，葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、蛋白胨、磷酸二氢钾等都是促进酵母细胞生长的主要营养物质。此外，多项研究结果表明，不同菌株由于自身性质与耐受性的不同，最适生长营养物质与条件均存在显著差异。目前国内外均未有报道如何低成本且规模化培养葡萄汁有孢汉逊酵母且有效促进胞外酶活性。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种合理、方便、低成本且能保证酵母菌大量生长，可应用于高效浓缩型发酵菌剂的工业化生产的葡萄汁有孢汉逊酵母增菌培养基及培养方法。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种葡萄汁有孢汉逊酵母培养基，其由以下原料组成：葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏、磷酸二氢钾及金属离子，其中，葡萄糖35～37g/L，酵母浸粉4～5g/L，牛肉膏18～19g/L，磷酸二氢钾5.5～5.8g/L。
作为本发明提供的所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养基的一种优选实施方式，所述培养基还添加有金属离子3～6mmol/L。
作为本发明提供的所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养基的一种优选实施方式，所述金属离子包括：Zn2+、Mn2+、Fe2+和Fe3+的至少一种。
作为本发明提供的所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养基的一种优选实施方式，所述培养基的溶剂为无菌水。
作为本发明提供的所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养基的一种优选实施方式，以1000mL无菌水所含的物质计，所述培养基包括葡萄糖36.683g、酵母浸粉4.178g、牛肉膏18.533g、磷酸二氢钾5.683g、金属离子5mmol。
一种葡萄汁有孢汉逊酵母培养方法，其包括以下步骤：酵母经活化后，接入上述培养基中，置于27.5～28.5℃，170～180r/min的条件下，摇床震荡培养 18～20h。
作为本发明提供的所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养基的一种优选实施方式，所述培养基PH值为5.0。
作为本发明提供的所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养基的一种优选实施方式，所述葡萄汁有孢汉逊酵母初始菌体密度为8*108cfu/mL。
作为本发明提供的所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养基的一种优选实施方式，所述葡萄汁有孢汉逊酵母的接种量为2％(v/v)。
作为本发明提供的所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养基的一种优选实施方式，其包括以下步骤：酵母经活化后，以2％(v/v)接种量接入上述培养基，置于28℃，180r/min的条件下，摇床震荡培养18h。
本发明具有如下有益效果：
本发明以营养物质丰富的牛肉膏代替了基础培养基中的蛋白胨，且添加了磷酸二氢钾，并且对其营养物质含量进行了调整，以达到增殖培养的效果，且这些成分来源方便，制作简单，能够起到增菌效果。实验证明，将葡萄汁有孢汉逊酵母接入该培养基进行培养，活菌数可达到5*109cfu/mL，与相同处理的常规培养基相比，活菌数得到了提高，比增殖培养前高出一个数量级，增殖效果显著，且配方简单，生产简单易行；而且加入金属离子后，对葡萄汁有孢汉逊酵母酶活力具有明显的激活作用，促使酶活力上升了23.72～70.72％。本发明在葡萄汁有孢汉逊酵母及其相关生物制品的工业化生产中可发挥巨大的作用。
附图说明
图1为葡萄汁有孢汉逊酵母在不同的基础培养基中的生长曲线；
图2为葡萄汁有孢汉逊酵母不同时间YPD培养基中活菌数；
图3为本发明不同碳源及浓度对葡萄汁有孢汉逊酵母菌株生长的影响关系图；
图4为本发明不同碳源下最高活菌数；
图5为本发明不同氮源及浓度对葡萄汁有孢汉逊酵母菌株生长的影响关系图；
图6为本发明不同氮源最高活菌数；
图7为本发明复合氮源对葡萄汁有孢汉逊酵母菌株生长的影响关系图；
图8为本发明不同无机盐及浓度对葡萄汁有孢汉逊酵母菌株生长的影响关系图；
图9不同无机盐最高活菌数；
图10为不同的培养基中葡萄汁有孢汉逊酵母菌株的生长曲线图。
图11为不同金属离子对葡萄汁有孢汉逊酵母的β-葡萄糖苷酶活力影响。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明。下面实施例中如无特别说明，均为常规手段。
实施例1：一种葡萄汁有孢汉逊酵母增殖培养基优化
一、菌种的活化、保存与培养
1.菌种的分离及保存
从葡萄中分离获得一株适用于葡萄酒发酵的葡萄汁有孢汉逊酵母菌种，置于甘油管中保存。
2.菌种的活化
将保存于4℃冰箱的酵母菌种挑取一环接种入YPD液体培养基中，在28℃条件下恒温培养24小时进行菌种活化，然后按2％(v/v)接种量将其菌悬液再次接种于YPD液体培养基中，连续活化三次备用。
3.生物量的测定
光密度法、平板稀释涂布法。
4.发酵种子液的制备
将活化好的菌种按照2％(v/v)的接种量转接至100mL YPD培养基中，置于28℃恒温培养18h，然后用稀释涂布法进行计数，制成备用种子液，其活菌数为108cfu/mL。
5.菌株生长曲线的绘制
将活化好的酵母按2％(v/v)的接种量接种于YPD基础培养基中，在28℃， 180r/min的条件下，进行摇床震荡培养，以未接种的空白培养基为对照，每隔两小时测定一次菌悬液的OD600nm，以时间为横坐标，绘制菌株生长曲线，并且同时利用稀释涂布法进行活菌数的计数，以确定最佳的菌龄收获时间。
将培养好的酵母菌种子液按2％(v/v)的接种量接种于YPD、PDB、黄豆芽、麦芽汁四种不同培养基(150mL三角瓶装液量为50mL)，于28℃、 180r/min培养26h，每隔2h取样，测定其OD600nm值，绘制菌株在不同基础培养中的生长曲线，实验以未接种的培养基调零，每组实验进行三个平行，从而得到最适基础培养基。
由图1酵母在不同基础培养基中的生长曲线可知，在基础培养基筛选实验中，其对数生长期和稳定期大致相同，分别为2-14h，14-20h。在4种培养基中发酵培养18h后，酵母菌细胞生长密度分别达到最高值。OD600nm测试的结果表明：其在YPD培养基中的生长密度最大，之后依次为黄豆芽培养基>麦芽汁培养基>马铃薯培养基，因此选择YPD培养基作为酵母的基础培养基。此外，由图2酵母在YPD培养基中不同时间的活菌数可知，随着培养时间的增加，活菌数呈现先增加后下降的的变化趋势，同时，在18h 的活菌数达到最大值，因此，选取18h(对数生长期末期)为菌体收集的最佳时间点，以保证菌体的总生长量和活性均达到最高值。
三、不同营养物质对酵母生长影响的单因素实验
分别探究不同碳源、氮源、无机盐、生长因子种类及浓度对酵母菌体密度的影响。以不含该营养物质的YPD培养基为基础培养基，添加不同营养物质，每种物质设置六个浓度梯度，在28℃，180r/min的培养条件下，摇床震荡培养18h后，将其菌悬液稀释五倍，采用光密度法，在OD600nm处测定其吸光值，同时，每种物质选取OD600nm最大的浓度采用平板稀释计数法测定其活菌数，综合考量OD600nm和活菌数，每组实验进行三个平行，从而确定菌株生长的最适营养物质及其浓度。各营养物质及浓度梯度见表1
表1不同营养物质对酵母生长的影响
Figure BDA0003227227480000041
Figure BDA0003227227480000051
由图3—图9可知，不同种类的碳源对菌体生长密度的影响存在显著差异，其中最适生长碳源为葡萄糖，浓度为35g/L；而复合氮源的使用效果显著优于单一氮源，其中酵母浸粉和牛肉膏的使用效果最好，浓度分别为5g/L，20g/L；而无机盐的用量虽远比C、N少，但其重要性并不亚于C和N，并且具有多种生理功能，其中最适无机盐为磷酸二氢钾，浓度为6g/L。
四、不同营养物质对酵母生长影响的响应面实验
在上述试验结果的基础上，选择葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏、磷酸二氢钾4 个因素进行四因素三水平的响应面实验，以活菌数为响应值，研究各因素及其交互作用对酵母高密度培养的影响，应用Design-Expert 12软件的响应面法优化培养基配方，实验设计因素水平及编码见表2。
表2 Box-Behnken试验因素水平表
Figure BDA0003227227480000052
回归分析的方差分析见表3，响应面模型的p值具有显著性(p<0.01)，而缺乏拟合的值不显著(p>0.05)，结果表明，该模型具有显著性，回归分析可用于响应面模型的建模。由于多元回归方程适合反映实际实验数据，因此可以根据所选自变量对Y的结果进行分析。R2＝0.9691，表明操作响应面为96.91％，可以被该模型解释，进一步表明实验数据与回归方程拟合良好。此外，主项A、B，交互项AB、BC、二次项A2、B2表现为极显著，说明对设计模型有显著影响。 F值可反映各因素对响应值的重要性，F值越大，则表明影响越大，则各因素影响活菌数的大小为B>A>C>D。
利用多元回归方程对葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏、磷酸二氢钾对酵母活菌数(Y)的影响进行了优化，使其活菌数达到最大值。根据Derringer 的期望函数，确定了培养基的最佳配方，对酵母高密度培养模型进行求导和解逆矩阵可以得到模型的极值点，葡萄糖36.683g/L、酵母浸粉4.178g/L、牛肉膏18.533g/L、磷酸二氢钾5.683g/L。此时模型预测的最大响应值为 5.689*109cfu/mL。为了验证预测结果，在上述培养基条件下进行验证试验，得到菌体密度为5.533*109cfu/mL，与理论值近似。由此可知，基于响应面法得到的优化培养基成分参数准确可靠，具有实用价值。
(Y)的多元二次回归方程如下：
Y＝5.58+0.3138A-0.3742B-0.3333C-0.1558D+0.9700AB+0.7800AC-0.6850AD+1.33BC+0.2275BD+0.4200CD-1.08A2-1.52B2-1.34C2-1.02D2
表3响应面实验方差分析表
Figure BDA0003227227480000061
Figure BDA0003227227480000071
A：葡萄糖；B：酵母浸粉；C：牛肉膏；D：磷酸二氢钾***p<0.001； **p<0.01；*p<0.05。
实施例2：一种酵母增殖培养的最适培养条件优化
在上述实验筛选出的最适培养基成分基础上，对其培养条件进行优化，主要包括以下步骤：
一、不同培养基初始PH对酵母生长的影响
将优化后的培养基PH分别而调整至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，按照2％(v/v) 的接种量分别接种酵母。于28℃，180r/min，摇床震荡培养18h后，将其菌悬液稀释五倍，分别于600nm处，测定其吸光值，并且使用平板稀释涂布法，测定其活菌数，得出5.0的pH为酵母的生长最适pH。
二、培养温度对酵母生长的影响
将其摇床培养温度分别调整至26、27、28、29、30℃，按照2％(v/v)的接种量分别接种酵母。于180r/min，摇床震荡培养18h后，将其菌悬液稀释五倍，分别于600nm处，测定其吸光值，并且使用平板稀释涂布法，测定其活菌数得出28℃为酵母的最适生长温度。
三、培养转速对酵母生长的影响
利用优化后的培养基，将其摇床培养转速分别调整至150、160、170、180、 190r/min，按照2％(v/v)的接种量分别接种酵母，于180r/min，摇床震荡培养18h后，将其悬液稀释五倍，分别于600nm处，测定其吸光值，并且使用平板稀释涂布法，测定其活菌数得出：180r/min为酵母的生长最适摇床转速。
利用优化后的培养基，按照1％、2％、3％、4％、5％(v/v)的接种量分别接种酵母，于180r/min，28℃下，摇床震荡培养18h后，将其悬液稀释五倍，分别于600nm处，测定其吸光值，并且使用平板稀释涂布法，测定其活菌数，得出：2％的接种量为酵母的最适接种量。
实施例3：为测定不同培养基对酵母生长的增殖效果
(1)麦芽汁培养基的制备：麦芽浸粉20g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，酵母浸粉10g/L，混匀于121℃条件下灭菌20min。
(2)YPD液体/固体培养基的制备：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，固体添加琼脂20g/L，混匀于121℃条件下灭菌20min。
(3)黄豆芽培养基的制备：200g黄豆芽添加一定量蒸馏水，煮沸并维持30min，趁热过滤后弃滤渣，加水至1L，加入20g葡萄糖，混匀于 121℃条件下灭菌20min。
(4)PDB培养基的制备：200g马铃薯添加一定量蒸馏水，煮沸并维持30min，趁热过滤后弃滤渣，加水至1L，加入20g葡萄糖，混匀于121℃条件下灭菌20min。
(5)增殖培养基的制备：葡萄糖36.683g/L、酵母浸粉4.178g/L、牛肉膏8.533g/L、磷酸二氢钾5.683g/L，混匀于121℃条件下灭菌20min。
(6)各时间段测定其生物量，以OD600nm表示
(7)各时间段的生物量测试结果如图10所示：由图10酵母在不同培养基中的生长曲线可知，其对数生长期和稳定期大致相同，分别为 2-14h，14-20h。在5种培养基中发酵培养18h后，酵母菌细胞生长密度分别达到最高值。OD600nm测试的结果表明：其在增殖培养基中的生长密度最大，之后依次为YPD>黄豆芽培养基>麦芽汁培养基>马铃薯培养基。
(8)从以上实例结论：增殖培养基比YPD、黄豆芽培养基、麦芽汁培养基、马铃薯培养基增殖效果好，本发明的增殖培养基所采用的原料来源方便，且可对酵母菌的生长达到显著的增殖效果。
以一株酵母为例，将其经YPD液体培养基活化后，以2％的接种量接入本实例所得到的增殖培养基中，置于28℃，180r/min的条件下，培养18h，活菌数可达到5.255*109cfu/mL，与相同处理的实验室常用YPD培养基活菌数8.19*108 cfu/mL相比，活菌数得到了提高，增殖效果显著。
实施例4：添加不同金属离子对酶活的影响
以上述增殖培养基为基础，分别添加有5mmol/L的ZnSO4·7H2O、 MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O和FeCl3，以一株酵母为例，将其经YPD液体培养基活化后，以10％的接种量接入此培养基中，180r/min，28℃的摇床条件下培养 72h。取发酵液于转速为8 000r/min、温度为4℃的条件下离心15min，收集上清液，用80％饱和度的硫酸铵盐析，4℃下静置过夜，离心(4℃，10 000r/min， 10min)收集沉淀，用等体积乙酸-乙酸钠缓冲液(pH＝5.0)溶解，再用PEG20 000 (上海源叶生物科技有限公司)进行透析，得到酶液。将200μL的酶液、750μL 的柠檬酸-磷酸缓冲液(pH＝5.0)、250μL 1mmol/L的p-NPG溶液混匀，在40℃条件下水浴30min后加入1mL 1mol/L Na2CO3终止反应，于400nm处测吸光值。β-葡萄糖苷酶活力单位(U)定义为：40℃下1min内催化生成1μmol p-NP 所需要的酶量。测定β-葡萄糖苷酶活力。其中Zn2+能够增加34.68％的酶活力， Mn2+能够增加64.86％的酶活力，Fe2+能够增加70.72％的酶活力，Fe3+能够增加 40.09％的酶活力。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种葡萄汁有孢汉逊酵母培养基，其特征在于，其由以下原料组成：葡萄糖、酵母浸粉、牛肉膏、磷酸二氢钾及金属离子，其中，葡萄糖35～37g/L，酵母浸粉4～5g/L，牛肉膏18～19g/L，磷酸二氢钾5.5～5.8g/L。
2.根据权利要求1所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养基，其特征在于，所述培养基还添加有金属离子3～6mmol/L。
3.根据权利要求2所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养基，其特征在于，所述金属离子包括：Zn2+、Mn2+、Fe2+和Fe3+的至少一种。
4.根据权利要求2所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养基，其特征在于，所述培养基的溶剂为无菌水。
5.根据权利要求4所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养基，其特征在于，以1000mL无菌水所含的物质计，所述培养基包括葡萄糖36.683g、酵母浸粉4.178g、牛肉膏18.533g、磷酸二氢钾5.683g、金属离子5mmol。
6.葡萄汁有孢汉逊酵母培养方法，其特征在于，其包括以下步骤：酵母经活化后，接入如权利要求1-5任一所述的培养基，置于27.5～28.5℃，170～180r/min的条件下，摇床震荡培养18～20h。
7.根据权利要求6所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养方法，其特征在于，所述培养基PH值为5.0。
8.根据权利要求6所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养方法，其特征在于，所述葡萄汁有孢汉逊酵母初始菌体密度为8*108cfu/mL。
9.根据权利要求6所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养方法，其特征在于，所述葡萄汁有孢汉逊酵母的接种量为2％(v/v)。
10.根据权利要求6所述的葡萄汁有孢汉逊酵母培养方法，其特征在于，其包括以下步骤：酵母经活化后，以2％(v/v)接种量接入如权利要求1-5任一所述的培养基，置于28℃，180r/min的条件下，摇床震荡培养18h。
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