CN113967210A - 一种干扰整合素β3/Src相互作用的化合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种干扰整合素β3/Src相互作用的化合物的用途。具体地，本发明提供一种式I化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于选自下组的一个或多个用途：(1)选择性抑制整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导；(2)预防和/或治疗整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导相关的疾病；(3)预防和/或治疗血栓；(4)预防和/或治疗肿瘤；(5)预防和/或治疗骨质疏松；(6)预防和/或治疗内皮细胞介导的血管形成。

Description

一种干扰整合素β3/Src相互作用的化合物的用途
技术领域
本发明涉及药物领域，具体地涉及一种干扰整合素β3/Src相互作用的化合物的用途。
背景技术
目前，心脑血管血栓性疾病如心肌梗塞、脑梗塞等成为严重威胁人类生命和健康的最主要病因，具有发病率高、死亡率高的特点。据世界卫生组织统计，每年约有1,200万人过早地被心脑血管疾病夺去了生命，心血管、脑血管疾病的死亡率为各种疾病死亡率之首，每年死于心脑血管疾病的人数约占全球死亡人数的1/3。血小板在心脑血管血栓形成中发挥着关键的作用，当血管内皮损伤或动脉粥样斑块破裂时，血小板活化并通过黏附、伸展、聚集等一系列功能导致病理性血栓形成，引起受累血管分布区域的心、脑组织缺血性坏死，严重可危及患者的生命，因此，抗血小板治疗成为治疗心脑血管血栓性疾病的首选。血栓性疾病中病理性血栓形成的最直接原因是血小板的异常活化聚集，体内各种血小板激动剂导致的血小板聚集、血栓形成的最终共同通路则是由整合素αIIbβ3(GPIIb/IIIa)介导，因此，整合素αIIbβ3成为抗血小板治疗的理想靶点。然而，目前抗血栓药物的难点在于抗血栓的同时抑制了正常的生理性止血功能，往往同时导致出血副作用。
整合素αIIbβ3属于整合素家族成员，整合素是一类在细胞中广泛存在的跨膜蛋白，介导细胞与细胞之间(通过结合钙黏蛋白和选择素)，细胞与细胞外基质(通过结合细胞外基质如纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白)的相互作用，参与细胞的信号转导、黏附、伸展、肿瘤的迁移、止血与血栓形成等一系列生理和病理过程。整合素是由α亚单位与β亚单位形成的异二聚体，目前在哺乳动物中共发现18个α亚单位，与8个β亚单位组成24种不同的整合素，其中，整合素β3可与αIIb和αv亚单位形成两种整合素：αIIbβ3和αvβ3。整合素αIIbβ3主要表达于血小板及巨核细胞表面，是血小板表面主要的膜受体，在血栓形成以及止血中发挥重要作用；而整合素αvβ3在体内分布广泛，如内皮细胞、破骨细胞、肿瘤细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等，介导血管形成、骨吸收、肿瘤转移等多种病理生理过程。
因此，本领域需要开发一种针对整合素靶点的药物，使得该药物在抗血栓的同时不影响正常的生理性止血功能，避免出血副作用的出现，同时针对整合素靶点使得药物能够具有多种治疗作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对整合素与Src激酶相互作用的药物，从而对血栓、肿瘤、骨质疏松和内皮细胞介导的血管形成等疾病具有优异的治疗作用。
本发明第一方面，提供一种式I化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于选自下组的一个或多个用途：(1)选择性抑制整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导；(2)预防和/或治疗整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导相关的疾病；(3)预防和/或治疗血栓；(4)预防和/或治疗肿瘤；(5)预防和/或治疗骨质疏松；(6)预防和/或治疗内皮细胞介导的血管形成；
Figure BDA0002601171440000021
其中，
R1为氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C3-C12元环烷基、取代或未取代的C6-C16芳基、取代或未取代的3-12元杂芳基、-取代或未取代的C1-C12亚烷基-C6-C16芳基、-取代或未取代的C1-C12亚烷基-3-12元杂芳基；
R2为取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C3-C12环烷基、异硫脲基、胍基、-取代或未取代的C1-C12亚烷基-异硫脲基、-取代或未取代的C1-C12亚烷基-胍基、-取代或未取代的C3-C12亚环烷基-异硫脲基、或-取代或未取代的C3-C12亚环烷基-胍基；
R3为氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C3-C12元环烷基、或取代或未取代的C2-C12酯基、或取代或未取代的C2-C12酰基；
R4为氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C3-C12环烷基、取代或未取代的C2-C12酯基、取代或未取代的C1-C12烷氧基、取代或未取代的C1-C12烷硫基、取代或未取代的C3-C12环烷氧基、或取代或未取代的C3-C12环烷硫基；
R5为氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C3-C12环烷基、卤素、取代或未取代的C6-C16芳基、或取代或未取代的3-12元杂芳基；
W、Z各自独立地为CH、C-R6、或N；
R6为取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C3-C12环烷基、卤素、取代或未取代的C6-C16芳基、或取代或未取代的3-12元杂芳基；
其中，所述的任一“取代”是指基团上的一个或多个(优选为1、2、3、4或5个)氢原子被选自下组的取代基所取代：C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8卤代环烷基、卤素、硝基、-CN、羟基、巯基、氨基、C1-C4羧基、C2-C4酯基、C2-C4酰胺基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷硫基、C1-C8卤代烷氧基、C1-C8卤代烷硫基、C6-C12芳基、5-10元杂芳基、5-10元杂环烷基；
所述的杂芳基的杂环具有1-4个(优选为1、2、3个或4个)选自N、O和S的杂原子。
在另一优选例中，R4和R5至少一个不为氢。
在另一优选例中，R1为氢、取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C3-C10元环烷基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的3-10元杂芳基、取代或未取代的C1-C8烷基-C6-C12芳基、取代或未取代的C1-C8烷基-3-10元杂芳基。
在另一优选例中，R1为氢、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8元环烷基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的3-10元杂芳基、-取代或未取代的C1-C6亚烷基-C6-C12芳基、-取代或未取代的C1-C6亚烷基-3-10元杂芳基。
在另一优选例中，R1为氢、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C3-C8元环烷基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的3-10元杂芳基、-取代或未取代的C1-C4亚烷基-C6-C12芳基、-取代或未取代的C1-C4亚烷基-3-10元杂芳基。
在另一优选例中，R1为甲基、苯甲基。
在另一优选例中，R2为取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、异硫脲基、胍基、-取代或未取代的C1-C8亚烷基-异硫脲基、-取代或未取代的C1-C8亚烷基-胍基、-取代或未取代的C3-C8亚环烷基-异硫脲基、或-取代或未取代的C3-C8亚环烷基-胍基。
在另一优选例中，R2为取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、异硫脲基、胍基、-取代或未取代的C1-C6亚烷基-异硫脲基、-取代或未取代的C1-C6亚烷基-胍基、-取代或未取代的C3-C8亚环烷基-异硫脲基、或-取代或未取代的C3-C8亚环烷基-胍基。
在另一优选例中，R2为取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、异硫脲基、胍基、-取代或未取代的C1-C4亚烷基-异硫脲基、-取代或未取代的C1-C4亚烷基-胍基、-取代或未取代的C3-C8亚环烷基-异硫脲基、-或取代或未取代的C3-C8亚环烷基-胍基。
在另一优选例中，R2取代或未取代的-甲基-异硫脲基、或甲基-胍基。
在另一优选例中，异硫脲基的结构式如下所示：
Figure BDA0002601171440000031
在另一优选例中，胍基的结构式如下所示：
Figure BDA0002601171440000032
在另一优选例中，R3为氢、取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C3-C10元环烷基、或取代或未取代的C2-C8酯基、或取代或未取代的C2-C8酰基。
在另一优选例中，R3为氢、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8元环烷基、或取代或未取代的C2-C6酯基、或取代或未取代的C2-C6酰基。
在另一优选例中，R3为氢、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C3-C8元环烷基、或取代或未取代的C2-C4酯基、或取代或未取代的C2-C4酰基。
在另一优选例中，R3为乙酯基、丙酯基、或丁酯基。
在另一优选例中，R3为C1-C8烷基-O-C(O)-或C1-C8烷基-C(O)-O-。
在另一优选例中，R3为C1-C6烷基-O-C(O)-或C1-C6烷基-C(O)-O-。
在另一优选例中，R3为C1-C4烷基-O-C(O)-或C1-C4烷基-C(O)-O-。
在另一优选例中，R3为C1-C3烷基-O-C(O)-或C1-C3烷基-C(O)-O-。
在另一优选例中，R3为乙基-O-C(O)-或乙基-C(O)-O-。
在另一优选例中，R4为氢、取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C2-C8酯基、取代或未取代的C1-C8烷氧基、取代或未取代的C1-C8烷硫基、取代或未取代的C3-C10环烷氧基、或取代或未取代的C3-C10环烷硫基。
在另一优选例中，R4为氢、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C2-C6酯基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C1-C6烷硫基、取代或未取代的C3-C8环烷氧基、或取代或未取代的C3-C8环烷硫基。
在另一优选例中，R4为氢、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C2-C4酯基、取代或未取代的C1-C4烷氧基、取代或未取代的C1-C4烷硫基、取代或未取代的C3-C8环烷氧基、或取代或未取代的C3-C8环烷硫基。
在另一优选例中，R4为氢、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C5-C7环烷基、取代或未取代的C2-C4酯基、取代或未取代的C1-C4烷氧基、取代或未取代的C1-C4烷硫基、取代或未取代的C5-C7环烷氧基、或取代或未取代的C5-C7环烷硫基。
在另一优选例中，R4为氢、C1-C6烷基-O-C(O)-、C1-C6烷基-C(O)-O-、C1-C6烷基-O-、C1-C6烷基-S-、C3-C8环烷基-O-、或C3-C8环烷基-S-。
在另一优选例中，R4为氢、C1-C4烷基-O-C(O)-、C1-C4烷基-C(O)-O-、C1-C4烷基-O-、C1-C4烷基-S-、C5-C7环烷基-O-、或C5-C7环烷基-S-。
在另一优选例中，R4为氢、乙酯基、丙酯基、或丁酯基、甲氧基、甲硫基、环戊基-O-、环戊基-S-、环己基-O-、或环己基-S-。
在另一优选例中，R4为氢、甲基-O-C(O)-、甲基-C(O)-O-、丙酯基、或丁酯基、甲氧基、甲硫基、环戊基-O-、环戊基-S-、环己基-O-、或环己基-S-。
在另一优选例中，R5为氢、取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、卤素、取代或未取代的C6-C12芳基、或取代或未取代的3-10元杂芳基；
在另一优选例中，R5为氢、卤素、苯基、萘基、喹啉基、异喹啉基、C1-C4烷基取代的喹啉基、C1-C4烷基取代的异喹啉基。
在另一优选例中，R5为氢、氯、溴、苯基、萘基、喹啉基、异喹啉基、单甲基取代的喹啉基、单甲基取代的异喹啉基。
在另一优选例中，卤素为氟、氯、溴、或碘。
在另一优选例中，W、Z各自独立地为CH、C-R6、或N；
R6为取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、卤素、取代或未取代的C6-C12芳基、或取代或未取代的3-10元杂芳基。
在另一优选例中，W、Z不同时为-N-。
在另一优选例中，W、Z各自独立地为-CH-。
在另一优选例中，所述的式I化合物具有如下式I-1所示的结构。
Figure BDA0002601171440000051
其中，
R1、R3、R4和R5各自独立地如上所定义；
A为S或NH。
在另一优选例中，所述的式I化合物为：
Figure BDA0002601171440000052
在另一优选例中，所述抑制整合素β3与Src激酶相互作用包括抑制整合素β3与Src激酶的SH3结构域的相互作用。
在另一优选例中，所述的选择性抑制整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导是指选择性抑制整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导但不影响内向外信号转导。
在另一优选例中，所述的整合素β3与Src激酶相互作用是指血小板中的整合素β3与c-Src激酶相互作用。
在另一优选例中，所述的整合素β3为整合素αIIbβ3和/或整合素αvβ3的β3。
在另一优选例中，所述的整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导相关的疾病选自下组：血栓、肿瘤、骨质疏松、内皮细胞介导的血管形成，或其组合。
在另一优选例中，所述的预防和/或治疗血栓在实现抗血栓的同时，不影响出血或改善出血。
在另一优选例中，所述的改善出血包括抑制出血、不增加出血风险、降低出血风险、不会引起出血副作用和/或不影响止血功能。
在另一优选例中，所述的止血功能包括血小板止血功能。
在另一优选例中，所述的止血包括生理性止血。
在另一优选例中，所述的血栓为心脑血管性疾病血栓，所述的血栓为心脑血管性疾病血栓选自下组：心肌梗塞血栓、脑梗塞血栓、缺血性卒中、动脉粥样硬化血栓，或其组合。
在另一优选例中，所述的预防和/或治疗血栓包括选自下组的一种或多种方式进行：
(3-1)抑制血小板在固相纤维蛋白原上的伸展功能；
(3-2)抑制血小板的聚集、粘附和/或伸展；
(3-3)抑制纤维蛋白凝块回缩；
(3-3)不影响血小板结合游离纤维蛋白原结合功能；
在另一优选例中，所述抑制血小板的聚集包括抑制血小板的一相聚集或二相聚集
在另一优选例中，所述的预防和/或治疗肿瘤包括选自下组的一种或多种方式进行：
(4-1)抑制肿瘤细胞的生长或增殖；
(4-2)抑制肿瘤血管的形成或生长；
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：实体瘤、血液系统肿瘤，或其组合。
在另一优选例中，所述的实体瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的肺癌选自下组：小细胞肺癌、非小细胞肺癌、心肌癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的预防和/或治疗骨质疏松包括选自下组的一种或多种方式进行：
(5-1)抑制破骨细胞的增殖和分化。
在另一优选例中，所述的预防和/或治疗内皮细胞介导的血管形成包括选自下组的一种或多种方式进行：
(6-1)抑制内皮细胞的增殖；
在另一优选例中，所述的血管选自下组：肿瘤血管、脐静脉血管，或其组合。
在另一优选例中，所述的内皮细胞选自下组：肿瘤血管内皮细胞、脐静脉血管内皮细胞，或其组合。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂为药物组合物或制剂。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂还包括药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂还包括其它抗血栓药物、其它抗肿瘤药物、其它治疗骨质疏松药物、和/或其它抗血管形成药物。
在另一优选例中，所述的组合物或制剂的剂型为片剂、注射剂、输液剂、膏剂、凝胶剂、溶液剂、微球或膜剂。
本发明第二方面，提供一种(1)选择性抑制整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导；(2)预防和/或治疗整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导相关的疾病；(3)预防和/或治疗血栓；(4)预防和/或治疗肿瘤；(5)预防和/或治疗骨质疏松；和/或(6)预防和/或治疗内皮细胞介导的血管形成的方法，所述的方法包括步骤：给需要的对象施用如本发明第一方面所述的式I化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐。
在另一优选例中，所述对象为人和非人哺乳动物(啮齿动物、兔、猴、家畜、狗、猫等)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示小分子化合物的筛选流程图。
图2显示DCDBS84对血小板伸展的抑制作用，DCDBS84能够浓度依赖性抑制血小板伸展，DMSO和RGDS分别为阴性和阳性对照。
图3显示表面等离子共振(SPR)检测DCDBS84能够与c-Src SH3结合以及亲和力(KD)。
图4显示不同浓度的DCDBS84不影响c-Src酪氨酸激酶活性，而PP2(含PXXP domain蛋白与c-Src结合的抑制剂)和Dasatinib(c-Src酪氨酸激酶抑制剂)能够抑制c-Src酪氨酸激酶活性。
图5显示DCDBS84不影响RLP1与c-Src SH3的相互作用，而PP2和Dasatinib都能够破坏RLP1与c-Src SH3的相互作用。
图6显示应用GST-pull down方法检测DCDBS84能够浓度依赖性解离整合素β3与c-Src SH3的相互作用。
图7显示应用Co-IP方法检测DCDBS84能够解离整合素β3与c-Src的相互作用。
图8显示DCDBS84能够浓度依赖性降低血小板在固相纤维蛋白原上的粘附，DMSO和RGDS分别为阴性和阳性对照。
图9显示DCDBS84能够浓度依赖性减少ADP诱导的血小板聚集。
图10显示DCDBS84能够浓度依赖性减少Thrombin诱导的血小板聚集。
图11显示DCDBS84能够浓度依赖性抑制纤维蛋白凝块回缩的照片图。
图12显示DCDBS84能够浓度依赖性抑制纤维蛋白凝块回缩的统计图。
图13显示DCDBS84结合可溶性纤维蛋白原的能力与DMSO一样，RGDS则结合能力降低。
图14显示在Fecl3诱导的颈动脉损伤模型中，DCDBS84能够浓度依赖性减少血栓形成，而对照药物integrilin的临床用量是0.18mg/kg,当用到16mg/kg时已经有严重的副作用无法用于临床，DCDBS84 10mg/kg的效果比integrilin 16mg/kg还强，提示DCDBS84能够深度抗血栓。
图15显示在小鼠剪尾实验中，DCDBS84 10mg/kg不会引起小鼠出血增加(与DMSO对照相比)，而integrilin 0.18mg/kg和4.2mg/kg时能够显著增加小鼠的出血量，因受到出血副作用的显示，integrilin不能使用高剂量。
图16显示在激光诱导的小鼠提睾肌动脉损伤模型中，DMSO处理组能够形成非常明显的血栓，DCDBS84 4.2mg/kg能够显著的抑制血栓形成，但是在伤口部位还能有一层活化的血小板附着，而integrilin 4.2mg/kg处理虽然也能显著的抑制血栓形成，但是在伤口部位没有血小板附着。
图17显示激光诱导的小鼠提睾肌动脉损伤模型结果的统计图，CD41是血小板的特异抗体(αIIb)，P-selectin(CD 62P)标记活化的血小板。
图18显示流体技术检测流动状态下DCDBS84能够抑制血栓形成，在1500s-1又能有血小板附着，而integrilin在抑制血栓形成的时候没有血小板附着。
图19显示流体技术检测结果的统计图。
图20显示DCDBS84能够抑制转染了β3的MCF-7(乳腺癌细胞)在纤维蛋白原上的粘附，β3Δ759(缺失了C末端的RGT，破坏了外向内功能)，细胞的粘附下降，对于没有β3表达的MCF-7，细胞不粘附。
图21显示DCDBS84能够抑制有β3表达的MDA-MB-231(乳腺癌细胞)在纤维蛋白原上的粘附。
图22显示DCDBS84对B16(小鼠黑色素瘤细胞，有β3表达)细胞在纤维蛋白原上的粘附影响不大。
图23显示高浓度的DCDBS84能够抑制划痕区域的B16细胞的生长，提示能够抑制肿瘤转移。
图24显示不同浓度的DCDBS84能够抑制划痕区域的MDA-MB-231生长，提示能够抑制肿瘤转移。
图25显示MCF-7细胞，因为没有β3表达，所以无论是否应用DCDBS84处理，在划痕区域都没有细胞能够生长。
图26显示MCF-7细胞转染了全长的β3，DCDBS84能够浓度依赖性抑制划痕区域的MCF-7-β3细胞的生长，提示能够抑制肿瘤转移。
图27显示MCF-7细胞转染β3Δ759(C末端RGT截短)，无论时是否应用DCDBS84，划痕区域细胞的生长都较少，其细胞生长情况介于MCF-7和MCF-7-β3之间。
图28显示MCF-7、MCF-7-β3以及MCF-7-β3Δ759三种细胞在划痕区域细胞生长的比较，提示β3/c-Src相互作用在细胞生长和粘附中的重要作用。
图29显示不同浓度的DCDBS84能够抑制划痕区域的NIH-3T3(小鼠胚胎成纤维细胞系，有αvβ3表达)生长。
图30显示不同浓度的DCDBS84对MCF-7、MCF-7-β3以及MCF-7-β3Δ759三种细胞增殖抑制的作用比较，对MCF-7几乎没有作用，对MCF-7-β3作用最明显，对MCF-7-β3Δ759作用较弱。
图31显示不同浓度的DCDBS84对MCF-7、MDA-MB-231以及B16三种细胞增殖抑制的作用，对MCF-7几乎没有作用，对MDA-MB-231和B16都有抑制作用。
图32显示不同浓度的DCDBS84对A549和NCI-H1975非小细胞肺癌细胞株都有一定的增殖抑制作用。
图33显示不同浓度的DCDBS84对破骨细胞的增殖抑制和破骨细胞分化的抑制作用。
图34显示不同浓度的DCDBS84能够有效抑制破骨细胞标志性基因的表达。
图35显示不同浓度的DCDBS84对Huvec(人脐静脉内皮细胞，有β3表达)的增殖抑制作用。
图36显示不同浓度的DCDBS84对HL-1(小鼠心肌细胞，有β3表达)的增殖抑制作用。
图37显示DCDBS84的衍生物(式I-XII)对血小板伸展的抑制作用，DCDBS84为对照。
图38显示DCDBS84的衍生物(式II-XV)对A549非小细胞肺癌的增殖抑制作用。
图39显示DCDBS84的衍生物(式II-XV)对MCF-7乳腺癌细胞的增殖抑制作用。
图40显示DCDBS84的衍生物(式II-XV)对MCF-7-β3细胞的增殖抑制作用。
图41显示DCDBS84的衍生物(式II-XV)对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用。
图42显示DCDBS84的衍生物(式II-XV)对Huvec细胞的增殖抑制作用。
图43显示DCDBS84的衍生物(式II-XV)对HL-1细胞的增殖抑制作用。
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，通过大量筛选，意外地发现一类特定的干扰整合素β3/Src相互作用的式I化合物能够(1)选择性抑制整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导，(2)预防和/或治疗整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导相关的疾病，(3)预防和/或治疗血栓，(4)预防和/或治疗肿瘤，(5)预防和/或治疗骨质疏松，(6)预防和/或治疗内皮细胞介导的血管形成，从而具有优异的治疗效果。
具体地，本发明的实验表明化合物DCDBS84能够靶向c-Src的SH3结构域，特异性解离β3与c-Src相互作用，抑制血小板的粘附、聚集、纤维蛋白凝块回缩，而不影响对可溶性纤维蛋白原的结合。在FeCl3诱导的颈动脉血栓模型中能够深度抑制血栓形成，在切尾实验中与阴性对照小鼠(DMSO处理)相比并没有增加小鼠的出血量，而对照药物埃替巴肽(Integrilin)处理组小鼠的出血量明显增加。在激光诱导的小鼠提睾肌动脉血栓模型中，化合物DCDBS84能够明显的抑制血小板血栓形成，而活化的血小板能够在伤口处铺上一层，防止出血。DMSO处理小鼠能够形成非常明显的血小板血栓，几乎将整个血管堵住。而Integrilin处理组也能够明显抑制血小板血栓形成，但是几乎没有血小板在伤口上，导致出现出血副作用的原因。此外，应用流体技术体外模拟血液在流动状态下血小板血栓形成情况，胶原包被管道模拟受损的内皮下胶原暴露，通过标记荧光的CD41抗体显示血小板血栓形成，发现在代表梗阻动脉的5000s-1的剪切力下，化合物DCDBS84能够较明显抑制血小板血栓形成；而在1500s-1剪切力(相当于末梢小动脉中的剪切力)时，化合物DCDBS84对血小板栓子没有明显抑制作用，这表明化合物DCDBS84既能够有效抗血栓同时对止血生理作用影响较小。该结果与体内激光诱导的小鼠提睾肌动脉血栓模型的结果一致。综上，可以看出本发明的式I化合物(特别是化合物DCDBS84)能够作为靶向c-Src激酶的SH3结构域并选择性抑制血小板外向内信号转导调控的相关血小板功能抑制剂，发挥抑制血小板血栓形成并且不影响生理性止血作用。
此外本发明的实验还表明，化合物DCDBS84能够特异性解离β3与c-Src相互作用，作为整合素β3与c-Src相互作用(β3RGT/c-Src SH3)抑制剂，除了影响血小板中αIIbβ3与c-Src的相互作用以外，还对αvβ3与c-Src的相互作用也产生影响，因而对有αvβ3表达的细胞的功能也会产生影响。本发明实验结果表明化合物DCDBS84对肿瘤、骨质疏松以及内皮细胞介导的相关疾病具有治疗作用。
术语
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，“Src激酶”为Src kinase，是一种非受体酪氨酸激酶。
如本文所用，“SH3”、“SH3结构域”、“SH3结构域蛋白”、“SH3蛋白”可互换使用。
应当理解，本领域的普通技术人员可以选择本发明的化合物上的取代基和取代型式以产生化学上稳定的化合物，所述化合物可以通过本领域己知的技术以及下文所阐述的方法合成。如果被超过一个(多个)取代基团取代，应当理解，这多个基团可以是在同一个碳上或在不同碳上，只要产生稳定的结构即可。
如本文所用，术语“取代”或“取代的”是基团上的氢原子被非氢原子基团取代，但需要满足其化合价要求并且由取代生成化学稳定的化合物，即不会自发进行诸如环化、消除等转变的化合物。
如本文所用，“R1”、“R1”和“R1”的含义相同，可相互替换，其它类似定义的含义相同。
如本文所用，
Figure BDA0002601171440000101
表示基团的连接位点。
如本文所用，术语“烷基”指只含碳原子的直链(即，无支链)或支链饱和烃基，或直链和支链组合的基团。当烷基前具有碳原子数限定(如C1-C10烷基)指所述的烷基含有1-10个碳原子，例如，C1-C4烷基指含有1-4个碳原子的烷基，代表性实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。
如本文所用，术语“亚烷基”是指烷基再去掉一个氢原子形成的基团。
在本发明中，术语“卤素”指F、Cl、Br或I。
在本发明中，术语“卤代”是指被卤素取代。
如本文所用，术语“卤代烷基”是指烷基的一个或多个(优选为1、2、3或4个)氢被卤素取代，所述的烷基和卤素如上所定义，当烷基前具有碳原子数限定(如C1-C6卤代烷基)指所述的烷基含有1-6个碳原子，例如，C1-C6卤代烷基指含有1-6个碳原子的卤代烷基，代表性实例包括但不限于-CF3、-CHF2、单氟代异丙基、双氟代丁基、或类似基团。
如本文所用，术语“环烷基”指具有饱和的或部分饱和的单元环，二环或多环(稠环、桥环或螺环)环系基团。当某个环烷基前具有碳原子数限定(如C3-C12)时，指所述的环烷基具有3-12个环碳原子。在一些优选实施例中，术语“C3-C8环烷基”指具有3-8个环碳原子的饱和或部分饱和的单环或二环烷基，包括环丙基、环丁基、环戊基、环庚基、或类似基团。“螺环烷基”指单环之间共用一个碳原子(称螺原子)的二环或多环基团，这些可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。“稠环烷基”指系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对碳原子的全碳二环或多环基团，其中一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。“桥环烷基”指任意两个环共用两个不直接连接的碳原子的全碳多环基团，这些可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。如下是环烷基的代表性实例，包括但不限于：
Figure BDA0002601171440000111
如本文所用，术语“亚环烷基”是指环烷基再去掉一个氢原子形成的基团。
如本文所用，术语“卤代环烷基”是指环烷基的一个或多个(优选为1、2、3或4个)氢被卤素取代，所述的环烷基和卤素如上所定义，当环烷基前具有碳原子数限定(如C3-C8卤代烷基)指所述的环烷基含有3-8个环碳原子，例如，C3-C8卤代烷基指含有3-6碳原子的卤代环烷基，代表性实例包括但不限于单氟代环丙基、单氯代环丁基、单氟代环戊基、双氟代环庚基，或类似基团。
术语“烷氧基”指R-O-基团，其中R为烷基，烷基为如上本文所定义，当烷氧基前具有碳原子数限定，如C1-C8烷氧基基指所述的烷氧基中的烷基具有1-8个碳原子。烷氧基的代表性示例包括但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基，或类似基团。
如本文所用，术语“烷硫基”指R-O-基团，其中R为烷基，烷基为如上本文所定义，当烷硫基前具有碳原子数限定，如C1-C8烷硫基指所述的烷硫基中的烷基具有1-8个碳原子。烷硫基的代表性示例包括但不限于：甲硫基、乙硫基、正丙硫基、异丙硫基、叔丁硫基，或类似基团。
术语“环烷氧基”指R-O-基团，其中R为环烷基，环烷基为如上本文所定义，当环烷氧基前具有碳原子数限定，如C3-C8环烷氧基基指所述的环烷氧基中的环烷基具有1-8个碳原子。烷烷氧基的代表性示例包括但不限于：环丙基-O-、环戊基-O-、环己基-O-，或类似基团。
术语“环烷硫基”指R-O-基团，其中R为环烷基，环烷基为如上本文所定义，当环烷硫基前具有碳原子数限定，如C3-C8环烷硫基基指所述的环烷硫基中的环烷基具有1-8个碳原子。烷烷硫基的代表性示例包括但不限于：环丙基-S-、环戊基-S-、环己基-S-，或类似基团。
如本文所用，术语“卤代烷氧基”是指卤代烷基-O-，所述的卤代烷基如上所定，例如，C1-C6卤代烷氧基指含有1-6个碳原子的卤代烷氧基，代表性实例包括但不限于、单氟代甲氧基、单氟代乙氧基、双氟代丁氧基、或类似基团。
如本文所用，术语“卤代烷硫基”是指卤代烷基-S-，所述的卤代烷基如上所定，例如，C1-C6卤代烷硫基指含有1-4个碳原子的卤代烷硫基，代表性实例包括但不限于、单氟代甲硫基、单氟代乙硫基、双氟代丁硫基、或类似基团。
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，是一种芳香环状烃类化合物基团，当芳基前面具有碳原子数限定，如C6-C12芳基，则指所述的芳基具有6-12个环碳原子，例如苯基和萘基。所述芳基环可以稠合于其它环状基团(包括饱和或不饱和环)，但不能含有杂原子如氮、氧、或硫，同时连接母体的点必须在具有共轭的π电子体系的环上的碳原子上。如下是芳基代表性实例，包括但不限于：
Figure BDA0002601171440000121
术语“杂芳基”指具有一个到多个(优选为1、2、3或4个)杂原子的芳族杂环系基团，其可以是单环(单环的)或者稠合在一起或共价地连接的多环(二环的、三环的或多环的)，每个含有杂原子的杂环上可以带有一个多个(如1、2、3、4个)各自独立选自下组的杂原子：氧、硫和氮。当杂芳基前有元数限定时，指的是杂芳基的环原子个数，例如5-12元杂芳基指的是具有5-12个环原子的杂芳基，代表性的例子包括但不限于：吡咯基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、三氮嗪基、三氮唑基及四氮唑基等。
如本文所用，术语“羧基”指具-COOH基团或-烷基-COOH基团，烷基为如上本文所定义，例如“C2-C4羧基”是指-C1-C3烷基-COOH结构的基团，羧基的代表性示例包括(但不限于)：-COOH、-CH2COOH、-C2H4COOH，或类似基团。
如本文所用，术语“酯基”指具R-C(O)-O-基团或-C(O)-O-R基团，其中R为烷基，烷基为如上本文所定义，例如“C2-C4酯基”是指C1-C3烷基-C(O)-O-结构的基团或者-C(O)-O-C1-C3烷基结构的基团，酯基的代表性示例包括但不限于：CH3COO-、C2H5COO-、C3H8COO-、(CH3)2CHCOO-、-COOCH3、-COOC2H5、-COOC3H8，或类似基团。
如本文所用，术语“酰基”指具R-C(O)-，其中R为烷基，烷基为如上本文所定义，例如“C2-C4酰基”是指C1-C3烷基-C(O)-结构的基团，酯基的代表性示例包括但不限于：CH3C(O)-、C2H5C(O)-、C3H8C(O)-、(CH3)2CHC(O)-，或类似基团。
如本文所用，术语“酰胺基”指具R-CO-N-基团或-CO-N-R基团，其中R为烷基，烷基为如上本文所定义，例如“C2-C4酰胺基”是指C1-C3烷基-CO-N-结构的基团或者-CO-N-C1-C3烷基结构的基团，酰胺基的代表性示例包括但不限于：CH3CO-N-、C2H5CO-N-、C3H8CO-N-、(CH3)2CHCO-N-、-CO-N-CH3、-CO-N-C2H5、-CO-N-C3H8，或类似基团。
如本文所用，在单独或作为其他取代基一部分时，术语"氨基"表示-NH2。
如本文所用，在单独或作为其他取代基一部分时，术语"硝基"表示-NO2。
如本文所用，在单独或作为其他取代基一部分时，术语"羟基"表示-OH。
如本文所用，在单独或作为其他取代基一部分时，术语"巯基"表示-SH。
在本说明书中，应解释为所有取代基为未取代的，除非在本文中明确描述为“取代的”。术语“取代”是指特定的基团上的一个或多个氢原子被特定的取代基所取代。特定的取代基为在前文中相应描述的取代基，或各实施例中所出现的取代基，优选地，所述的取代是指环或基团上的一个或多个(优选为1、2、3、4或5个)氢原子被选自下组的取代基所取代：C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8卤代环烷基、卤素、硝基、-CN、羟基、巯基、氨基、C1-C4羧基、C2-C4酯基、C2-C4酰胺基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷硫基、C1-C8卤代烷氧基、C1-C8卤代烷硫基、C6-C12芳基、5-10元杂芳基、5-10元杂环烷基。除非特别说明，某个任意取代的基团可以在该基团的任何可取代的位点上具有一个选自特定组的取代基，所述的取代基在各个位置上可以是相同或不同的。
在本发明中，术语“预防”表示预防疾病和/或它的附随症状的发作或者保护对象免于获得疾病的方法。本文中使用的"预防"还包括延迟疾病和/或它的附随症状的发作和降低对象的得病的风险。
本发明所述的“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，或消除疾病，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述的组合物、药盒、食品盒或保健品盒、活性成分组合时观察到的水平相比，本发明所述组合物或药物组合物通过抑制线粒体氧化磷酸化通路将相关疾病(如肿瘤)及其并发症减轻、抑制和/或逆转了例如至少约10％、至少约30％、至少约50％、或至少约80％。
整合素和整合素β3/Src相互作用
整合素αIIbβ3是由αIIb和β3两个亚基通过非共价键组成的跨膜异二聚体，主要表达于血小板及巨核细胞表面，是血小板表面主要的膜受体，可介导血小板双向信号转导，因此在血小板活化、维持血小板正常功能以及血栓形成中起关键作用。血小板激活剂如凝血酶、ADP等与相应受体作用后引起整合素αIIbβ3的构型改变并导致与其配体即可溶性纤维蛋白原等的亲和力增高，此过程为内向外信号转导，标志性事件是血小板的非稳定粘附、游离纤维蛋白原结合和可逆聚集等；整合素αIIbβ3被活化并结合配体，激活外向内信号转导，标志性事件是血小板的稳定粘附、伸展、不可逆聚集、纤维蛋白凝块回缩等，最终促使血小板相互聚集并形成较为稳定的血栓而完成止血和血栓形成的生理或病理过程。目前的共识是，止血和血栓形成的实现需要内向外和外向内信号转导共同参与，而血栓形成的病理过程需要在对抗高血流冲击力条件下增大血小板栓子，因此，血栓形成对外向内信号转导的依赖性相对更大。
整合素αIIbβ3作为介导血小板活化聚集、血栓形成的最终共同通路，因此是抗血栓药物研究的主要靶点。而事实上，以整合素αIIbβ3为抗血栓药物靶点的研究取得了重要的进展，目前主要集中于整合素αIIbβ3受体拮抗剂类药物，已获得很好的临床疗效。目前，经美国食品药物监督管理局(FDA)批准用于临床抗血栓治疗的整合素αIIbβ3受体拮抗剂类抗血小板药物有三种，即阿昔单抗、埃替巴肽、替罗非班。此类αIIbβ3受体拮抗剂通过干扰整合素αIIbβ3与其配体的相互作用而特异性地发挥抗血栓作用。但这一策略仍存在明显问题，αIIbβ3受体拮抗剂药物通过阻止整合素αIIbβ3结合其配体从而阻断双向信号转导，也就是在发挥抗血栓作用的同时影响了正常的止血功能。临床实验回顾统计显示，经整合素αIIbβ3拮抗剂类药物治疗的病人中约有2％发生严重的颅内出血，约有15％发生胃肠道出血，约有5-10％出现腹膜出血，另大约有60-80％受试患者于股动脉穿刺点出现明显出血。与经典的抗血栓药物阿司匹林、氯吡格雷一样，整合素αIIbβ3拮抗剂在发挥有效抗血栓作用的同时也导致患者出血风险的增加，这是目前抗血栓药物最常见也是最重要的副作用。所以，临床上抗血栓药物剂量的选择还要兼顾其出血副作用的奉献，致使目前难以通过增加抗血栓药物剂量来达到更好的抗血栓效果。因此，通过开发新一代不影响正常止血功能的抗血栓药物，将有可能在低风险的前提下获得更强的抗血栓疗效，这代表了抗血栓药物的发展方向。
整合素β3是结合血小板胞内信号分子并调节双向信号转导的主要亚基，其胞内段与信号分子的相互作用参与双向信号转导调控的研究受到学者的广发关注。近年来大量研究成果提示选择性抑制整合素αIIbβ3外向内信号转导，可抑制病理性血栓形成，且不引起自发性出血风险。因此，为达成更为合理的抗血栓新策略，科学合理的思路应该避免直接拮抗αIIbβ3受体而是通过干扰整合素β3与血小板胞内信号分子相互作用选择性调控外向内信号转导，实现在有效抗血栓的同时尽可能保留生理性止血功能。因此，目前面临的关键问题是涉及一种可实现临床转化应用的方式，最为可行的是小分子干扰策略，通过选择性调控人血小板整合素外向内信号转导，而基本上不影响血小板整合素内向外信号转导，在真正意义上实现有效抗血栓的同时不影响正常止血功能的抗血栓策略。
整合素αIIbβ3双向信号转导是两条相互联系单又相互区别的信号通路。近年来关于整合素β3胞浆段通过与胞浆信号蛋白分子相互作用调控双向信号转导的研究有了很大的进展，如β3-endonexin、ILK、talin head domain、kindlin-3等参与内向外信号转导调控；而c-Src、Gα13、Talin、VPS33B、Shc、JAM-A、Dok-1等参与外向内信号转导调控。其中，血小板整合素β3与c-Src相互作用的功能和机制研究最为清楚。组成性结合于整合素β3尾端RGT序列的c-Src在收到激活信号作用是发生激酶活性调变，进而磷酸化下游信号分子，是已被确认的外向内信号转导最基本的调控途径。现已确证Src家族基因c-Src、Hck、Fgr、Lyn等(特别是c-Src)缺陷或在Src激酶抑制剂的作用下，整合素β3T762A突变和β3Δ760-762缺失突变均能抑制外向内信号介导的血小板功能。β3亚基胞内末端三个氨基酸RGT与c-Src能够发生直接的相互作用，并且人工合成的RGT多肽能够特异性干扰血小板中整合素β3与c-Src的相互作用，并选择性抑制血小板外向内信号转导。因此，β3/c-Src相互作用在血小板整合素αIIbβ3介导的外向内信号转导中发挥非常重要的作用，这已成为学术界的共识。通过人工合成分子靶向β3/c-Src相互作用进而选择性抑制外向内信号转导具有发展为新一代抗血栓药物的潜能。
血小板在静息状态下，血小板膜的表面大约有8万个整合素αIIbβ3，当激活时血小板α颗粒释放整合素αIIbβ3同时胞内管道系统开放，并转移到膜上，提高数量以增强止血功能。整合素αIIbβ3由αIIb亚单位和β3亚单位以非共价键结合而成，其中αIIb亚单位分子量为140kD，由一条重链(含871个氨基酸)和一条轻链(含137个氨基酸)以二硫键连接,β3亚单位分子量为105kD，是一条由762个氨基酸组成的跨膜多肽。αIIb与β3亚单位均由较长的胞外段、跨膜的α螺旋以及较短的胞内段组成。整合素胞外段可以与纤维蛋白原、vWF因子等配体结合，它与配体的结合能力并非仅由胞外段调控，而是胞外、跨膜、胞内三部分均参与调节。电镜发现，两个亚单位的胞外段都有一个N端与配体结合的“头部”，连接在较长的C端的“腿部”上，再与跨膜段以及胞浆段连接。
晶体衍射进一步发现，α亚单位的“头部”由七个叶片状的折叠组成β-螺旋桨状结构域(β-propeller)，“腿部”由“thigh”、“Calf-1”和“Calf-2”结构域组成，并在“thigh”与“Calf-1”两个结构域之间形成腿的膝部；β亚单位的的“头部”由βA结构域以及类免疫球蛋白的“Hybrid”结构域组成，“腿部”由一个PSI(plexin-semaphorin-integrin，丛状蛋白-信号素-整合素)结构域，四个EGF(epidermal growth factor，表皮生长因子)结构域以及一个β尾部结构域组成，并在“EGF-1”与“EGF-2”两个结构域之间形成腿的膝部。当整合素静息时，两个亚单位的腿部均呈“V”字型屈曲状态，使得亚单位的头部靠近细胞膜，遮蔽了与配体的结合位点，整合素αIIbβ3与配体的亲和力较低。当血小板激动剂如凝血酶、二磷酸腺苷等与血小板膜上的相应受体作用后，通过一系列信号转导，踝蛋白头部与整合素β3胞浆近膜段结合，破坏维系αIIbβ3静息状态αIIbR995-β3D723之间的盐桥。整合素αIIbβ3的空间构象发生改变，由“屈曲”转变为“伸展”状态。配体结合位点暴露，对配体亲和力增加，这一过程称之为“内向外”信号转导(inside-out signaling)，功能上表现为血小板结合可溶性纤维蛋白原、血小板初步黏附以及一相聚集。构象改变后的整合素αIIbβ3受体发生集簇，与激酶和锚定蛋白聚集、结合，导致钙内流、蛋白酪氨酸磷酸化、骨架蛋白重组等一系列信号转导，这个过程称之为“外向内”信号转导(outside-in signaling)，功能上表现为血小板的稳定黏附和伸展、二相聚集、纤维蛋白凝块回缩。整合素αIIbβ3通过这样的双向信号转导来完成其在血栓与止血中的作用，内向外信号转导完成整合素的初步活化，初步黏附和可逆聚集，基本实现止血功能，而外向内信号转导实现血小板的伸展、不可逆聚集、纤维蛋白凝块形成牢固血栓，更多在血栓形成中发挥作用。
整合素αIIbβ3的胞浆段很短，但却能够和许多胞内蛋白以及激酶结合，发挥调节整合素αIIbβ3信号转导的重要作用，与β3胞浆段相互作用的蛋白有细胞骨架蛋白踝蛋白、α辅肌动蛋白、细丝蛋白和肌球蛋白等，激酶有Src激酶家族，整合素连接激酶(ILK)，粘着斑激酶(FAK)等，调节蛋白有β3-内联蛋白和细胞附着蛋白-1。近年来，Src激酶在整合素αIIbβ3双向信号转导尤其是外向内信号转导中所起的作用引起了众多学者的兴趣。Src激酶是SFK(Src家族激酶蛋白)家族的一员，SFK家族共包含9个成员，其中的Src、Fyn、Yes广泛存在于体内的各个组织，对于细胞的生长、发育、分化等起着重要的调控作用，当小鼠缺失这三种激酶时则因发育缺陷而胚胎死亡。Src激酶从N端到C端由SH3、SH2、激酶区、C末端区结构域组成，Csk激酶可以结合在SH2结构域上并且磷酸化Src激酶C末端上的Y527，从而维持Src激酶封闭构象，使其处于非活化状态。在某些信号刺激下，Csk激酶可以离开Src激酶的SH2结构域，Y527从而发生去磷酸化，并且使得Src激酶的Y416发生磷酸化，从而使Src具有激酶活性并可以磷酸化下游底物，参与细胞的信号转导。
目前的研究显示，Src激酶的SH3结构域与整合素β3C末端的RGT三个氨基酸形成组成性结合。血小板在静息状态下，β3-Src(SH3)-Src(SH2)-Csk形成复合物，构成整合素αIIbβ3外向内信号转导的基础。当小鼠血小板缺乏Src激酶时，整合素αIIbβ3的外向内信号转导受到抑制，而用Src激酶抑制剂作用于血小板，其外向内信号转导也受到明显抑制。当整合素活化后的外向内信号转导中，Src激酶与β3C末端的RGT序列相互作用，并且发生β3胞浆段Y747和Y759的磷酸化，成为外向内信号转导的重要事件。当在CHO细胞中转入αIIbβ3Δ759，较αIIbβ3的CHO细胞其外向内信号明显受抑，而在小鼠中敲除整合素αIIbβ3-RGT序列其外向内信号明显受损，Y747和Y759磷酸化受抑。Ablooglu,A.J.等建立了整合素αIIbβ3Δ759转基因小鼠，即RGT敲除小鼠。结果显示，和对照小鼠相比，RGT敲除小鼠血小板在固相纤维蛋白原上的伸展受抑；纤维蛋白凝块回缩也收到抑制；Y747的磷酸化受损；但在PAR4及糖蛋白VI作为激动剂的游离纤维蛋白原结合不受影响。体内实验证实，RGT敲除小鼠可避免FeCl3刺激颈动脉导致的血栓形成；在切尾实验中，部分小鼠出血时间延长，但是没有出现自发性出血、手术后大出血、血便、血尿、贫血等情况。作者认为敲除整合素αIIbβ3的RGT序列可以影响c-Src激酶参与的αIIbβ3信号转导，可避免动脉血栓形成；抑制了整合素αIIbβ3的外向内信号转导，而对内向外信号转导仅有部分影响。
通过Myr-RGT阐述了干扰整合素αIIbβ3RGT序列与Src激酶SH3结构域的结合可以选择性抑制外向内信号转导，该机制研究为应用研究奠定了基础。但由于模拟肽受到低效能的限制，难以应用到体内，成为药物化乃至应用到临床的重大障碍。所以亟需探索、寻找一批新的小分子化合物，能够以该结合位点作为靶点，并且足够高效应用到体内。因此，通过人工合成小分子化合物靶向β3/c-Src相互作用进而选择性抑制外向内信号转导，基本不影响内向外信号转导，具有发展为新一代抗血栓药物的潜能。
综上，目前抗血栓药物研发的最大难题在于，该类药物研发的难点是能够将同步发生的血小板血栓形成和止血功能分开，即将血小板的外向内信号转导和内向外信号转导区分开来进行抑制，虽然目前有研究发现一些寡肽或多肽能够选择性抑制血小板外向内信号(与血栓形成有关)而对内向外信号(与止血功能有关)影响较小，但是由于该类模拟肽透膜性较差，利用效能较低，难以应用到体内，成药性较差，成为药物化乃至应用到临床的重大障碍。目前尚无针对β3与c-Src蛋白-蛋白相互作用的抑制剂的报道。
除了在血小板和巨核细胞中特异性表达的αIIbβ3，整合素αvβ3在体内分布广泛，如内皮细胞、破骨细胞、肿瘤细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等，介导血管形成、骨吸收、肿瘤转移等多种病理生理过程。由于αIIbβ3和αvβ3的β3亚单位完全相同，那么由β3/c-Src相互作用在其他组织和细胞中介导的病理生理作用也有可能会被β3与c-Src蛋白-蛋白相互作用的抑制剂所影响。目前尚无针对β3与c-Src蛋白-蛋白相互作用的抑制剂的对内皮细胞、破骨细胞、肿瘤细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等αvβ3表达细胞作用效果的报道
Src和c-Src
Src作为一个癌基因蛋白起初发现于Rous肉瘤逆转录病毒(retrovirus roussarcoma virus)，随后发现在细胞中普遍存在高度保守并与其同源的v-Src。
Src激酶家族是具有酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase，PTK)活性的蛋白质，其中c-Src是Src激酶家族的一个重要组成部分。
活性成分
如本文所用，“本发明化合物”、“本发明式I化合物”、或“式I化合物”可互换使用，指具有式I结构的化合物，或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐。应理解，该术语还包括上述组分的混合物。
Figure BDA0002601171440000161
具体地体地，所述的式I化合物如上本发明第一方面所述。
术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐，适合形成盐的酸包括(但并不限于)：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。一类优选的盐是本发明化合物与碱形成的金属盐，适合形成盐的碱包括(但并不限于)：氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠等无机碱、氨水、三乙胺、二乙胺等有机碱。
本发明所述的如式I所示化合物可通过常规方法转化为其药学上可接受的盐，例如，可将相应的酸的溶液加入到上述化合物的溶液中，成盐完全后除去溶剂即得本发明所述化合物的相应的盐。
本发明优选的化合物选自下组：
Figure BDA0002601171440000171
用途
本发明还提供一种本发明化合物用于选自下组的一种或多种用途：(1)选择性抑制整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导；(2)预防和/或治疗整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导相关的疾病；(3)预防和/或治疗血栓；(4)预防和/或治疗肿瘤；(5)预防和/或治疗骨质疏松；(6)预防和/或治疗内皮细胞介导的血管形成。
在本发明的一个优选例中，所述抑制整合素β3与Src激酶相互作用包括抑制整合素β3与Src激酶的SH3结构域的相互作用。
在另一优选例中，所述的选择性抑制整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导是指选择性抑制整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导但不影响内向外信号转导。
在另一优选例中，所述的整合素β3与Src激酶相互作用是指血小板中的整合素β3与c-Src激酶相互作用。
在另一优选例中，所述的整合素β3为整合素αIIbβ3和/或整合素αvβ3的β3。
在另一优选例中，所述的整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导相关的疾病包括(但不限于)：血栓、肿瘤、骨质疏松、内皮细胞介导的血管形成，或其组合。
在另一优选例中，所述的预防和/或治疗血栓包括抗血栓和改善出血。
在另一优选例中，所述的改善出血包括抑制出血、不增加出血风险、降低出血风险、不会引起出血副作用和/或不影响止血功能。
在另一优选例中，所述的止血功能包括血小板止血功能。
在另一优选例中，所述的止血包括生理性止血。
在另一优选例中，所述的血栓为心脑血管性疾病血栓，所述的血栓为心脑血管性疾病血栓包括(但不限于)：心肌梗塞血栓、脑梗塞血栓、缺血性卒中、动脉粥样硬化血栓，或其组合。
在另一优选例中，所述的预防和/或治疗血栓包括选自下组的一种或多种方式进行：
(3-1)抑制血小板在固相纤维蛋白原上的伸展功能；
(3-2)抑制血小板的聚集、粘附和/或伸展；
(3-3)抑制纤维蛋白凝块回缩；
(3-3)不影响血小板结合游离纤维蛋白原结合功能；
在另一优选例中，所述抑制血小板的聚集包括抑制血小板的一相聚集或二相聚集
在另一优选例中，所述的预防和/或治疗肿瘤包括选自下组的一种或多种方式进行：
(4-1)抑制肿瘤细胞的生长或增殖；
(4-2)抑制肿瘤血管的形成或生长；
在另一优选例中，所述的肿瘤包括(但不限于)：实体瘤、血液系统肿瘤，或其组合。
在另一优选例中，所述的实体瘤包括(但不限于)：肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括(但不限于)：肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括(但不限于)：肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的肺癌包括(但不限于)：小细胞肺癌、非小细胞肺癌、心肌癌，或其组合。
在另一优选例中，所述的预防和/或治疗骨质疏松包括选自下组的一种或多种方式进行：
(5-1)抑制破骨细胞的增殖和分化。
在另一优选例中，所述的预防和/或治疗内皮细胞介导的血管形成包括选自下组的一种或多种方式进行：
(6-1)抑制内皮细胞的增殖；
在另一优选例中，所述的血管选自下组：肿瘤血管、脐静脉血管，或其组合。
在另一优选例中，所述的内皮细胞选自下组：肿瘤血管内皮细胞、脐静脉血管内皮细胞，或其组合。
组合物或制剂、活性成分的组合和药盒和施用方法
本发明还提供一种组合物，所述的组合物包含本发明式I化合物。
本发明所述的组合物优选为药物组合物。本发明所述的组合物可以包括药学上可接受的载体。
如本文所用“药学上可接受的载体”是指一种或多种相容性固体、半固体、液体或凝胶填料，它们适合于人体或动物使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”是指药物组合物中的各组分和药物的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低药效。
应理解，在本发明中，所述的药学上可接受的载体没有特别的限制，可选用本领域常用材料，或用常规方法制得，或从市场购买得到。药学可接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等)、明胶、滑石粉、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油、等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、缓冲剂、螯合剂、增稠剂、pH调节剂、透皮促进剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、抑菌剂、无热原水等。
在本发明中，组合物和制剂的剂型包括但不限于口服制剂、注射制剂、外用制剂。
代表性地，合物和制剂的的剂型包括但不限于：片剂、注射剂、输液剂、膏剂、凝胶剂、溶液剂、微球、膜剂。
典型地，所述的注射剂为瘤内注射剂。
药物制剂应与给药方式相匹配，优选的给药方式为口服给药、注射给药(如瘤内注射)，使用时，是将治疗有效量的药物施用于所需对象(如人或非人哺乳动物)。如本文所用，术语“治疗有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“治疗有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。
在一个施用方式中，第一活性成分的安全有效日使用剂量通常至少约0.1mg，而且在大多数情况下不超过约2500mg。较佳地，该剂量是1mg-500mg；第二活性成分的安全有效量通常至少约0.01mg，而且在大多数情况下不超过2500mg。较佳地，该剂量范围是0.1mg至2500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是在熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
1、本发明意外地开发发现本发明化合物(如化合物DCDBS84)能够有效的解离整合素β3与c-Src相互作用，抑制血小板的粘附、聚集、纤维蛋白凝块回缩，而不影响对可溶性纤维蛋白原的结合，从而能够特异性抑制血小板外向内信号(与血栓形成有关)而基本不影响血小板内向外信号(与止血功能有关)，进而能够实现在深度抗血栓的同时不引起出血副作用，能够成为新一代预防和治疗血栓相关心脑血管疾病的有效药物。
2、本发明的化合物(如化合物DCDBS84)能够抑制肿瘤的生长和转移、通过抑制破骨细胞而发挥对骨质疏松的治疗作用和对内皮细胞的抑制作用能够发展成为抑制肿瘤血管形成，此外，本发明的化合物对内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞及其他αvβ3表达细胞也具有一定的作用。
3、本发明化合物为小分子化合物，成药性好、副作用低等优点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例
化合物的结构式如下：
Figure BDA0002601171440000201
符号代表：
“RGDS”为αIIbβ3拮抗剂。
“ADP”为二磷酸腺苷。
实施例1：靶向β3/c-Src相互作用小分子化合物的筛选模式图。
基于SH3:RGT复合物的晶体结构(PDB编号：4HXJ)，我们采用分子对接的方法对含有20万个小分子化合物的SPECS进行了虚拟筛选，分子对接使用的软件为Glide，对接模式为extra precision,从对接结果中，挑选打分前1200名的小分子化合物，去重后共得到898个候选小分子，然后对这898个小分子进行聚类分析，从聚类结果中，挑选了124个小分子，购买实体化合物，筛选模式图如图1。
实施例2：小分子化合物DCDBS84对血小板在固相纤维蛋白原上伸展的影响。
首先在96孔板中加50μl纤维蛋白原(0.1M，pH 8.3的碳酸氢钠稀释，20μg/ml)，4℃包被过夜。次晨经PBS洗涤3次后以牛血清白蛋白(20mg/ml)37℃封闭60min，然后取洗涤血小板悬液100μl，分别加入各组小分子化合物使得终浓度为250μM，在37℃下孵育60min。取50μl孵育后的血小板加到96孔板中，于37℃温箱中黏附60min，通过PBS洗涤3次去除未黏附的血小板，以4％多聚甲醛固定稳定黏附的血小板，PBS洗涤3次。随后以0.5％曲拉通X-100对血小板膜打孔，再用0.5μg/ml鬼笔环肽-罗丹明在37℃下染血小板60min，并以PBS洗涤3次(每次10min)。洗涤结束后，用荧光显微镜(Leica)观察其荧光显色，降低药物作用浓度，观察不同浓度梯度小分子化合物对于血小板在固相纤维蛋白原上伸展功能的影响。结果如图2所示，从图2中可以看出，化合物DCDBS84在20-80μM的浓度梯度下可以不同程度地抑制血小板在固相纤维蛋白原上的伸展功能。
实施例3:在表面等离子共振实验中，测定化合物与蛋白SH3的解离常数图。
表面等离子共振测试在BIACORE T200仪器(GE公司)上进行。用10mM CH3COONa(pH4.2)将新鲜的纯化级Src激酶的SH3结构域蛋白(浓度2mg/ml)稀释至0.1mg/ml，然后通过标准氨基偶联方法将SH3结构域蛋白偶联至CM5芯片上。采用缓冲溶液(20mM Tris-HCl,PH8.0，100mM NaCl)将小分子化合物DCDBS84逐级稀释后，以20μl/s的流速连续进样60秒钟，解离120秒钟。记录随时间增长响应值的变化情况，经BIA Evaluation Software(GEHealthcare)程序分析获得化合物与SH3蛋白的解离常数Kd。如图3所示，从图3中可以看出，化合物DCDBS84与SH3蛋白的解离常数为980nM。
实施例4：检测小分子化合物DCDBS84对c-Src酪氨酸激酶活性的影响以及对含PXXP结构域蛋白与c-Src SH3经典结合的影响。
应用c-Src酪氨酸磷酸化试剂盒(MBL公司)检测不同浓度的DCDBS84、PP2(c-Src抑制剂)以及Dasatinib(酪氨酸激酶抑制剂)对c-Src酪氨酸激酶活性的影响。结果如图4所示，可以看出，不同浓度的DCDBS84均不抑制c-Src的酪氨酸激酶活性，而PP2和Dasatinib均能明显抑制c-Src的酪氨酸激酶活性。
此外，我们应用ELISA方法检测了DCDBS84、PP2和Dasatinib对含PXXP结构域多肽(RLP1)与c-Src SH3的结合的影响。细胞中与Src激酶存在相互作用的配体蛋白分子一般通过经典的(PXXP)基序靶向Src-SH3结构域，RLP1多肽(含经典的(PXXP)基序)是模拟细胞中与Src-SH3结构域相互作用多种配体蛋白分子共同的(PXXP)基序序列。具体的实验流程如下，96孔板每孔加入50μL含Flag抗体(Sigma)的包被液(1μg/mL,0.1M NaHCO3PH 8.3稀释)，4℃放置过夜。第2天用TBST洗3次，每次5min，加5％BSA封闭2h,再用TBST洗3次，备用。前期在293T细胞中分别转染pFlag-CMV4-Src(WT)及另4种Src突变型过表达载体(lipo 2000),48h后用RIPA裂解293T细胞30min，离心(4℃,18000rpm)收集裂解液上清，在包被Flag抗体的96孔板中每孔添加50μL裂解液上清，4℃放置过夜，各实验组留部分上清液做Westernblot相对定量。第3天，用TBST洗3次，每孔添加50μL生物素标记的RLP1及对照(RLA)多肽(1μg/mL)，37℃孵育1h。然后用TBST洗3次，每次5min，每孔添加50μL HRP标记的亲和素，37℃孵育1h。后再TBST清洗3次，每孔添加TMB显示液100μL，室温放置15min,再添加100μL硫酸(1M)终止反应，用酶标仪在450nm波长下检测各孔吸光值。结果如图5所示，从图5中可以看出，DCDBS84不影响RLP1与c-Src的相互作用，而PP2和Dasatinib都能明显抑制RLP1与c-Src的相互作用。
实施例5：采用Pull-down实验技术测定化合物在体外对SH3-RGT相互作用的干扰。
分别在原核中表达和纯化His-Src-SH3与GST-β3蛋白蛋白。具体方法如下：
Src-SH3野生型及突变型质粒由本实验室构建，表达载体为pET32A。N端带有Trx标签，His Tag以及凝血酶切割位点，纯化时使用Ni-NTA蛋白纯化柱(5mL HisTrap FFcolumn,GE,USA)。将Src-SH3野生型或突变型质粒转化到BL21感受态细胞中，在LB(含100μg/mL氨苄青霉素)平板上挑选阳性克隆。然后挑取克隆到10mL LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，摇床(37℃，220rpm)过夜培养。第2天，取5mL菌液接种到1L LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中进行扩大培养(37℃，220rpm)，待菌液在600nm波长下的光密度值在0.6-0.8时，将摇床的温度调整为16℃，继续培养1h(220rpm)。然后，添加400μL异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(1M)，诱导目的蛋白表达过夜12–14hs(16℃，220rpm)。第3天将菌液导入离心罐中，离心收集菌体(4℃，5000rpm，10min)。用预冷的buffer A(20mM Tris-HCl,PH 8.0,100mM Nacl)重悬沉底，在冰上超声破碎菌体(超声5s，停5s，功率40％，15min)，然后高速离心(4℃,18000rpm,40min)弃沉底，留上清。后将收集的上清液体以1mL/min的流速上样Ni-NTA蛋白纯化柱。在AKTA Pure系统(GE,USA)先用2％的buffer B(20mM Tris-HCl,PH 8.0,100mM Nacl,500mM iminazole)洗脱杂蛋白，待蛋白峰(UV_280)恒定后，调至8％的bufferB洗脱目的蛋白并收集，然后用20％buffer B完全洗脱目的蛋白并收集，最后用100％buffer B彻底洗净柱上的蛋白。向收集的蛋白洗脱液中加入凝血酶(2U/mL)室温处理12-16h。第4天，采用脱盐的方法(HiTrap Desalting纯化柱)除掉iminazole。然后再次以1mL/min的流速上样Ni-NTA蛋白纯化柱，流穿液即为切掉His Tag和Trx-标签的Scr-SH3蛋白。流穿液浓缩至1mL左右时，再通过分子筛Superdex 75(24mL,GE,USA)用buffer A进一步纯化。纯化后的蛋白用NanoDrop 2000测试浓度，然后加入甘油至终浓度为5％，-80℃保存。当实验需要保留His Tag标签时，则不经过凝血酶处理，其余操作不变。
GST-β3胞内段质粒构建在Pgex-6p1载体上，由本实验室保存。带GST Tag的β3胞内段蛋白(K716-T762)前期抽提过程与上面相似，但纯化方法与Src-SH3蛋白不同，使用GST亲和层析介质(GST Agarose)纯化。用预冷的PBS缓冲液重悬菌体，冰上超声，后高速离心(4℃,18000rpm,40min)保留上清，以0.5mL/min的流速上样GST亲和层析柱(GlutathioneSepharose 4Fast Flow)。然后在AKTK Pure系统上PBS洗杂，待UV_280恒定后，用含还原型谷胱甘肽(GSH，20mM)的PBS将GST-β3胞内段蛋白洗脱下来。将收集液浓缩后，用分子筛Superdex 75(24mL,GE,USA)进一步纯化，GST-β3胞内段蛋白的保存方法与上面相同。
将谷胱甘肽-琼脂糖树脂预处理成50％谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆，加入纯化的GST-β3胞内段蛋白，再加入纯化的带有His Tag的Src-SH3蛋白(野生型或突变型)4℃过夜翻转孵育。第2天早上离心(4℃,1000g,1min)，后用200μL buffer H(0.1％NP-40,50mMKCl,20％glycerol,0.007％β-mercaptoethanol,20mM HEPES,pH 7.7)洗涤沉淀3次。分析DCDBS84对野生型Src-SH3蛋白与Src-SH3蛋白相互作用，重悬沉淀并加入DCDBS84(250μM)或DMSO对照在4℃旋转孵育1h，最后再次洗涤，后用1×SDS loading buffer(100mM Tris-HCl，pH 6.8，5％β-mercaptoethanol，4％SDS，20％glycerol，0.1％bromophenol blue)煮样(100℃,10min)。通过Western blot检测靶蛋白。
结果如图6所示，可以看出，化合物DCDBS84可以呈浓度依赖性地抑制GST-β3与His-Src-SH3的结合。
实施例6：采用免疫共沉淀实验技术(Co-IP)测定化合在体外对SH3-RGT的相互作用。
应用Co-IP方法检测小分子化合物DCDBS84对β3与c-Src相互作用的影响。待DCDBS84与洗涤的人血小板孵育1h后，离心除上清，用IP buffer(碧云天生物技术有限公司)冰上裂解血小板30min，然后离心(4℃,12000rpm,15min)留上清，BCA蛋白定量。加入50μL预先经IP buffer洗涤过的Protein A/G琼脂糖珠子，4℃旋转孵育2h，离心(4℃,1000g,5min),再将上清转移到新的离心管中。在蛋白上清中加入抗整合素β3抗体SZ-21(10μg)或非特异性的鼠IgG(sc-2025，Santa Cruz Biotechnology，10μg)，于4℃旋转孵育抗原抗体混合物过夜。次晨向混合物中加入20μL预先经IP buffer洗涤的Protein A/G琼脂糖珠子，于4℃旋转孵育2h,随后离心(4℃,1000g,5min)，收集琼脂糖珠子-抗原抗体复合物，用预冷的PBS缓冲液洗涤3遍。最后用1×SDS loading buffer重悬琼脂糖珠子-抗原抗体复合物，100℃煮沸10min。通过Western检测免疫共沉淀物。
结果如图7所示，在对照组(未加药物)及DMSO组中，复合物中含有整合素β3及c-Src蛋白；而予以80μM DCDBS84处理血小板后，复合物中仅有整合素β3，而无c-Src蛋白。说明在80μM的浓度下，DCDBS84可以明显的抑制人血小板中整合素β3与c-Src的相互作用。
实施例7：小分子化合物DCDBS84对血小板在固相纤维蛋白原上黏附功能的影响。
黏附功能实验中纤维蛋白原的包被与封闭方法同伸展实验，首先取洗涤血小板悬液100μl，分别加入各组试剂使得终浓度分别为DMSO(250μM)、SMDBS84(20μM、40μM、80μM)、RGDS(1mM)在37℃下孵育60min。取50μl孵育后的血小板加到96孔板中，于37℃温箱中黏附60min。黏附完成后，PBS洗涤5次以去除未黏附以及不稳定黏附的血小板。再将对硝基酚磷酸二钠(PNPP)底物显色液以50μl/孔加到血小板黏附的孔中，置于37℃温箱孵育60min，加入等量1×氢氧化钠终止反应。最后酶标仪405nm波长下读OD值，以未加血小板孔作为空白对照，计算黏附的血小板量。每个样品设3个副孔，结果取均值。结果如图8所示，可以看出，化合物DCDBS84可以浓度依赖性地抑制血小板在固相纤维蛋白原上的黏附功能。
实施例8：小分子化合物DCDBS84对血小板聚集的影响。
首先取健康献血者静脉血10ml(枸橼酸钠抗凝)，300×g离心7min得到PRP，再以500×g离心10min得到乏血小板血浆(Platelet poor plasma,PPP)，用PPP调整PRP中血小板浓度至2×108/ml。再取200μl PPP以校正仪器透光聚集仪(Chrono-Log)零点。随后各组试剂分别与PRP于37℃孵育60min后，以200μl/管上聚集仪(37℃，1000rpm搅拌)，校正零点后加入诱导剂ADP(2μM)启动聚集，观察并记录聚集曲线。当以凝血酶作为诱导剂的血小板聚集，取洗涤血小板，调整血小板浓度为2×108/mL，加入0.1U/ml凝血酶启动反应，记录聚集曲线。结果如图9、图10所示，可以看出，化合物DCDBS84对于不同诱导剂作用的血小板聚集呈现浓度依赖性的抑制，对于ADP诱导剂下的血小板聚集，DCDBS84选择性抑制血小板二相聚集，而不影响一相聚集。
实施例9：小分子化合物DCDBS84对纤维蛋白凝块回缩功能的影响。
纤维蛋白凝块回缩是整合素αIIbβ3外向内信号转导介导的血栓形成中的重要步骤，血栓形成中，通过纤维蛋白凝块挤出血清，形成牢固的血栓。而回缩过程是通过整合素与纤维蛋白原、整合素与细胞骨架的相互作用而产生。本实验在硅化的聚集管观察化合物对血小板纤维蛋白凝块回缩功能的影响。为了观察化合物对血小板纤维蛋白凝块回缩的影响，将药物预先孵育的人类洗涤血小板加入含有Fg(2mg/ml)的HEPES缓冲液中，置入硅化后的聚集管，加入1U/mL的凝血酶启动反应，开始观察纤维蛋白凝块的形成。将聚集管置37℃温箱中孵育，然后在加入凝血酶后15min、30min、45min、60min分别观察纤维蛋白凝块回缩情况并拍照。用NIH Image 1.67e软件计算凝块体积，以Excel处理数据，凝块体积(clotsize)与初始体积比例为纵坐标、各时间段为横坐标作折线图反映凝块体积变化。结果如图11显示，可以看出，化合物DCDBS84抑制血小板纤维蛋白凝块回缩，并且其抑制程度呈剂量依赖性。图12是根据图11数据得到的统计结果。
实施例10：小分子化合物DCDBS84对ADP活化的血小板与游离纤维蛋白原的结合的影响。
前面的实验观察了化合物对血小板整合素αIIbβ3的外向内信号转导调控相关功能的影响，为了检测化合物对整合素αIIbβ3内向外信号通路中所调控的整合素αIIbβ3的活化状态、配体结合功能的影响，进行了血小板游离纤维蛋白原的结合实验。选用ADP诱导血小板整合素αIIbβ3活化，结合游离纤维蛋白原。再将化合物处理后的血小板先用20μM ADP刺激，然后加入100μg/ml Alexa Fluor 488标记的纤维蛋白原共孵育，通过流式细胞仪检测ADP活化的不同处理组血小板对Alexa Fluor 488标记的纤维蛋白原的结合量。结果如图13的流式细胞仪荧光结果所示，可以看出，当血小板被20μM ADP刺激后，对照(未用药组)血小板的荧光强度发生改变，结合Alexa Fluor 488-Fg的量高于阴性对照(Control)即未用ADP激活的血小板的游离纤维蛋白原结合量；化合物预处理的血小板的荧光强度即纤维蛋白原结合量与DMSO处理组的血小板相似，而在1mM的RGDS(αIIbβ3拮抗剂)下血小板对游离纤维蛋白原的结合几乎完全被抑制。
血小板的游离纤维蛋白原结合功能反映整合素αIIbβ3的活化状态，以及对配体的结合能力，是整合素αIIbβ3内向外信号转导介导的重要标志。图13结果表明，小分子化合物DCDBS84并不影响ADP诱导的血小板结合游离纤维蛋白原结合功能。提示小分子化合物DCDBS84对整合素内向外信号转导并无明显影响，并不影响整合素αIIbβ3从低亲和力到高亲和力状态的变构、配体结合以及受体活化功能。而RGDS，由于抑制了整合素αIIbβ3介导的内向外信号转导，致使ADP诱导的血小板结合游离纤维蛋白原的功能明显受抑制。
实施例11：用小分子化合物DCDBS84处理小鼠后检测劲动脉阻塞血栓形成的影响。
首先选取6周龄的C57BL/6小鼠作为实验对象。通过尾静脉注射的方式给药，DCDBS84给药量为2.5μg/g BW、5μg/g BW、10μg/g BW，对应的药物浓度为6.25μmol/kg BW、12.5μmol/kg BW、25μmol/kg BW。注射integrilin为阳性对照药物，给药量为0.18μg/g BW、4.2μg/g BW、16μg/g BW，对应的药物浓度为16μmol/kg BW、50μmol/kg BW、192μmol/kg BW。以注射DMSO和生理盐水的小鼠作分别作为DCDBS84和integrilin所对应的阴性对照。按照文献报道的实验方法，在注射药物后15min开始FeCl3刺激小鼠颈动脉，从而导致内皮的损伤，继而开始血栓形成过程，在FeCl3刺激的远心端以多普勒超声探头检测血流，当上游血栓形成并堵塞血管时，则血流下降。
结果如图14所示，从图14可以看出，相比较于对照组，应用化合物DCDBS84后，小鼠在FeCl3刺激下颈动脉血栓形成时间明显延长，而且呈现出时间依赖性，即在10μg/g BW效果最为明显，血栓形成时间约12.5min；在5μg/g BW时约7.5min；而当2.5μg/g BW时，血栓形成时间约5min，与对照组类似。0.18μg/g下的integrilin阻塞血栓形成时间约为6min，效能略低于5μg/g BW DCDBS84；4.2μg/g下的integrilin阻塞血栓形成时间约为7.5min，效能与5μg/g BW DCDBS84相当；16μg/g下的integrilin阻塞血栓形成时间约为12.5min，效能与10μg/g BW DCDBS84相当。结果表明，化合物DCDBS84对于小鼠动脉血栓形成起明显抑制作用，而且此作用为剂量依赖性。
实施例12：用小分子化合物DCDBS84处理小鼠后通过剪尾检测出血时间的影响。
就小分子化合物DCDBS84对止血功能影响进行评估，这是在血管破损后，血小板维持正常的止血功能，堵塞血管伤口的过程。首先自尾静脉注射药物.15min后在距离尾尖5mm处以锋利的刀片快速切断小鼠尾巴(tail-cut)，然后以每15s用滤纸来蘸小鼠尾巴渗出的血液，切勿触碰小鼠尾巴以免造成新的损伤。以出血停止而且15s不复发作为计时标准。
结果如图15所示，从图15可以看出，对照组约在160s时停止出血，而相比较于对照组，应用较高浓度化合物DCDBS84下(10μg/g BW)其出血时间未有明显延长，也约160s。而0.18μg/g和4.2μg/g的integrilin，由于阻断了整合素αIIbβ3与配体纤维蛋白原的结合，完全抑制了双向信号转导，包括在止血中起重要作用的内向外信号转导，从而出血时间明显延长(600s)。由于出血时间延长的限制，integrilin不能使用到足够的抗血栓剂量4.2μg/g甚至16μg/g，而只能用到低剂量0.18μg/g。
实施例13：用小分子化合物DCDBS84处理小鼠后实时检测提睾肌动脉血栓形成的影响。
此外，我们又采用更精准的激光诱导小鼠提睾肌微动脉血栓形成模型，实时分析DCDBS84对小鼠体内血栓形成的影响。
取8周龄野生型C57BL/6小鼠，通过尾静脉注射DCDBS84(10μg/g BW)，药物作用30分钟后，1％戊巴比妥腹腔麻醉小鼠，在体式显微镜下通过颈动脉注射抗CD41-FITC抗体以及抗CD62P红色荧光抗体，然后分离小鼠提睾肌小动脉，将小鼠转移到激光荧光显微镜下，应用激光器在小动脉内皮的部位进行激光照射造成损伤，荧光显微镜实时观察损伤部位的血栓形成情况。进行多点损伤后的统计学分析。绿光表示CD41(Alexa Fluor 488标记的血小板)，红光代表P-selectin(Alexa Fluor 633标记的活化血小板)。结果如图16所示，DCDBS84能显著抑制小鼠血栓斑块形成的大小，与DMSO对照组比较，DCDBS84处理组斑块内CD41荧光强度及斑块内活化血小板的数量(图17)均明显降低，该模型实验结果同样证实DCDBS84能抑制小鼠体内血栓形成。但是在受损血管内皮下仍有少量活化血小板粘附，这可能是DCDBS84基本不影响止血功能的基础。而对照药物integrilin能够显著抑制小鼠血栓斑块形成的大小(图16)，斑块内CD41荧光强度及斑块内活化血小板的数量(图17)几乎检测不到，在受损血管内皮下没有血小板粘附，这可能是integrilin会引起出血副作用的基础。
实施例14：体外流体技术检测小分子化合物DCDBS84处理对血小板在胶原包被管道中的血栓形成。
体外流体血小板黏附聚集实验是模拟血小板在血管中黏附聚集过程，该过程也由整合素αIIbβ3信号转导所介导。Integrilin是FDA通过的抑制整合素αIIbβ3与配体相互结合的抗血栓药物。
应用胶原包被Bioflux 200实验专用48孔板的实验孔过夜，第二天应用PBS洗后，用BSA封闭1-2小时，采集新鲜志愿者的外周血，应用水蛭素抗凝，加入DCDBS84(20μM、40μM、80μM)37℃孵育1-2小时，DMSO为阴性对照，Integrilin为阳性对照。经处理后的血液样本加入左侧的实验孔中，Bioflux 200操作界面设置流动的剪切力(500s-1、1500s-1、5000s-1)，不同处理组的样本会分别在设置的剪切力作用下从左侧的孔流入右侧的孔，通过荧光显微镜实时录像，捕获在包被的管道中血栓形成的情况的数据，后续进行统计分析。结果如图18显示，在剪切力为5000s-1(模拟体内大动脉出现病理性狭窄)条件下，DCDBS84和Integrilin处理组都能抑制血小板聚集黏附(图18)；而在剪切力为1500s-1(模拟体内末梢小动脉)条件下，Integrilin处理组的荧光信号明显较DMSO组和DCDBS84组低，表明Integrilin显著抑制血小板聚集黏附(图18)，而DCDBS84在此条件对血小板聚集黏附过程基本没有影响，这也是DCDBS84对正常止血功能几乎没有影响的机制；在剪切力为500s-1(模拟体内大动脉)条件下，与DMSO相比，DCDBS84也能一定程度上抑制血小板聚集。上述结果表明，在剪切力为5000s-1时，DCDBS84表现出明显的抗血小板聚集黏附作用，与Integrilin一样具有抗血栓作用；而在剪切率为1500s-1时，DCDBS84作用效果与Integrilin不同，DCDBS84对血小板聚集黏附的影响较小，从而不增加出血风险。上述结果表明，DCDBS84能抑制小鼠体内血栓形成且不增加出血风险。图19为根据图18数据的统计结果。
实施例15：小分子化合物DCDBS84对肿瘤细胞在固相纤维蛋白原上粘附的影响。
除了特异性表达于血小板和巨核细胞的αIIbβ3以外，整合素β3还可以与αv亚单位形成异二聚体αvβ3。由于αvβ3在体内分布广泛，在多种组织和细胞中表达，如肿瘤细胞等。我们检测了抑制β3/c-Src相互作用的小分子化合物DCDBS84对几种肿瘤细胞在固相纤维蛋白原上粘附的影响。
首先在96孔板中加50μl纤维蛋白原(0.1M，pH 8.3的碳酸氢钠稀释，20μg/ml)，4℃包被过夜。首先取各种肿瘤细胞，计数保证各组细胞数量一致，分别加入各组试剂使得终浓度分别为DMSO(250μM)、DCDBS84(20μM、40μM、80μM)、RGDS(1mM)在37℃下孵育60min。取50μl孵育后的肿瘤细胞加到96孔板中，于37℃温箱中粘附60min。粘附完成后，PBS洗涤5次以去除未粘附以及不稳定粘附的细胞。再将对硝基酚磷酸二钠(PNPP)底物显色液以50μl/孔加到细胞黏附的孔中，置于37℃温箱孵育60min，加入等量1×氢氧化钠终止反应。最后酶标仪405nm波长下读OD值，以未加细胞孔作为空白对照，计算粘附的肿瘤细胞数量。每个样品设3个复孔，结果取均值。
如图20所示，对于本身没有β3表达的MCF-7乳腺癌细胞，该细胞不能在固相纤维蛋白原上粘附；当把β3在MCF-7中过表达后，MCF-7-β3细胞能够在固相纤维蛋白原上粘附，不同浓度的DCDBS84处理能够抑制MCF-7-β3细胞在固相纤维蛋白原上粘附；当把β3Δ759(C末端RGT截短体)转染到MCF-7时，MCF-7-β3Δ759细胞在固相纤维蛋白原上粘附收到抑制，其效果与MCF-7-β3应用DCDBS84处理的效果相当。
此外，对于有β3表达的MDA-MB-231(人乳腺癌细胞，图21)和B16(小鼠黑色素瘤细胞，图22)，DCDBS84能够一定程度地抑制细胞在固相纤维蛋白原上粘附。
实施例16：小分子化合物DCDBS84对几种细胞在划痕区域细胞生长的影响。
细胞划痕实验能够反映细胞的增殖和迁移能力，以此可以一定程度的预测细胞的增殖和转移情况。我们检测了小分子化合物DCDBS84对几种细胞在划痕区域细胞生长的影响。
取各种肿瘤细胞，计数保证各组细胞数量一致，将细胞铺于6孔板中过夜，分别加入各组试剂使得终浓度分别为DMSO(250μM)、DCDBS84(20μM、40μM、80μM)、RGDS(1mM)在37℃下孵育60min。用移液器枪头在每个空的中间区域用力划出一条直径约1cm的划痕，然后继续培养细胞12h,24h,36h,48h后，于倒置显微镜下拍照观察划痕区域的肿瘤细胞生长情况。
图23显示高浓度的DCDBS84能够抑制划痕区域的B16细胞的生长，提示能够抑制肿瘤转移；图24显示不同浓度的DCDBS84能够抑制划痕区域的MDA-MB-231生长；图25表示MCF-7细胞，因为没有β3表达，所以无论是否应用DCDBS84处理，在划痕区域都没有细胞能够生长；图26表示MCF-7细胞转染了全长的β3，DCDBS84能够浓度依赖性抑制划痕区域的MCF-7-β3细胞的生长，提示能够抑制肿瘤转移；图27显示MCF-7细胞转染β3Δ759(C末端RGT截短)，无论时是否应用DCDBS84，划痕区域细胞的生长都较少，其细胞生长情况介于MCF-7和MCF-7-β3之间；图28表示MCF-7、MCF-7-β3以及MCF-7-β3Δ759三种细胞在划痕区域细胞生长的比较，提示β3/c-Src相互作用在细胞生长和粘附中的重要作用；图29显示不同浓度的DCDBS84能够抑制划痕区域的NIH-3T3(小鼠胚胎成纤维细胞系，有αvβ3表达)生长。
实施例17：小分子化合物DCDBS84对几种肿瘤细胞增殖的影响。
我们检测了小分子化合物DCDBS84对几种肿瘤细胞增殖的影响。
取各种肿瘤细胞，计数保证各组细胞数量一致，将细胞铺于96孔板中过夜，分别加入各组试剂使得终浓度分别为DMSO(250μM)、DCDBS84(20μM、40μM、80μM)、RGDS(1mM)在37℃下孵育24h或48h。加入1/10体积的CCK-8染色，37℃下孵育4h,酶标仪405nm波长下读OD值，以未加细胞孔作为空白对照，计算细胞增殖抑制率。每个样品设3个复孔，结果取均值。
结果如下：图30显示了不同浓度的DCDBS84对MCF-7、MCF-7-β3以及MCF-7-β3Δ759三种细胞增殖抑制的作用比较，对MCF-7几乎没有作用，对MCF-7-β3作用最明显，对MCF-7-β3Δ759作用较弱；图31表示不同浓度的DCDBS84对MCF-7、MDA-MB-231以及B16三种细胞增殖抑制的作用，对MCF-7几乎没有作用，对MDA-MB-231和B16都有抑制作用；上述结果提示，DCDBS84对于没有β3表达的细胞几乎没有增殖抑制作用，对于有β3表达细胞，可能通过抑制β3/c-Src相互作用而发挥细胞增殖抑制作用。图32显示不同浓度的DCDBS84对A549和NCI-H1975非小细胞肺癌细胞株都有一定的增殖抑制作用。
实施例18：小分子化合物DCDBS84对破骨细胞增殖和分化的影响。
由于αvβ3在破骨细胞中也有表达，因此，我们检测了小分子化合物DCDBS84对破骨细胞增殖和分化的影响。
取破骨细胞，计数保证各组细胞数量一致，将细胞铺于96孔板中过夜，分别加入试剂使得终浓度为DCDBS84(1μM、5μM、10μM、20μM)，在37℃下孵育24h或48h。加入1/10体积的CCK-8染色，37℃下孵育4h,酶标仪405nm波长下读OD值，以未加细胞孔作为空白对照，计算细胞增殖抑制率。每个样品设3个复孔，结果取均值。
正常骨代谢是通过成骨细胞生长与破骨细胞建立骨吸收而维持平衡。破骨细胞的标记酶是抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)，细胞处理方法同上，应用DCDBS84处理细胞后，加入TRAP酶活性染色的显色底物溶液，然后应用酶标仪405nm波长下读OD值，以未加细胞孔作为空白对照，计算TRAP活性。细胞处理方法同上，将细胞铺于6孔板中，6孔板中提前放入灭菌盖玻片，让细胞铺于盖玻片上，对细胞进行上述处理后，应用TRAP酶活性染色的显色底物溶液对细胞进行处理后，显微镜拍照观察。图33A展示了不同浓度的DCDBS84对破骨细胞的增殖抑制作用，显示20μM DCDBS84处理能够明显抑制破骨细胞的增殖；图33B不同浓度的DCDBS84对破骨细胞分化的影响，结果显示DCDBS84能够浓度依赖性抑制破骨细胞的分化；图33C、33D显示了不同浓度的DCDBS84能够抑制破骨前提细胞的分化。图34显示不同浓度的DCDBS84能够有效抑制破骨细胞的数量。提示小分子化合物DCDBS84能够抑制破骨细胞的增殖和分化。
实施例19：小分子化合物DCDBS84对内皮细胞和心肌细胞增殖的影响
由于αvβ3在内皮细胞和心肌细胞中有表达，因此，我们检测了小分子化合物DCDBS84对内皮细胞和心肌细胞增殖的影响。
取心肌细胞，计数保证各组细胞数量一致，将细胞铺于96孔板中过夜，分别加入各组试剂使得终浓度分别为DMSO(250μM)、DCDBS84(0.1μM、1μM、10μM、50μM)，在37℃下孵育24h或48h。加入1/10体积的CCK-8染色，37℃下孵育4h,酶标仪405nm波长下读OD值，以未加细胞孔作为空白对照，计算细胞增殖抑制率。每个样品设3个复孔，结果取均值。
结果显示：不同浓度的DCDBS84对Huvec(人脐静脉内皮细胞，有β3表达)的增殖具有抑制作用(图35)；不同浓度的DCDBS84对HL-1(小鼠心肌细胞，有β3表达)的增殖具有抑制作用(图36)。
实施例20：小分子化合物DCDBS84的结构衍生物(式II-XII)对血小板在固相纤维蛋白原上伸展的影响。
除了小分子化合物DCDBS84以外，我们还合成了其结构衍生物(式II-XII)，检测了这些衍生物对血小板在固相纤维蛋白原上伸展的影响。
血小板伸展实验的基本过程如下：首先在96孔板中加50μl纤维蛋白原(0.1M，pH8.3的碳酸氢钠稀释，20μg/ml)，4℃包被过夜。次晨经PBS洗涤3次后以牛血清白蛋白(20mg/ml)37℃封闭60min，然后取洗涤血小板悬液100μl，分别加入各组DCDBS84的结构衍生物(式II-XII)使得终浓度分别为1μM、10μM、50μM、100μM、62.5μM、125μM、250μM，在37℃下孵育60min。取50μl孵育后的血小板加到96孔板中，于37℃温箱中黏附60min，通过PBS洗涤3次去除未黏附的血小板，以4％多聚甲醛固定稳定黏附的血小板，PBS洗涤3次。随后以0.5％曲拉通X-100对血小板膜打孔，再用0.5μg/ml鬼笔环肽-罗丹明在37℃下染血小板60min，并以PBS洗涤3次(每次10min)。洗涤结束后，用荧光显微镜(Leica)观察其荧光显色，降低药物作用浓度，观察不同浓度梯度小分子化合物对于血小板在固相纤维蛋白原上伸展功能的影响。
结果显示，这些衍生物都能不同程度的抑制血小板在固相纤维蛋白原上伸展(图37)，有些作用与DCDBS84相当，有些作用强于DCDBS84。
实施例21：小分子化合物DCDBS84的结构衍生物(式II-XII)对几种肿瘤细胞增殖的影响。
取各种肿瘤细胞，计数保证各组细胞数量一致，将细胞铺于96孔板中过夜，分别加入各组DCDBS84的结构衍生物(式II-XII)使得终浓度分别为DMSO(250μM)、DCDBS84(0.1μM、1μM、10μM、50μM)在37℃下孵育24h或48h。加入1/10体积的CCK-8染色，37℃下孵育4h,酶标仪405nm波长下读OD值，以未加细胞孔作为空白对照，计算细胞增殖抑制率。每个样品设3个复孔，结果取均值。
检测了式II-XII对肺癌(图38)、乳腺癌(图39、图40、图41)的增殖抑制作用，发现这些衍生物对肺癌和乳腺癌都能发挥一定的增殖抑制作用。
实施例22：小分子化合物DCDBS84的结构衍生物(式II-XII)对内皮细胞增殖的影响。
取内皮细胞，计数保证各组细胞数量一致，将细胞铺于96孔板中过夜，分别加入各组DCDBS84的结构衍生物(式II-XII)使得终浓度分别为DMSO(250μM)、DCDBS84(0.1μM、1μM、10μM、50μM)在37℃下孵育24h或48h。加入1/10体积的CCK-8染色，37℃下孵育4h,酶标仪405nm波长下读OD值，以未加细胞孔作为空白对照，计算细胞增殖抑制率。每个样品设3个复孔，结果取均值。
检测了式II-XV对Huvec内皮细胞(图42)的增殖抑制作用，发现这些衍生物对Huvec内皮细胞能发挥一定的增殖抑制作用。
实施例23：小分子化合物DCDBS84的结构衍生物(式II-XII)对心肌细胞增殖的影响。
取心肌细胞，计数保证各组细胞数量一致，将细胞铺于96孔板中过夜，分别加入各组DCDBS84的结构衍生物(式II-XII)使得终浓度分别为DMSO(250μM)、DCDBS84(0.1μM、1μM、10μM、50μM)在37℃下孵育24h或48h。加入1/10体积的CCK-8染色，37℃下孵育4h,酶标仪405nm波长下读OD值，以未加细胞孔作为空白对照，计算细胞增殖抑制率。每个样品设3个复孔，结果取均值。
检测了式II-XV对小鼠心肌细胞(HL-1)(图43)的增殖抑制作用，发现这些衍生物对HL-1能发挥一定的增殖抑制作用。
总结：
综合上述具体实施例测定结果，本发明的化合物以及衍生物能够通过抑制整合素β3/c-Src相互作用而发挥对血小板外向内信号介导的功能的影响，而对内向外信号介导的功能几乎不影响，从而有效的抑制了血小板的聚集、粘附、伸展和纤维蛋白凝块回缩等与外向内信号相关的血小板功能，而对于与游离纤维蛋白原结合等与内向外信号相关的血小板功能基本上没有影响。在小鼠体内的研究显示，本发明的化合物能够有效的实现深度的抗血栓而基本不影响生理性止血功能。首次在化合物的层面实现了将血小板血栓形成和止血这一对同向调节的作用分别进行调控，为开发新一代抗血栓药物提供了全新的视角和前景。除了特异性表达于血小板和巨核细胞的αIIbβ3以外，整合素β3还可以与αv亚单位形成异二聚体αvβ3。由于αvβ3在体内分布广泛，在多种组织和细胞中表达，如肿瘤细胞、破骨细胞、内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞等。我们也检测了本发明的化合物以及衍生物对这些有αvβ3表达细胞的增殖、在固相纤维蛋白原上的粘附、在划痕区域的细胞生长和迁移等，发现化合物及衍生物能够通过抑制整合素β3/c-Src相互作用也能够对肿瘤细胞、破骨细胞、内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞等发挥一定的抑制肿瘤细胞增殖、粘附和迁移，发挥对多种恶性肿瘤的治疗作用；抑制破骨细胞增殖和分化，发挥对骨质疏松的预防和治疗作用；抑制内皮细胞的增殖，以及由内皮细胞介导的肿瘤血管形成等相关功能；以及对心肌细胞、成纤维细胞等相关作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种式I化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于选自下组的一个或多个用途：(1)选择性抑制整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导；(2)预防和/或治疗整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导相关的疾病；(3)预防和/或治疗血栓；(4)预防和/或治疗肿瘤；(5)预防和/或治疗骨质疏松；(6)预防和/或治疗内皮细胞介导的血管形成；
Figure FDA0002601171430000011
其中，
R1为氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C3-C12元环烷基、取代或未取代的C6-C16芳基、取代或未取代的3-12元杂芳基、-取代或未取代的C1-C12亚烷基-C6-C16芳基、-取代或未取代的C1-C12亚烷基-3-12元杂芳基；
R2为取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C3-C12环烷基、异硫脲基、胍基、-取代或未取代的C1-C12亚烷基-异硫脲基、-取代或未取代的C1-C12亚烷基-胍基、-取代或未取代的C3-C12亚环烷基-异硫脲基、或-取代或未取代的C3-C12亚环烷基-胍基；
R3为氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C3-C12元环烷基、或取代或未取代的C2-C12酯基、或取代或未取代的C2-C12酰基；
R4为氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C3-C12环烷基、取代或未取代的C2-C12酯基、取代或未取代的C1-C12烷氧基、取代或未取代的C1-C12烷硫基、取代或未取代的C3-C12环烷氧基、或取代或未取代的C3-C12环烷硫基；
R5为氢、取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C3-C12环烷基、卤素、取代或未取代的C6-C16芳基、或取代或未取代的3-12元杂芳基；
W、Z各自独立地为CH、C-R6、或N；
R6为取代或未取代的C1-C12烷基、取代或未取代的C3-C12环烷基、卤素、取代或未取代的C6-C16芳基、或取代或未取代的3-12元杂芳基；
其中，所述的任一“取代”是指基团上的一个或多个(优选为1、2、3、4或5个)氢原子被选自下组的取代基所取代：C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C1-C8卤代烷基、C3-C8卤代环烷基、卤素、硝基、-CN、羟基、巯基、氨基、C1-C4羧基、C2-C4酯基、C2-C4酰胺基、C1-C8烷氧基、C1-C8烷硫基、C1-C8卤代烷氧基、C1-C8卤代烷硫基、C6-C12芳基、5-10元杂芳基、5-10元杂环烷基；
所述的杂芳基的杂环具有1-4个(优选为1、2、3个或4个)选自N、O和S的杂原子。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的式I化合物为：
Figure FDA0002601171430000021
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导相关的疾病选自下组：血栓、肿瘤、骨质疏松、内皮细胞介导的血管形成，或其组合。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的预防和/或治疗血栓在实现抗血栓的同时，不影响出血或改善出血。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的改善出血包括抑制出血、不增加出血风险、降低出血风险、不会引起出血副作用和/或不影响止血功能。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的血栓为心脑血管性疾病血栓，所述的血栓为心脑血管性疾病血栓选自下组：心肌梗塞血栓、脑梗塞血栓、缺血性卒中、动脉粥样硬化血栓，或其组合。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组：肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌，或其组合。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肺癌选自下组：小细胞肺癌、非小细胞肺癌、心肌癌，或其组合。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物或制剂还包括其它抗血栓药物、其它抗肿瘤药物、其它治疗骨质疏松药物、和/或其它抗血管形成药物。
10.一种(1)选择性抑制整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导；(2)预防和/或治疗整合素β3与Src激酶相互作用介导的外向内信号转导相关的疾病；(3)预防和/或治疗血栓；(4)预防和/或治疗肿瘤；(5)预防和/或治疗骨质疏松；和/或(6)预防和/或治疗内皮细胞介导的血管形成的方法，其特征在于，给需要的对象施用如权利要求1所述的式I化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116178358A (zh) * 2022-11-04 2023-05-30 济南大学 一种靶向c-Src激酶SH3结构域的化合物及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115105597A (zh) * 2022-07-25 2022-09-27 南方科技大学 Kindlin-2作为靶点在治疗骨质疏松及预防癌症骨转移中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1118347A (zh) * 1993-08-03 1996-03-13 赫彻斯特股份公司 苯并五员杂环、其制法和作为药物和诊断药的用途
US20040097583A1 (en) * 2002-02-14 2004-05-20 Hans-Jochen Lang Use of inhibitors of the sodium/hydrogen exchanger for the treatment of thrombotic and inflammatory disorders
US20060025401A1 (en) * 2002-02-14 2006-02-02 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Use of inhibitors of the sodium-dependent chloride/bicarbonate exchanger for the treatment of thrombotic and inflammatory disorders
CN101172997A (zh) * 2006-11-03 2008-05-07 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种寡肽或其修饰物/衍生物以及它们的应用
US20090042949A1 (en) * 2005-01-19 2009-02-12 Benjamin Pelcman Indoles Useful in the Treatment of Inflammation
CN107286077A (zh) * 2016-04-01 2017-10-24 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 一种选择性的c-kit激酶抑制剂
TW201922694A (zh) * 2017-10-19 2019-06-16 一般社團法人藥谷項目支援機構 Ido/tdo抑制劑

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2822463B1 (fr) * 2001-03-21 2004-07-30 Lipha Derives bicycliques de guanidines et leurs applications en therapeutique
CA2501685A1 (en) * 2002-10-08 2004-04-22 Massachusetts Institute Of Technology Compounds for modulation of cholesterol transport
DE102012103405A1 (de) * 2012-04-18 2013-10-24 Heinrich-Pette-Institut Desoxyhypusin-Synthase-Inhibitoren
PL2936151T3 (pl) * 2012-12-18 2018-11-30 Biocrine Ab Sposoby leczenia i/lub ograniczania rozwoju cukrzycy

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1118347A (zh) * 1993-08-03 1996-03-13 赫彻斯特股份公司 苯并五员杂环、其制法和作为药物和诊断药的用途
US20040097583A1 (en) * 2002-02-14 2004-05-20 Hans-Jochen Lang Use of inhibitors of the sodium/hydrogen exchanger for the treatment of thrombotic and inflammatory disorders
US20060025401A1 (en) * 2002-02-14 2006-02-02 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Use of inhibitors of the sodium-dependent chloride/bicarbonate exchanger for the treatment of thrombotic and inflammatory disorders
US20090042949A1 (en) * 2005-01-19 2009-02-12 Benjamin Pelcman Indoles Useful in the Treatment of Inflammation
CN101172997A (zh) * 2006-11-03 2008-05-07 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种寡肽或其修饰物/衍生物以及它们的应用
CN107286077A (zh) * 2016-04-01 2017-10-24 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 一种选择性的c-kit激酶抑制剂
TW201922694A (zh) * 2017-10-19 2019-06-16 一般社團法人藥谷項目支援機構 Ido/tdo抑制劑

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LONG Z ET AL.: "Small molecule DCDBS84 regulates platelet thrombus formation by targeting C-SRC SH3 domain", ADV SCI, 3 June 2015 (2015-06-03), pages 99 - 100 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116178358A (zh) * 2022-11-04 2023-05-30 济南大学 一种靶向c-Src激酶SH3结构域的化合物及其应用
CN116178358B (zh) * 2022-11-04 2024-04-19 济南大学 一种靶向c-Src激酶SH3结构域的化合物及其应用

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