CN114989312B

CN114989312B - 一种结核分枝杆菌融合蛋白dr2及其应用

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Publication number: CN114989312B
Application number: CN202210732645.9A
Authority: CN
Inventors: 王晓春; 杜建鹏; 毛莉蓉; 漆志扬; 夏露
Original assignee: Anhui University of Science and Technology
Current assignee: Anhui University of Science and Technology
Priority date: 2022-06-27
Filing date: 2022-06-27
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-06-27
Also published as: CN114989312A

Abstract

本发明属于分子生物学领域和疫苗领域，具体的，本发明涉及一种结核分枝杆菌融合蛋白DR2及其应用。所述融合蛋白DR2由SEQ ID NO.1所示基因编码。所述融合蛋白DR2联用脂质体佐剂DIMQ，作为BCG初免的增强疫苗免疫C57BL/6小鼠，通过评价其短期及长期免疫原性，同时检测其记忆性免疫应答水平，证实以DR2/DIMQ作增强免疫的异源性增强策略可实现长效的免疫应答，呈现出较强的免疫记忆效应。本发明为进一步探究DR2/DIMQ的保护效应及预防作用提供前期研究基础，揭示了新型脂质体佐剂DIMQ的效应，同时也为TB新型亚单位疫苗的异源性增强策略研究提供理论及实验支持。

Description

一种结核分枝杆菌融合蛋白DR2及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域和疫苗领域，具体的，本发明涉及一种结核分枝杆菌融合蛋白DR2及其应用。

背景技术

结核病(tuberculosis,TB)作为全球性的严重呼吸道传染病之一，由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)感染所引发，传染性强，易迁延不愈。卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)作为目前唯一被批准用于预防TB的疫苗，于1921年首次应用于人体，并于1978年被纳入我国儿童计划免疫中。虽然BCG具有保护效力不一的局限性，但目前其全球接种覆盖率已超过90％，是当今使用最广泛的疫苗之一。然而，BCG是牛分枝杆菌(mycobacterium bovis,M.bovis)经13年连续体外传代后制成的减毒活疫苗，其安全性仍存疑。此外，BCG虽可有效预防儿童性TB的发生，但其提供的保护效力随时间推移，即在接种后10-20年会逐渐减弱，从而导致成人TB的传播和流行。连续传代使得BCG缺失了大量重要的保护性抗原；曾有环境分枝杆菌暴露或先前感染过M.tb也会使得分枝杆菌对BCG的反应性下降；BCG基因组内表达一些抑制性抗原基因，这反而有利于M.tb持续寄生于巨噬细胞内；BCG主要介导CD4⁺T细胞免疫应答，其主要作用于预防M.tb原发感染，而CD8⁺T细胞在阻止TB复发中占据主要作用，这些均是BCG保护力下降的重要原因。另外，多项研究均指出，BCG重复接种不会产生更好的免疫保护力。目前唯一可用的TB治疗方法仍然是直接督导下的短程化疗(Directly Observed Treatment Short-course,DOTS)，但其可能会削弱免疫反应，从而导致TB复发。鉴于此，新型TB疫苗研究在近年来得到重视，但因缺乏针对M.tb保护性免疫作用的充分认识，相关研究仍未取得效果全面稳定的实质进展。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种结核分枝杆菌融合蛋白DR2及其应用。

第一方面，本发明提供一种结核分枝杆菌融合蛋白DR2，由SEQ ID NO.1所示基因编码。

本发明中的编码基因构建、转化、表达、纯化等步骤分子生物学、蛋白或免疫领域技术人员可以根据本领域常规技术。

第二方面，本发明提供一种疫苗，其包含所述的融合蛋白DR2。

进一步的，所述疫苗还包括佐剂二甲基三十六烷基溴化铵和咪喹莫特。

第三方面，本发明提供所述融合蛋白DR2或所述疫苗在制备预防结核病的药物中的应用。

进一步的，所述药物用于增强BCG的免疫效果。

第四方面，本发明提供一种预防结核病的的药物组合，包括卡介苗和所述的疫苗。

进一步的，所述卡介苗作初次免疫，所述疫苗作增强免疫。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明所构建的融合蛋白DR2及其亚组分蛋白在刺激中国M.tb感染者外周血后均可诱导受试者外周血淋巴细胞分泌高水平的抗原特异性IFN-γ，其分泌量均显著高于未感染人群，提示融合抗原及其亚组分抗原均可被中国M.tb感染者外周血淋巴细胞特异性识别，且融合蛋白DR2诱导的IFN-γ分泌水平显著高于亚组分蛋白，这表明融合抗原DR2更易被识别。

2、在免疫后9周，以BCG初免、DR2/DIMQ作增强免疫的C57BL/6小鼠血清表达高水平的抗原特异性IgG类抗体，脾细胞及肺脏组织均可分泌高水平的抗原特异性Th1型细胞因子，且其各项免疫指标均随免疫时间延长而增加。这表明以融合蛋白DR2为基础的亚单位疫苗用作BCG初免的异源性增强疫苗时可诱导更强的CD4⁺Th1型细胞免疫应答，从而有效弥补BCG免疫原性的不足。

3、BCG+DR2/DIMQ组小鼠脾细胞在免疫后9周以产生IFN-γ⁺CD4⁺T_EM细胞亚群为主，在免疫后18周以产生IL-2⁺CD4⁺和CD8⁺T_CM细胞亚群为主，表明此免疫策略可充分发挥T_EM对于M.tb感染的直接及短期控制作用，以及T_CM对于M.tb感染的长期控制作用。

4、BCG+DR2/DIMQ组小鼠虽在免疫后9周已显示高水平的免疫原性，其在免疫后18周的各项免疫指标分泌水平及表达水平仍有进一步增加，这表明以BCG初免，以DR2/DIMQ作增强免疫的异源性增强策略可实现长效的免疫应答，呈现出较强的免疫记忆效应。

本发明为进一步探究DR2/DIMQ的保护效应及预防作用提供前期研究基础，揭示了新型脂质体佐剂DIMQ的效应，同时也为TB新型亚单位疫苗的异源性增强策略研究提供理论及实验支持。

附图说明

图1为pPROEX图谱。

图2为pET-30b图谱。

图3为pET30b-DR2构建图谱。

图4为重组原核表达质粒pET30b-DR2构建模式图。

图5为重组原核表达质粒pPROEX-Rv3621c(A)、pPROEX-Rv0572c(B)构建模式图。

图6为pET30b-DR2、pPROEX-Rv3621c、pPROEX-Rv0572c酶切鉴定图。

图7为DR2(A)、rRv3621c(B)、rRv0572c(C)的表达及纯化鉴定，其中，M：蛋白标志物；1：重组菌未诱导对照；2：IPTG诱导重组菌全菌液；3：重组菌IPTG诱导后超声破碎上清；4：蛋白镍柱层析流出液；5：8M尿素结合缓冲液洗涤后流出物；6-9：蛋白镍柱层析蛋白洗脱液。

图8为DR2、rRv3621c、rRv0572c的SDS-PAGE鉴定。

图9为DR2、rRv3621c、rRv0572c的Western blot鉴定。

图10为人群外周血淋巴细胞接受蛋白DR2、rRv3621c、rRv0572c及PHA诱导后分泌的IFN-γ水平，图A为DR2、rRv3621c、rRv0572c及PHA被不同人群识别百分比；图B为DR2、rRv3621c、rRv0572c及PHA诱导不同人群分泌的IFN-γ水平。

图11为不同组小鼠的免疫方案。

图12为抗原特异性T淋巴细胞的分选策略。

图13为小鼠血清特异性IgG(A)、IgG1(B)、IgG2a(C)抗体滴度以及IgG2a与IgG1滴度之比。

图14为小鼠脾细胞抗原特异性IFN-γ(A)、TNF-α(B)及IL-2(C)分泌水平。

图15为小鼠脾细胞抗原特异性记忆T细胞应答水平，图A为DR2刺激下IFN-γ⁺TEM细胞应答水平，图B为DR2刺激下IL-2⁺T_CM细胞，图C为PPD刺激下IFN-γ⁺TEM细胞应答水平，图D为PPD刺激下IL-2⁺T_CM细胞，。

图16为小鼠肺脏IFN-γ(A)、TNF-α(B)、iNOS(C)和IL-10(D)的mRNA表达水平。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：融合蛋白DR2及其亚组分蛋白的构建表达及人外周血抗原特异性IFN-γ水平检测

1实验方法

1.1引物设计与融合基因合成

检索Genbank数据库获取M.tb H37Rv全基因组序列，从中分别提取Rv0572c和Rv3621c编码的基因序列片段，借助UniProtKB数据库检查并按需去除信号肽。继而，通过DNAMAN软件对其进行酶切位点分析。同时，根据原核表达载体pPROEX(图1)、pET-30b(图2)的多克隆酶切位点，以Primer Primier 5.0软件对目的基因序列进行特异性上下游引物设计(表1所示)。特异性上下游引物由苏州泓讯公司合成。融合抗原DR2(Rv3621c-Rv0572c)，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)由滁州通用生物系统(安徽)有限公司合成，通过分子克隆技术构建重组质粒pET30b-DR2，经测序比对无误。

表1基因与引物信息

以pET-30b质粒作为原核表达载体，构建重组质粒pET30b-DR2，并在其N端融合表达6×His标签。

重组质粒pET30b-DR2构建图谱如图3所示。

1.2 M.tb H37Rv基因组DNA提取

于超净台内无菌操作，按照常规实验方法操作。

1.3 PCR扩增目的基因片段

(1)目的基因扩增条件如下表：

表2 Rv3621c、Rv0572c及DR2的PCR反应条件

(2)PCR反应体系如下表：

表3 PCR反应体系

1.4 0.8％琼脂糖凝胶电泳

前步的PCR产物进行电泳，电泳结束后，关闭电泳仪；取出凝胶放置于Bio-RadChemiDoc XRS+凝胶成像仪中，运行图像，标记完毕后，保存并导出。

1.5基因片段的回收与验证

1.6质粒与目的基因双酶切

(1)采用BamH I/Xho I分别双酶切Rv3621c和pPROEX。

(2)采用BamH I/Xho I分别双酶切Rv0572c和pPROEX。

(3)采用HindⅢ/Xho I分别双酶切DR2和pET-30b。

1.7离心法纯化双酶切反应产物及纯化验证

1.8目的基因与空质粒连接

根据纯化验证琼脂糖凝胶成像结果计算连接比例，将前述双酶切后的纯化产物进行连接，Rv3621c、Rv0572c分别与pPROEX连接，DR2与pET-30b连接。

1.9制备感受态E.Coli DH5α

1.10克隆载体E.Coli DH5α转化

取步骤1.8的连接产物pPROEX-Rv3621c、pPROEX-Rv0572c及pET30b-DR2，分别转化感受态E.Coli DH5α。

1.11摇菌

于超净台内无菌操作。取已灭菌的洁净玻璃试管，倒入5mL无菌LB液体培养基，根据1000:1比例加入5μL相应抗生素，再用无菌牙签一头挑取单个菌落加入其中，将其放置于摇床，转速为210rpm/min，37℃培养12～16h。

1.12菌液PCR及验证

1.13离心法提取质粒及验证

1.14酶切鉴定

1.15表达载体E.Coli BL21转化

将提取所得质粒转化至E.Coli BL21。

1.16融合蛋白及亚组分蛋白的诱导及纯化

(1)摇菌：于超净台内无菌操作。取已灭菌的洁净玻璃试管，倒入5mL无菌LB液体培养基，根据1000:1比例加入5μL相应抗生素，再用无菌牙签一头挑取单个菌落加入其中，将其放置于摇床，转速为210rpm/min，37℃培养12～16h；

(2)转摇：于超净台内无菌操作。将过夜菌液全部倒入新鲜的100mL LB液体培养基中，再根据1000:1比例加入105μL相应抗生素，将其置于摇床里，转速为200rpm/min，37℃培养2h，至菌液OD值在600nm处达到0.6，留取50μL转摇菌液用于SDS-PAGE鉴定；

(3)诱导：于超净台内无菌操作。按照1000:1比例加入105μL IPTG诱导剂，再次置于摇床里，转速为200rpm/min，37℃培养4h，留取50μL诱导菌液用于SDS-PAGE鉴定，将剩余菌液分装至50mL离心管中，3000rcf离心20min，弃上清，收集菌体并储存于-20℃；

(4)融合蛋白及亚组分蛋白的纯化：

本次采用Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF进行纯化，在其上键合亚氨基二乙酸基，再在此基础上螯合Ni²⁺构成的一种亲和层析介质，Ni²⁺可带有选择性地与具有融合组氨酸(His)标签的蛋白(含His残基)结合。在分段洗脱过程中，采用竞争性试剂咪唑(Imidazole)在Ni-NTA柱中置换蛋白，以防金属离子Ni²⁺的流失。

1)装Ni-NTA柱：使Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF恢复室温，并充分摇匀，从中取1.2mL新填料放于层析柱中，用五倍体积(6mL)的去离子水洗涤2次，加入等体积(1.2mL)的BindingBuffer平衡柱子，备用；

2)取前述储存于-20℃的冻存菌体于冰上解冻，根据湿重每克菌以5mL BindingBuffer重悬细菌，注意避免气泡产生；

3)将菌液转移至自制半截15mL离心管中，并将离心管插入碎冰中，开始超声破碎，设置功率为200W，时间为2sec/次，间隔时间为3sec，共120次，超声过程中应始终保持清脆的声音，直至菌液变得清亮；

4)将菌液倒入50mL离心管中，3000rcf离心30min，从上清液中留取50μL用于SDS-PAGE鉴定；

5)将剩余上清液全部加入柱子中，轻轻混匀，置于碎冰里，将其放于脱色摇床上，转速为200rpm/min，转动60min；

6)将柱子置于50mL承接管中，300rcf离心1min，从流出物中留取50μL用于SDS-PAGE鉴定；

7)用1个柱床体积(1.2mL)的Binding Buffer清洗柱子，300rcf离心1min，共清洗4次，从第4次离心后流出物中留取50μL用于SDS-PAGE鉴定；

8)用1个柱床体积(1.2mL)的Elution Buffer对柱子进行洗脱，300rcf离心1min，共洗脱4次，每次洗脱后均从流出物中留取50μL用于SDS-PAGE鉴定，剩余洗脱流出物全部收集至洁净EP管中，根据洗脱次数分别标记1、2、3、4，并储存于-20℃备用；

9)用五倍体积(6mL)Binding Buffer洗涤柱子，后用等体积(1.2mL)BindingBuffer平衡柱子。

1.17融合蛋白及亚组分蛋白纯化后表达

(1)准备上样蛋白

将前述用于SDS-PAGE鉴定的留样中各加入50μL 2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，涡旋震荡数秒混匀，煮沸5min；

(2)凝胶的制备

1)洗净聚丙烯酰胺垂直电泳灌胶装置，晾干后组装，将去离子水注入灌胶板，静置5min，注意观察是否漏水，确保灌胶装置密闭性完好；

2)检漏结束后，用吸水纸擦干灌胶板；

3)分离胶的制备：

制备13％分离胶，制备体系如下：

表4分离胶体系

在凝胶聚合过程中，APS为引发剂，而TEMED是催化APS产生自由基的加速剂，二者反应加速丙烯酰胺的聚合，因而制备分离胶时应最后加入10％APS及TEMED，下同；另外，APS具有浓度要求，需完全溶化才可加入，下同。

快速摇匀分离胶溶液，向玻璃板夹层注入分离胶7～8mL，避免产生气泡，以去离子水封顶，水平放置于温箱中，37℃静置30min，待其凝固。分离胶凝固后，弃尽用于封顶的去离子水，用吸水纸吸干水分，洗净1.5mm 15齿梳子，插入玻璃板夹层中。

4)浓缩胶的制备：

制备5％浓缩胶，制备体系如下：

表5浓缩胶体系

快速摇匀浓缩胶溶液，向玻璃板夹层注入浓缩胶至没梳齿，避免产生气泡，水平放置于温箱中，37℃静置1h，待其凝固。

(3)上样与电泳

1)洗净聚丙烯酰胺垂直电泳槽，将灌胶板放置于电泳槽内(注意正负极方向)，向槽内加入1×甘氨酸缓冲液，轻轻拔出梳子；

2)在第一个胶孔中加入4μL蛋白Marker，前述留取样品依次加入剩余胶孔，每孔加入12μL；

3)设置电压为90V，电流为60mA，时间为30min，进行浓缩胶部分电泳，待溴酚蓝跑至浓缩胶和分离胶交界处，调整电压为120V，电流为90mA，时间为1h，待溴酚蓝到达分离胶下缘时即可停止电泳；

(4)染色与脱色

1)拆卸灌胶板，去除浓缩胶，保留分离胶，将其放置于玻璃皿中，倒入足量考马斯亮蓝溶液，使其完全没过分离胶，将玻璃皿放在脱色摇床上，启动脱色摇床，转速适中(以考马斯亮蓝溶液不外溅为宜)，染色30min；

2)染色完成后，回收考马斯亮蓝溶液，先以高甲醇脱色液脱色1h，后以低甲醇脱色液脱色2h，更换低甲醇脱色液持续脱色过夜，次日将分离胶放置于Bio-Rad ChemiDoc XRS+凝胶成像仪中，成像保存。

1.18融合蛋白及亚组分蛋白Western blot鉴定

(1)上样蛋白的准备、凝胶的制备以及上样与电泳的过程均同“步骤17”中的(1)、(2)、(3)点，但只进行洗脱蛋白的上样，且电泳结束并不染色；

(2)拆卸灌胶板，去除浓缩胶，保留分离胶并将分离胶切成所需大小；

(3)根据胶的大小裁剪NC膜，抽取16张滤纸，分为相等的两份，根据转膜装置中海绵垫的大小裁剪滤纸；

(4)准备两个玻璃皿，将NC膜与凝胶一起放置于倒满转移缓冲液的平皿中浸泡，将滤纸与海绵垫一起放置于倒满转移缓冲液的平皿中浸泡，各浸泡15min(注意沉底浸泡，如果NC膜表面正电荷没有充分被转移缓冲液中的甲醇活化，将无法吸引蛋白所带的负电荷，达不到转膜目的)；

(5)转膜：

1)白色阴极板置于台面，先后垫上海绵垫—八层滤纸—NC膜—胶—八层滤纸—海绵垫(注意避免气泡产生)，最后盖上黑色阳极板，在转移缓冲液中夹紧、扣上；

2)组装好转膜装置，黑色阳极板对应黑色，白色阴极板对应红色，置于水槽内，水槽内灌满转移缓冲液；

3)取碎冰置于转膜泡沫盒内，将转膜装置放入，盖上转膜泡沫盒盖子，调整电压为90V，电流为150mA，时间为30min；

(6)固定：将NC膜浸泡于0.2％戊二醛中，置于脱色摇床上温和震荡45min，以固定蛋白(戊二醛有固定作用，可有效防止因反复漂洗导致的蛋白弥散)；

(7)封闭：以0.1％PBST漂洗NC膜1次，再以1％BSA-PBST封闭液浸泡NC膜，置于脱色摇床上温和震荡2h，以封闭蛋白；

(8)洗膜：弃封闭液，用0.1％PBST温和震荡漂洗NC膜，5min/次，共5次；

(9)一抗孵育：以0.1％PBST稀释的鼠源性His单抗(稀释度为1:5000)作为一抗，4℃孵育过夜；

(10)洗膜：回收一抗，用0.1％PBST温和震荡漂洗NC膜，5min/次，共5次；

(11)二抗孵育：以0.1％PBST稀释的HRP标记山羊抗鼠IgG作为二抗，室温避光孵育1h；

(12)洗膜：回收二抗，用0.1％PBST温和震荡漂洗NC膜，5min/次，共5次；

(13)显色：

1)按照1:1比例取显色液A、B至棕色避光离心管中混匀；

2)用吸水纸吸干NC膜表面的0.1％PBST；

3)暗室下，在NC膜表面滴加一半显色液，致NC膜呈泡起状态，静置避光反应8min；

(14)上机：

1)借助Bio-Rad ChemiDoc XRS+凝胶成像仪进行曝光；

2)在NC膜表面滴加另一半显色液，再次借助Bio-Rad ChemiDoc XRS+凝胶成像仪进行曝光。

1.19融合蛋白及亚组分蛋白的透析

(1)制备梯度尿素透析液：称取尿素192g，以去离子水作为溶剂配制8M尿素400mL(含5mM Tris-Cl，pH值为7.9)，再以1×PBS将其稀释为6M、5M、4M、3M、1M、0M，具体如下表：

表6梯度透析表

(2)准备透析袋：

1)取烧杯并盛一定量去离子水，剪取相应大小透析膜，放入烧杯中，煮沸(为方便打开透析袋)；

2)扎紧透析膜一端，向其注入2～4mL 1×PBS，观察透析袋是否漏水；

3)检查密封性完好后弃尽1×PBS，根据袋口大小注入一定量的洗脱蛋白，扎紧透析膜另一端；

(3)透析：将透析袋放入8M透析液中，再按照梯度高低依次放入6M、5M、4M、3M、1M、0M透析液中，每间隔3h更换一次透析液，于4℃透析。

1.20融合蛋白及亚组分蛋白的内毒素去除

根据金斯瑞公司生产的ToxinEraser^TMEndotoxin Removal Kit具体操作说明去除纯化蛋白中的内毒素。纯化蛋白以结合的方式高效去除内毒素的树脂，最终使得纯化蛋白的内毒素水平低于0.1EU/mL。

1.21融合蛋白及亚组分蛋白的定量

(1)以BCA蛋白定量试剂盒进行透析蛋白的定量，以1×PBS将牛血清白蛋白(BSA)母液(2mg/mL)稀释成标准品液(0.5mg/mL)，并制备蛋白定量的标准曲线，具体见下表：

表7 BSA标准曲线制备

(2)按照上表次序将梯度BSA依次加入96孔板中，且设置复孔，取前述透析蛋白各20μL加入96孔板中；

(3)试剂A、B以50:1的比例混合，制备BCA工作液；

(4)每孔加入200μL BCA工作液，置于温箱中37℃孵育30min；

(5)以Gen5发光检测仪(Gen5 TS 2.09)中562nm波长测定透析蛋白的吸光度值，回归拟合得出标准方程，借此可计算出透析蛋白的浓度。

以Image Lab软件分析融合蛋白DR2的纯度，得出其纯度约为95％。

1.22 rCM-WBIA法检测人群外周血抗原特异性IFN-γ浓度

(1)受检人群中M.tb感染者与未感染人群的区分

委托安徽省淮南市安徽理工大学附属肿瘤医院(淮南东方医院集团肿瘤医院)检验科募集M.tb感染者和未感染受试者共40人，在对受试者开展一系列病史采集、问卷调查及全身体检之后，依据TB临床诊断标准(中华人民共和国卫生行业标准WS 288-2017)对受试者进行初筛。其中，活动性结核病(active tuberculosis infection,ATB)患者表现出明显TB感染症状，且具有TB接触史，此外经临床检查发现其痰涂片或痰培养呈阳性、胸部X射线检查呈现可疑阴影、结核菌素试验(TST)检测阳性(TST≥5mm)；潜伏性结核病(latenttuberculosis infection,LTBI)患者虽有TB接触史却不具备明显TB感染症状，临床检查中痰涂片或痰培养呈阴性、胸部X射线检查无可疑阴影，但TST检测呈阳性(TST≥5mm)；而HCs均无TB接触史，且TST检测呈阴性(TST＜5mm)。ATBs及LTBIs可统称为M.tb感染者。另外，参考TB-IGRA试剂盒操作说明对受试人群开展进一步的分类诊断。此次人群试验已获批于淮南东方医院集团肿瘤医院医学伦理委员会(No.T20171108-25)，受试者均已签署知情同意书。

(2)采集受试者全血接受融合蛋白及亚组分蛋白刺激

1)以抗凝管采集受试者新鲜全血3～4mL；

2)将每管血分为六组，即阴性对照组(以PBS刺激)、阳性对照组(以PHA刺激)、rCM对照组(以融合蛋白CFP21-MPT64刺激)、实验组(分别以融合蛋白DR2及亚组份蛋白rRv3621c、rRv0572c刺激)，依据分组各吸取500μL/孔受试者新鲜全血加入24孔板中；

3)在阴性对照组中加入20μL PBS，在阳性对照组中加入20μL PHA，在rCM对照组中加入10μg rCM，在实验组中分别加入10μg DR2、rRv3621c及rRv0572c，震荡混匀；

4)将24孔板置于温箱中37℃孵育18～24h；

5)以3000rpm转速离心10min收集血清，置入已灭菌的EP管内，-20℃保存备用；

6)参考说明书操作步骤使用预包被的人IFN-γ检测试剂盒，使用酶标仪于450nm和630nm双波长检测各孔吸光度值，根据OD值和浓度绘制标准曲线，再依据标准曲线计算各样本孔IFN-γ浓度(待测蛋白诱导产生的IFN-γ实际含量为实验蛋白诱导IFN-γ浓度减去PBS组IFN-γ浓度之差)。

1.23统计学分析

借助SPSS19.0软件进行统计学分析。采用独立样本t检验对不同刺激组人群外周血抗原特异性IFN-γ浓度差异进行分析。P<0.05则表示结果具有统计学意义。

2结果

2.1成功构建重组质粒pET30b-DR2、pPROEX-Rv3621c及pPROEX-Rv0572c

融合基因的序列顺序为Rv3621c-Rv0572c，且已完全去除信号肽序列。由滁州通用生物系统(安徽)有限公司合成最终序列，且基于载体构建技术将其插入至原核质粒pET30b中，将其命名为pET30b-DR2。经基因测序鉴定，重组质粒构建正确。以M.tb全基因组H37Rv为模板，按照PCR反应体系将所需试剂依次加入PCR管中，根据PCR反应条件对Rv3621c、Rv0572c进行扩增，分别得到片段大小为1242bp及342bp的PCR产物。通过分子克隆技术将Rv3621c、Rv0572c分别插入至pPROEX载体中，得到原核表达重组质粒pPROEX-Rv3621c及pPROEX-Rv0572c。经双酶切鉴定，重组质粒构建无误(见图4-6)。

2.2成功纯化、表达及鉴定融合蛋白DR2及亚组份蛋白

将重组质粒经热休克法转化至E.Coli BL21(DE3)感受态细胞中。通过摇菌扩大培养后，以IPTG诱导蛋白表达，4h后通过离心收集菌体。重悬菌体经超声破碎后，在变性条件下经离心式蛋白纯化柱以Ni-NTA琼脂糖凝胶6FF分步纯化蛋白，获得纯化蛋白产物，通过SDS-PAGE电泳鉴定，蛋白分子量分别为58kDa(DR2)、45.5kDa(rRv3621c)、12.5kDa(rRv0572c)，与预期结果相符，见图7和图8。

以鼠源性His单抗作为一抗，对前述所得蛋白进行Western blot鉴定，结果证明融合蛋白DR2及亚组份蛋白rRv3621c、rRv0572c均被成功表达及纯化，且具有较好的特异性，见图9。

2.3融合蛋白DR2及其亚组分蛋白均可刺激M.tb感染者产生高水平IFN-γ

根据TB临床诊断标准筛选出ATBs、LTBIs各15例，同时募集HCs共10人，具体分组特征如下表：

表8受试人群分组及特征

经rCM-WBIA技术检测不同人群外周血受不同蛋白刺激后释放的抗原特异性IFN-γ水平。如图10所示，以PHA刺激全血样本时，所有受试者外周血均释放较高水平的IFN-γ，*表示同一受试者外周血接受PHA刺激与其他抗原刺激后IFN-γ释放水平统计差异P<0.01；而rCM(CFP21-MPT64)只可被所有的ATBs外周血T淋巴细胞识别(图10A)，其释放的特异性IFN-γ水平显著高于HCs(t＝5.191，P<0.01)(图10B)。

对于实验蛋白组，融合蛋白DR2及亚组分蛋白rRv3621c、rRv0572c刺激ATBs、LTBIs外周血产生的抗原特异性IFN-γ均显著高于HCs(t_{[DR2(ATBs vs HCs)}＝6.824，t_{[DR2(LTBIs vs HCs)]}＝5.758，t_{[rRv3621c(ATBs vs HCs)]}＝4.54，t_{[rRv3621c(LTBIs vs HCs)]}＝3.176，t_{[rRv0572c(ATBs vs HCs)]}＝3.261，t_{[rRv0572c(LTBIs vs HCs)]}＝3.885，均P<0.01)(图10B)。亚组分蛋白中rRv3621c和rRv0572c可分别被90％及68％的ATBs和70％及85％的LTBIs外周血T淋巴细胞特异性识别(图10A)。

相比于亚组份蛋白rRv3621c、rRv0572c，融合蛋白DR2可被100％的ATBs及100％的LTBIs外周血T淋巴细胞所识别(图10A)，提示其能够提供优于亚组份蛋白的免疫原性。

作为阳性对照，PHA的截断值为100pg/mL。在临床诊断之后，rCM(CFP21-MPT64)基于398.5pg/mL的截断值用于确认不同人群特征。虚线代表人外周血受到融合蛋白刺激后出现阳性反应的截断值，在这里将其直接设定为HCs阴性对照数值平均值的三倍。

实施例2：亚单位融合蛋白疫苗制备及免疫原性分析

本实施例拟制备以阳离子脂质体二甲基三十六烷基溴化铵(DDA)为基础，联合TLR7/8受体激动剂咪喹莫特(Imiquimods)的新型复合型佐剂，命名为DIMQ，并将其与前期构建表达成功的融合蛋白DR2混合制备新型佐剂蛋白亚单位疫苗；借鉴“BCG初免-异源性疫苗增强免疫”策略免疫C57BL/6小鼠，从血清抗体水平、脾细胞上清细胞因子水平、肺脏细胞因子mRNA表达水平以及记忆T细胞类型和数量等方面评估该疫苗的持久免疫原性。

1实验方法

1.1佐剂与疫苗的制备

1.1.1佐剂的制备

(1)以薄膜法制备阳离子脂质体DDA：称取32mg二甲基三十六烷基溴化铵(DDA)，量取氯仿(CHCl₃)和甲醇(CH₃OH)并按体积比9:1混匀作为溶剂，以其充分溶解DDA。缓慢通入N₂完全去除有机溶剂，室温过夜以彻底晾干。以无菌1×PBS将其配制成2.5mg/mL溶液，并在60℃条件下水浴1h，期间每隔10min将其混合均匀，收集即可得DDA脂质体，室温冷却，4℃保存备用；

(2)配制咪喹莫特(Imiquimods)溶液：称取26mg Imiquimods，以无菌1×PBS将其配制成2.64mg/mL溶液，充分溶解，-80℃保存备用；

(3)制备DIMQ脂质体佐剂：一次注射每只小鼠需250μg DDA；Imiquimods用于小鼠注射的剂量为10mg/kg；按照小鼠所需佐剂剂量计算佐剂体积并混合，即得DIMQ脂质体佐剂。

1.1.2亚单位疫苗的制备

取融合蛋白DR2 20μg充分乳化于DIMQ脂质体佐剂中即可得亚单位疫苗。

1.1.3亚单位疫苗质量评估

以高液相色谱评估佐剂含量，基于动态光散射进行粒度分析，以SDS-PAGE鉴定蛋白。

1.1.4 BCG注射液的制备

称取适量卡介苗(BCG)干粉，以无菌1×PBS对其充分溶解，按照1×10⁷CFU/mg估算菌量，继而将每只小鼠注射菌量调整至1×10⁶CFU/200μL。以无菌1×PBS对菌液进行倍比稀释后，涂布均匀，将其置于CO₂培养箱中37℃培养3～4周后，进行菌落计数，并依此计算出每只小鼠单次注射所需的BCG菌量。实际每只小鼠单次注射BCG菌量为1.2×10⁶CFU/200μL。

1.2动物分组及免疫方案

1.2.1动物分组方案

依据实验设计，对前述所购C57BL/6小鼠进行随机分组，共分为5组，具体分组方案如下表：

表9实验动物分组方案

注：初次免疫后9周(3只)及18周(3只)后各处死半数小鼠，开展免疫原性实验；且为保证数据稳定可靠，重复试验一次，故一组共需12只小鼠。借助安徽理工大学医学院病原生物学教研室动物房进行小鼠饲养和免疫。

1.2.2动物免疫方案

所有分组小鼠均采用皮下两点式注射，100μL/点。PBS组小鼠在0周时注射无菌200μL 1×PBS，共免疫1次；BCG组小鼠在0周时注射含菌量为1.2×10⁶CFU的BCG菌液200μL，共免疫1次；DIMQ组及DR2/DIMQ组在第0周、第3周、第6周时分别注射DIMQ、DR2/DIMQ各一次，共免疫3次；BCG+DR2/DIMQ组小鼠在0周时注射1次含菌量为1.2×10⁶CFU的BCG菌液200μL作初次免疫，在第3周、第6周时各注射1次DR2/DIMQ作增强免疫，共免疫3次。免疫后9周及18周分别对每组中半数小鼠进行摘眶取血，后以脱椎方式处死小鼠，于无菌环境下分离小鼠脾脏与肺脏，开展后续免疫原性实验。具体免疫方案如图11所示。

1.3亚单位疫苗免疫原性分析

1.3.1 ELISA检测小鼠血清抗原特异性总IgG抗体及其亚类效价水平

(1)对小鼠摘眶取血，室温静置数分钟，12000rpm离心1min，收集小鼠抗原特异性血清，-20℃保存备用；

(2)包被：准备96孔板，以碳酸盐包被缓冲液(0.05M，pH值为9.6)稀释融合蛋白DR2至5μg/mL，以100μL/孔加入，空白对照组加入100μL碳酸盐包被缓冲液，设复孔，4℃孵育过夜；

(3)封闭：甩去孔内液体，扣干，以0.05％PBST洗板5次，3min/次；扣干后，加入1％BSA/PBST进行封闭，以100μL/孔加入，置于37℃孵育1h；洗板；

(4)加样：取已灭菌过滤的1×PBS按1:200稀释各免疫组小鼠血清，以200μL/孔加入每列第1孔，以倍比稀释法稀释至1:12800，空白对照组加入100μL碳酸盐包被缓冲液，置于37℃孵育1h；洗板；

(5)二抗孵育：分别加入HRP标记山羊抗鼠二抗IgG(稀释比1:5000)、IgG1(稀释比1:10000)、IgG2a(稀释比1:10000)，以100μL/孔加入，置于37℃孵育1h；洗板(最后一次用去离子水洗板)；

(6)显色：加入TMB显色液，以100μL/孔加入，置于37℃显色20min；

(7)终止反应：加入终止液(2mol/L H₂SO₄)，以50μL/孔加入，终止显色；

(8)结果测定：以Gen5发光检测仪(Gen5 TS 2.09)中450nm波长测定吸光度值；

(9)结果处理：根据出现阳性结果的最高稀释倍数计算其倒数log₁₀，即可表示抗体滴度，以实际稀释倍数计算IgG2a/IgG1比值。

1.3.2小鼠脾细胞分离

(1)将小鼠断椎处死后，以75％乙醇浸泡10min，后于已消毒的超净台内以大头针及泡沫板固定小鼠，无菌剥离小鼠脾脏，尽量去除筋膜组织；

(2)将无菌细胞筛(孔径70μm)套在已灭菌的50mL离心管上，以无菌镊子镊取小鼠脾脏置于尼龙筛网上，以无菌注射器活塞轻柔研磨小鼠脾脏，期间以4℃预冷的灭菌1×PBS冲洗；

(3)研磨完毕后，以5000rpm转速4℃离心10min(往返途中菌液需保持冰浴)，于消毒超净台内弃尽上清；

(4)加入预冷灭菌1×PBS，以5000rpm转速4℃离心10min(往返途中菌液需保持冰浴)，于消毒超净台内弃尽上清；

(5)于消毒超净台内加入1mL预冷RPMI1640完全培养基重悬细胞沉淀，取10μL细胞悬浮液，以红细胞裂解液将其稀释100倍，从中取30μL，镜下准确计数。

1.3.3 ELISA检测小鼠脾细胞上清抗原特异性细胞因子分泌水平

(1)准备24孔板，向每孔加入3.5×10⁶个脾细胞，设置实验蛋白组、阴性对照组及阳性对照组，分别接受融合蛋白DR2(10μg)、RPMI1640完全培养基(20μL)及纯化蛋白衍生物(PPD，10μg)刺激，补足RPMI1640完全培养基至1mL；

(2)将前述24孔板置于5％CO₂培养箱中进行37℃孵育，其中，用于检测IL-2分泌水平的脾细胞孵育24h即可，而用于检测IFN-γ及TNF-α分泌水平的脾细胞需孵育72h；

(3)孵育结束后，分别收集孔内脾细胞培养液于无菌EP管中，以3000rpm转速离心8min，留取脾细胞培养液上清于洁净EP管中，于-80℃中保存备用；

(4)铺孔：准备96孔板，设置标准品孔和样本孔，其中标准品孔设置复孔，孔中依次加入不同浓度的标准品50μL，样本孔中先各加入不同免疫组小鼠脾细胞培养液上清10μL，再加入样本稀释液40μL；

(5)二抗孵育：各孔均加入100μL HRP标记检测抗体，放置于培养箱中37℃避光孵育1h；

(6)洗板：弃去孔内液体，扣干，以洗涤液洗板5次，1min/次；

(7)显色：各孔均加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育30min；

(8)终止反应：各孔均加入终止液50μL，终止显色；

(9)结果测定：以Gen5发光检测仪(Gen5 TS 2.09)中450nm波长测定吸光度值，根据标准曲线和吸光度值计算细胞因子分泌浓度。

1.3.4流式细胞术检测小鼠抗原特异性T淋巴细胞亚群

(1)准备流式管，向每管加入3.5×10⁶个脾细胞，以RPMI1640完全培养基补足至250μL，设置实验蛋白组、阳性组、阴性组、PPD组及空白组，各组加样体系如下表：

表10各组的刺激物加样体系

按照上述体系加至流式管之后，将流式管置于5％CO₂培养箱里37℃孵育4h，期间每隔1h震荡混匀一次。

(2)孵育完成后，除空白组以外，其余流式管均加入5μL Anti-Mouse CD4、5μLAnti-Mouse CD8α、0.3μL Anti-Mouse CD62L及1.25μL Anti-Mouse CD44，震荡混匀，室温避光孵育15min；

(3)每管加入50uL固定破膜液A，震荡混匀，室温避光孵育15min；

(4)用去离子水将10×流式细胞术染色缓冲液(FCS buffer)稀释为1×，每管加入1mL预冷1×FCS buffer，以300rcf离心5min，弃上清；

(5)每管加入50uL固定破膜液B；

(6)除空白组以外，其余流式管均加入5μL Anti-Mouse IFN-γ及5μLAnti-MouseIL-2，震荡混匀，避光冰浴过夜；

(7)重复步骤(4)一次；

(8)每管加入250uL 1×FCS buffer重悬，上机检测；

(9)分选策略：圈定淋巴细胞群为P1门，依此分选出CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，基于CD62L和CD44分子的表达，继而分选出CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞中中枢记忆性T细胞(Centralmemory T cells,T_CM)及效应记忆性T细胞(Effector memory T cells,T_EM)，最终分析IFN-γ⁺CD44⁺T_EM细胞和IL-2⁺CD44⁺T_CM细胞的比例。门控策略见图12。

1.3.5 qRT-PCR分析小鼠肺脏组织抗原特异性细胞因子mRNA表达水平

(1)获取总RNA：处死小鼠后，无菌摘取肺脏，参考试剂盒说明书操作步骤利用Trizol试剂提取总RNA，并测定其OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.8～2.0之间(注意若OD₂₆₀/OD₂₈₀值＜1.7提示蛋白质可能污染，需应用酚/氯仿进行再抽提；而OD₂₆₀/OD₂₈₀值＞2.2则表明RNA出现降解)。

(2)逆转录：取洁净PCR管，向其中加入1μg总RNA及1μL特异性引物，再以DEPC将总体积补足至12μL，将其置于PCR仪中变性5min，继而立即冰浴5min，再根据下表配制反应体系：

表11逆转录反应体系

配制完毕后，42℃水浴60min，后以70℃水浴5min灭活逆转录酶终止反应，即可得cDNA，-20℃保存备用。

(3)引物设计：依据相应的cDNA序列分别设计IFN-γ、TNF-α、IL-10、iNOS及内参GAPDH的上下游引物，如下表。引物由滁州通用生物系统(安徽)有限公司合成。

表12 qRT-PCR分析鼠肺脏iNOS和各细胞因子的引物

(4)qRT-PCR：以GAPDH为内参，定量检测肺脏IFN-γ、TNF-α、IL-10、iNOS中mRNA的表达水平，PCR反应体系如下：

表13 qRT-PCR反应体系

反应条件为：预变性95℃3min；变性95℃20sec，退火60℃30sec，延伸72℃30sec，共40个循环；4℃forever。

记录各反应管的Ct值，采用ΔΔCt法计算得出各样本mRNA含量：ΔCt_Sample＝Ct_Test-Ct_GAPDH，ΔCt_Control＝Ct_Test-Ct_GAPDH；ΔΔCt＝ΔCt_Sample-ΔCt_Control；以2^-ΔΔCt表示各样本mRNA含量。

1.4统计学分析

运行SPSS19.0软件进行数据处理。采用配对样本t检验对免疫后9周与18周两个时间点之间同一免疫组的同一指标的差异进行分析，采用LSD单因素方差分析对同一时间点各免疫组之间同一指标的差异进行分析。P<0.05则表示结果具有统计学意义。

2结果

2.1初免增强组小鼠血清长期产生最高水平IgG类抗体

为判断DR2联合脂质体复合型佐剂DIMQ的免疫应答类型，用ELISA法检测小鼠血清中DR2抗原特异性总IgG抗体及其亚类IgG1、IgG2a产生水平。如图13所示，DIMQ单独免疫小鼠其血清未产生DR2抗原特异性IgG类抗体。DR2联合佐剂DIMQ免疫小鼠或作为BCG初免的增免疫苗均可诱导产生DR2抗原特异性高水平IgG类抗体(F_(IgG-9w)＝775.2，F_(IgG-18w)＝1116，F_(IgG1-9w)＝310.8，F_(IgG1-18w)＝422，F_(IgG2a-9w)＝642.9，F_(IgG2a-18w)＝411.8，均P<0.01)，且免疫后18周IgG类抗体产生水平均显著高于免疫后9周同组水平，且同组间以IgG2a抗体增长最为显著(t_{[(DR2/DIMQ)-IgG]}＝5.275，t_{[(BCG+DR2/DIMQ)-IgG]}＝6.237，t_{[(DR2/DIMQ)-IgG1]}＝6.104，t_{[(BCG+DR2/DIMQ)-IgG1]}＝4.414，t_{[(DR2/DIMQ)-IgG2a]}＝13.51，t_{[(BCG+DR2/DIMQ)-IgG2a]}＝8.574，均P<0.05)。在免疫后9周或18周，BCG+DR2/DIMQ组IgG类抗体产生水平始终显著高于DR2/DIMQ组(t_(IgG-9w)＝15.01，t_(IgG-18w)＝15.07，t_(IgG1-9w)＝6.953，t_(IgG1-18w)＝6.819，t_(IgG2a-9w)＝9.342，t_(IgG2a-18w)＝7.258，均P<0.01)。BCG组小鼠血清在免疫后9周产生IgG类抗体水平不及BCG+DR2/DIMQ组及DR2/DIMQ组(t_{[IgG(BCG vs BCG+DR2/DIMQ)]}＝24.68，t_{[IgG(BCG vs DR2/DIMQ)]}＝9.669，t_{[IgG1(BCG vs BCG+DR2/DIMQ)]}＝14.86，t_{[IgG1(BCG vs DR2/DIMQ)]}＝7.902，t_{[IgG2a(BCG vs BCG+DR2/DIMQ)]}＝26.52，t_{[IgG2a(BCG vs DR2/DIMQ)]}＝17.18，均P<0.01)，由于BCG产生IgG类抗体随时间延长而减少，而BCG+DR2/DIMQ组及DR2/DIMQ组反之，这种差异在免疫后18周更为显著(t_{[IgG(BCG vs BCG+DR2/DIMQ)]}＝33.48，t_{[IgG(BCG vs DR2/DIMQ)]}＝18.4，t_{[IgG1(BCG vs BCG+DR2/DIMQ)]}＝19.53，t_{[IgG1(BCG vs DR2/DIMQ)]}＝12.71，t_{[IgG2a(BCG vs BCG+DR2/DIMQ)]}＝23.54，t_{[IgG2a(BCG vs DR2/DIMQ)]}＝16.28，均P<0.01)。

此外，BCG+DR2/DIMQ组及DR2/DIMQ组小鼠血清IgG2a:IgG1比值大于1，且免疫后18周其比值显著高于免疫后9周同组水平(t_{(BCG+DR2/DIMQ)}＝5.914，t_(DR2/DIMQ)＝5.361，均P<0.01)，这表明DR2联合佐剂DIMQ免疫小鼠或作为BCG初免的增免疫苗均可主导Th1型免疫应答，且这种应答随时间延长更加强烈。在免疫后9周或18周，BCG+DR2/DIMQ组小鼠血清IgG2a:IgG1比值始终显著高于DR2/DIMQ组(t_{(IgG2a:IgG1-9w)}＝25.88，t_{(IgG2a:IgG1-18w)}＝33.66，均P<0.01)，即相对于DR2/DIMQ单独免疫，DR2/DIMQ作为BCG初免的异源增强性疫苗可稳定诱导更显著的Th1型免疫应答。

*表示相同免疫组小鼠免疫后9周与18周之间同一统计指标差异P<0.05，**表示相同免疫组小鼠免疫后9周与18周之间同一统计指标差异P<0.01。

2.2初免增强组小鼠脾细胞上清长期分泌最高水平Th1型细胞因子

为评价DR2联合脂质体复合型佐剂DIMQ对于Th1型细胞因子的刺激水平，用ELISA法测定小鼠脾细胞37℃孵育后其上清分泌DR2抗原特异性IFN-γ、TNF-α及IL-2水平。如图14所示，无论是免疫后9周还是18周，以PPD或DR2刺激时，BCG+DR2/DIMQ组小鼠脾细胞上清分泌最高水平抗原特异性IFN-γ、TNF-α及IL-2，PBS组分泌水平最低(F_{(PPD-9w-IFN-γ)}＝604.5，F_{(DR2-9w-IFN-γ)}＝515.4，F_{(PPD-18w-IFN-γ)}＝1206，F_{(DR2-18w-IFN-γ)}＝614.1，F_{(PPD-9w-TNF-α)}＝807.3，F_{(DR2-9w-TNF-α)}＝397.6，F_{(PPD-18w-TNF-α)}＝907.5，F_{(DR2-18w-TNF-α)}＝2456，F_{(PPD-9w-IL-2)}＝188.2，F_{(DR2-9w-IL-2)}＝308.3，F_{(PPD-18w-IL-2)}＝145.8，F_{(DR2-18w-IL-2)}＝346.2，均P<0.01)，DR2/DIMQ组分泌水平显著高于单独佐剂DIMQ组(t_{(PPD-9w-IFN-γ)}＝12.33，t_{(DR2-9w-IFN-γ)}＝21.32，t_{(PPD-18w-IFN-γ)}＝17.06，t_{(DR2-18w-IFN-γ)}＝24.88，t_{(PPD-9w-TNF-α)}＝18.72，t_{(DR2-9w-TNF-α)}＝20.82，t_{(PPD-18w-TNF-α)}＝19.1，t_{(DR2-18w-TNF-α)}＝54.91，t_{(PPD-9w-IL-2)}＝6.891，t_{(DR2-9w-IL-2)}＝13.17，t_{(PPD-18w-IL-2)}＝6.345，t_{(DR2-18w-IL-2)}＝15.78，均P<0.01)。以PPD刺激时，BCG组小鼠脾细胞上清分泌IFN-γ、TNF-α及IL-2水平显著高于DR2/DIMQ组(t_(9w-IFN-γ)＝11.65，t_(18w-IFN-γ)＝17.41，t_(9w-TNF-α)＝11.29，t_(18w-TNF-α)＝12.26，t_(9w-IL-2)＝3.072，t_(18w-IL-2)＝3.869，均P<0.01)；以DR2刺激时，差异则反之(t_(9w-IFN-γ)＝8.966，t_(18w-IFN-γ)＝12.92，t_(9w-TNF-α)＝10.84，t_(18w-TNF-α)＝32.96，t_(9w-IL-2)＝10.9，t_(18w-IL-2)＝11.71，均P<0.01)。与免疫后9周相比，免疫后18周以PPD刺激各组小鼠脾细胞上清后IFN-γ、TNF-α及IL-2分泌水平无明显变化(t_(PBS-IFN-γ)＝0.6278，t_{(DIMQ-IFN-γ)}＝0.506，t_{(DR2/DIMQ-IFN-γ)}＝0.9553，t_(BCG-IFN-γ)＝0.883，t_{(BCG+DR2/DIMQ-IFN-γ)}＝2.085，t_(PBS-TNF-α)＝0.8662，t_{(DIMQ-TNF-α)}＝0.5441，t_{(DR2/DIMQ-TNF-α)}＝0.2199，t_(BCG-TNF-α)＝0.9103，t_{(BCG+DR2/DIMQ-TNF-α)}＝1.248，t_(PBS-IL-2)＝1.346，t_(DIMQ-IL-2)＝1.685，t_{(DR2/DIMQ-IL-2)}＝0.1189，t_(BCG-IL-2)＝1.551，t_{(BCG+DR2/DIMQ-IL-2)}＝1.085，均P>0.05)。以DR2刺激时，与免疫后9周相比，免疫后18周DR2/DIMQ组、BCG组及BCG+DR2/DIMQ组小鼠脾细胞上清分泌IFN-γ、TNF-α及IL-2水平均有增加，但DR2/DIMQ组及BCG+DR2/DIMQ组分泌水平增加较为显著(t_{(DR2/DIMQ-IFN-γ)}＝7.024，t_{(BCG+DR2/DIMQ-IFN-γ)}＝6.663，t_{(DR2/DIMQ-TNF-α)}＝16，t_{(BCG+DR2/DIMQ-TNF-α)}＝16.89，t_{(DR2/DIMQ-IL-2)}＝20.65，t_{(BCG+DR2/DIMQ-IL-2)}＝8.587，均P<0.01)，而BCG组分泌水平随时间延长增长幅度较小(t_(BCG-IFN-γ)＝1.765，P>0.05；t_(BCG-TNF-α)＝2.971，t_(BCG-IL-2)＝3.153，均P<0.05)。

*表示相同免疫组小鼠免疫后9周与18周之间同一统计指标差异P<0.01。

3.3初免增强组小鼠可诱导最高水平免疫记忆应答

为进一步探究DR2联合佐剂DIMQ诱导的免疫记忆应答水平，以CD62L、CD44作为表达分选标志物，利用胞内细胞因子染色法检测DR2抗原特异性T_EM细胞和T_CM细胞。如图15所示，无论是免疫后9周还是18周，以PPD或DR2刺激时，PBS组及DIMQ组小鼠脾细胞均未产生可观的特异性IFN-γ⁺T_EM细胞或IL-2⁺T_CM细胞。与BCG组相比，DR2/DIMQ组和BCG+DR2/DIMQ组小鼠在免疫后9周产生更多的DR2特异性IFN-γ⁺CD4⁺和CD8⁺T_EM细胞(t_{[IFN-γ+CD4+TEM(DR2/DIMQ vs BCG)]}＝9.01，t_{[IFN-γ+CD4+TEM(BCG+DR2/DIMQ vs BCG)]}＝14.9，t_{[IFN-γ+CD8+TEM(DR2/DIMQ vs BCG)]}＝3.204，t_{[IFN-γ+CD8+TEM(BCG+DR2/DIMQ vs BCG)]}＝9.309，均P<0.01)，且在免疫后18周均产生显著高于BCG组的DR2特异性IL2⁺CD4⁺和CD8⁺T_CM细胞(t_{[IL-2+CD4+TCM(DR2/DIMQ vs BCG)]}＝7.697，t[_{IL-2+CD4+TCM(BCG+DR2/DIMQ vs BCG)]}＝18.36，t_{[IL-2+CD8+TCM(DR2/DIMQ vs BCG)]}＝13.03，t[_{IL-2+CD8+TCM(BCG+DR2/DIMQ vs BCG)]}＝23.37，均P<0.01)。此外，在免疫后的每个时间点，无论是以PPD刺激还是以DR2刺激，与DR2/DIMQ组相比，BCG+DR2/DIMQ组小鼠均可产生更多的特异性IFN-γ⁺T_EM细胞(t_{(PPD-9w-CD4+)}＝16.37，t_{(PPD-9w-CD8+)}＝4.432，t_{(PPD-18w-CD4+)}＝1.629，t_{(PPD-18w-CD8+)}＝6.455，t_{(DR2-9w-CD4+)}＝5.888，t_{(DR2-9w-CD8+)}＝6.106，t_{(DR2-18w-CD4+)}＝6.243，t_{(DR2-18w-CD8+)}＝6.496)或IL-2⁺T_CM细胞(t_{(PPD-9w-CD4+)}＝5.189，t_{(PPD-9w-CD8+)}＝2.817，t_{(PPD-18w-CD4+)}＝6.489，t_{(PPD-18w-CD8+)}＝5.626，t_{(DR2-9w-CD4+)}＝1.791，t_{(DR2-9w-CD8+)}＝4.29，t_{(DR2-18w-CD4+)}＝10.66，t_{(DR2-18w-CD8+)}＝10.34)。更需关注的是，在以BCG作初免并以DR2/DIMQ作增强免疫诱导的记忆细胞中，随免疫时间的延长，PPD或DR2特异的IL-2⁺CD4⁺和CD8⁺T_CM细胞占主导地位(t_(PPD-CD4+)＝54.43，t_(PPD-CD8+)＝37.77，t_(DR2-CD4+)＝34.01，t_(DR2-CD8+)＝24.95，均P<0.01)。

在免疫后9周，BCG组、DR2/DIMQ组及BCG+DR2/DIMQ组小鼠产生的DR2特异性IL-2⁺T_CM细胞差异较小但仍具有统计学意义(F_(CD4+)＝4.363，P<0.05；F_(CD8+)＝14.39，P<0.01)，而在免疫后18周，DR2/DIMQ单独免疫小鼠或用作BCG初免的增强疫苗均可诱导显著高于BCG组的DR2特异性IL-2⁺T_CM细胞(t_{[CD4+(DR2/DIMQ vs BCG)]}＝7.697，t_{[CD4+(BCG+DR2/DIMQ vs BCG)]}＝18.36，t_{[CD8+(DR2/DIMQ vs BCG)]}＝13.03，t_{[CD8+(BCG+DR2/DIMQ vs BCG)]}＝23.37，均P<0.01)。在接受PPD刺激时，无论免疫9周还是18周，BCG均诱导小鼠产生了最高水平的IL-2⁺CD8⁺T_CM细胞、IFN-γ⁺CD4⁺和CD8⁺T_EM细胞(F_{[9w-(IL-2+CD8+TCM)]}＝360，F_{[18w-(IL-2+CD8+TCM)]}＝1044，F_{[9w-(IFN-γ+CD4+TEM)]}＝3133，F_{[18w-(IFN-γ+CD4+TEM)]}＝105.9，F_{[9w-(IFN-γ+CD8+TEM)]}＝200，F_{[18w-(IFN-γ+CD8+TEM)]}＝218.5，P<0.01)。在免疫后9周时，BCG诱导产生的PPD特异性IL-2⁺CD4⁺T_CM细胞略高于DR2/DIMQ组和BCG+DR2/DIMQ组(t_{(DR2/DIMQ vs BCG)}＝5.762，P<0.01；t_{(BCG+DR2/DIMQ vs BCG)}＝2.093，P<0.05)，但在免疫后18周，其水平反而低于DR2/DIMQ组和BCG+DR2/DIMQ组(t_(DR2/DIMQ _vs _BCG)＝3.183，t_{(BCG+DR2/DIMQ vs BCG)}＝9.671，均P<0.01)。

此外，从整体上看，与DR2或PPD特异性IFN-γ⁺CD4⁺T_EM细胞数相比，BCG+DR2/DIMQ组及DR2/DIMQ组小鼠脾细胞IFN-γ⁺CD8⁺T_EM细胞数在免疫后9周或18周均有明显差距(t_{[PPD-9w(BCG+DR2/DIMQ)]}＝26.86，t_{[PPD-18w(BCG+DR2/DIMQ)]}＝6.558，t_{[PPD-9w(DR2/DIMQ)]}＝22.46，t_{[PPD-18w(DR2/DIMQ)]}＝7.21，t_{[DR2-9w(BCG+DR2/DIMQ)]}＝23.3，t_{[DR2-18w(BCG+DR2/DIMQ)]}＝8.243，t_{[DR2-9w(DR2/DIMQ)]}＝13.5，t_{[DR2-18w(DR2/DIMQ)]}＝4.673，均P<0.01)；而BCG+DR2/DIMQ组及DR2/DIMQ组小鼠脾细胞的DR2或PPD特异性IL-2⁺CD8⁺T_CM细胞数在免疫后9周水平基本与IL-2⁺CD4⁺T_CM持平(t_{[PPD-9w(BCG+DR2/DIMQ)]}＝7.69，P<0.01；t_{[PPD-9w(DR2/DIMQ)]}＝2.562，P>0.05；t_{[DR2-9w(BCG+DR2/DIMQ)]}＝2.233，P>0.05；t_{[DR2-9w(DR2/DIMQ)]}＝0.6057，P>0.05)，但二者在免疫后18周水平存在一定差距(t_{[PPD-18w(BCG+DR2/DIMQ)]}＝30.38，P<0.01；t_{[PPD-18w(DR2/DIMQ)]}＝15.07，P<0.01；t_{[DR2-18w(BCG+DR2/DIMQ)]}＝4.178，P<0.05；t_{[DR2-18w(DR2/DIMQ)]}＝2.22，P>0.05)。

2.4初免增强组小鼠肺脏组织长期高表达Th1型细胞因子及iNOS的mRNA水平

M.tb感染最常见于肺脏，故在评估候选疫苗时需重点观察肺脏组织Th1型细胞因子及iNOS的mRNA表达情况。如图16所示，无论是免疫后9周还是18周，小鼠肺脏组织IFN-γ、TNF-α及iNOS的mRNA表达水平均呈差异性(F_(9w-IFN-γ)＝810.1，F_(18w-IFN-γ)＝758.6，F_(9w-TNF-α)＝1462，F_(18w-TNF-α)＝1130，F_(9w-iNOS)＝753.7，F_(18w-iNOS)＝595.5，均P<0.01)。其中，BCG+DR2/DIMQ组表达水平最高，而DIMQ单佐剂组表达水平最低。DR2/DIMQ组小鼠肺脏组织IFN-γ、TNF-α及iNOS的mRNA表达水平显著高于BCG组(t_(9w-IFN-γ)＝11.7，t_(18w-IFN-γ)＝24.79，t_(9w-TNF-α)＝7.496，t_(18w-TNF-α)＝9.627，t_(9w-iNOS)＝3.023，t_(18w-iNOS)＝5.264，均P<0.01)。与免疫后9周相比，DR2/DIMQ组、BCG组及BCG+DR2/DIMQ组小鼠肺脏组织IFN-γ、TNF-α及iNOS的mRNA表达随时间延长均有增加(t_{(DR2/DIMQ-IFN-γ)}＝18.37，t_(BCG-IFN-γ)＝5.174，t_{(BCG+DR2/DIMQ-IFN-γ)}＝6.745，t_{(DR2/DIMQ-TNF-α)}＝19.5，t_(BCG-TNF-α)＝7.399，t_{(BCG+DR2/DIMQ-TNF-α)}＝6.708，t_{(DR2/DIMQ-iNOS)}＝6.267，t_(BCG-iNOS)＝4.531，t_{(BCG+DR2/DIMQ-iNOS)}＝7.951，均P<0.05)。此外，对于反映Th2型体液免疫应答的细胞因子IL-10而言，各组小鼠表达水平始终无显著性差异，且均呈较低水平(F_(9w-IL-10)＝2.154，F_(18w-IL-10)＝2.676，均P>0.05)。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 安徽理工大学

<120> 一种结核分枝杆菌融合蛋白DR2及其应用

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtgctggact ttgctcagtt accgccggag gtcaactccg cgctgatgta cgccggaccc 60

ggttcgggac cgatgctggc tgccgcggcg gcctgggagg cgctggccgc cgagttgcaa 120

accacggcgt ccacctacga cgctctgatc actggcctgg ccgacgggcc atggcagggg 180

tcctccgcgg cgtccatggt ggctgccgcc acgccccagg tggcgtggtt gaggagcacc 240

gccgggcagg ccgagcaagc cggcagccaa gcggtggcag cggcgagtgc ttatgaggcg 300

gcgtttttcg cgaccgtgcc gcccccggag atcgcggcca acagggcgtt gttgatggcg 360

ttgctggcga cgaacttcct tggccagaac acggcggcga tcgcggccac cgaggcgcaa 420

tacgccgaga tgtgggccca ggatgcggcc gcgatgtacg gctatgctgg cgcgtcggcg 480

gcggcgacgc agttgtcgcc attcaatccg gcggcgcaga ccatcaaccc ggccgggctg 540

gccagccagg ccgcatctgt cggacaagct gtcagcgggg ccgcaaatgc gcaagcactc 600

accgacattc ctaaagcgtt gtttgggctt agcggaatct tcaccaatga accgccttgg 660

ctcaccgacc ttggcaaggc gctcggtttg accgggcaca cctggtcctc ggacggtagc 720

gggctcatcg tgggcggagt gcttggcgac tttgtgcagg gtgtgaccgg gtcggccgaa 780

cttgatgcca gcgtggccat ggacacgttc ggcaaatggg tctcgcccgc tcggctcatg 840

gtcacccaat tcaaggacta ctttggcctg gcgcacgacc tgccgaagtg ggcgagtgaa 900

ggcgccaaag ccgccggtga ggccgccaag gcgttgccgg ccgccgttcc ggccattccg 960

agtgctggcc tgagcggcgt tgcgggcgcc gtcggtcagg cggcgtcggt cgggggattg 1020

aaggttccgg ccgtttggac cgccacgacc ccggcggcga gccccgcggt gctggcggcg 1080

tccaacggcc tcggagccgc ggccgccgct gaaggttcga cacacgcgtt tggcgggatg 1140

ccgctcatgg gtagcggtgc cggacgtgcg tttaacaact tcgctgcccc tcgatacgga 1200

ttcaagccga ccgtgatcgc ccaaccgccg gctggcggag gtgagcacgc catcaagcgg 1260

cacatgcggc aacggaagcc tacgaagcat cccctagccc agaaacgggg cgcgcggatt 1320

ctggtcttca ccgacgatcc ccgcaggagc gtcctcatag tgcccggttg ccacctggat 1380

tccatgcgcc gagaaaagaa cgcgtactac ttccaggacg gcaatgcgtt ggttgggatg 1440

gttgtctcgg gcggcacggt tgagtacgac gccgacgacc gcacatatgt cgtgcagctc 1500

accgacggaa ggcacaccac tgagtcatct ttcgaacact catcgccgag tcgatcacct 1560

caatccgatg acctataa 1578

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttcggatccc tggactttgc tcagttaccg ccg 33

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atctcgagtc cgccagccgg cggttggg 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcggatccg gtgagcacgc catcaagcg 29

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atctcgagta ggtcatcgga ttgaggtgat cga 33

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttcaagcttc tggactttgc tcagttaccg 30

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atctcgagta ggtcatcgga ttgaggtg 28

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agtggcatag atgtggaa 18

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctgatggcct gattgtc 17

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggcggtgcct atgtctc 17

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tccacttggt ggtttgtga 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggttgccaag ccttatcgga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acctgctcca ctgccttgct 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gagcgagttg tggattgtc 19

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agggcttggc tgagtga 17

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gaccaggttg tctcctgcga cttc 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggtgggtggt ccagggtttc ttac 24

Claims

1.一种结核分枝杆菌融合蛋白DR2，其特征在于，由SEQ ID NO.1所示基因编码。

2.一种疫苗，其特征在于，其包含权利要求1所述的融合蛋白DR2。

3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，还包括佐剂二甲基三十六烷基溴化铵和咪喹莫特。

4.权利要求1所述融合蛋白DR2或权利要求2所述疫苗在制备预防结核病的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物用于增强卡介苗的免疫效果。

6.一种预防结核病的药物组合，其特征在于，包括卡介苗和权利要求3所述疫苗。

7.根据权利要求6所述的药物组合，其特征在于，所述卡介苗作初次免疫，权利要求3所述疫苗作增强免疫。