CN113967188A - 竹叶发酵滤液的制备法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种竹叶发酵滤液的制备方法，包括以下步骤：将竹叶干燥后粉碎，得竹叶粉末；称取1g竹叶粉末、2±0.1g葡萄糖，加入100ml蒸馏水，灭菌后，作为发酵基质；将已活化好的酿酒酵母菌，接种于YPD液体培养基，于28±0.5℃摇床培养24±2h，得到种子液；将种子液接种至发酵基质中，调pH5.5±0.5，28±0.5℃摇床发酵3±0.5天，将所得的发酵产物离心，离心所得的上清液过滤，得竹叶发酵滤液。该竹叶发酵滤液的用途为：用于美白、增强皮肤屏障、抗炎护肤。

Description

竹叶发酵滤液的制备法及其用途

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及竹叶发酵滤液的制备法及其用途。

背景技术

竹子属禾本科竹亚科，我国竹子资源丰富种类繁多，共有40余属400多种[1]；其中毛竹的种植面积约占竹子总面积的三分之一左右，但其利用率很低[2]。据《本草纲目》详细记载竹叶、竹茹、竹根等有着丰富的药食两用价值，为开发中医药、保健品和护肤品提供重要的资源。近年来随着生物技术和现代医学的发展，人们对竹叶的开发利用有进一步的提高[3]。据研究报道竹叶中含有丰富的竹叶黄酮、多糖、氨基酸以及多种微量元素[4]。潘进权等研究表明竹叶黄酮作为一种天然的抗氧化剂，对超氧阴离子和羟自由基有着较好的清除能力[5]；王楠等研究表明通过将竹叶黄酮纳米粒子作用于B16细胞，能显著抑制细胞内的酪氨酸酶活性，抑制其黑色素的生成，且当浓度为100mg/mL时其美白效果优于β-熊果苷[6]。黄赛金等研究表明竹叶多糖能显著降低实验组小白鼠的脂质过氧化，提升SOD和GSH-px的活性，表明竹叶多糖具有一定的抗衰老功效[7]。张英等研究表明竹叶中含有丰富的氨基酸资源，如Glu、Asp等，且其中的特种氨基酸δ-OH-Lys具有比Lys较高的抗氧化活性[8]。总之，大量的研究表明竹叶中的活性成分具有抗氧化、抗自由基、抗衰老、美白等生物学功效。

在护肤行业中，发酵化妆品已成为天然植物提取化妆品之后的又一大热点，如海蓝之谜、SK-II神仙水等，因其具有显著的护肤功效，所以深受消费者喜爱[9]。我国拥有丰富的中草药资源，已有不少研究报道利用微生物发酵这些中草药，得到护肤功效显著的化妆品原料。赵丹等利用葡萄酒酵母发酵灵芝，得到的灵芝发酵液具有抗衰老和美白功效[10]；蔡丙国等研究酵母菌发酵茉莉花的发酵液具有显著的美白功效[11]。

CN112913370A的专利公开了一种竹叶发酵液：所述竹叶发酵液的pH为2-5，其通过包括以下步骤的方法制备：按重量份数计，将3至5份粒径为10μm-20μm的竹叶碎片、10至15份水和1至3份糖装入发酵罐中，混合均匀；在20℃-35℃下，每天搅拌至少一次，发酵10-15天，得竹叶发酵液，稀释50-150倍使用；其用途是修复露天竹林土壤退化。

涉及的参考文献如下：

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[2]李延军,许斌,张齐生,蒋身学.我国竹材加工产业现状与对策分析[J].林业工程学报,2016,1(01):2-7。

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[4]岳永德,操海群,汤锋.竹提取物的化学成分及其利用研究进展[J].安徽农业大学学报,2007(03):328-333。

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[6]王楠,唐伟敏,楚秉泉,陈纯,金露,张英.基于B16黑素瘤细胞评价体系的竹叶黄酮纳米粒子美白功效[J].精细化工,2016,33(12):1375-1380。

[7]黄赛金,尹爱武,龚灯,李探芳.淡竹叶多糖的抗衰老作用研究[J].现代食品科技,2015,31(11):51-55。

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发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种竹叶发酵滤液的制备方法及其用途。

为解决上述技术问题，本发明提供一种竹叶发酵滤液的制备方法，包括以下步骤：

1)、制备竹叶粉末

将竹叶干燥后粉碎，得竹叶粉末；

2)、配制发酵基质

称取1g竹叶粉末、2±0.1g葡萄糖，加入100ml蒸馏水，灭菌(121℃高压灭菌15min)后，作为发酵基质；

即，等待冷却后再接种子液；

3)、制备种子液

将已活化好的酿酒酵母菌(酿酒酵母单菌落)，接种于YPD液体培养基，于28±0.5℃摇床培养24±2h，得到种子液(菌液浓度约为1.8～2.2×10⁸CFU/ml)；

4)、制备竹叶发酵滤液

按体积分数9～11％(优选10％)接种量，将步骤3)所得的种子液接种至步骤2)所得的发酵基质中，调pH5.5±0.5，28±0.5℃摇床发酵3±0.5天，将所得的发酵产物离心，离心所得的上清液过滤，得竹叶发酵滤液。

说明：发酵滤液外观上透亮、呈浅黄绿色，并带有特殊气味。

作为本发明的竹叶发酵滤液的制备方法的改进：

种子液的浓度为(1.8～2.2)×10⁸CFU/ml。

作为本发明的竹叶发酵滤液的制备方法的进一步改进：

将酵母菌先进行活化，从而获得已活化好的酵母菌；

所述活化(菌株活化)为：挑取一环酵母菌于麦芽汁琼脂培养基平板上划线，培养于28±0.5℃无菌培养箱，直至长出单菌落。

说明：酿酒酵母单菌落的形态特点是表面光滑、湿润、粘稠、接种环易挑起。

作为本发明的竹叶发酵滤液的制备方法的进一步改进：

所述步骤3)的摇床转速为220±20rpm；

所述步骤4)的摇床转速为220±20rpm；

所述步骤4)的离心为10000±1000rpm离心9～11分钟。

作为本发明的竹叶发酵滤液的制备方法的进一步改进：

所述步骤1)中：采取毛竹竹叶(径山毛竹竹叶)，洗净后于50±10℃烘箱烘干3±0.5天，粉碎机中粉碎至过40目筛，得竹叶粉末。

本发明还同时提供了利用上述任一方法制备而得的竹叶发酵滤液的用途：用于美白、增强皮肤屏障、抗炎护肤。

本发明以竹叶发酵滤液为研究对象，以角质形成细胞和B16黑色素瘤细胞为研究模型，探讨了竹叶发酵滤液的美白、增强皮肤屏障和抗炎的护肤功效。通过CCK8实验表明，竹叶发酵滤液对角质形成细胞和B16黑色素瘤细胞都没有毒性；通过氢氧化钠裂解法测定B16细胞内的黑色素含量表明，竹叶发酵滤液能显著降低细胞内黑色素的含量(p＜0.001)；通过构建十二烷基硫酸钠损伤角质形成细胞模型表明，竹叶发酵滤液能促进丝聚合蛋白的mRNA表达(p＜0.001)，抑制细胞中TNF-α和IL-6的mRNA表达(p＜0.001，p＜0.01)。

因此，本发明为竹叶发酵滤液在化妆品中美白、保湿、抗炎等功效的应用提供一定的实验依据，同时也为提高毛竹附加值的利用率提供参考。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为竹叶发酵滤液对角质形成细胞(a)和B16黑色素细胞(b)的增殖作用；

图2为竹叶发酵滤液对B16黑色素细胞黑色素合成的影响；

图1、图2中的横坐标“10^-1、10^-2、10^-3”指竹叶发酵液的稀释倍数；

图3为竹叶发酵滤液对角质形成细胞形态的影响；

图3中：

(a)为空白对照组，(b)为SLS模型组，(c)为竹叶发酵滤液实验组；

图4为竹叶发酵滤液对角质形成细胞中丝聚合蛋白基因表达的影响；

图5为竹叶发酵滤液对角质形成细胞中炎症相关基因表达的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

以下案例中，所用成分均能通过常规市购形式获得。

酿酒酵母：中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号CICC 31105。

主要设备包括：UV-35000型双光速紫外可见分光光度计：上海凌析仪器有限公司；震荡培养箱：上海润度生物科技有限公司。

所用培养基包括：

1、麦芽汁琼脂培养基：

称取麦芽汁琼脂40g，加入1000ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，分装，121℃高压(0.1MPa)灭菌15min。等温度降到40℃左右，在无菌操作台上倒入已灭菌的培养皿，1小时后再把平板倒置。

2、酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD液体培养基)：

称量10g酵母膏，20g蛋白胨于900ml水中，高压115℃灭菌15min，再加入100ml的葡萄糖水溶液(含20g葡萄糖)。

实施例1、竹叶发酵滤液的制备，依次进行以下步骤：

1)、制备竹叶粉末

采取径山毛竹竹叶，洗干净后于50℃烘箱烘干3天，粉碎机中粉碎至过40目筛，收集获得竹叶粉末。

2)、配制发酵基质

称取1g竹叶粉末，2g葡萄糖，加入100ml蒸馏水，121℃高压灭菌15min后，冷却至室温后作为发酵基质；待用；

该发酵基质用于接种种子液。

3)、制备种子液

3.1)、菌株活化：

挑取一环酿酒酵母菌液于麦芽汁琼脂培养基平板上划线，培养于28℃无菌培养箱，直至长出单菌落(约需24小时)，酿酒酵母单菌落的形态特点是表面光滑、湿润、粘稠、接种环易挑起。

3.2)、挑取已活化好的酿酒酵母单菌落，接种于YPD液体培养基，于28℃摇床(转速为220rpm)培养24h，得到种子液，此时菌液浓度约为2×10⁸CFU/ml。

3.3)、种子液镜检：

无菌移液器吸取10uL步骤3.2)所得的种子液制备水浸片，并于高倍显微镜下观察酵母形态；此时的酵母形态是单一的形态即椭圆形并带有出芽繁殖的迹象。

因此可得知步骤3.2)所得的种子液形态均一、无其它杂菌、菌液浓度约为2×10⁸CFU/ml，故可用于后续步骤制备发酵液。

4)、制备竹叶发酵滤液

按10％接种量，接种步骤3.2)所得的种子液于步骤2)所得的发酵基质中，调pH5.5,28℃摇床(转速为220rpm)发酵3天，即得到发酵产物。

收集发酵产物，在10000rpm的离心条件下离心10分钟，收集上清液，再把上清液经过滤纸过滤，即得到发酵滤液。

发酵滤液外观上透亮、呈浅黄绿色，并带有特殊气味。

发酵滤液中活性物浓度的测定

一、发酵滤液中黄酮含量的测定

取干燥好的芦丁样品10.0mg，用30％的乙醇水溶液稀释至100ml备用；分别量取上述标准液0.0ml、1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml于25ml容量瓶中，加入30％乙醇水溶液适当稀释；向容量瓶中转移1ml预先配置好的5％的NaNO₂溶液，振荡并放置5min后，立刻加入1ml10％的Al(NO₃)₃水溶液，振荡至体系均匀，室温放置5min；向上述体系中分别滴加10ml1.0mol/L氢氧化钠溶液，摇匀并静置10min，用30％的乙醇水溶液定容，放置5min后测定其在510nm处测定吸光度，每个样品至少平行测定3次，0.0mL溶剂瓶为空白参比。以吸光度为横坐标，芦丁浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

取适量的原料，用约4ml的30％乙醇水溶液稀释溶解并转移至25ml容量瓶中，加入一定量的5％的NaNO₂水溶液，振荡至体系均匀，室温下静置5min后滴加10％Al(NO₃)₃溶液至体系变色，摇匀并放置5min；待体系完全反应后加入1mol/LNaOH水溶液10ml，振荡至体系完全均一，静置10min，待络合结束加入30％的乙醇水溶液定容并静置5min。取适量的待测液转移至比色皿中，30％的乙醇水溶液(不含样品)作为空白对照，用紫外分光光度计测定其吸光度，每个样品平行测定3次，记录每次吸光度，带入标准曲线方程计算样品中总黄酮的浓度。

所得结果为：实施例1所得的发酵滤液中，总黄酮的浓度为129.77ug/mL。黄酮提取率为1.39％。

黄酮提取率(％)＝C(黄酮浓度)*V(提取液总体积)÷m(竹粉质量)×100

二、发酵滤液中多糖含量的测定

精密称取蒽酮试剂100.0mg，用预先配置好的75％的硫酸溶解并定容至100ml，在低温避光条件下保存备用(6h内用完，配好的溶液呈现黄色，见光会变绿，使试剂变质)；配置1mg/ml的葡萄糖标准液，并稀释成0、20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、80ug/ml、100ug/ml、120ug/ml、140ug/ml、160ug/ml的溶液备用；分别取1ml上述溶液于10ml的离心管中，1ml的蒸馏水作为空白对照，分别于冰浴中加入4ml现配的蒽酮-硫酸试剂，立刻封口振荡，于100℃沸水浴中加热15min，每个样品重复四次。每个样品至加入沸水浴到反应结束前后的间隔时间应控制在8s内，反应结束后应立即转移至冰水浴中冷却5min后转移至室温环境，待体系与环境温度一致时测定其在620nm的吸光度。以吸光度为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

取适量的样品稀释至合适浓度，加入蒽酮-硫酸试剂，待反应结束后按上述标准方法测定并计算多糖含量，最终结果以葡糖糖计。

所得结果为：实施例1所得的发酵滤液中，多糖含量为581.74ug/mL。多糖提取率为7.14％。

多糖提取率(％)＝C(多糖浓度)*V(提取液总体积)÷m(竹粉质量)×100

三、发酵滤液中氨基酸含量的测定

配置20mg/ml的茚三酮水溶液100ml，低温避光保存(现配现用)；取10ml的离心管，分别加入0ug/ml、2ug/ml、4ug/ml、6ug/ml、8ug/ml、10ug/ml、12ug/ml、14ug/ml、16ug/ml、18ug/ml不同浓度的甘氨酸标准液1ml，再加入2mlPBS缓冲液(pH＝6.0)，摇匀后再加入1ml的茚三酮标准液，振荡后于100℃加热30min，反应结束后冰水浴冷却5min后转移至室温环境，用0ug/ml标准液作为空白对照，用紫外分光光度计于568nm处测定吸光度。以甘氨酸吸光度为横坐标，其浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

取适量的样品，加入茚三酮水溶液，按上述标准方法测定并计算氨基酸含量，最终结果以甘氨酸计。

所得结果为：实施例1所得的发酵滤液中，氨基酸含量为32.23ug/mL。氨基酸的提取率为0.28％。

氨基酸提取率(％)＝C(氨基酸浓度)*V(提取液总体积)÷m(竹粉质量)×100

实验1

1实验部分

1.1主要试剂与仪器

角质形成细胞、B16细胞，购买于上海歌凡生物科技有限公司；RPMI1640培养液(含双抗)，购买于浙江森瑞生物科技有限公司；胎牛血清，购买于浙江天杭生物科技股份有限公司；CCK8试剂盒，购买于TargetMol；磷酸缓冲盐溶液，购买于北京索莱宝生物科技有限公司；RNAiso Plus kit、PrimeScript^TMRT reagent Kit、TB Green qPCR，购买于宝日医生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

竹叶发酵滤液：实施例1所得的竹叶发酵滤液(简称FBL)；

CO₂培养箱HF90，HealForce；多功能酶标仪Spark，Tecan；倒置生物显微镜，奥林巴斯公司；离心机L3-5K，湖南可诚。

1.2实验方法和结果

说明，数据分析：实验结果均以

表示，不同实验条件下比较均采用齐性方差t检验，再由GraphPad Prism 8软件中的One-Way ANOVO完成数据分析，p＜0.05有差异统计学意义。

1.2.1细胞培养和分组

角质形成细胞(HaCaT细胞)、小鼠黑色瘤细胞(B16细胞)分别用RPMI1640培养液(含体积分数1％的青-链霉素，体积分数1％的胎牛血清)和DMEM高糖培养液(含体积分数1％的青-链霉素，体积分数1％的胎牛血清)在37℃、5％CO₂条件下培养，当细胞融合度达到70％-80％时，采用0.25％的胰酶进行消化，并用血球计数板计数，最后制备一定浓度的细胞悬液用来接种于细胞培养皿传代。

角质形成细胞实验分为三组：空白对照组、模型组、实验组；其中空白对照组细胞不经过任何处理，模型组细胞采用85ug/mL浓度的十二烷基硫酸钠(SLS)处理4h，实验组细胞先用一定浓度的竹叶发酵液(实施例1所得的FBL稀释100倍)处理24h后，吸弃样品再用无菌PBS洗两遍，最后再用85ug/mL浓度的十二烷基硫酸钠(SLS)处理4h[12]。用于进行下述1.2.4。

1.2.2 HaCaT细胞和B16细胞的活力测定

将实施例1所得的FBL用PBS缓冲液稀释成10倍、100倍、1000倍，从而获得梯度浓度的竹叶发酵液；

通过CCK8实验对细胞增殖进行测定，选择适当的竹叶发酵液浓度进行后续的实验。取对数生长期的HaCaT细胞和B16细胞，密度为(3-5)x10⁴个/ml，分别在96孔细胞培养板上铺板，在37℃5％CO₂条件下过夜培养。加入10μL已配好梯度浓度的竹叶发酵液，于37℃5％CO₂的条件下作用24h后，再加入10μL的CCK8试剂孵育2-4小时(孵育条件为37℃5％CO₂)，作为实验组。

取消竹叶发酵液的使用，其余等同于实验组，作为对照组；

以空白孔作为调零孔(为了排除背景干扰)；

用酶标仪测定各孔在450nm下的吸光值。细胞增殖率计算方法如下[13]：

竹叶发酵滤液的细胞毒性测定结果如下：

HaCaT和B16细胞经过不同浓度的FBL处理24h后的增值率如图1(a)、(b)所示，从图1(a)中可以看出当FBL稀释十倍后，对HaCaT细胞具有明显的促进增殖的作用，细胞活力达到138.4％(p＜0.01)，具有统计学意义，而其他浓度的FBL对HaCaT细胞没有促进增殖也没有毒性；从图1(b)图中可以看出不同浓度的FBL对B16细胞都没有促进增殖也没有毒性，需要指明的是在这些不同浓度FBL作用下，HaCaT细胞和B16细胞的形态都没有发生改变；当细胞活力小于80％时，可说明该样品对细胞存在毒性[15]，而从图1可知在FBL作用下，两种细胞的活力均在100％以上，后续功效实验选择10^-3g/mL作为实验浓度，综上分析初步判断FBL作为一种天然的护肤原料具有一定的安全性。

1.2.3 B16细胞内黑色素含量的测定

通过氢氧化钠裂解法测定细胞内黑色素的含量[14]，取对数生长期的B16细胞，密度为(3-5)×10⁴个/ml，在96孔细胞培养板上铺板，在37℃5％CO₂条件下过夜培养。加入10μL已配好梯度浓度的竹叶发酵液，每组设置五个平行，作用24h，吸弃上清液，再用已灭菌过的PBS洗涤3次，加入150μL,1N NaOH(含10％DMSO)，用移液器吹打混匀，再在80℃水浴锅中反应40min，作为实验组。

取消竹叶发酵液的使用，其余等同于实验组，作为对照组；

以空白孔作为调零孔(为了排除背景干扰)；

最后在酶标仪上测405nm处吸光值。相对黑色素含量计算方法如下：

竹叶发酵滤液对B16细胞内黑色素含量的影响结果如下：

相对黑色素含量如图2所示。

小鼠B16黑色素瘤细胞与人类黑色素细胞合成黑色素的代谢过程较为相似，因此在体外筛选美白相关的原料时大都会采用此细胞作为模型。熊果苷、VC等是目前化妆品中常用的美白原料，但发现他们在高浓度下对细胞有较大的毒性[16]，因此当下美白原料的开发不仅要注重美白效果，也要考量对细胞的毒性即安全性。从以上的FBL对B16细胞的毒性实验可以看出，高浓度和低浓度的FBL对B16细胞的增殖都没有影响，FBL作为美白化妆品原料是比较安全的。从图2中可以看出当FBL稀释一百倍再作用在B16细胞24h后，细胞中的黑色素含量降低到空白对照组的63.81％，与空白对照组相比差异极显著(p＜0.001)，因此FBL能显著降低B16细胞中黑色素的含量，可以推测FBL作为一种护肤美白原料具有一定的美白功效。

1.2.4 RNA抽提和荧光定量PCR

取对数生长期的细胞，密度为5×10⁴个/ml，在6孔细胞培养板上铺板，每孔总体积为2ml；细胞分为三组，分别是空白对照组(细胞没有任何处理)、SLS组(85ug/mL浓度的SLS处理4h)、FBL组(一定浓度的FBL处理24h后再用85ug/mL浓度的SLS处理4h)，利用RNAiso提取总RNA，然后采用PrimeScript^TMRT reagent Kit把RNA逆转成cDNA，加入SYBR、引物以及cDNA模板后，进行实时荧光定量PCR反应，反应程序为两步法，具体程序如下：预变性95℃30s；PCR反应95℃5s，60℃30s 40次循环。引物序列为FLG-F:TGAAGCCTATGACACCACTGA,FLG-R:TCCCCTACGCTTTCTTGTCCT；TNF-α-F:GAGGCCAAGCCCTGGTATG，TNF-α-R：CGGGCCGATTGATCTCAGC；IL-6-F：CCTGAACCTTCCAAAGATGGC，IL-6-R:TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA。

竹叶发酵液的抗炎功效评价结果如下：

十二烷基硫酸钠是化妆品行业常见的一种表面活性剂，它能破坏皮肤表皮的屏障功能，且能通过TNF-α信号通路引发皮肤炎症，最终使促炎因子IL-6表达增加[21]。本实验通过一定浓度的SLS制造炎症模型，从图5中可以看出SLS模型组的TNF-α和IL-6的mRNA表达水平显著高于空白对照组(p＜0.001，p＜0.01)，这一结果与BERNHOFER等的研究结论一致[22]，而FBL组的TNF-α和IL-6的mRNA表达水平显著低于SLS模型组(p＜0.001，p＜0.01)；因此FBL能抑制细胞中TNF-α和IL-6的基因表达，减轻角质形成细胞的炎症反应，保护由SLS造成损伤的细胞，初步推测FBL作为一种化妆品原料具有抗炎功效。

竹叶发酵滤液增强皮肤屏障的研究结果如下：

角质形成细胞位于皮肤的表皮层，在皮肤屏障功能中起着重要作用[17]。图3为HaCaT细胞在倒置显微镜下(目镜10x，物镜20x)的形态图；(a)图的细胞没有经过任何处理，正常的HaCaT细胞生长方式为贴壁生长，轮廓清晰，形态呈扁平多角形，折光性好[18]；(b)图的细胞经过85ug/mL浓度的SLS处理4h，此时贴壁细胞的数量明显比(a(图少，且部分细胞的形态变成长条形，轮廓模糊，细胞内外可见较多的颗粒物；(c)图的细胞先先用一定浓度的竹叶发酵液处理24h后，吸弃样品再用无菌PBS洗两遍，最后再用85ug/mL浓度的十二烷基硫酸钠(SLS)处理4h，此时HaCaT细胞不管是数量还是形态上均与(a)图差异不大。

丝聚合蛋白是角质形成细胞分化蛋白中的一种，主要在颗粒层和透明层中表达。Batista等研究表明特应性皮炎患者中丝聚合蛋白的表达明显比正常人低[19]；Kabashima-Kubo等发现丝聚合蛋白表达水平下降，会导致皮肤屏障功能异常[20]。从图4中可以看出SLS模型组的丝聚合蛋白的mRNA表达水平显著低于空白对照组(p＜0.01)，而FBL组的丝聚合蛋白的mRNA表达水平显著高于SLS模型组(p＜0.001)，这一结果与倒置显微镜下观察到的细胞形态的结果一致，综上分析初步推测FBL具有强化皮肤屏障功能的功效。

综上，可获得如下结论：

竹叶发酵滤液作用于角质形成细胞和B16黑色素细胞都没有毒性，两种细胞均表现出较高的活力，竹叶发酵滤液具有一定的安全性；通过测定黑色素含量实验发现竹叶发酵滤液能明显抑制B16细胞中黑色素的生成，说明竹叶发酵滤液具有一定的美白功效；通过一定浓度的十二烷基硫酸钠制备角质形成细胞损伤模型，发现有加入竹叶发酵滤液的实验组细胞形态明显好于对照组，且丝聚合蛋白的基因表达水平也显著高于对照组，炎症因子TNF-α和IL-6的基因表达水平也显著低于对照组，说明竹叶发酵滤液有一定的增强皮肤屏障和抗炎的功效。

发明人在还进行过如下的对比试验：

对比例1、竹叶乙醇浸提法(现有技术)，

称取磨碎的竹叶粉末约3g，加入50％乙醇水溶液(v/v)90ml，调整超声功率至600W和超声时间30min，设置超声温度40℃，参数设置好后进行超声提取实验。超声结束后，冷却至室温后过滤，并用超纯水少量多次冲洗；合并滤液，减压蒸馏除去全部乙醇和部分水，待瓶内叶绿素沉淀后再次过滤，用超纯水少量多次洗涤，合并滤液；冷藏；离心，离心时间为25-35min之间，视叶绿素含量多少而定，转速为12000r/min，离心结束后可见离心管内有大量色素沉淀，取上清液(黄色，略微带点绿)备用。所得产物按照上述方法进行实验，与本发明的竹叶发酵的对比，如下表1所示。

表1

	竹叶乙醇浸提(提取率)	竹叶发酵(提取率)
			氨基酸	0.15％	0.28％
黄酮	1.16％	1.39％
			多糖	3.69％	7.14％

对比例2、将3份粒径为10μm-20μm的竹叶碎片、10份水和1糖装入发酵罐中，混合均匀；在20℃-35℃下，每天搅拌至少一次，发酵15天，氨基酸、黄酮、多糖的提取率，均远远不如竹叶乙醇浸提所得的提取率。

对比例3、将发酵基质中的葡萄糖的用量改为3g，其余等同于实施例1。所得发酵滤液中总黄酮、多糖、氨基酸的含量均不如实施例1所得结果，但是也优于竹叶乙醇浸提所得结果，这说明本发明设定的葡萄糖浓度的重要性。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州雅妍化妆品有限公司

<120> 竹叶发酵滤液的制备法及其用途

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgaagcctat gacaccactg a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcccctacgc tttcttgtcc t 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaggccaagc cctggtatg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgggccgatt gatctcagc 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctgaacctt ccaaagatgg c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcaccaggc aagtctcctc a 21

Claims (6)

1.竹叶发酵滤液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、制备竹叶粉末

将竹叶干燥后粉碎，得竹叶粉末；

2)、配制发酵基质

称取1g竹叶粉末、2±0.1g葡萄糖，加入100ml蒸馏水，灭菌后，作为发酵基质；

3)、制备种子液

将已活化好的酿酒酵母菌，接种于YPD液体培养基，于28±0.5℃摇床培养24±2h，得到种子液；

4)、制备竹叶发酵滤液

按体积分数9～11％接种量，将步骤3)所得的种子液接种至步骤2)所得的发酵基质中，调pH5.5±0.5，28±0.5℃摇床发酵3±0.5天，将所得的发酵产物离心，离心所得的上清液过滤，得竹叶发酵滤液。

2.根据权利要求1所述的竹叶发酵滤液的制备方法，其特征在于：

种子液的浓度为(1.8～2.2)×10⁸CFU/ml。

3.根据权利要求1或2所述的竹叶发酵滤液的制备方法，其特征在于：

将酵母菌先进行活化，从而获得已活化好的酵母菌；

所述活化为：挑取一环酵母菌于麦芽汁琼脂培养基平板上划线，培养于28±0.5℃无菌培养箱，直至长出单菌落。

4.根据权利要求3所述的竹叶发酵滤液的制备方法，其特征在于：

所述步骤3)的摇床转速为220±20rpm；

所述步骤4)的摇床转速为220±20rpm；

所述步骤4)的离心为10000±1000rpm离心9～11分钟。

5.根据权利要求4所述的竹叶发酵滤液的制备方法，其特征在于：

所述步骤1)中：取毛竹竹叶，洗净后于50±10℃烘箱烘干3±0.5天，粉碎机中粉碎至过40目筛，得竹叶粉末。

6.如权利要求1～5任一方法制备而得的竹叶发酵滤液的用途，其特征在于：用于美白、增强皮肤屏障、抗炎护肤。

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