CN113981020A - 一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法，在反应瓶中加入有机溶剂、纯化水、缓冲盐和底物I，化合物II，控制在合适的温度，调节PH至合适范围后，加入酶，保温反应12小时即得到相应的中间体III，中间体III经水解得到产物IV。本发明收率和纯度均优于手性化学试剂制备工艺。本发明通过采用绿色环保的酶法工艺进行底物I的还原，避免了手性化学试剂制备工艺选择性低，使用危险，费用较高以及环保处理困难等问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶催化手性还原合成药物中间体的方法，具体涉及一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法。
背景技术
盐酸洛贝林，英文名称为Lobeline hydrochloride，化学名称为2-[6-(2-羟基-2-苯乙基)-1-甲基-2-哌啶基]-1-苯乙酮盐酸盐，结构式如下所示。
盐酸洛贝林为反射性呼吸中枢兴奋药。由于刺激颈动脉体及主动脉弓化学感受器，反射性地兴奋延髓呼吸中枢，对迷走神经中枢和血管运动中枢也同时有反射性的兴奋作用；对植物神经节先兴奋而后阻断。用于各种原因引起的呼吸抑制。常用于新生儿窒息，一氧化碳、阿片中毒等。
洛贝林的合成方法有很多，总体来看分为两类：一类是逐步合成手性中心，这一类方法一般都存在路线长、收率低的缺点，很难应用于工业化生产。其中典型路线如下(J.Org.Chem:67(2002)9192-9199)。
另一类是先合成对称的中间体山梗烷酮(即底物I)，然后采用不对称合成的方法获得最终产物。
山梗烷酮(即底物I)的合成方法简单，原料也易得。反应式如下：
后续不对称合成方法也有不少，英国的Vladimir等人采用(S)-BTM非酶的不对称酰化、然后氧化、脱酰基进行不对称合成洛贝林。(Organic Letter:9(2007)3237 3240)。
Franz-Dietrich等人运用金属铑络合物催化加氢反应，同时应用大分子的磷配体，可一步合成目标产物，但该步骤需要1520bar的高压条件，且收率低，很难用于工业化生产(US20060014791)。
发明内容
本发明的目的是克服现有盐酸洛贝林合成工艺路线长、收率低、手性试剂选择性低、价格昂贵等问题，提供一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法，该方法用酶来进行还原，条件温和，方法简单，极大的降低了成本。
本发明的技术方案如下：
一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法，包括以下步骤：
1)、在反应瓶中加入有机溶剂和底物I，化合物II，控制反应温度在-30℃～20℃，向反应瓶中加入预处理好的固定化酶，反应开始，保温至反应结束；
2)、反应完成后，过滤，滤液降温至0℃，在向反应瓶中加5％盐酸调节PH至1～2，搅拌0.5小时后升温至室温，搅拌至水解反应结束；
3)、反应完成后，分出有水层，氢氧化钠溶液调节pH至12～13，室温搅拌1小时，加有机溶剂萃取，有机相浓缩后加异丙醇搅拌，析出晶体，过滤，烘干得产物IV。
步骤1)中固定化酶为海藻酸钙固定化面包酵母。
步骤1)中所述反应温度在-20℃至10℃，优选控制反应温度在-20℃～0℃，进一步优选地控制反应温度在-10～-5℃。
步骤1)中酶与底物的质量比在10:1至1:1之间。
步骤1)所述的有机溶剂选自下列一种：二氯甲烷、正己烷、正庚烷、乙酸乙酯、二氧六环、甲苯中的任意一种。
步骤1)化合物II为(包括但不限于)(3S,4R)-3,4-二(二苯基膦)吡咯-1-羰酰氯，(2S,4S)-4-(二苯基膦基)-2-((二苯基膦基)甲基)-吡咯-1-羰酰氯。
步骤1)反应时间在12～72小时。
本发明化学反应方程式如下所示：
本发明的创新点不仅仅是酶催化反应，实际上单独用酶催化反应只能得到少量的目标产物，而大部分产物是过度还原产物，结构如下：
本发明主要是利用酶一次只能手性还原一个位点的特点，在低温下控制还原的速度，当酶还原中间体被释放出来后，则与化合物II结合形成中间体III的结构。而在此结构下，中间体III则不会与酶结合生产过度还原的产物。后续则只需将中间体III进行水解反应即可得到目标产物。
有益效果：
本发明用酶来进行还原，条件温和，手性选择性好，方法简单，极大的降低了成本。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，以下将通过具体的实例进行详细的阐述，应该说明的是，以下实例并非是对本发明范围的限制，显然，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围。
(3S,4R)-3,4-二(二苯基膦)吡咯-1-羰酰氯
直接外购试剂(3S,4R)-3,4-二(二苯基膦)吡咯烷，然后酰氯化反应制备得到。
(2S,4S)-4-(二苯基膦基)-2-((二苯基膦基)甲基)-吡咯-1-羰酰氯
直接外购试剂(2S,4S)-4-二苯基膦-2-(二苯基膦甲基)-吡咯烷，然后酰氯化反应制备得到。
上述两种吡咯烷制备成酰氯的制备方法：
氮气保护下，干燥的250ml反应瓶中加入100ml二氯甲烷，碳酸氢钠(25.2g，0.3mol)，三光气(29.7g，0.1mol)，搅拌降温至10℃，缓慢滴加吡咯烷(0.15mol)的二氯甲烷溶液。滴加过程控温10℃以下。滴加结束，缓慢升温至25℃，保温20小时。氮气压滤，滤液减压蒸馏至无液体，旋干浓缩液加甲苯重结晶即得目标产物。
底物I山梗烷酮可以直接采购，也可以根据如下反应式自行制备：
面包酵母(日本东方酵母工业株式会社采购)，回来培养后，活体用海藻酸钙固定化后，放冰箱保存待用，具体方法如下：
配制培养基：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，乳酸30g/L，甘油30g/L，调节PH至5.0，灭菌后待用。
培养酵母：1000ml的锥形瓶中加入配制好的培养基200ml，酵母0.12g，置于30℃，180rpm摇床中进行增殖培养24小时。培养结束后，离心，0.9％生理盐水洗涤三次，最后收集固体即为培养好的酵母细胞。
酵母细胞的固定化：250ml锥形瓶中加入25ml的Tris-HCl缓冲溶液，3g培养好的酵母细胞，搅拌半小时，再向锥形瓶中加入75ml溶有2％海藻酸钠的Tris-HCl缓冲溶液，搅拌半小时。将上述混悬液缓慢滴加到缓慢搅拌的0.1mol/L的氯化钙溶液中。滴加完毕，保持缓慢搅拌2小时，过程中渐有固体颗粒析出。过滤，得到固体颗粒重新加入0.1mol/L的氯化钙溶液中，静置半小时。过滤，得到固体颗粒即为固定化的酵母细胞。冷藏待用。
实施例1
中间体III的合成
在500ml反应瓶中加入甲苯100g、正丁醇5g、底物I 20.0g，加完控制反应温度在-10～-5℃，待温度稳定后，缓慢向反应瓶中加入(2S,4S)-4-(二苯基膦基)-2-((二苯基膦基)甲基)-吡咯-1-羰酰氯32.3g，然后向反应瓶中加入预处理好的固定化酶40.0g，反应即开始，保温-10～-5℃，反应约48小时后，中控确认反应完成(取样HPLC或点板监控)。反应完成后，过滤掉酶，滤液即为中间体III的甲苯溶液。
产物IV的合成
将上步反应的滤液加入反应瓶中，温度至0℃，再向反应瓶中加5％盐酸调节PH至1～2，搅拌0.5小时后升温至25℃，继续搅拌2小时，中控确认水解反应完成。分出水层，有机层加水150g分三次萃取，合并有水层。将水层倒回反应瓶中，室温滴加氢氧化钠溶液调节pH至12～13，待pH稳定后继续搅拌1小时，加二氯甲烷200g萃取分相，水相继续加300g二氯甲烷分三次萃取，合并二氯甲烷相浓缩，后加异丙醇100g室温搅拌1小时，析出晶体，过滤，烘干的产物IV。产物IV与该反应手性异构体比例为99.5:0.5，收率80.6％。
酶和化合物II，均可回收活化后重复利用，从而降低成本。
酶的回收：过滤出来的固定化酶加二氯甲烷漂洗两次，少量0.9％生理盐水漂洗两次后，冷藏保存，即可待下次重复利用。
化合物II的回收：回收方法同制备方法。
实施例2
其他条件与实施例1一致，化合物II换成(3S,4R)-3,4-二(二苯基膦)吡咯-1-羰酰氯，产物IV与该反应手性异构体比例为99.5:0.5，收率52.5％。
实施例3(没有化合物II参与的酶催化反应)
在500ml反应瓶中加入甲苯100g、正丁醇5g、底物I 20.0g、预处理好的固定化酶40.0g，30℃保温12小时，中控确认反应完成(取样HPLC或点板监控)。反应完成后，过滤掉酶，滤液浓缩，浓缩液过柱分离，去除溶剂，烘干的产物IV。产物IV与该反应手性异构体比例为92.3:7.7，收率16.5％。
实施例4
中间体III的合成
在500ml反应瓶中加入甲苯100g、正丁醇5g、预处理好的固定化酶40.0g，加完控制反应温度在-10～-5℃，待温度稳定后，缓慢向反应瓶中加入底物I 20.0g，然后再缓慢向反应瓶中加入(2S,4S)-4-(二苯基膦基)-2-((二苯基膦基)甲基)-吡咯-1-羰酰氯32.3g，保温-10～-5℃，反应约48小时后，中控确认反应完成(取样HPLC或点板监控)。反应完成后，过滤掉酶，滤液即为中间体III的甲苯溶液。
产物IV的合成
将上步反应的滤液加入反应瓶中，温度至0℃，再向反应瓶中加5％盐酸调节PH至1～2，搅拌0.5小时后升温至25℃，继续搅拌2小时，中控确认水解反应完成。分出水层，有机层加水150g分三次萃取，合并有水层。将水层倒回反应瓶中，室温滴加氢氧化钠溶液调节pH至12～13，待pH稳定后继续搅拌1小时，加二氯甲烷200g萃取分相，水相继续加300g二氯甲烷分三次萃取，合并二氯甲烷相浓缩，后加异丙醇100g室温搅拌1小时，析出晶体，过滤，烘干的产物IV。产物IV与该反应手性异构体比例为99.2:0.8，收率68.3％。
实施例5
中间体III的合成
在500ml反应瓶中加入甲苯100g、正丁醇5g、底物I 20.0g，加完控制反应温度在0～10℃，待温度稳定后，缓慢向反应瓶中加入(2S,4S)-4-(二苯基膦基)-2-((二苯基膦基)甲基)-吡咯-1-羰酰氯32.3g，然后向反应瓶中加入预处理好的固定化酶40.0g，反应即开始，保温0～10℃，反应约22小时后，中控确认反应完成(取样HPLC或点板监控)。反应完成后，过滤掉酶，滤液即为中间体III的甲苯溶液。
产物IV的合成
将上步反应的滤液加入反应瓶中，温度至0℃，再向反应瓶中加5％盐酸调节PH至1～2，搅拌0.5小时后升温至25℃，继续搅拌2小时，中控确认水解反应完成。分出水层，有机层加水150g分三次萃取，合并有水层。将水层倒回反应瓶中，室温滴加氢氧化钠溶液调节pH至12～13，待pH稳定后继续搅拌1小时，加二氯甲烷200g萃取分相，水相继续加300g二氯甲烷分三次萃取，合并二氯甲烷相浓缩，浓缩液过柱分离，去除溶剂后，固体加异丙醇重结晶，过滤，烘干的产物IV。产物IV与该反应手性异构体比例为96.7:3.3，收率43.6％。
Claims (9)
1.一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在反应瓶中加入有机溶剂和底物I，化合物II，控制一定温度，向反应瓶中加入预处理好的固定化酶，反应开始，保温至反应结束；
2)反应完成后，过滤，滤液加盐酸调节pH至1～2，搅拌升温至室温，搅拌至水解反应完成；
3)反应完成后，分出有水层，氢氧化钠溶液调节pH至12～13，室温搅拌1小时，加有机溶剂萃取，有机相浓缩后加异丙醇搅拌，析出晶体，过滤，烘干得产物IV；
反应方程式如下：
2.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法，其特征在于：步骤1)中固定化酶为海藻酸钙固定化面包酵母。
3.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法，其特征在于：步骤1)中酶与底物I的质量比在10:1至1:1之间。
4.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法，其特征在于：步骤1)中所述有机溶剂为二氯甲烷、正己烷、正庚烷、乙酸乙酯、二氧六环、甲苯中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法，其特征在于：步骤1)化合物II为(3S,4R)-3,4-二(二苯基膦)吡咯-1-羰酰氯或者(2S,4S)-4-(二苯基膦基)-2-((二苯基膦基)甲基)-吡咯-1-羰酰氯。
6.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法，其特征在于：步骤1)中化合物II与底物I的摩尔比在5:1至1:1之间。
7.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法，其特征在于：步骤1)中保温反应温度为-30℃～20℃。
8.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法，其特征在于：步骤1)中保温反应时间为12～72小时。
9.根据权利要求7所述的一种酶催化手性还原合成盐酸洛贝林中间体的方法，其特征在于：步骤1)中保温反应温度为--20℃～0℃。
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