CN113999865A - 结核分枝杆菌融合蛋白ar2及其构建与表达纯化方法和应用 - Google Patents

结核分枝杆菌融合蛋白ar2及其构建与表达纯化方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了结核分枝杆菌融合蛋白AR2及其构建与表达纯化方法和应用，所述构建与表达纯化方法包括以下步骤，S1：从结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列中提取Rv1988及Rv1886c编码的基因序列；S2：以pET28a、pET30b作为载体，构建pET30b‑Rv1988重组质粒和pET28a‑Rv1886c重组质粒；S3：根据提取的Rv1988及Rv1886c基因序列合成Rv1988‑Rv1886c，也即融合蛋白AR2；S4：以质粒pET28a作为载体，构建重组质粒pET28a‑AR2；S5：将步骤S2和步骤S4中构建的重组质粒转入表达载体E.coli BL21菌株中；S6：融合蛋白AR2及亚组份蛋白rRv1988、rRv1886c的表达与纯化，将本发明中的融合蛋白AR2和佐剂进行联合构建结核亚单位疫苗，该疫苗可在小鼠体内诱导较强的细胞免疫应答并促进记忆性T细胞的产生，后期有望成为更为有效的结核病新型候选疫苗。

Description

结核分枝杆菌融合蛋白AR2及其构建与表达纯化方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及结核分枝杆菌融合蛋白AR2及其构建与表达纯化方法和应用。
背景技术
结核分枝杆菌(MTB)是结核病的病原体，是人类病原体中最能适应人体环境的一种，它可以以潜伏状态在人体巨噬细胞内长时间存活。据估计，全球有三分之一的人口存在结核分枝杆菌潜伏感染，其中这一人群中有10％的人口在免疫功能低下时由潜伏期结核进展为活动性结核。对于结核病的控制策略很大程度上依赖于疾病的诊断和至少三种不同抗痨药物长期的治疗。但这导致了多重耐药结核的不断发展。另外，由于艾滋病病毒的流行，并发的结核分枝杆菌感染也逐渐成为亟待解决的问题。全球结核病对公共卫生健康的影响日益严重，迫切需要研制一种新的抗结核疫苗。
目前所使用的结核疫苗卡介苗(BCG)，自1921年开始应用于临床，是一种减毒牛结核分枝杆菌活疫苗。研究证实，它能够有效预防新生儿和儿童患严重的脑膜结核及全身粟粒性结核病，但是不能有效的防止成人肺结核的发生。继BCG疫苗应用80多年以来，全球尚未研制出有效的新型抗结核疫苗。因此，为了在全球范围内彻底消灭结核病，我们迫切需要研制更为有效的结核病新型疫苗。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供结核分枝杆菌融合蛋白AR2及其构建与表达纯化方法和应用，通过一种全新的结核分歧杆菌融合蛋白AR2和佐剂进行联合构建结核亚单位疫苗，该疫苗可在小鼠体内诱导较强的细胞免疫应答并促进记忆性T细胞的产生，后期有望成为更为有效的结核病新型候选疫苗。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：从结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列中提取Rv1988及Rv1886c编码的基因序列；
S2：以pET28a、pET30b作为载体，构建pET30b-Rv1988重组质粒和pET28a-Rv1886c重组质粒；
S3：根据提取的Rv1988及Rv1886c基因序列合成Rv1988-Rv1886c，也即融合蛋白AR2的融合基因；
S4：以质粒pET28a作为载体，构建重组质粒pET28a-AR2；
S5：将步骤S2和步骤S4中构建的重组质粒转入表达载体E.coli BL21菌株中；
S6：融合蛋白AR2及亚组份蛋白rRv1988、rRv1886c的表达与纯化。
进一步的，步骤S2的具体操作包括以下步骤，
S201：参照原核表达载体pET28a、pET30b的多克隆位点设计Rv1988及Rv1886c对应的引物，以H37Rv基因组作为模板进行PCR基因扩增；
S202：对PCR基因扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；
S203：目的基因Rv1988和Rv1886c回收与验证；
S204：将回收的目的基因Rv1988、Rv1886c，以及原核表达载体pET28a、pET30b分别进行双酶切；
S205：对双酶切反应液进行纯化；
S206：将纯化后的双酶切产物进行连接，Rv1988与质粒pET30b连接，Rv1886c与质粒pET28a连接；
S207：将步骤S206中得到的两个连接体系分别转入大肠杆菌E.coli DH5α菌株中，置于LB固体培养基上培养，待其长出菌落，每个菌落即为一个单克隆；
S208：于超净台内取高压灭菌的洁净玻璃试管，向其中加入LB液体培养基和抗生素，挑取步骤S207中培养得到单克隆置于液体培养基中，将试管置于摇床内摇菌；
S209：从步骤S208的液体培养基中抽提pET30b-Rv1988重组质粒和pET28a-Rv1886c重组质粒。
进一步的，步骤S202的具体操作包括以下步骤，
1)：1％琼脂糖凝胶的制备；以万分之一天平称取琼脂糖0.2g至烧杯，取20ml 1×TAE溶液，倒入烧杯内，微波炉中火加热1min；取出，待冷却至约50℃时，加2μl Gelview染料，摇匀，倒入制胶模具中；室温冷却约30min，得1％琼脂糖凝胶，将其取出置于水平电泳槽内；
2)：加样；在1％琼脂糖凝胶的胶孔内加入4μl核酸标志物Marker DL2000，25μlPCR基因扩增产物；
3)：电泳；打开电泳仪，并与电泳槽通电，调整电泳仪电压为100V，电流为100mA，电泳时间设置为25min，Start开始电泳；
4)：成像；电泳仪提示结束后关闭仪器，取出电泳完成的琼脂糖胶，将其置于Bio-Rad凝胶成像系统ChemiDoc XRS+中，运行成像并拍照保存。
进一步的，步骤S205的具体操作包括以下步骤，
1)：将双酶切产物装入洁净1.5ml EP管，以无菌水补至100μl，再向其中加入500μl含有异丙醇的缓冲液中，充分混匀；
2)：混匀后移至吸附柱内，以转速为8000rcf离心30s，将流出液再移至吸附柱内，8000rcf离心30s，弃流出液；
3)：将500μl含有乙醇的漂洗液加入到吸附柱内，9000rcf离心30s，弃流出液；
4)：重复操作步骤3)；
5)：将空吸附柱以转速为9000rcf离心1min；
6)：开盖，室温放置5min以挥发残留乙醇；
7)：于水浴锅预热洗脱缓冲液至60℃；
8)：向吸附柱膜中央加入35μl预热至60℃的洗脱缓冲液，40℃静置温浴2min，以转速为9000rcf离心1min，得洗脱液，取3.5μl进行验证，余下于-20℃保存备用。
进一步的，步骤S207的具体操作包括以下步骤，
1)：于-80℃冻存柜中取出感受态细胞E.coli DH5α，插在碎冰上进行冰浴，待溶化；
2)：取洁净EP管，移取120μl E.coli DH5α悬液加入其中，再将10μl连接体系与E.coli DH5α悬液混匀；
3)：将步骤2)中的混悬液冰浴45min；
4)：冰浴完成后42℃水浴90s；
5)：水浴完成后快速平稳移至冰上静置10min；
6)：于EP管中加入LB液体培养基870μl，混匀；
7)：将菌液混悬液37℃、170rpm，复苏45min；
8)：复苏完成后以5000rpm、时间为6min对菌液进行离心；
9)：留取50-100μl上清与菌体进行混匀，将混合液滴加至预热约30℃的含抗生素的LB固体琼脂培养基上，以无菌涂布棒均匀涂开；
10)：培养基室温正置20min，后倒置于培养箱中37℃培养16h。
进一步的，步骤S6中采用IPTG诱导融合蛋白AR2及亚组份蛋白表达，具体操作包括以下步骤；
1)摇菌：将已转化的E.coli BL21单克隆接种至5ml含有抗生素的LB液体培养基中，摇床设置210rpm，37℃，培养12-16h；
2)转摇：取100ml已高压灭菌的液体培养基，向其中按1:1000加入对应抗生素，将过夜摇的菌液加入到该液体培养基中，190rpm、37℃，培养约2h，以UV计于600nm处测定OD约为0.6，留取转摇菌液50μl用于鉴定；
3)诱导：向转摇菌液中加入1M IPTG 100μl，摇床210rpm，37℃，培养约4h，留取菌液50μl用于鉴定，余下菌液分装至50ml离心管，以3500rpm离心30min，弃上清收集菌体，-20℃保存。
进一步的，步骤S6中采用金属螯合高流速琼脂糖微球纯化融合蛋白AR2及亚组份蛋白，具体操作包括以下步骤；
1)装Ni-NTA柱：将所用材料和试剂置于室温下使其达到室温，Ni2+－高流速琼脂糖微球凝胶保存于20％乙醇溶液中，取1ml凝胶于柱，以5ml无菌水洗涤2次，再向柱中加入1mlBinding Buffer平衡，备用；
2)取-20℃冻存菌体，冰上放置解冻，按湿重每克菌加入5ml Binding Buffer；
3)温和混匀菌液，注意避免有气泡；
4)超声细胞破碎仪设置功率为120W，工作2s、间隔3s，共计200次，使菌体破裂；
5)对菌液以转速3000rpm，时间30min，温度4℃进行离心，收集离心后上清；
6)按50％Ni-NTA悬液:上清液＝1:4进行加入柱中，轻混，将Ni柱封口插入碎冰中，摇床200rpm，转动60min；
7)取出Ni柱，套上新EP管，转速300rpm离心1min，留50μl用于SDS-PAGE鉴定；
8)移取1ml Elution Buffer至Ni柱，转速350rpm离心1min，操作4次，取第4次流出物50μl用于SDS-PAGE鉴定；
9)移取1ml洗脱缓冲液至Ni柱，转速350rpm离心1min，操作4次，收集每次的流出液即为洗脱蛋白，记为洗脱1、2、3、4，各留取50μl用于SDS-PAGE鉴定；
10)洗脱完成后以5ml Binding Buffer进行洗涤，并以3ml Binding Buffer平衡柱子。
进一步的，利用上述方法得到的结核分歧杆菌融合蛋白AR2。
进一步的，结核分歧杆菌融合蛋白AR2在制备结核病亚单位疫苗中的应用。
进一步的，结核分歧杆菌融合蛋白AR2在制备结核病亚单位疫苗中的应用，其特征在于：包括以下步骤，
1)制备阳离子脂质体DDA；
2)使用阳离子脂质体DDA分别制备DC佐剂、DM佐剂和DMC佐剂；
3)将融合蛋白AR2分别与DC佐剂、DM佐剂和DMC佐剂按照体积比1:1混合，即可得到AR2/DC、AR2/DM、AR2/DMC亚单位疫苗。
本发明的有益效果是：
1、本发明中通过提取结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列中提取Rv1988及Rv1886c编码的基因序列，通过基因工程技术，成功构建了重组质粒pET28a-AR2、pET28a-Rv1886c和pET30b-Rv1988，使用IPTG诱导，成功表达纯化了融合蛋白AR2以及亚组分蛋白rRv1988、rRv1886c，通过小鼠实验证明了表达出来的蛋白均具有较好的特异性和生物活性。
2、本发明中表达纯化的融合蛋白AR2经人体实验验证，其刺激M.tb感染者T细胞产生的IFN-γ水平较其亚组分诱导水平均高。
3、本发明中将融合蛋白AR2与不同佐剂DC、DM、DMC联合构建结核亚单位疫苗，通过动物免疫实验证实，采用联合单佐剂成分的复合型佐剂DMC后，BCG+AR2/DMC组小鼠无论在脾细胞上清细胞因子、抗体和肺脏mRNA水平检测中，TNF-α+及IFN-γ+单阳的CD4+和CD8+T细胞数明显升高，尤其IFN-γ+TNF-α+双阳的CD8+T细胞数明显高于其他初免增强组，提示DMC可增强亚单位疫苗的免疫原性并提供强大、持久的免疫保护力。AR2/DMC可能是一种有较大发展潜力和广阔应用前景的TB亚单位疫苗。
附图说明
图1为本发明实施例一中重组原核表达质粒pET28a-AR2构建图；
图2为本发明实施例一中重组原核表达质粒pET30b-Rv1988和pET28a-Rv1886c构建图；
图3为本发明实施例一中重组质粒双酶切鉴定结果；
图4为本发明实施例一中AR2(A)、rRv1988(B)和rRv1886c(C)的表达及纯化鉴定结果；
图5为本发明实施例一中AR2、rRv1988和rRv1886c的SDS-PAGE鉴定结果；
图6为本发明实施例一中AR2、rRv1988和rRv1886c的Western blot鉴定结果；
图7为本发明实施例一中PHA诱导M.tb感染者及健康者全血IFN-γ水平；
图8为本发明实施例一中rRv1988、rRv1886c和AR2诱导不同人群外周血特异性IFN-γ水平；
图9为本发明实施例一中rRv1988、rRv1886c和AR2诱导M.tb感染者外周血特异性IFN-γ水平；
图10为本发明实施例二中不同组小鼠的免疫方案；
图11为本发明实施例二中抗原特异性T淋巴细胞的流式分选策略；
图12为本发明实施例二中小鼠血清中抗原特异性抗体滴度及IgG2a:IgG1值；
图13为本发明实施例二中ELISA检测不同组小鼠脾细胞分泌的IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-4水平结果；
图14为本发明实施例二中各组小鼠脾细胞代表性IFN-γ和TNF-α分泌型T淋巴细胞流式分析结果；
图15为本发明实施例二中各组小鼠脾细胞抗原特异性T细胞数目水平；
图16为本发明实施例二中qRT-PCR检测不同疫苗接种小鼠肺中IFN-γ、IL-10、TNF-α和iNOS的mRNA水平。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
实施例一：结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化
结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，包括以下步骤，
S1：根据Genbank数据库提供的M.tb H37Rv全基因组序列，从中提取Rv1988及Rv1886c编码的基因序列；
S2：以pET28a、pET30b作为载体，构建pET30b-Rv1988重组质粒和pET28a-Rv1886c重组质粒；
具体的，S201：参照原核表达载体pET28a、pET30b的多克隆位点设计Rv1988及Rv1886c对应的引物，如下表1所示，以H37Rv基因组作为模板进行PCR基因扩增；基因扩增的反应条件和PCR反应体系分别如下表2和下表3所示。
表1基因与引物信息
Figure BDA0003295604720000061
表2 Rv1988和Rv1886c的PCR反应条件
Figure BDA0003295604720000071
表3 PCR反应体系
Figure BDA0003295604720000072
S202：对PCR基因扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；
1)：1％琼脂糖凝胶的制备；以万分之一天平称取琼脂糖0.2g至烧杯，取20ml 1×TAE溶液，倒入烧杯内，微波炉中火加热1min；取出，待冷却至约50℃时，加2μl Gelview染料，摇匀，倒入制胶模具中；室温冷却约30min，得1％琼脂糖凝胶，将其取出置于水平电泳槽内；
1×TAE溶液的配制方法为：称取Tris 24.2g，EDTA3.72g，加80ml去离子水，充分搅拌混匀；量取5.71ml冰乙酸加入其中，后以去离子水定容至100ml即得50×TAE母液；取母液10ml加490ml去离子水即得1×TAE溶液。
2)：加样；在1％琼脂糖凝胶的胶孔内加入4μl核酸标志物Marker DL2000，25μlPCR基因扩增产物；
3)：电泳；打开电泳仪，并与电泳槽通电，调整电泳仪电压为100V，电流为100mA，电泳时间设置为25min，Start开始电泳；
4)：成像；电泳仪提示结束后关闭仪器，取出电泳完成的琼脂糖胶，将其置于Bio-Rad凝胶成像系统ChemiDoc XRS+中，运行成像并拍照保存。
S203：目的基因Rv1988和Rv1886c回收与验证；
具体的，将电泳完成的琼脂糖胶置于紫外分析仪中，打开紫外灯，用洁净刀片切下包含目的基因的凝胶(尽可能地不切多余的凝胶；尽量减少目的基因在紫外光下的暴露时间，以减少对DNA的损伤)，参照《Sangon Biotech DNA胶回收试剂盒操作手册》操作。
S204：将回收的目的基因Rv1988、Rv1886c，以及原核表达载体pET28a、pET30b分别进行双酶切；
具体的，Rv1988、Rv1886c、原核表达载体pET28a、pET30b的酶切体系分别如下表4～7所示。
Figure BDA0003295604720000081
将不同的酶切体系按体系加入到新的洁净EP管中，37℃水浴4小时，而后65℃水浴20min灭活酶。
S205：利用离心法对双酶切反应液进行纯化；
具体的，1)：将双酶切产物装入洁净1.5ml EP管，以无菌水补至100μl，再向其中加入500μl缓冲液中(已加入指定量异丙醇使异丙醇终浓度为20％)，充分混匀；所述缓冲液成分为3M醋酸钾和5M醋酸。
2)：混匀后移至吸附柱内，以转速为8000rcf离心30s，将流出液再移至吸附柱内，8000rcf离心30s，弃流出液；
3)：将500μl漂洗液(已加入指定量乙醇)加入到吸附柱内，9000rcf离心30s，弃流出液；所述漂洗液为10mM Tris-HCl(pH 7.5)和80％乙醇。
4)：重复操作步骤3)；
5)：将空吸附柱以转速为9000rcf离心1min；
6)：开盖，室温放置5min以挥发残留乙醇；
7)：于水浴锅预热洗脱缓冲液至60℃；
8)：向吸附柱膜中央加入35μl预热至60℃的洗脱缓冲液，40℃静置温浴2min，以转速为9000rcf离心1min，得洗脱液，取3.5μl进行验证，余下于-20℃保存备用。
S206：将纯化后的双酶切产物进行连接，Rv1988与质粒pET30b连接，Rv1886c与质粒pET28a连接；pET30b-Rv1988和pET28a-Rv1886c连接体系分别如下表8和下表9所示。
Figure BDA0003295604720000091
取洁净EP管，按体系将各成分加入其中，16℃温浴连接12小时。
S207：将步骤S206中得到的两个连接体系分别转入大肠杆菌E.coli DH5α菌株中，置于LB固体培养基上培养，待其长出菌落，每个菌落即为一个单克隆；
具体的，本发明中选用的E.coli DH5α菌株于endA1及recA1处突变，对于克隆DNA的稳定性及提高质粒DNA的纯度均有利，采用Ca2+-热休克法进行转化，具体方法如下(于超净工作台内无菌操作)：
1)：于-80℃冻存柜中取出感受态细胞E.coli DH5α，插在碎冰上进行冰浴，待溶化；
2)：取洁净EP管，移取120μlE.coli DH5α悬液加入其中，再将10μl连接体系与E.coli DH5α悬液混匀；
3)：将步骤2)中的混悬液冰浴45min；
4)：冰浴完成后42℃水浴90s；
5)：水浴完成后快速平稳移至冰上静置10min；
6)：于EP管中加入LB液体培养基870μl，混匀；
7)：将菌液混悬液37℃、170rpm，复苏45min；
8)：复苏完成后以5000rpm、时间为6min对菌液进行离心；
9)：留取50-100μl上清与菌体进行混匀，将混合液滴加至预热约30℃的LB固体琼脂培养基((含对应抗生素))上，以无菌涂布棒均匀涂开；
所述LB固体琼脂培养基的配制体系如下表10所示。
表10 LB固体培养基(100m1)
Figure BDA0003295604720000101
Soluble in 100ml deionized water
高压溶解，冷却至约50℃，加入指定抗生素100μl，倒平板冷却，4℃储存备用。
10)：培养基室温正置20min，后倒置于培养箱中37℃培养16h。
S208：于超净台内取高压灭菌的洁净玻璃试管，向其中加入5ml LB液体培养基，再加入5μl对应抗生素，用灭菌牙签挑取步骤S207中培养得到单克隆置于液体培养基中，将试管置于摇床内，210rpm、37℃摇菌12-16h；
所述LB液体培养基的配制体系如下表11所示。
表11 LB液体培养基(100ml)
Figure BDA0003295604720000102
Soluble in 100ml deionized water
高压溶解灭菌，4℃储存备用。
S209：从步骤S208的液体培养基中抽提pET30b-Rv1988重组质粒和pET28a-Rv1886c重组质粒。具体抽提方法参照《Sangon Biotech质粒DNA小量抽提剂盒操作手册》操作。
S3：根据提取的Rv1988及Rv1886c基因序列合成Rv1988-Rv1886c，也即融合蛋白AR2的融合基因；该操作步骤根据常规基因工程方法进行即可。
S4：以质粒pET28a作为载体，构建重组质粒pET28a-AR2，于N端融合表达6×His；
具体的，重组质粒pET28a-AR2的构建方法参照步骤S2中pET30b-Rv1988重组质粒和pET28a-Rv1886c重组质粒的构建方法完成。
S5：将步骤S3和步骤S4中构建的重组质粒转入表达载体E.coli BL21菌株中；
具体的，本发明中选用E.coli BL21菌株以T7 RNA聚合酶为表达系统，可高效表达外源性蛋白，转入的具体操作同步骤S207。
S6：融合蛋白AR2及亚组份蛋白rRv1988、rRv1886c的表达与纯化。
具体的，(1)IPTG诱导蛋白表达
1)摇菌：将已转化的E.coli BL21单克隆接种至5ml LB液体培养基(已加入5μl对应抗生素)中，摇床设置210rpm，37℃，培养12-16h；
2)转摇：取100ml已高压灭菌的液体培养基，向其中按1:1000加入对应抗生素，将过夜摇的菌液加入到该液体培养基中，190rpm、37℃，培养约2h，以UV计于600nm处测定OD约为0.6，留取转摇菌液50μl用于SDS-PAGE鉴定；
3)诱导：向转摇菌液中加入1M IPTG 100μl，摇床210rpm，37℃，培养约4h，留取菌液50μl用于SDS-PAGE鉴定，余下菌液分装至50ml离心管，以3500rpm离心30min，弃上清收集菌体，-20℃保存；
所述1M IPTG的配制方法为：以5ml无菌去离子水溶解1g IPTG，用0.22微米滤器过滤除菌，并分装至灭菌EP管中，-20℃储存备用。
(2)融合蛋白及亚组份的纯化
本发明中采用金属螯合高流速琼脂糖微球(Chelating Bio-sep 6FF IDA)纯化，在6FF高流速琼脂糖微球上键和亚氨基二乙酸基，再螯合上Ni2+构成的一种亲和层析介质，Ni2+可选择性的与带融合组氨酸(His)标签的蛋白(含组氨酸残基)进行结合。洗脱采用竞争性试剂咪唑(Imidazole)，从Ni-NTA柱上置换出蛋白，以此种方法洗脱蛋白不会引起金属离子Ni2+的流失，采取分段式洗脱方式。
1)装Ni-NTA柱：提前将所用材料和试剂置于室温下使其达到室温，Ni2+－高流速琼脂糖微球凝胶保存于20％乙醇溶液中，取1ml凝胶于柱，以5ml无菌水洗涤2次，再向柱中加入1ml Binding Buffer平衡，备用；
2)取-20℃冻存菌体，冰上放置解冻，按湿重每克菌加入5ml Binding Buffer；所述Binding Buffer的配制体系如下表12所示。
表12结合缓冲液(Binding Buffer)
Figure BDA0003295604720000111
加1×PBS溶解，再用其定容至500ml(pH 7.4)，以0.22微米滤器过滤后室温保存。
3)温和混匀菌液，注意避免有气泡；
4)超声细胞破碎仪设置功率为120W，工作2s、间隔3s，共计200次，使菌体破裂(菌液冰浴)；
5)对菌液以转速3000rpm，时间30min，温度4℃进行离心，收集离心后上清(留取上清50μl用于SDS-PAGE鉴定)
6)按50％Ni-NTA(Ni2+-高流速琼脂糖微球与缓冲液等体积)悬液：上清液＝1：4进行加入柱中，轻混，将Ni柱封口插入碎冰中，摇床200rpm，转动60min；
7)取出Ni柱，套上新EP管，转速300rpm离心1min，留50μl用于SDS-PAGE鉴定；
8)移取1ml Elution Buffer至Ni柱，转速350rpm离心1min，操作4次，取第4次流出物50μl用于SDS-PAGE鉴定；所述Elution Buffer配制体系如下表13所示。
表13洗脱缓冲液(Elution Buffer)
Figure BDA0003295604720000121
加1×PBS溶解，再用其定容至500ml，调pH至7.4，以0.22微米滤器过滤后室温储存。
9)移取1ml洗脱缓冲液至Ni柱，转速350rpm离心1min，操作4次，收集每次的流出液即为洗脱蛋白，记为洗脱1、2、3、4，各留取50μl用于SDS-PAGE鉴定；
10)洗脱完成后以5ml Binding Buffer进行洗涤，并以3ml Binding Buffer平衡柱子。
结果分析：
(1)通过步骤S1～步骤S4，成功构建了重组质粒pET28a-AR2、pET28a-Rv1886c和pET30b-Rv1988
融合基因的设计顺序为Rv1988-Rv1886c，已去除信号肽序列。序列由苏州爱康得生物医学技术公司合成，并通过载体构建技术插入到pET28a中，命名为pET28a-AR2，如附图1所示，基因测序鉴定正确。以H37Rv基因组作为模板，根据PCR反应体系准确将各项试剂加至PCR管中，按反应条件设定相关参数对Rv1988和Rv1886c进行扩增，片段大小分别为540bp和972bp。将Rv1988克隆入pET30b载体，Rv1886c克隆入pET28a载体，得重组质粒pET30b-Rv1988和pET28a-Rv1886c，如附图2所示，重组质粒双酶切鉴定结果如附图3所示，经双酶切鉴定无误，重组质粒均构建成功。
(2)通过步骤S5和步骤S6，融合蛋白AR2及其亚组分蛋白成功表达
在本发明中使用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定融合蛋白AR2及其亚组分蛋白
向步骤S2和步骤S4中蛋白表达和纯化过程中所留取的50μl样品中各加入12.5μl的5×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀后煮沸5min，以SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。
(1)蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳
1)制备凝胶
①洗净晾干玻璃板，组装灌胶板，将蒸馏水注入灌胶板，静置5min检漏；
②检漏完成后以吸水纸擦干灌胶板，向其中注入7-8ml分离胶，以ddH2O封顶，于温箱中37℃水平静置30min待凝固；
③分离胶凝固后弃封胶的ddH2O，插入1.5mm 15teeth的梳子，向其中注入浓缩胶至没梳齿(避免产生气泡)，于温箱中37℃水平静置1h待凝固。
注：本次凝胶聚合采用化学聚合法，以APS作为引发剂，TEMED作为加速剂催化APS产生自由基，使得丙烯酰胺能快速聚合。故制备胶时应最后加入10％APS和TEMED。
2)上样与电泳
①将灌胶板置于电泳槽，向槽内加入配制好的1×甘氨酸缓冲液，拔出梳子；
②以10μl移液枪上样，蛋白Marker上样4μl，其它留取样品各10μl/孔上样；
③设置电压90V，电流60mA进行电泳，约30min，至溴酚蓝到达浓缩胶与分离胶边界时调电压120V，电流90mA，约80min直至溴酚蓝出分离胶边界；
④取出凝胶，切除浓缩胶，留取分离胶置于玻璃皿中以考马斯亮蓝染色30min；
⑤染色完成后以高甲醇溶液脱色2h，再以低甲醇溶液脱色2h，后以低甲醇溶液脱色过夜，第二天成像保存。
(2)蛋白的Western blot鉴定
1)Western blot鉴定操作步骤前面与SDS-PAGE电泳相同，切除浓缩胶后不染色，而是将分离胶切成所需大小，并将其置于transfer buffer中浸泡20min；
2)取一张NC膜和16张滤纸，裁减至大小与凝胶相同，将NC膜、滤纸和海棉在transfer buffer中浸泡15min；
3)转膜：
①阴极板置于平整台面，先后垫上海绵垫-8层滤纸-NC膜-胶-8层滤纸-海绵垫(避免膜与胶之间产生气泡)，最后盖上黑色阳极板，在transfer buffer中夹紧、扣上；
②组装好转膜装置，阳极板对应黑色，阴极板对应红色，置于转移池内，向转移池内灌满转移缓冲液；
③设置电压90V，电流150mA，冰浴转膜30min；
4)固定：NC膜置于0.2％戊二醛中室温震荡固定45min；
5)封闭：0.1％PBST温和震荡NC膜，漂洗1次，以1％BSA-PBST室温震荡封闭2h；
6)洗膜：弃封闭液，以0.1％PBST温和震荡NC膜，5min/次，漂洗5次；
7)一抗孵育：分别以0.1％PBST稀释的抗His鼠单抗(稀释度1:5000)和抗-AR2小鼠血清多克隆抗体(本室制备)作为一抗进行孵育，4℃过夜。然后以0.1％PBST温和震荡NC膜，漂洗5次，每次5min；
8)二抗孵育：加入以0.1％PBST稀释的HRP标记的羊抗鼠(稀释度1:5000)，室温孵育1h。加入0.1％PBST温和震荡NC膜，漂洗4次，每次5min；
9)显色：避光将ECL化学发光试剂A、B液等体积混匀制成工作液，按10cm2/ml加至NC膜上，室温静置2min后成像。
SDS-PAGE电泳鉴定结果如附图4所示，在图4中，A为AR2表达纯化鉴定结果，B为、rRv1988表达纯化鉴定结果，C为rRv1886c表达纯化鉴定结果(M蛋白分子质量标准；1重组质粒未诱导；2重组质粒IPTG诱导4h；3超声破碎产物；4亲和柱层析流出液；5亲和层析8mol/L尿素结合液洗脱液；6-9:洗脱蛋白)，，从附图4中可以看出，纯化蛋白大小分别为51kDa(AR2)、19.8kDa(rRv1988)、35.6kDa(rRv1886c)，与预期相符。
Western blot鉴定结果如附图5和附图6所示。从附图5和附图6中可以看出，AR2及其亚组分蛋白rRv1988和rRv1886c均成功表达并纯化，具有较好的特异性和生物活性。
(3)融合蛋白及亚组份蛋白的透析、去除内毒素和浓度定量
1)蛋白透析
以1×PBS为溶剂配制500ml 8M尿素(含5mM Tris-Cl，pH 7.9)，再将其以1×PBS稀释浓度为8、6、4、2、1、0M，具体如下表14所示。
表14梯度透析表
Figure BDA0003295604720000151
每步2h于4℃进行透析，完成后取出蛋白液置于洁净EP管中，标记，于-20℃备用。
2)内毒素去除
以金斯瑞公司的ToxinEraserTMEndotoxin Removal Kit对纯化蛋白进行内毒素去除，纯化蛋白样品通过结合高效去除内毒素的树脂，以达到去除内毒素的目的。具体步骤参见试剂盒说明书，最终纯化蛋白的内毒素水平<0.1EU/ml。
3)蛋白定量及纯度测定
以BCA定量试剂盒对透析蛋白进行定量。牛血清白蛋白(BSA)母液浓度为2mg/ml，以1×PBS对其进行稀释制备标准曲线，具体如下表15所示。
表15 BSA标准曲线制备
Figure BDA0003295604720000152
①按顺序依次将梯度BSA加入96孔板中，并设置复孔，透析蛋白各取20μl置于96孔板中；
②将试剂A和B按50:1制备BCA工作液，混匀；
③向加样孔中各上200μl BCA工作液，于温箱中37℃孵育30min；
④孵育完成后于Gen5发光检测仪(Gen5 TS 2.09)中以波长为562nm测定吸光度值，回归得出标准曲线方程，计算得蛋白浓度。
以Image Lab软件分析融合蛋白AR2纯度，显示纯化后的AR2纯度约为95％。
(4)融合蛋白及亚组份蛋白人群试验
1)招募受检人群以及M.tb感染者与未感染者的区分
委托山西省长治医学院和平医院感染科共募集受试志愿者35人，对受试者进行问卷调查、体检及病史问询等，结合TB临床诊断标准(中华人民共和国卫生行业标准WS 288-2017)对受试者进行初筛。区分方式：对于活动性肺结核患者(ATB)，有临床症状、痰培养阳性、胸片X射线检查有可疑阴影、TST≥5mm；对于潜伏感染者(LTBI)，无临床症状、胸片X射线检查无可疑阴影、结核菌素试验阳性(TST≥5mm)；对于健康人群，无TB感染者接触史、TST<5mm。另以TB-IGRA试剂盒对受试人群分类进行辅助诊断，操作方法与结果判定参照说明书。ATB和LTBI统称为M.tb感染者。
2)收集受试者全血及IFN-γ浓度的检测
①以抗凝管收集每个受试者新鲜全血3-4ml；
②共分3个组，即阳性组(PHA刺激)、阴性组(生理盐水刺激)和实验组(融合蛋白及亚组份蛋白刺激)，按分组依次以500μl/孔将新鲜全血加入24孔板中，阳性组加入20μlPHA，阴性组加入20μl生理盐水，实验组分别加入10μg AR2、Ag85B、rRv1988蛋白，震荡混匀；
③细胞培养箱37℃孵育24h；
④3000rpm离心10min收集经上述实验操作的血浆，置于已灭菌的Ep管中，于-20℃保存。
⑤按说明书使用预包被的人IFN-γ检测试剂盒，以标准品浓度作为横坐标，对应的OD值作为纵坐标，利用Excel工作表进行线性回归，得回归方程(相关系数R≥0.99)，据回归曲线方程计算各样本IFN-γ的含量，蛋白诱导产生的IFN-γ含量＝蛋白组IFN-γ的含量－生理盐水组IFN-γ的含量(本底值)。
以SPSS22.0软件对各组人群外周血抗原特异性IFN-γ浓度进行统计学分析，采用独立样本t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。统计学分析结果如下：
据TB临床诊断标准和TB-IGRA分析技术将受试人群分为3组：活动性TB患者、M.tb潜伏感染者和健康人群。对受试人群按标准进行检测，共筛选出M.tb感染者22例，其中男性13人(年龄35.2±16.3)，女性9人(年龄36.2±14.3)；共筛选出未感染者13例，其中男性7人(年龄36.0±17.4)，女性6人(年龄36.5±11.8)。具体分组及特征如下表16所示。
表16受试人群分组及特征
Figure BDA0003295604720000171
注：ATB和LTBI统称为M.tb感染者
全血样本以非特异性刺激剂PHA进行刺激时，M.tb感染者和健康人群细胞所诱导产生的IFN-γ水平差异无统计学意义(P＞0.05)，如附图7所示，表明受试人群免疫功能无显著差异。以融合蛋白AR2及其亚组分蛋白对受试者血样进行刺激时，显示M.tb感染者外周血T淋巴细胞被诱导的IFN-γ水平较健康人群为高，且在M.tb感染活动期时外周血所刺激的IFN-γ水平更高，差异具有统计学意义(t＝4.562、4.467和3.458，均P＜0.05)，如附图8所示(图8中，A、B、C分别代表rRv1988、rRv1886c和AR2蛋白)。进一步发现经融合蛋白AR2刺激M.tb感染者T细胞产生的IFN-γ水平较其亚组分诱导水平均高(t＝3.45，P＜0.05)，如附图9所示。
实施例二：
实施例二提供结核分歧杆菌融合蛋白AR2在制备结核病亚单位疫苗中的应用，具体应用过程包括以下步骤，
1)制备阳离子脂质体DDA；
阳离子脂质体DDA以薄膜法制备：将CHCl3和CH3OH按体积比9:1混合作为溶剂，称DDA 20mg加入并溶解，缓慢通入N2吹干上述溶剂，在室温条件下过夜，使其彻底晾干。以灭菌1×PBS配制成5mg/ml母液；60℃水浴1h(定时涡旋使其溶解充分)，冷却。
2)使用阳离子脂质体DDA分别制备DC佐剂、DM佐剂和DMC佐剂；
具体的，DC佐剂：
5’-T*C*C*A*T*G*A*C*G*T*T*C*C*T*G*A*C*G*T*T-3’，寡核苷酸序列由苏州泓迅生物科技公司合成，规格为1mg/管。以10ml 1×PBS缓冲液为溶剂将CpG ODN配制成0.1mg/ml的母液。将DDA浓度稀释为2.5mg/ml，取100μl，与0.1mg/ml CpG ODN 100μl溶液充分乳化均匀，即得到DC佐剂。
DM佐剂：单磷酰脂质A规格为5mg/管，以10ml 1×PBS缓冲液配制浓度为0.5mg/ml的MPLA母液，将DDA浓度稀释为2.5mg/ml，取100μl，与0.5mg/ml MPLA 100μl溶液充分乳化均匀，即得到DM佐剂。
DMC佐剂：将CpG ODN母液与MPLA母液按体积比为1:1混合；将DDA浓度稀释为2.5mg/ml，取100μl，与上述混合液100μl充分乳化均匀，即得到DMC佐剂。
3)将融合蛋白AR2(0.2μg/μl)分别与DC佐剂、DM佐剂和DMC佐剂按照体积比1:1混合，即可得到AR2/DC、AR2/DM、AR2/DMC亚单位疫苗。
将以上步骤3)中制备出来的亚单位疫苗应用在小鼠动物实验中，所使用的动物小鼠具体为：6周龄体重为16～20g的SPF级C57BL/6雌性小鼠，购自常州卡文斯实验动物公司，动物许可证号：SCXK(苏)2016-0010。本课题涉及的动物实验已通过安徽理工大学生物医学研究伦理委员会审核并获得许可。
具体实验过程包括以下步骤，
(1)BCG的制备：称取适量BCG干粉溶于溶于灭菌1×PBS中，按1×107CFU/mg先估算菌量，调整至每只鼠注射菌量约为1×106CFU/200μl。同时以无菌PBS倍比稀释该菌液，涂布培养3～4周后进行菌落计数，推算出单只鼠注射BCG的菌量。实际单次注射菌量为1.2×106CFU/200μl。
(2)动物分组及免疫
1)动物分组方案
按照实验设计，将C57BL/6小鼠随机分为以下5组，具体分组情况如下表17所示。
表17实验动物分组方案
Figure BDA0003295604720000191
注：小鼠3只/组，免疫原性分析重复一次，故总共为6只。实验小鼠饲养和免疫在安徽理工大学医学院动物房进行。
2)动物免疫方式
均采用皮下2点式注射免疫，每点100μl。PBS组小鼠注射200μl经灭菌处理的1×PBS，共1次；BCG组小鼠注射200μl菌量为1.2×106CFU的BCG溶液，共1次；BCG+AR2/DC组、BCG+AR2/DM组和BCG+AR2/DMC组小鼠第0周注射200μl菌量为1.2×106CFU的BCG菌液，第3周和第6周分别以AR2/DC、AR2/DM和AR2/DMC亚单位疫苗200μl(含蛋白20μg)对小鼠进行增强免疫。免疫9周后摘眶取血并脱椎处死各组小鼠，而后于超净台内无菌条件下分离小鼠脾脏和肺脏，进行免疫原性分析，如附图10所示，在图10中，A为PBS组和BCG组小鼠免疫方案；B为BCG+AR2/DC组、BCG+AR2/DM和BCG+AR2/DMC组免疫方案。
3)亚单位疫苗免疫原性分析
①ELISA检测小鼠血清抗原特异性IgG及其亚类抗体水平
a.以碳酸盐包被液稀释AR2蛋白至浓度为5μg/ml，100μl/孔包被96孔板(空白对照孔加100μl碳酸盐包被液)，设复孔，置于4℃过夜；
b.弃尽孔内溶液，以250μl/孔0.05％PBST对板进行洗涤，2min/次，共计5次；
c.每孔加入100μl 1％BSA/PBST封闭液，于温箱37℃封闭1h；
d.各组小鼠血清以高压灭菌并经0.22μm滤器过滤的1×PBS缓冲液稀释，由1:200倍比稀释至1:12800，加至孔中，空白对照孔加200μl 1×PBS缓冲液，于温箱37℃孵育1h；
e.弃尽孔内溶液，以250μl/孔0.05％PBST对板进行洗涤，2min/次，共计5次；
f.加入HRP标记二抗(IgG、IgG1和IgG2a稀释比例分别为：1:5000、1:10000、1:10000)，每孔加入100μl，于温箱37℃孵育1h；
g.弃尽孔内溶液，以250μl/孔0.05％PBST对板进行洗涤，2min/次，共计5次，第5次以250μl/孔无菌去离子水对板进行洗涤2min；
h.配制TMB显色液，100μl/孔，37℃避光放置20min；
i.每孔加50μl 2M H2SO4终止液终止反应；
g.于Gen5发光检测仪(Gen5 TS 2.09)中以波长为450nm测定吸光度(OD)值，记录；
k.以阳性结果最高稀释倍数的倒数log10表示抗体滴度，IgG2a与IgG1的比值以实际稀释倍数计算。
②小鼠脾细胞的分离
a.小鼠断椎后将其置于75％乙醇中10min，于已消毒超净台内将小鼠固定，无菌剥离小鼠脾脏，尽量除去筋膜组织；
b.将无菌细胞筛(孔径70μm)套在经高压灭菌的50ml离心管上，取小鼠脾脏放在无菌细胞筛上，用无菌注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，同时以预冷的无菌1×PBS冲洗；
c.研磨结束后以1500rpm低温离心10min，于超净台内弃上清；
d.向离心管中加入5ml红细胞裂解液，室温放置1min，后以1500rpm低温离心10min，弃上清；
e.内向离心管中加入5ml预冷1×PBS洗涤，以1500rpm低温离心10min，弃上清；
f.重复操作e一次；
g.于超净台内向离心管中加入1ml预冷的RPMI1640完全培养基重悬小鼠脾细胞，对每只小鼠的脾细胞进行计数并记录，根据计数结果以RPMI1640完全培养基调整细胞浓度为1×107/ml。
注：操作过程注意无菌和低温，可冰浴进行。
③ELISA检测小鼠脾细胞上清抗原特异性IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-4水平
a.取250μl上述浓度为1×107/ml的脾细胞置于24孔板中，设置3个组别，阴性对照组加入20μl RPMI1640完全培养基，阳性对照组加入20μl PPD(以RPMI1640完全培养基稀释，含PPD 10μg)，实验组加入20μl AR2蛋白(含蛋白10μg)；
b.将上述细胞板于37℃、5％CO2培养箱中培养，检测IL-2的脾细胞培养24h即收集，检测IFN-γ、TNF-α和IL-4的脾细胞需培养72h，到时间后分别收集孔内培养液于经高压无菌EP管内，以3000rpm离心10min，收集上清至新EP管中，做好标记，保存于-80℃冷藏室中备用；
c.依照IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-4ELISA检测试剂盒说明书操作，并计算各样品细胞因子浓度。注意测得值应在标准曲线的检测范围之内。
④流式细胞术检测小鼠抗原特异性T淋巴细胞种类和数量
a.取250μl上述浓度为1×107/ml的脾细胞置于24孔板中，设置3个组别，阴性对照孔不加刺激物，阳性对照孔同时加入1μl PMA/Ionomycin Mixture和1μl BFA/MonensinMixture，实验组同时加入20μl AR2蛋白(含蛋白10μg)和1μl BFA/Monensin Mixture，混匀，细胞培养箱37℃孵育6h，每隔1h即震荡混匀；
b.孵育完成后移至流式管中，加入5μl Anti-Mouse CD4和5μl Anti-Mouse CD8α，吹打混匀，4℃避光孵育1h；
c.向每个流式管中加100μl Fix&PERM Medium A，4℃避光孵育1h；
d.以去离子水将10×Flow Cytometry Staining Buffer稀释为1×，向每个流式管中加入2ml预冷的1×Flow Cytometry Staining Buffer，300g(1290rpm)离心5min，弃上清(弃尽无残留)；
e.向每个流式管中加100μl Fix&PERM Medium B，5μl Anti-Mouse IFN-γ和5μlAnti-Mouse TNF-α，4℃避光孵育1h；
f.向每个流式管中加2ml预冷的1×Flow Cytometry Staining Buffer，300g(1290rpm)离心5min，弃上清；
g.向每个流式管中加300μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer，FCM上机检测。
h.分选策略如futu 11所示：首先圈定淋巴细胞群为P1门，然后以CD4+FSC和CD8+FSC分别分选CD4+T和CD8+T细胞，分析CD4+T和CD8+T中仅分泌IFN-γ、TNF-α及同时分泌IFN-γ和TNF-α的淋巴细胞比例，见图15(仅提供分泌不同细胞因子CD4+T细胞的流式分选策略)。
g.据上机显示不同类型T细胞在总细胞数中所占比例，以及脾细胞计数结果，计算单只小鼠IFN-γ、TNF-α单阳/双阳分泌型CD4+T/CD8+T淋巴细胞的数量。
⑤免疫小鼠肺脏组织IFN-γ、TNF-α、IL-10及iNOS mRNA表达水平
a.总RNA的获取：免疫9周后，无菌解剖小鼠取出其肺脏，并利用TRIzol试剂提取小鼠肺脏RNA，具体参照试剂盒说明书进行。测定OD260/OD280在1.8～2.0之间(若OD260/OD280<1.7，表明可能存在蛋白质等污染，应用酚/氯仿再抽提；若OD260/OD280>2.2，则表明RNA有降解)。
b.逆转录：向PCR管中加入总RNA 1μg和特异性引物1μl，以DEPC水补足至12μl，PCR仪中65℃变性5min，然后迅速冰浴5min。而后配制如下表18所示的反应体系。反应条件为：42℃ 60min，70℃ 5min(灭活逆转录酶以终止反应)，-20℃保存。
表18反应体系
Figure BDA0003295604720000221
c.引物设计：据细胞因子cDNA序列设计各细胞因子IFN-Y、TNF-α、IL-10、iNOS以及内参GAPDH的上下游引物，如下表19所示，引物由苏州泓迅生物科技公司合成。
表19 qRT-PCR分析鼠肺脏iNOS和各细胞因子的引物
Figure BDA0003295604720000222
d.qRT-PCR定量检测iNOS及细胞因子IFN-Y、TNF-α、IL-10mRNA含量：以GAPDH作为内参，采用ΔΔCt法进行定量检测。配制反应体系如下表20所示。
表20反应体系
Figure BDA0003295604720000223
反应程序：95.0℃ 3min；95.0℃ 20s，60.0℃ 30s，72℃ 30s，40cycles；4℃forever。
记录各反应管的Ct值。ΔCtSample＝CtTest-CtGAPDH，ΔCtControl＝CtTest-CtGAPDH。ΔΔCt＝ΔCtSample-ΔCtControl。得出每个样本的ΔΔCt值，各样本mRNA含量以2-ΔΔCt表示。
4)统计学分析
小鼠血清特异性抗体滴度检测比较、小鼠脾细胞上清分泌特异性细胞因子检测及对比和小鼠肺脏四种细胞因子mRNA水平检测比较，以及FCM检测各组小鼠特异性IFN-γ和TNF-α分泌型CD4+和CD8+T淋巴细胞数比较，均采用单因素方差分析，以SPSS19.0对数据进行处理，P<0.05表明差异具有统计学意义。
5)分析结果
①初免增强组小鼠产生高水平抗原特异性IgG类抗体
免疫9周后对小鼠进行摘眶取血并收集血清，而后断椎处死，以融合蛋白AR2对96孔板进行包被，稀释血清以间接ELISA法进行检测，主要检测以BCG初免联用不同佐剂的亚单位疫苗增强免疫的小鼠血清中特异性抗体滴度水平，结果如附图12所示。以BCG初免后再以联合不同佐剂的亚单位疫苗增强的小鼠血清中三种抗体水平均较高，且显著高于BCG组(F＝43.38、25.98和38.74，均P＜0.05)；以DMC为佐剂的亚单位疫苗组较以DM佐剂或DC佐剂的亚单位疫苗组三种抗体水平均高(F＝16.53、10.97和13.67，均P＜0.05)。初免增强组中以BCG+AR2/DMC组抗体水平最高，其次为BCG+AR2/DC组；初免增强组的IgG2a/IgG1均大于1，联用复合佐剂DMC的IgG2a/IgG1最高，其次为BCG+AR2/DC组，均显著高于BCG组(F＝34.92，P＜0.01)。
②融合蛋白AR2免疫小鼠脾细胞产生高水平抗原特异性细胞因子
小鼠免疫9周后断椎处死，无菌条件下取出小鼠脾脏，经无菌细胞筛研磨处理得到脾细胞。以AR2为刺激物，阳性对照为PPD，阴性对照为RPMI 1640完全培养基，检测IL-2水平的脾细胞于24h后离心收集上清，检测IL-4、IFN-γ和TNF-α水平的脾细胞于72h后离心收集上清，以鼠ELISA法检测各组脾细胞上清细胞因子水平，结果如附图13所示。无论是以PPD刺激亦或是AR2刺激，BCG+AR2/DMC组的IFN-γ、TNF-α和IL-2水平均为最高，其中BCG+AR2/DC组所诱导出的IFN-γ、TNF-α水平又较BCG+AR2/DM组为高(F＝11.29和14.04，均P＜0.05)；脾细胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平与刺激物有关：以AR2作为刺激物BCG组小鼠脾细胞分泌IFN-γ及TNF-α水平较PPD低；以PPD刺激时IL-2在BCG+AR2/DC组和BCG+AR2/DM组之间无显著差异(P＞0.05)，而以AR2刺激时BCG+AR2/DM组IL-2水平较BCG+AR2/DC组低，但均较BCG组为高；IL-4分泌水平在各实验组间无显著差异。
③初免增强组小鼠脾细胞抗原特异性IFN-γ+、TNF-α+单阳和IFN-γ+TNF-α+双阳CD4+/CD8+T淋巴细胞数量显著上升，如附图14和附图15所示。
a.分析IFN-γ+单阳T淋巴细胞：以融合蛋白AR2作为刺激物，小鼠脾IFN-γ+单阳的CD4+T淋巴细胞以PBS组最低，初免增强3个组均较BCG组为高(F＝15.52,P<0.05)，其中以BCG+AR2/DMC组最高，其次为BCG+AR2/DM组。IFN-γ+单阳的CD8+T细胞数情况与CD4+T细胞数情况不同的是，初免增强组中BCG+AR2/DC组IFN-γ+单阳的CD8+T细胞数较BCG+AR2/DM组显著上升(F＝7.61，P<0.05)。
b.分析TNF-α+单阳T淋巴细胞：与IFN-γ+情况相类似。
c.分析IFN-γ+TNF-α+双阳T淋巴细胞：PBS组IFN-γ+TNF-α+双阳CD4+/CD8+T淋巴细胞数最低，初免增强3个组均较BCG组为高(F＝11.96和9.79，均P<0.05)，其中尤以BCG+AR2/DMC组IFN-γ+TNF-α+双阳CD8+T淋巴细胞数显著高于其它组。而在BCG+AR2/DC组与BCG+AR2/DM组之间无统计学意义(P＞0.05)。
④融合蛋白AR2免疫小鼠肺脏组织产生高水平抗原特异性细胞因子mRNA
M.tb感染最常见的器官即为肺脏，因此肺脏组织引发的免疫应答水平和病变程度在候选疫苗的评估中非常重要。由附图16可见，与PBS对照组小鼠相比，上述细胞因子在所有免疫组的表达水平均有上升。与BCG组相比较，初免增强组免疫小鼠肺脏IFN-γ、TNF-α和iNOS表达水平均显著上升(F＝145.6、113.7和95.72，均P<0.01)，其中以BCG+AR2/DMC组水平最高；IFN-γ和TNF-α表达水平在BCG+AR2/DM组与BCG+AR2/DC组无显著差异(P＞0.05)；而iNOS在BCG+AR2/DC组表达水平较高，且显著高于BCG+AR2/DM组(F＝24.89，P<0.01)。各组表达的IL-10水平均较低且无显著差异(P＞0.05)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤，
S1：从结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列中提取Rv1988及Rv1886c编码的基因序列；
S2：以pET28a、pET30b作为载体，构建pET30b-Rv1988重组质粒和pET28a-Rv1886c重组质粒；
S3：根据提取的Rv1988及Rv1886c基因序列合成Rv1988-Rv1886c，也即融合蛋白AR2的融合基因；
S4：以质粒pET28a作为载体，构建重组质粒pET28a-AR2；
S5：将步骤S2和步骤S4中构建的重组质粒转入表达载体E.coliBL21菌株中；
S6：融合蛋白AR2及亚组份蛋白rRv1988、rRv1886c的表达与纯化。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，步骤S2的具体操作包括以下步骤，
S201：参照原核表达载体pET28a、pET30b的多克隆位点设计Rv1988及Rv1886c对应的引物，以H37Rv基因组作为模板进行PCR基因扩增；
S202：对PCR基因扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；
S203：目的基因Rv1988和Rv1886c回收与验证；
S204：将回收的目的基因Rv1988、Rv1886c，以及原核表达载体pET28a、pET30b分别进行双酶切；
S205：对双酶切反应液进行纯化；
S206：将纯化后的双酶切产物进行连接，Rv1988与质粒pET30b连接，Rv1886c与质粒pET28a连接；
S207：将步骤S206中得到的两个连接体系分别转入大肠杆菌E.coli DH5α菌株中，置于LB固体培养基上培养，待其长出菌落，每个菌落即为一个单克隆；
S208：于超净台内取高压灭菌的洁净玻璃试管，向其中加入LB液体培养基和抗生素，挑取步骤S207中培养得到单克隆置于液体培养基中，将试管置于摇床内摇菌；
S209：从步骤S208的液体培养基中抽提pET30b-Rv1988重组质粒和pET28a-Rv1886c重组质粒。
3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，步骤S202的具体操作包括以下步骤，
1)：1％琼脂糖凝胶的制备；以万分之一天平称取琼脂糖0.2g至烧杯，取20ml 1×TAE溶液，倒入烧杯内，微波炉中火加热1min；取出，待冷却至约50℃时，加2μl Gelview染料，摇匀，倒入制胶模具中；室温冷却约30min，得1％琼脂糖凝胶，将其取出置于水平电泳槽内；
2)：加样；在1％琼脂糖凝胶的胶孔内加入4μl核酸标志物Marker DL2000，25μlPCR基因扩增产物；
3)：电泳；打开电泳仪，并与电泳槽通电，调整电泳仪电压为100V，电流为100mA，电泳时间设置为25min，Start开始电泳；
4)：成像；电泳仪提示结束后关闭仪器，取出电泳完成的琼脂糖胶，将其置于Bio-Rad凝胶成像系统ChemiDoc XRS+中，运行成像并拍照保存。
4.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，步骤S205的具体操作包括以下步骤，
1)：将双酶切产物装入洁净1.5ml EP管，以无菌水补至100μl，再向其中加入500μl含有异丙醇的缓冲液中，充分混匀；
2)：混匀后移至吸附柱内，以转速为8000rcf离心30s，将流出液再移至吸附柱内，8000rcf离心30s，弃流出液；
3)：将500μl含有乙醇的漂洗液加入到吸附柱内，9000rcf离心30s，弃流出液；
4)：重复操作步骤3)；
5)：将空吸附柱以转速为9000rcf离心1min；
6)：开盖，室温放置5min以挥发残留乙醇；
7)：于水浴锅预热洗脱缓冲液至60℃；
8)：向吸附柱膜中央加入35μl预热至60℃的洗脱缓冲液，40℃静置温浴2min，以转速为9000rcf离心1min，得洗脱液，取3.5μl进行验证，余下于-20℃保存备用。
5.根据权利要求4所述的结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，步骤S207的具体操作包括以下步骤，
1)：于-80℃冻存柜中取出感受态细胞E.coli DH5α，插在碎冰上进行冰浴，待溶化；
2)：取洁净EP管，移取120μl E.coli DH5α悬液加入其中，再将10μl连接体系与E.coliDH5α悬液混匀；
3)：将步骤2)中的混悬液冰浴45min；
4)：冰浴完成后42℃水浴90s；
5)：水浴完成后快速平稳移至冰上静置10min；
6)：于EP管中加入LB液体培养基870μl，混匀；
7)：将菌液混悬液37℃、170rpm，复苏45min；
8)：复苏完成后以5000rpm、时间为6min对菌液进行离心；
9)：留取50-100μl上清与菌体进行混匀，将混合液滴加至预热约30℃的含抗生素的LB固体琼脂培养基上，以无菌涂布棒均匀涂开；
10)：培养基室温正置20min，后倒置于培养箱中37℃培养16h。
6.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，步骤S6中采用IPTG诱导融合蛋白AR2及亚组份蛋白表达，具体操作包括以下步骤；
1)摇菌：将已转化的E.coli BL21单克隆接种至5ml含有抗生素的LB液体培养基中，摇床设置210rpm，37℃，培养12-16h；
2)转摇：取100ml已高压灭菌的液体培养基，向其中按1:1000加入对应抗生素，将过夜摇的菌液加入到该液体培养基中，190rpm、37℃，培养约2h，以UV计于600nm处测定OD约为0.6，留取转摇菌液50μl用于鉴定；
3)诱导：向转摇菌液中加入1M IPTG 100μl，摇床210rpm，37℃，培养约4h，留取菌液50μl用于鉴定，余下菌液分装至50ml离心管，以3500rpm离心30min，弃上清收集菌体，-20℃保存。
7.根据权利要求6所述的结核分枝杆菌融合蛋白AR2的构建与表达纯化方法，其特征在于，步骤S6中采用金属螯合高流速琼脂糖微球纯化融合蛋白AR2及亚组份蛋白，具体操作包括以下步骤；
1)装Ni-NTA柱：将所用材料和试剂置于室温下使其达到室温，Ni2+－高流速琼脂糖微球凝胶保存于20％乙醇溶液中，取1ml凝胶于柱，以5ml无菌水洗涤2次，再向柱中加入1mlBinding Buffer平衡，备用；
2)取-20℃冻存菌体，冰上放置解冻，按湿重每克菌加入5ml Binding Buffer；
3)温和混匀菌液，注意避免有气泡；
4)超声细胞破碎仪设置功率为120W，工作2s、间隔3s，共计200次，使菌体破裂；
5)对菌液以转速3000rpm，时间30min，温度4℃进行离心，收集离心后上清；
6)按50％Ni-NTA悬液:上清液＝1:4进行加入柱中，轻混，将Ni柱封口插入碎冰中，摇床200rpm，转动60min；
7)取出Ni柱，套上新EP管，转速300rpm离心1min，留50μl用于SDS-PAGE鉴定；
8)移取1ml Elution Buffer至Ni柱，转速350rpm离心1min，操作4次，取第4次流出物50μl用于SDS-PAGE鉴定；
9)移取1ml洗脱缓冲液至Ni柱，转速350rpm离心1min，操作4次，收集每次的流出液即为洗脱蛋白，记为洗脱1、2、3、4，各留取50μl用于SDS-PAGE鉴定；
10)洗脱完成后以5ml Binding Buffer进行洗涤，并以3ml Binding Buffer平衡柱子。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法得到的结核分歧杆菌融合蛋白AR2。
9.如权利要求8所述的结核分歧杆菌融合蛋白AR2在制备结核病亚单位疫苗中的应用。
10.如权利要求9所述的结核分歧杆菌融合蛋白AR2在制备结核病亚单位疫苗中的应用，其特征在于：包括以下步骤，
1)制备阳离子脂质体DDA；
2)使用阳离子脂质体DDA分别制备DC佐剂、DM佐剂和DMC佐剂；
3)将融合蛋白AR2分别与DC佐剂、DM佐剂和DMC佐剂按照体积比1:1混合，即可得到AR2/DC、AR2/DM、AR2/DMC亚单位疫苗。
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