CN109097410A - 一种酶催化手性还原合成依折麦布中间体的方法 - Google Patents

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杨多
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Abstract

本发明公开了一种利用酶催化手性合成依折麦布中间体的方法，在反应瓶中加入有机溶剂、纯化水、缓冲盐和底物，控制在合适的温度，调节PH至合适范围后，加入酶，保温反应12小时即得到相应的产物

Description

一种酶催化手性还原合成依折麦布中间体的方法
技术领域
本发明涉及一种酶催化手性还原合成药物中间体的方法，具体涉及一种酶催化手性还原合成依折麦布中间体的方法。
背景技术
依折麦布，英文名称为Ezetimibe，化学名称为1-(4-氟苯基)-(3R)-[3-(4-氟苯基)-(3S)-羟基丙基]-(4S)-(4-羟基苯基)-2-丙内酰胺，结构式如下所示。
Ezetimibe是由默克(Merck)公司和先灵葆雅(Schering-Plough)公司共同研制，于2002年10月被美国食品和药品管理局FDA批准，2002年11月在德国首次上市，同期在美国、英国、瑞典等地上市，商品名为益适纯(Ezetrlo/Zetia)，是第一个被批准上市的选择性抑制胆固醇吸收的药物。现已经通过我国国家食品药品监督管理局批准，2007年在中国上市。Ezetimibe被用于降低人体胆固醇的含量，对治疗原发性高胆固醇血症，家族性纯合子高胆固醇血症(HoFH)，纯合子谷甾醇血症(或植物甾醇血症)，混合性高脂血症和冠心病都有一定作用。
Ezetimibe作为新型胆固醇吸收抑制剂，既可单独给药也可以与他汀类等调脂药联用。血浆胆固醇的来源主要有两条途径，一是肝脏和外周组织合成的胆固醇，二是由肠道吸收膳食和胆汁中的胆固醇。和他汀类药物联用可以同时抑制两种胆固醇的来源，从而进一步降低血浆胆固醇水平。因此Ezetimibe和低剂量他汀联合治疗可达到高剂量他汀的效果，因此，对他汀类药物效果不佳或耐受性不好的患者是可以选择联合治疗。该药物具有广阔的市场前景。
依折麦布合成路线较多，在现有及文献描述的合成工艺方面，主要有两条工艺路线。一是原研厂家先灵葆雅的专利WO20034240中公布了一种手性合成方法，使用CBS还原得到的(S)-3-羟基化合物作为原料，在羰基的α-位接支链的同时上羟基三甲基硅基，然后成环、去除保护剂得到依折麦布。
其合成工艺路线如下：
二是全球最大的非专利药制药公司以色列梯瓦制药工业有限公司(TevaPharmaceutical Industries Limited，NASDAQ:TEVA)的合成路线。
其合成工艺路线如下：
这两条路线各有优势，并均已工业化生产。
TEVA工艺中，还原步骤采用手性还原试剂进行还原反应，其收率达到90％左右，手性选择性也较高(ee值在95％至98％)，但反应过程条件较苛刻。反应过程中用到还原试剂，需严格控制水分。同时反应过程中还原试剂硼烷二甲硫醚和手性试剂(R)-2-甲基-CBS-恶唑硼烷在溶剂中先结合成为手性还原试剂再进一步还原底物I生成产物II，反应温度过低则使得手性还原试剂活性太低，硼烷会直接还原底物I，使得手性杂质过多；而反应温度过高则使得过度还原杂质变多。综上，现有工艺中该步反应对水分和温度要求均比较苛刻，增加了工业生产的难度。
发明内容
本发明的目的是克服现有依折麦布中间体II合成工艺中手性试剂选择性低、价格昂贵等问题，提供一种酶催化手性还原合成依折麦布中间体的方法，该方法用酶来进行还原，对水分和温度要求简单，不需要使用手性还原试剂，同时使用溶剂的量也减少，极大的降低了成本。
本发明的技术方案如下：
一种酶催化手性还原合成依折麦布中间体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)、在反应瓶中加入有机溶剂、纯化水、缓冲盐和底物I，加完保温控制反应温度在合适的温度，加4N的氢氧化钠溶液调节PH至7.0，向反应瓶中加入酶，反应即开始，保温至反应结束；
2)、反应完成后，降温至0℃，在向反应瓶中加5％盐酸调节PH至1～2，搅拌0.5小时后升温至室温，分出有机层，水层加有机溶剂萃取后，合并有机层，浓缩后加异丙醇升温至溶清，后降温至室温，在向体系中滴加纯化水，析出晶体，过滤，烘干的产物II。
其中步骤(1)所述的酶购买于上海尚科生物医药有限公司，经实验筛选，以下一种或几种的混合，具有良好的反应效果：KRED-101，KRED-112，KRED-113，KRED-131，KRED-238；优选酶为KRED-101、KRED-113、KRED-238按6:3:1混合得到的混合酶。
虽然同一类型的酶(比如酮还原酶)都是用于一个类型反应(比如酮还原成醇)，但同一类型酶中不同的酶在立体结构上还是有一定的差异，这些差异导致不同的底物接近酶的反应活性中心的难易程度不同。一般情况下，底物的分子结构约复杂，越难以靠近酶的活性中心，寻找合适的酶来进行反应就越困难。
步骤1)中酶与底物的质量比在0.01:1至0.1:1之间；
步骤1)中加入有机溶剂、纯化水、底物I的质量比为：5:5:1；
步骤1)所述的有机溶剂选自下列一种：二氯甲烷、二甲基亚砜、乙酸乙酯、二氧六环、甲苯；
本反应是两相反应，原料在有机相中，酶在水相。有机溶剂选用原料相容性较好的溶剂。
步骤1)所述反应温度在15℃至50℃，反应时间在6～36小时。
步骤1)中所述缓冲盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾按一定比例的混合物。
本发明化学反应方程式如下所示：
有益效果：
本发明通过在有机溶剂和水两相体系中，控制反应条件，筛选不同的还原酶对反应的选择性，最终筛选出KRED-101，KRED-112，KRED-113，KRED-131，KRED-238这五种还原酶单独或者以一定比例混合后催化反应，能够得到产物II，且收率和纯度均优于手性化学试剂制备工艺。本发明通过采用绿色环保的酶法工艺进行底物I的还原，避免了手性化学试剂制备工艺选择性低，使用危险，费用较高以及环保处理困难等问题。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，以下将通过具体的实例进行详细的阐述，应该说明的是，以下实例并非是对本发明范围的限制，显然，本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围。
实施例1
在500ml反应瓶中加入二氯甲烷100g、纯化水100g、三水合磷酸氢二钾1.40g、磷酸二氢钾0.52g和底物I 20g，加完控制反应温度在25～30℃，待温度稳定后，加4N的氢氧化钠溶液调节PH至7.0，向反应瓶中加入酶KRED-101 0.5g，反应即开始，保温反应约12小时后，中控确认反应完成。反应完成后，降温至0℃，在向反应瓶中加5％盐酸调节PH至1～2，搅拌0.5小时后升温至室温，分出有机层，水层加二氯甲烷150g分三次萃取，合并有机层，浓缩后加异丙醇100g升温至溶清，后降温至室温，在向体系中滴加纯化水40g，析出晶体，过滤，烘干的产物II。产物II与该反应手性异构体比例为90:10，收率80.3％。采用酶法制备，与手性试剂相比成本大大降低，同时溶剂用量也减少了。
实施例2
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-113，产物II与该反应手性异构体比例为85:15，收率72.5％。
实施例3
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-238，产物II与该反应手性异构体比例为98:2，收率89.4％。
实施例4
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-101、KRED-113、KRED-238混合物(比例6:3:1)，产物II与该反应手性异构体比例为99.5:0.5，收率93.5％。
实施例5
其他条件与实施例1一致，所用溶剂为甲苯，产物II与该反应手性异构体比例为90:10，收率78.8％。
实施例6
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-121，基本无产物生成，收率0。
实施例7
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-176，基本无产物生成，收率0。
实施例8
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-131，产物II与该反应手性异构体比例为94:6，收率67.5％。
实施例9
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-132，产物II与该反应手性异构体比例为92:8，收率32.5％。
实施例10
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-128，产物II与该反应手性异构体比例为92:8，收率18.3％。
实施例11
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-156，产物II与该反应手性异构体比例为50:50，收率30.6％。
实施例12
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-157，产物II与该反应手性异构体比例为49:51，收率36.3％。
实施例13
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-142，产物II与该反应手性异构体比例为28:72，收率12.3％。
实施例14
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-101、KRED-113混合物(比例2:1)，产物II与该反应手性异构体比例为91:9，收率86.7％。
实施例15
其他条件与实施例1一致，还原酶换成KRED-113、KRED-238混合物(比例3:1)，产物II与该反应手性异构体比例为99:1，收率88.3％。
由以上实施例可知，虽然是同一系列的酮还原酶，但针对于该反应的原料，很多酶不具备反应活性，如KRED-121、KRED-176等(实际上大部分酶是不具备反应活性的)。而有一些酶虽然手性选择性较好，但反应活性偏低，导致整体收率也不高，如KRED-132、KRED-128(KRED-131收率也不够高，虽然超过50％)。还有一些酶具有一定的反应活性，但不具备手性选择性(如KRED-156、KRED-157，产物基本是混旋的)，或者主要产物是手性异构体(如KRED-142)。所以，我们先是做了大量的筛选工作，找出针对于该反应的原料具有较好的反应性能的酶，然后再将筛选出了几种酶，进行一定比例的混合进行反应(实施例14，实施例15)，从而最终筛选出了较优的几种酶和酶的混合的反应条件。

Claims (7)

1.一种酶催化手性还原合成依折麦布中间体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在反应瓶中加入有机溶剂、纯化水、缓冲盐和底物I，控制反应温度在15℃～50℃，调节溶液pH至7.0，向反应瓶中加入酶，反应开始，保温至反应结束；所述的酶为以下一种或几种的混合：KRED-101，KRED-112，KRED-113，KRED-131，KRED-238；
2)反应完成后，降温至0℃，调节pH至1～2，搅拌升温至室温，分出有机层，水层加有机溶剂萃取后，合并有机层，浓缩后加异丙醇升温至溶清，后降温至室温，在向体系中滴加纯化水，析出晶体，过滤，烘干得产物II；
所述底物I为：
产物II为：
2.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成依折麦布中间体的方法，其特征在于：步骤1)中酶为KRED-101、KRED-113、KRED-238按6:3:1混合得到的混合酶。
3.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成依折麦布中间体的方法，其特征在于：步骤1)中酶与底物I的质量比在0.01:1至0.1:1之间。
4.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成依折麦布中间体的方法，其特征在于：步骤1)中有机溶剂、纯化水、底物I的质量比为：5:5:1。
5.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成依折麦布中间体的方法，其特征在于：步骤1)中所述有机溶剂为二氯甲烷、二甲基亚砜、乙酸乙酯、二氧六环、甲苯中的任意一种。
6.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成依折麦布中间体的方法，其特征在于：步骤1)中所述缓冲盐为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾按一定比例的混合物。
7.根据权利要求1所述的一种酶催化手性还原合成依折麦布中间体的方法，其特征在于：步骤1)中保温反应时间为6～36小时。
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