CN103946218B - 抑制脯氨酸羟化酶活性的化合物的稳定晶型及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及结构式I所示化合物的晶型、其制备方法包括中间体的制备、其药物组合物，以及上述晶型在治疗疾病、病症或病状的应用，或在制备治疗疾病、病症或病状的药物制剂中的用途。

Description

抑制脯氨酸羟化酶活性的化合物的稳定晶型及其应用

技术领域

本发明涉及一种新化合物的多种晶型，以及它们在抑制脯氨酸羟化酶(prolylhydroxylase)的活性中的应用。本发明也涉及应用上述至少一种晶型来调节体内HIF水平或活性，或治疗与体内HIF水平或活性提高或减低有关的疾病、病症或病状的方法。

背景技术

细胞转录因子HIF(HypoxiaInducibleFactor，缺氧诱导因子)在很多生物体内对氧的动态平衡起着中心的作用，同时也是对缺氧响应的一个关键的调控因子。HIF的转录活性所调控的基因在血管生成、红细胞生成、血红蛋白F生成、能量代谢、炎症、血管舒缩功能调控、细胞凋亡和细胞增殖中都有着举足轻重的作用。HIF在癌症(一般在癌细胞中表达升高)以及在缺血和缺氧的生理响应中也起作用。

HIF转录复合体包括αβ异二聚体(HIFαβ)：HIF-β是一个与氧调控的HIF-α亚基形成二聚体的基本的核蛋白。氧调控通过对HIF-α亚基的羟基化发生，其随后迅速被蛋白酶体破坏。在有充足氧的细胞中，pVHL蛋白(vonHippel-Lindautumorsuppressorprotein)与羟基化的HIF-亚基结合以促进其泛素(ubiquitin)依赖的蛋白分解。这个过程在缺氧条件下会被抑制，HIF-α变得更稳定，并促进HIFαβ二聚体的转录和活化。

HIF-α亚基的羟基化可以发生在脯氨酸和天冬氨酸残基上，并可以由一系列2-酮戊二酸依赖的酶来催化。这一系列酶包括羟基化人HIFl的Pro402和Pro564的HIF脯氨酸羟化酶(HIFprolylhydroxylaseisozymes，PHDs)，以及羟基化人HIFl的Asn803的HIF抑制因子(FactorInhibitingHIF，FIH)。对PHDs或FIH的抑制会增加HIF的稳定性并更有利于其转录和活化。

对PHDs的抑制也会促进HIF的稳定和HIF复合体的转录活化，这可以反过来为治疗缺血和贫血症状提供了一种可能。已有多篇专利申请保护了潜在PHDs抑制剂的化学结构式设计，参见WO2004108681、WO2007070359和WO2011006355。

发明内容

本发明涉及多种基本上纯的晶型，这些晶型为如下结构式I所示化合物多种晶型，

本发明所述结构式I的化合物可以以一种或一种以上的晶型存在。

本发明提供了结构式I所示化合物，即N-[(4-羟基-2-氧代-8(3-甲基苯)-2H-3-色烯基)羰基]甘氨酸的晶型。

本发明提供了一种优选晶型-晶型I，其X射线粉末衍射谱图具有衍射角2θ为7.1°、12.4°和20.2°的特征峰。

本发明进一步提供了晶型I的优选实施方式。

作为优选，上述晶型I中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为和

作为优选，其X射线粉末衍射谱图具有衍射角2θ为7.1°、10.4°、12.4°、17.0°和20.2°的特征峰。

作为优选，上述晶型I中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为和

作为优选，其X射线粉末衍射谱图具有衍射角2θ为7.1°、8.4°、10.4°、12.4°、13.3°、17.0°、20.2°和27.6°的特征峰。

作为优选，上述晶型I中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为 及

作为优选，上述晶型I具有基本如图1所示的X-射线粉末衍射图。

表A总结了图1所示的X-射线粉末衍射图。

表A：

作为优选，该晶型I熔点为190～193℃。

作为优选，该晶型I纯度≥85％。

作为优选，该晶型I纯度≥95％。

作为优选，该晶型I纯度≥99％。

本发明还提供了晶型I的制备方法，包括如下的步骤：

室温下将结构式I所示化合物先溶解于溶剂中，再挥发、沉淀即得最终的晶型，其中，所述溶剂选自丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、或者丙酮／甲醇、丙酮／庚烷、丙酮／异丙醇、丙酮／乙酸异丙酯、四氢呋喃／甲醇、四氢呋喃／乙酸乙酯、四氢呋喃／庚烷、四氢呋喃／乙腈、四氢呋喃／异丙醇、四氢呋喃／甲基叔丁基醚或四氢呋喃／二氯甲烷的混合溶剂；

或者，将过量的结构式I所示化合物在二氯甲烷或者水／丙酮或水／四氢呋喃的混合溶剂中，室温下悬浮搅拌48小时以上，或在庚烷、甲醇或水／四氢呋喃的混合溶剂中，50℃下悬浮搅拌48小时以上，即得最终的晶型。

本发明提供了一种优选晶型-晶型II，其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为6.5°、11.2°和18.4°的特征峰。

本发明进一步提供了晶型II的优选实施方式。

作为优选，上述晶型II中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为和

作为优选，其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为6.5°、9.3°、11.2°、15.4°和18.4°的特征峰。

作为优选，上述晶型II中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为和

作为优选，其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为6.5°、9.3°、11.2°、13.0°、14.1°、15.4°、18.4°和24.6°的特征峰。

作为优选，上述晶型II中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为 和

作为优选，上述晶型II具有基本如图2所示的X-射线粉末衍射图。

表B总结了图2所示的X-射线粉末衍射图。

表B：

作为优选，该晶型II熔点为129～132℃。

作为优选，该晶型II纯度≥85％。

作为优选，该晶型II纯度≥95％。

作为优选，该晶型II纯度≥99％。

本发明还提供了上述晶型II的制备方法，包括如下的步骤：结构式I所示化合物先溶解于溶剂中，再挥发、沉淀，即得最终的晶型，其中所述溶剂选自二甲基甲酰胺或四氢呋喃／二甲基甲酰胺的混合溶剂。

本发明进一步提供了结构式I所示化合物的一种优选晶型-晶型III，其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为12.3°、16.6°和25.4°的特征峰。

本发明进一步提供了晶型III的优选实施方式。

作为优选，上述晶型III中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为和

作为优选，其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为12.3°、16.6°、21.8°、25.4°和29.2°的特征峰。

作为优选，上述晶型III中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为和

作为优选，其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为12.3°、13.0°、16.6°、18.6°、21.8°、25.4°、26.9°和29.2°的特征峰；

作为优选，上述晶型III中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为 和

作为优选，上述晶型III具有基本如图3所示的X-射线粉末衍射图。

表C总结了图3所示的X-射线粉末衍射图。

表C：

作为优选，该晶型III熔点为196～199℃。

作为优选，该晶型III纯度≥85％。

作为优选，该晶型III纯度≥95％。

作为优选，该晶型III纯度≥99％。

本发明还提供了上述晶型III的制备方法，包括如下的步骤：

结构式I所示化合物先溶解于乙酸异丙酯，再挥发、沉淀，即得最终的晶型；

或者，过量的结构式I所示化合物，在溶剂中悬浮搅拌48小时以上，即得最终的晶型，所述溶剂选自甲基叔丁基醚(MTBE)、乙酸异丙酯或乙酸乙酯，其中所述悬浮搅拌的温度优选20～50℃；

或者，过量的结构式I所示化合物在丙酮／水的混合溶剂中，室温下悬浮搅拌48小时以上，或者，在乙酸乙酯／四氢呋喃的混合溶剂中，50℃下悬浮搅拌48小时以上，即得最终的晶型，其中，乙酸乙酯／四氢呋喃的体积比为3∶1，丙酮／水的体积比为1∶1；

或者，结构式I所示化合物在惰性气体保护下加热到195℃，再冷却到室温，即得最终的晶型；

或者，结构式I所示化合物先溶解于溶剂中，加入晶型III作为晶种，再挥发、沉淀，即得最终的晶型，其中所述溶剂，包括但不限于，甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯或乙酸乙酯；

或者，结构式I所示化合物先溶解于混合溶剂中，加入晶型III作为晶种，再挥发、沉淀，即得最终的晶型，其中所述混合溶剂，包括但不限于，含有乙酸乙酯的混合溶剂、含有四氢呋喃的混合溶剂、含有丙酮的混合溶剂或含有水的混合溶剂，所述混合溶剂优选乙酸乙酯／四氢呋喃或丙酮／水的混合溶剂；

或者，结构式I所示化合物先加热溶解于溶剂中以形成溶液，然后冷却同时加入晶型III作为晶种，即得最终的晶型，其中所述溶剂，包括但不限于，异丙醇(IPA)、4-甲基-2-戊酮、乙酸丙酯、甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯或乙酸乙酯；

或者，结构式I所示化合物先加热溶解于混合溶剂中以形成溶液，再加入晶型III作为晶种，冷却、结晶，即得最终的晶型，其中所述混合溶剂，包括但不限于，含有乙酸乙酯的混合溶剂、含有四氢呋喃的混合溶剂、含有丙酮的混合溶剂或含有水的混合溶剂，所述混合溶剂优选异丙醇／水混合溶剂、乙酸乙酯／四氢呋喃混合溶剂、乙酸异丙酯／四氢呋喃混合溶剂、甲基叔丁基醚／四氢呋喃混合溶剂或丙酮／水混合溶剂。

本发明进一步提供了结构式I所示化合物的一种优选晶型-晶型IV，其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为12.5°、17.0°和22.3°的特征峰。

本发明进一步提供了晶型IV的优选实施方式。

作为优选，上述晶型IV中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为和

作为优选，其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为8.4°、12.5°、17.0°、18.1°和22.3°的特征峰。

作为优选，上述晶型IV中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为 和

作为优选，其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为8.4°、9.0°、11.3°、12.5°、17.0°、18.1°、22.3°和28.2°的特征峰。

作为优选，上述晶型IV中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为 和

作为优选，上述晶型IV具有基本如图4所示的X-射线粉末衍射图。

表D总结了图4所示的X-射线粉末衍射图。

表D：

作为优选，该晶型IV熔点为189～193℃。

作为优选，该晶型IV纯度≥85％。

作为优选，该晶型IV纯度≥95％。

作为优选，该晶型IV纯度≥99％。

本发明还提供了晶型IV的制备方法，包括如下的步骤：

晶型I加热到50℃，再冷却到室温，即得最终的晶型；

或者，结构式I所示化合物先溶解于四氢呋喃中，再挥发、沉淀，即得最终的晶型。

本发明提供了一种优选晶型-晶型V，其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为12.3°、21.8°和27.6°的特征峰。

本发明进一步提供了晶型V的优选实施方式。

作为优选，上述晶型V中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为和

作为优选，其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为12.3°、16.8°、17.9°、21.8°和27.6°的特征峰。

作为优选，上述晶型V中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为和

作为优选，其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为11.1°、12.3°、16.8°、17.9°、21.2°、21.8°、23.0°和27.6°的特征峰。

作为优选，上述晶型V中，衍射角2θ对应的晶面间距分别为 和

作为优选，上述晶型V具有基本如图5所示的X-射线粉末衍射图。

表E总结了图5所示的X-射线粉末衍射图。

表E：

作为优选，该晶型V熔点为192～195℃。

作为优选，该晶型V纯度≥85％。

作为优选，该晶型V纯度≥95％。

作为优选，该晶型V纯度≥99％。

本发明还提供了晶型V的制备方法，包括如下步骤：在惰性气体保护下加热晶型IV到175℃，即得最终的晶型。

本发明还提供了结构式I所示化合物的制备方法，包括如下的步骤：

化合物2的合成：

化合物1溶于乙酸中，搅拌，升温至75-85℃，缓慢滴加液溴，滴加完毕继续反应7-9小时，TLC监测反应完全后冷却至室温，将反应溶液倒入4000mL饱和的亚硫酸氢钠(NaHSO3)溶液中，析出固体，过滤，水洗，60℃以下真空干燥得化合物2；

化合物3的合成：

惰性气体保护下，将化合物2、对甲基苯硼酸、四(三苯基膦)钯、N，N-二甲基甲酰胺和碳酸钠水溶液混合，75-85℃反应10-14小时，TLC监测反应至完全后，反应溶液冷却至室温，加入水和乙酸乙酯，水相进一步用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和盐水洗涤两次，无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，除去乙酸乙酯，得粗品，粗品在甲醇中重结晶，得化合物3；

化合物4的合成：

将化合物3加入水中，然后加入甲酸铵和Pd／C(5％)，反应加热回流1.5-2.5小时，冷却后，除去Pd／C，反应混合物用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，用水和饱和盐水洗涤，无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，过滤，真空蒸馏除去溶剂得化合物4；

化合物5的合成：

将化合物4、乙酸酐和磷酸于45-55℃反应直到完成，然后冷却至室温，加水搅拌，升温至45-55℃至水解完全，反应混合物冷却，过滤，最终的固体干燥得化合物5；

化合物6的合成：

将化合物5和1-羟基苯并三唑(HOBt)溶于四氢呋喃中，冷却至0℃以下，分批加入二环己基碳二亚胺(DCC)，并于10℃以下搅拌10-14小时，过滤得滤液；

将丙二酸二甲酯溶于四氢呋喃中，首先加入氢化钠(70％水分散性油悬剂)，接着在搅拌下加入上述所得滤液，该混合物反应1-3小时，真空蒸馏除去四氢呋喃，加入甲醇和10％盐酸室温搅拌过夜，过滤形成的沉淀，甲醇洗涤，得化合物6；

化合物7的合成：

甘氨酸叔丁酯盐酸盐、甲醇钠加入到甲醇中，搅拌均匀后蒸馏除去甲醇，加入四氢呋喃和化合物6，于55-65℃反应过夜；反应混合物真空蒸馏除去四氢呋喃，然后加入甲醇搅拌1.5-2.5小时，过滤得化合物7；

化合物8，即结构式I所示化合物的合成：

化合物7、二氯甲烷和三氟乙酸(TFA)昆合，搅拌反应3.5-4.5小时，蒸馏除去二氯甲烷与三氟乙酸，剩余物用甲醇重结晶得化合物8。

本发明还提供了一种药物组合物：含有治疗有效量的上述任一晶型，和药学上可接受的辅料、辅助剂或载体。

本发明还提供了所述药物组合物的优选实施方式。

作为优选，所述药物组合物含有治疗有效量的本发明的一种晶型，联用至少一种另外的活性成分

作为优选，所述药物组合物用于口服给药。

作为优选，所述药物组合物为片剂或胶囊。

作为优选，所述药物组合物中含有1重量％-99重量％的本发明所述的晶型。

作为优选，所述药物组合物中含有1重量％-70重量％的本发明所述的晶型。

作为优选，所述药物组合物中含有10重量％-30重量％本发明所述的晶型。

本发明还提供了上述任一晶型在制备用于调节HIF水平或HIF活性的药物中的应用。

本发明还提供了晶型应用的优选实施方式。

作为优选，本发明的所述晶型在制备用于治疗与HIF水平或HIF活性相关的疾病、病症或病状的药物中的应用。

作为优选，本发明的所述晶型在制备用于治疗贫血或缺血，或者与贫血或缺血相关的疾病、病症或病状的药物中的应用。

作为优选，本发明的所述晶型在制备用于治疗患者的疾病、病症或病状的药物中的应用，其中，所述疾病、病症或病状选自缺血、贫血、伤口愈合、原位移植、异位移植、异体移植、全身性高血压、地中海贫血、糖尿病、癌症或炎症，或者其中两种或两种以上的组合。

本发明还提供了一种调节体内HIF水平或活性的方法，即给患者施用本发明的一种晶型。

本发明进一步提供了一种治疗与体内HIF水平或HIF活性相关的疾病、病症或病状的方法，即给患者施用本发明的一种晶型。

本发明又提供了一种治疗体内缺血或贫血，或者与缺血或贫血相关的疾病、病症或病状的方法，即给患者施用本发明的一种晶型。

本发明又提供了一种治疗疾病、病症或病状的方法，其中，所述疾病、病症或病状选自缺血、贫血、伤口愈合、原位移植、异位移植、异体移植、全身性高血压、地中海贫血、糖尿病、癌症或炎症，或者其中两种或两种以上的组合，即给患者施用本发明的一种晶型。

本发明提供的所有晶型都是基本上纯的。

本文所用的术语“基本上纯的”是指至少85重量％，优选至少95重量％，更优选至少重量99％的结构式I所示的化合物，即本发明的N-[(4-羟基-2-氧代-8-(3-甲基苯基)-2H-3-色烯基)羰基]甘氨酸，存在于晶型中，特别地存在于本发明所述的晶型中。

上述晶型的主要的峰可再现并且在误差限度内(所述值±0.2)。

本发明中，“具有如图1所示的X射线粉末衍射图谱”是指X-射线粉末衍射图示出的主要的峰如图1所示，其中主要的峰是指与图1中最高的峰(其相对强度指定为100％)相比，相对强度超过10％，优选超过30％的那些峰。同样地，在本发明中，如图2、图3、图4或图5所示的X-射线粉末衍射图，是指X-射线粉末衍射图示出的主要的峰如图2、图3、图4或图5所示，其中主要的峰是指分别地与图2、图3、图4或图5中最高的峰(其相对强度指定为100％)相比，相对强度超过10％，优选超过30％的那些峰。

结晶的获得可使用或不使用适于结晶本发明化合物的晶种。

本发明的结晶与特定条件下各个晶型的动力学和平衡有关。因此本领域技术人员会意识到，得到的晶型取决于结晶过程的动力学和热力学。在特定条件下(溶剂体系、温度、压力和本发明化合物的浓度)，一种晶型可能要比另一种晶型稳定(或实际上比任何其它晶型稳定)。然而，具有相对较低热力学稳定性的晶型可能在动力学上有利。动力学之外的因素，例如时间、杂质分布、搅动、晶种的存在与否等也可能影响结晶的形式。

本文所用的术语“治疗有效量”是指一个化合物施用于治疗对象时对于治疗一种疾病、或一种疾病或病症的至少一种临床症状时，足以影响对疾病、病症或症状的这种治疗的量。“治疗有效量”可以随着化合物，疾病、病症、和／或疾病或病症的症状，疾病、病症、和／或疾病或病症的症状的严重程度，被治疗的患者的年龄，和／或被治疗的患者的体重等变化。在任意特定的情况下，一个合适的量对那些本领域的技术人员可以是显而易见的，也可以是用常规实验确定的。在联合治疗的情况下，“治疗有效量”是指有效治疗疾病、病症或病状的联用对象的总量。

包括本发明的化合物的药物组合物可通过口服、鼻吸入、直肠、肠胃外或局部施用方式对需要治疗的患者给药。用于口服时，药物组合物可以制成诸如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等的常规的固体制剂，诸如水或油悬浮剂的液体制剂或诸如糖浆、溶液、悬浮液等的其他液体制剂；用于肠胃外给药时，药物组合物可以制成溶液、水、油性悬浮剂、冻干粉针等。优选地，药物组合物的剂型选自片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂、鼻喷雾剂或注射剂，更优选片剂或胶囊。该药物组合物可以是具有精确剂量的单一单位剂量施用。此外，该药物组合物还可以包括其它的活性成分。

本发明的药物组合物的所有剂型都可以通过药学领域的常规方法制备。例如，将活性成分与一种或多种辅料混合，然后制成所需的剂型。

“药学上可接受的载体”是指适合于期望药物制剂的常规的药用载体，例如：诸如水、各种有机溶剂等的稀释剂、赋形剂；诸如淀粉、蔗糖等的填充剂；诸如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的黏合剂；诸如甘油的湿润剂；诸如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠的崩解剂；诸如季铵化合物的吸收促进剂；诸如十六烷醇的表面活性剂；诸如高岭土和膨润土的吸收载体；诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇等的润滑剂。另外还可以在药物组合物中加入其它药学上可接受的辅料，如分散剂、稳定剂、增稠剂、络合剂、缓冲剂、扩散剂、聚合物、芳香剂、甜味剂和染料。优选使用类型适合期望剂型和期望给药方式的辅料。

术语“疾病”或“病症”或“病状”是指任意的疾病、不适、病、症状或者适应症。

附图说明

图1：结构式I所示化合物的晶型I的X-射线粉末衍射图谱；

图2：结构式I所示化合物的晶型II的X-射线粉末衍射图谱；

图3：结构式I所示化合物的晶型III的X-射线粉末衍射图谱；

图4：结构式I所示化合物的晶型IV的X-射线粉末衍射图谱；

图5：结构式I所示化合物的晶型V的X-射线粉末衍射图谱。

图1、图2、图3、图4及图5所示的X-射线粉末衍射图谱是在具有Empyrean控制台的PANalyticalX-射线衍射系统上测得的。衍射峰位置用具有28.443°的2θ值的单晶硅进行校正。X-射线光源是一个Empyrean铜LEFX-射线管的K-Alpha射线。

具体实施方式

下面通过给出的实施例对本发明作出进一步说明，但所述实施例并不对本发明要求保护的范围构成任何限制。在本发明的具体实施例中，未作特别说明的技术或方法等为本领域的常规技术或方法等。

实施例1化合物8-N-[(4-羟基-2-氧代-8(3-甲基苯)-2H-3-色烯基)羰基]甘氨酸(结构式I所示化合物)的合成

化合物2的合成：

5L三口瓶中，将200g化合物1溶解于3000mL乙酸中，搅拌升温至80℃，缓慢滴加液溴，滴加完毕继续反应8小时，TLC监测反应完全后冷却至室温，将反应溶液倒入4000mL饱和亚硫酸氢钠(NaHSO₃)溶液中，过滤所得固体，水洗，60℃以下真空干燥得到204.6g白色固体(化合物2)，纯度98％以上。

化合物3的合成：

氮气(N₂)保护下，将15g3-溴-5-氯水杨酸(化合物2)、8.16g对甲基苯硼酸、2g四(三苯基膦)钯、120mLN，N-二甲基甲酰胺和30mL2mol／L的碳酸钠水溶液混合，升温至80℃反应约12小时。TLC监测反应至完全后，反应溶液冷却至室温，加入500mL水和300mL乙酸乙酯，水相进一步用200mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用300mL饱和盐水洗涤两次，无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥，真空蒸馏除去乙酸乙酯，得到21.6g粗品，粗品用甲醇重结晶得到18.2g化合物3。

化合物4的合成：

将27g化合物3加入250mL水中，加入5g甲酸铵和8.7gPd／C(5％)，反应加热回流约2小时，冷却，除去Pd／C后，反应混合物用100mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，水洗及饱和盐水洗涤，无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥，过滤，真空蒸馏除去溶剂得化合物4。

化合物5的合成：

将27g化合物4、130mL乙酸酐和1mL磷酸混合，于50℃保温直到反应完成。反应溶液冷却至室温，加入500mL水搅拌，升温至50℃水解完全，溶液冷至0℃过滤析出的固体，干燥得24.4g化合物5。

化合物6的合成：

将13g化合物5、6.8g1-羟基苯并三唑(HOBt)溶于四氢呋喃中，冷却至0℃以下，分批加入10.4g二环己基碳二亚胺(DCC)并于10℃以下搅拌约12小时。滤除固体得滤液。将6.6g丙二酸二甲酯溶于400mL四氢呋喃，首先加入3.8g氢化钠(70％水分散性油悬剂)，接着在搅拌下加入上述滤液，反应2小时。真空蒸馏除去四氢呋喃，加入甲醇200mL、200mL10％盐酸室温搅拌过夜。过滤形成的沉淀，200mL甲醇洗涤得6g化合物6。

化合物7的合成：

13.5g甘氨酸叔丁酯盐酸盐和4.4g甲醇钠加入到200mL甲醇中，搅拌均匀后蒸馏除去甲醇，加入200mL四氢呋喃和6.0g化合物6于60℃反应过夜。反应混合物真空蒸馏除去四氢呋喃，加入400mL甲醇搅拌2小时，过滤得白色固体3.5g(化合物7)。

化合物8的合成：

100mL三口瓶中，加入0.5g化合物7再加入5mL二氯甲烷和5mL三氟乙酸，搅拌反应约4小时。反应混合物蒸馏除去二氯甲烷与三氟乙酸，剩余物用甲醇重结晶得化合物8(即结构式I所示化合物)。

实施例2晶型I的制备

实施例1制备的结构式I所示化合物先溶解于丙酮、乙酸乙酯(EtOAc)、异丙醇、甲基叔丁基醚(MTBE)，或者，丙酮／甲醇、丙酮／庚烷、丙酮／异丙醇、丙酮／乙酸异丙酯(IPAc)、四氢呋喃／甲醇、四氢呋喃／乙酸乙酯、四氢呋喃／庚烷、四氢呋喃／乙腈、四氢呋喃／异丙醇、四氢呋喃／甲基叔丁基醚或四氢呋喃／二氯甲烷的混合溶剂中中，再挥发、沉淀，即得期望的所述晶型I，熔点为190～193℃。

实施例3晶型I的制备

过量的按照实施例1制备的结构式I所示化合物在二氯甲烷(CH₂Cl₂)，或者，水／四氢呋喃或水／丙酮的混合溶剂中，室温下悬浮搅拌48小时以上，得期望的所述晶型I。

实施例4晶型I的制备

过量的按照实施例1制备的结构式I所示化合物在庚烷、甲醇或水／四氢呋喃的混合溶剂中，50℃下悬浮搅拌48小时或72小时，得期望的所述晶型I。

实施例5晶型II的制备

按照实施例1制备的结构式I所示化合物先溶解于二甲基甲酰胺或四氢呋喃／二甲基甲酰胺的混合溶剂中，再挥发、沉淀，即得期望的所述晶型II，熔点为129～132℃。

实施例6晶型III的制备

按照实施例1制备的结构式I所示化合物先溶解于乙酸异丙酯，再挥发、沉淀即得期望的所述晶型III，熔点为196～199℃。

实施例7晶型III的制备

过量的按照实施例1制备的结构式I所示化合物在甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯或乙酸乙酯中，室温下悬浮搅拌48小时以上，即得期望的所述晶型III。

实施例8晶型III的制备

过量的按照实施例1制备的结构式I所示化合物在甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯或乙酸乙酯中，50℃下悬浮搅拌48小时以上，即得期望的所述晶型III。

实施例9晶型III的制备

过量的按照实施例1制备的结构式I所示化合物在丙酮／水(1∶1)的混合溶剂中，室温下悬浮搅拌48小时以上，即得期望的所述晶型III。

实施例10晶型III的制备

过量的按照实施例1制备的结构式I所示化合物在乙酸乙酯／四氢呋喃(3∶1)的混合溶剂中，50℃下悬浮搅拌48小时以上，即得期望的所述晶型III。

实施例11晶型III的制备

按照实施例1制备的结构式I所示化合物先溶解于甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯、乙酸乙酯，或者，乙酸乙酯／四氢呋喃或丙酮／水的混合溶剂中，再加入按照实施例6-8中任一实施例所制备的晶型III作为晶种，再挥发、沉淀即得期望的所述晶型III。

实施例12晶型III的制备

按照实施例1制备的结构式I所示化合物先加热溶解于异丙醇(IPA)、4-甲基-2-戊酮、乙酸丙酯、甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯、乙酸乙酯，或者，乙酸乙酯／四氢呋喃、丙酮／水或异丙醇／水(9：1)的混合溶剂中，再加入按照实施例6-8中任一实施例所制备的晶型III作为晶种，冷却结晶即得所述晶型III。

实施例13晶型III的制备

惰性气体(如氮气或氦气)保护下，将按照实施例1制备的结构式I所示化合物加热到195℃，再冷却到室温，即得所述晶型III。

实施例14晶型IV的制备

按照实施例2-4中任一实施例所制备的晶型I加热到50℃即得所述晶型IV，熔点为189～193℃。

实施例15晶型IV的制备

按照实施例1制备的结构式I所示化合物先溶解于四氢呋喃中，再挥发、沉淀即得所述晶型IV。

实施例16晶型IV的制备

按照实施例1制备的结构式I所示化合物在水／丙酮的混合溶剂中，50℃下悬浮搅拌48小时以上，即得所述晶型IV。

实施例17晶型V的制备

按照实施例14-16中任一实施例所制备的晶型IV加热到175℃即得所述晶型V，熔点为192～195℃。

实施例18HIF-PHD2酶活性的测定

HIF-PHD2活性的测定采用均相TR-FRET技术(参见US2008／004817；DaoJH等人，AnalBiochem.2009，384：213-23)。在96孔板中的一半区域向每孔中滴加2μL测试化合物的DMSO溶液和40μL测定缓冲液(50mMTrisPH7.4／0.01％吐温-20／0.1mg／mLBSA／1mM抗坏血酸钠／20μg／mL过氧化氢酶／10μM硫酸亚铁)，该缓冲液中还包含600nM的全链PHD2。室温下预孵化30分钟后，加入8μL的底物(最终浓度为0.2μM2-酮戊二酸和0.5μMHIF-1α肽生物素酰基DLDLEMLAPYIPMDDDFQL)引发酶反应。2小时后，室温下，加入50μL的淬灭剂／检测试剂混合液(最终浓度为1mM邻二氮杂菲，0.1mMEDTA，0.5nManti-(His)₆LANCE试剂，100nMAF647标记的抗生素蛋白链菌素和30nM(His)₆-VHL-elonginB-elonginC)终止反应并产生信号。测定在665和620nm处的时间分辨荧光信号强度比，并计算相对于平行进行的不受抑制的对照样品的抑制百分比。按照实施例1公开的方法制备的式I化合物的IC50值测定约为150nM。

实施例19正常小鼠中红细胞生成素(EPO)诱导的测定

八周龄C57BL／6雄鼠口服给予含有化合物I的一种晶型的混悬液，给药剂量分别为20，60，100mg／kg，溶剂为0.5％CMC。给药6小时后从眼眶静脉取血获得血清样品(参见RobinsonA，等人，Gastroenterology.2008，134：145-55；HsiehMM，等人，Blood.2007，110：2140-7)。按照说明书指示使用电化学发光免疫分析仪(MSD)分析样品中的红细胞生成素。当按照60mg/kg剂量给予本发明的晶型III的混悬液时，样品中诱导产生的红细胞生成素的含量超过没有诱导的空白对照组样品中的红细胞生成素35倍。

实施例20晶型稳定性的测定

100mg按照上述实施例1所述方法制备的式I化合物(晶型混合物)加入2mL乙酸乙酯，在室温下搅拌72小时，离心处理并干燥后，得到的晶体经XRPD测试为纯的晶型III，表明室温下晶型III比实施例1中制备得到的混合晶体在热力学上是更稳定的晶型。

实施例21晶型稳定性的测定

50mg按照上述实施例1所述方法制备的式I化合物(晶型混合物)加入1mL乙酸乙酯，50℃下搅拌72小时，离心处理并干燥后，得到的晶体经XRPD测试为纯的晶型III，表明50℃时晶型III比实施例1中制备得到的混合晶体在热力学上是更稳定的晶型。

实施例22腺嘌呤导致肾脏贫血小鼠的药效学研究

六周龄Wistar雄鼠被分为对照组和治疗组。首先全部给予10天的标准饲料喂养，对照组继续给予标准饲料喂养，而治疗组在标准饲料的基础上增加0.75％的腺嘌呤饲养30天后使其产生贫血症。此后两组均给予标准饲料喂养，治疗组口服赋形剂(vehicle)或含有化合物的一种晶型的0.5％CMC-Na混悬液，给药剂量分别为20，40或80mg／kg，每天一次，共给药四周。在给药第0、5、12、19、27天时眼眶静脉取血样。使用自动血细胞分析仪MEK-6318K分析样品血液参数，如红细胞数(RBC)、血红蛋白浓度(HGB)和红细胞压积值(HCT)。样品中的血红蛋白浓度测定值详见表I，数据清楚表明使用化合物的晶型III提高了动物血液中的血红蛋白浓度水平并纠正使其接近正常值。

表I

虽然本发明已经进行了详细的描述，但参考优选的技术方案，还存在其他的实施可能。因此，上述实施例仅为充分说明本发明而列举的具体实施例，本发明的保护范围以权利要求书的内容为准，而不限于上述具体实施方式。本领域的技术人员在本发明基础上所作的不脱离本发明实质内容的等同替代或变换，亦均在本发明的保护范围之内。

Claims (39)

1.一种结构式I所示化合物的晶型III，其特征在于：其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为12.3°、16.6°和25.4°的特征峰，

2.根据权利要求1所述的晶型III，其特征在于：所述衍射角2θ对应的晶面间距分别为和

3.根据权利要求1所述的晶型III，其特征在于：其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为12.3°、16.6°、21.8°、25.4°和29.2°的特征峰。

4.根据权利要求3所述的晶型III，其特征在于：所述衍射角2θ对应的晶面间距分别为和

5.根据权利要求1所述的晶型III，其特征在于：其X射线粉末衍射谱图中具有衍射角2θ为12.3°、13.0°、16.6°、18.6°、21.8°、25.4°、26.9°和29.2°的特征峰。

6.根据权利要求5所述的晶型III，其特征在于：所述衍射角2θ对应的晶面间距分别为和

7.根据权利要求1所述的结构式I所示化合物的晶型III，其特征在于：具有基本如图3所示的X-射线粉末衍射图。

8.根据权利要求1～7任一项所述的晶型III，其特征在于，所述晶型III的熔点为196～199℃。

9.根据权利要求8所述的晶型III，其特征在于，所述晶型III纯度≥85％。

10.根据权利要求9所述的晶型III，其特征在于，所述晶型III纯度≥95％。

11.根据权利要求10所述的晶型III，其特征在于，所述晶型III纯度≥99％。

12.结构式I所示化合物的的制备方法，其特征在于，包括如下的步骤：

化合物2的合成：

化合物1溶于乙酸中，搅拌，升温至75-85℃，缓慢滴加液溴，滴加完毕继续反应7-9h，TLC监测反应至完全，冷却至室温，将反应液倒入4000mL饱和的亚硫酸氢钠(NaHSO₃)溶液中，过滤所得沉淀，水洗，60℃以下真空干燥得化合物2；

化合物3的合成：

惰性气体保护下，将化合物2、对甲基苯硼酸、四(三苯基膦)钯、N,N-二甲基甲酰胺、碳酸钠水溶液混合，75-85℃反应10-14h，TLC监测反应至完全后，反应溶液冷却至室温，加入水和乙酸乙酯，水相进一步用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和盐水洗涤两次，用无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥，真空蒸馏除去乙酸乙酯，得粗品，粗品用甲醇重结晶，得化合物3；

化合物4的合成：

将化合物3加入水中，加入甲酸铵和5％的Pd/C，反应加热回流1.5-2.5h，冷却并除去Pd/C后，反应混合物用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相，用水和饱和盐水洗涤，无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥，过滤，真空蒸馏除去溶剂得化合物4；

化合物5的合成：

将化合物4、乙酸酐和磷酸于45-55℃反应直到完成，然后冷却至室温，加水搅拌，升温至45-55℃至水解完全，将反应混合物冷却并过滤，干燥所得固体得化合物5；

化合物6的合成：

将化合物5、1-羟基苯并三唑(HOBt)溶于四氢呋喃中，冷却至0℃以下，分批加入二环己基碳二亚胺(DCC)，10℃以下搅拌10-14小时，滤除固体得滤液；将丙二酸二甲酯溶于四氢呋喃中，首先加入氢化钠，所述氢化钠为70％水分散性油悬剂，接着在搅拌下加入上述滤液，混合物反应1-3小时，真空蒸馏除去四氢呋喃，加入甲醇、10％盐酸室温搅拌过夜，过滤形成的沉淀，甲醇洗涤，得化合物6；

化合物7的合成：

甘氨酸叔丁酯盐酸盐、甲醇钠加入到甲醇中，搅拌，随后蒸馏除去甲醇，加入四氢呋喃、化合物6，于55-65℃反应过夜，反应混合物真空蒸馏除去四氢呋喃，然后加入甲醇搅拌1.5-2.5小时，过滤得化合物7；

化合物8，即结构式I所示化合物的合成：

化合物7、二氯甲烷和三氟乙酸(TFA)混合，搅拌反应3.5-4.5小时，蒸馏除去二氯甲烷与三氟乙酸，剩余物用甲醇重结晶得化合物8。

13.权利要求1～11任一项所述晶型III的制备方法，其特征在于：包括如下的步骤，结构式I所示化合物先溶解于乙酸异丙酯中，再挥发、沉淀即得最终的晶型。

14.权利要求1～11任一项所述晶型III的制备方法，其特征在于：包括如下的步骤，过量的结构式I所示化合物在溶剂中，悬浮搅拌48小时以上，即得最终的晶型，其中所述溶剂选自甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯或乙酸乙酯。

15.根据权利要求14所述晶型III的制备方法，其特征在于：所述悬浮搅拌的温度为20～50℃。

16.权利要求1～11任一项所述晶型III的制备方法，其特征在于：包括如下的步骤，过量的结构式I所示化合物在丙酮/水的混合溶剂中，室温下悬浮搅拌48小时以上，或者，在乙酸乙酯/四氢呋喃的混合溶剂中，50℃下悬浮搅拌48小时以上，即得最终的晶型。

17.根据权利要求16所述晶型III的制备方法，其特征在于：乙酸乙酯/四氢呋喃的体积比为3/1，丙酮/水的体积比为1/1。

18.权利要求1～11任一项所述晶型III的制备方法，其特征在于：包括如下的步骤，结构式I所示化合物在惰性气体保护下加热到195℃，再冷却到室温，即得最终的晶型。

19.权利要求1～11任一项所述晶型III的制备方法，其特征在于：包括如下的步骤，结构式I所示化合物先溶解于溶剂中，再加入权利要求13～18任一项所制备的晶型作为晶种，再挥发、沉淀，即得最终的晶型，其中所述溶剂包括甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯或乙酸乙酯。

20.根据权利要求19所述晶型的制备方法，其特征在于：所述溶剂选自甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯或乙酸乙酯。

21.权利要求1～11任一项所述晶型III的制备方法，其特征在于：包括如下的步骤，结构式I所示化合物先溶解于混合溶剂中，再加入权利要求13～20任一项所制备的晶型作为晶种，再挥发、沉淀，即得最终的晶型，其中所述混合溶剂包括含有乙酸乙酯的混合溶剂、含有四氢呋喃的混合溶剂、含有丙酮的混合溶剂或含有水的混合溶剂。

22.根据权利要求21所述晶型III的制备方法，其特征在于：所述混合溶剂包括乙酸乙酯/四氢呋喃的混合溶剂或丙酮/水的混合溶剂。

23.根据权利要求21所述晶型III的制备方法，其特征在于：所述混合溶剂选自乙酸乙酯/四氢呋喃的混合溶剂或丙酮/水的混合溶剂。

24.权利要求1～11任一项所述晶型III的制备方法，其特征在于：包括如下的步骤，结构式I所示化合物先加热溶解于溶剂中，再加入权利要求13～15任一项所制备的晶型作为晶种，然后冷却、即得最终的晶型，其中所述溶剂包括异丙醇、4-甲基-2-戊酮、乙酸丙酯、甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯或乙酸乙酯。

25.根据权利要求24所述晶型III的制备方法，其特征在于：所述溶剂选自异丙醇、4-甲基-2-戊酮、乙酸丙酯、甲基叔丁基醚、乙酸异丙酯或乙酸乙酯。

26.权利要求1～11任一项所述晶型III的制备方法，其特征在于：包括如下的步骤，结构式I所示化合物先加热溶解于混合溶剂中，再加入权利要求13～15任一项所制备的晶型作为晶种，然后冷却、即得最终的晶型，其中所述混合溶剂包括含有异丙醇的混合溶剂、含有乙酸乙酯的混合溶剂、含有乙酸异丙酯的混合溶剂、含有甲基叔丁基醚的混合溶剂、含有四氢呋喃的混合溶剂、含有丙酮的混合溶剂或含有水的混合溶剂。

27.根据权利要求26所述晶型的制备方法，其特征在于：所述混合溶剂包括异丙醇/水的混合溶剂、乙酸乙酯/四氢呋喃的混合溶剂、乙酸异丙酯/四氢呋喃的混合溶剂、甲基叔丁基醚/四氢呋喃的混合溶剂或丙酮/水的混合溶剂。

28.根据权利要求26所述晶型的制备方法，其特征在于：所述混合溶剂选自异丙醇/水的混合溶剂、乙酸乙酯/四氢呋喃的混合溶剂、乙酸异丙酯/四氢呋喃的混合溶剂、甲基叔丁基醚/四氢呋喃或丙酮/水的混合溶剂，其中所述异丙醇/水的体积比为9:1。

29.一种药物组合物，其特征在于：含有治疗有效量的权利要求1～11任一项所述的晶型III，和药学上可接受的辅料、辅助剂或载体。

30.一种药物组合物，其特征在于：含有治疗有效量的权利要求1～11任一项所述的晶型III；联用至少一种另外的有效成分。

31.根据权利要求29或30任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物用于口服给药。

32.根据权利要求31所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物为片剂或胶囊。

33.根据权利要求29～32任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物中包括1重量％-99重量％的权利要求1～11任一项所述的晶型III。

34.根据权利要求33所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物中包括1重量％-70重量％的权利要求1～11任一项所述的晶型III。

35.根据权利要求34所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物中包括10重量％-30重量％的权利要求1～11任一项所述的晶型III。

36.权利要求1～11任一项所述的晶型III在制备用于调节体内HIF水平或HIF活性的药物中的应用。

37.权利要求1～11任一项所述的晶型III在制备用于治疗与HIF水平或HIF活性相关的疾病、病症或病状的药物中的应用。

38.权利要求1～11任一项所述的晶型III在制备用于治疗贫血或缺血，或者与贫血或缺血相关的疾病、病症或病状的药物中的应用。

39.权利要求1～11任一项所述的晶型III在制备用于治疗疾病、病症或病状的药物中的应用，其中，所述疾病、病症或病状选自缺血、贫血、伤口愈合、原位移植、异位移植、异体移植、全身性高血压、地中海贫血、糖尿病、癌症或炎症，或者其中两种或两种以上的组合。