CN113957175A - 一种非洲猪瘟病毒的数字pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒的数字PCR检测方法，包括如下步骤：步骤一材料准备；步骤二样本标记；步骤三样本稀释；步骤四反应体系配置；步骤五数字PCR反应；步骤六数据分析；步骤七数据分析；本发明属于猪瘟病毒检测技术领域，具体是一种非洲猪瘟病毒的数字PCR检测方法，该方法采用数字PCR手段，测试了适用于低浓度非洲猪瘟病毒模板检测的检测系统，该系统不依赖于标准品或其他参考基因，可实现病毒模板绝对定量，此外通过对多个稀释梯度的样板进行检测，该系统可实现低浓度阳性样本的检测，最低可检测到5拷贝/μL的非洲猪瘟病毒，具有更高的灵敏度和精确度。

Description

一种非洲猪瘟病毒的数字PCR检测方法
技术领域
本发明属于猪瘟病毒检测技术领域，具体是指一种非洲猪瘟病毒的数字PCR检测方法。
背景技术
非洲猪瘟(ASF)是一种传染性很强的病毒性疾病，一旦感染，可引起家猪极高的死亡率。对养猪产业和人民生活造成重大影响，带来巨大经济损失。
当下，世界上仍未有针对非洲猪瘟病毒有效的相应疫苗，也使得其成为“不治之症”。在这种情况下，采取及时、有效的早期诊断检测，做到早发现、早处理，是保护养猪产业的重要手段。而目前针对非洲猪瘟病毒，常用的检测方法是采用荧光定量PCR检测，该方法可通过对荧光信号的检测，确定样本中是否含有病毒模板，可通过参考基因实现病毒模板的半定量。但是该手段依赖于参考基因的标准曲线，经常受抑制剂或模板浓度过低的限制，无法检测病毒感染初期的低浓度病毒模板。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种非洲猪瘟病毒的数字PCR检测方法，该方法采用数字PCR手段，测试了适用于低浓度非洲猪瘟病毒模板检测的检测系统，该系统不依赖于标准品或其他参考基因，可实现病毒模板绝对定量，此外通过对多个稀释梯度的样板进行检测，该系统可实现低浓度阳性样本的检测，最低可检测到5拷贝/μL的非洲猪瘟病毒，具有更高的灵敏度和精确度。
本发明采取的技术方案如下：本发明一种非洲猪瘟病毒的数字PCR检测方法，包括如下步骤：
步骤一 材料准备
包括如下材料：(1)数字PCR板(QIAGEN凯杰)
(2)QIAcuity Probe Master Mix 4X缓冲液(QIAGEN凯杰)
(3)引物1:CACGTAATCCGTGTCCCAAC(湖州河马生物)10μL/mL
(4)引物2:GCGATTAAAACCCCCGATGA(湖州河马生物)10μL/mL
(5)探针:CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG、5’:6-carboxy-fluorescein(FAM)、3’:3`BHQ1(湖州河马生物)；
步骤二 样本标记
对非洲猪瘟病毒的VP72质粒样本进行了采用Taq-Man探针荧光信号检测，采用了4个非洲猪瘟阳性样本进行测试，分别标记为：样本一、样本二、样本三和样本四；
步骤三 样本稀释
采用了不同稀释倍数的阳性样本，以测试本试剂盒检测非洲猪瘟病毒的灵敏度，稀释倍数为1X、4X、16X、64X、128X；
步骤四 反应体系配置
采用了40μL的反应体系，每个反应中加入2μL不同浓度的阳性样本，反应体系配置如表一所示；
步骤五 数字PCR反应
将配置好的反应体系充分混匀，小心将样品加入数字PCR板(QIAGEN凯杰)的加样孔中，过程中应避免有气泡产生，加样后，用配套封板膜封住PCR板，将数字PCR板按标识放入QIAcuity数字PCR仪中，以95℃预变性2min，95℃变性15S，57℃退火30S，共采用30个循环；
步骤六 数据分析
采用QIAcuity数字PCR仪自带分析软件观察检测荧光结果，计算阳性样本中的模板拷贝数，按照反应体系中的稀释倍数计算样品中的总拷贝数；
步骤七 数据分析
阳性膜拜检测结果显示，荧光信号显示，所测之阳性样本均显示出阳性信号，而阴性对照则无荧光信号。
进一步地，所述步骤四中反应体系配置时全程在冰上操作，探针需避光保存，阴性对照组中不含非洲猪瘟阳性样本，加入同体积的dd ddH2O补齐反应体系体积。
表一 反应体系配置表
Figure BDA0003405503950000031
采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本方案一种非洲猪瘟病毒的数字PCR检测方法，本技术采用数字PCR系统作为非洲猪瘟病毒检测的主要手段，数字PCR系统可以用来解决传统分子检测技术在定量时出现的检测灵敏度不足与扩增抑制剂敏感的问题。在实际检测过程中，多数样品的病毒丰度极低，并且可能存在的PCR抑制剂，故导致了定量PCR检测结果处于灰区和假阴性的问题。数字PCR系统无需构建标准曲线，基于其结果判读原理，一举解决了传统分子检测技术在应对低载量病毒核酸或者低丰度拷贝变异检测时，检测灵敏度不足与扩增抑制剂敏感的问题，有效避免检测假阴性。可在1.5小时内获得96个样本的全封闭全自动化检测，减少人员操作误差以及人员接触污染的几率，提供了一个更安全、可靠、精准、自动化、高通量的检测平台。采用本技术可实现病毒样本的绝对定量，避免了常规荧光定量PCR中，由于内参基因引起的检测误差，此外，该技术可对丰度极低的病毒样本进行量化监测，从而做到尽早发现，尽早干预，避免病毒引起更大损失。
附图说明
图1为本方案的样本一检测结果图；
图2为本方案的样本二检测结果图；
图3为本方案的样本三检测结果图；
图4为本方案的样本四检测结果图。
其中，图1-4中黑色标记为该体系中阳性样本的稀释倍数。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明一种非洲猪瘟病毒的数字PCR检测方法，包括如下步骤：
步骤一 材料准备
包括如下材料：(1)数字PCR板
(2)QIAcuity Probe Master Mix 4X缓冲液
(3)引物1:CACGTAATCCGTGTCCCAAC10μL/mL
(4)引物2:GCGATTAAAACCCCCGATGA10μL/mL
(5)探针:CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG、5’:6-carboxy-fluorescein(FAM)、3’:3`BHQ1；
步骤二 样本标记
对非洲猪瘟病毒的VP72质粒样本进行了采用Taq-Man探针荧光信号检测，采用了4个非洲猪瘟阳性样本进行测试，分别标记为：样本一、样本二、样本三和样本四；
步骤三 样本稀释
采用了不同稀释倍数的阳性样本，以测试本试剂盒检测非洲猪瘟病毒的灵敏度，稀释倍数为1X、4X、16X、64X、128X；
步骤四 反应体系配置
采用了40μL的反应体系，每个反应中加入2μL不同浓度的阳性样本，反应体系配置如表一所示，反应体系配置时全程在冰上操作，探针需避光保存。阴性对照组中不含非洲猪瘟阳性样本，加入同体积的dd ddH2O补齐反应体系体积；
步骤五 数字PCR反应
将配置好的反应体系充分混匀，小心将样品加入数字PCR板的加样孔中，过程中应避免有气泡产生，加样后，用配套封板膜封住PCR板，将数字PCR板按标识放入QIAcuity数字PCR仪中，以95℃预变性2min，95℃变性15S，57℃退火30S，共采用30个循环；
步骤六 数据分析
采用QIAcuity数字PCR仪自带分析软件观察检测荧光结果，计算阳性样本中的模板拷贝数，按照反应体系中的稀释倍数计算样品中的总拷贝数，如本检测中，采用40μL体系，其中共有阳性样本2μL，稀释倍数为20倍。因此结果中的模板拷贝数应X20即为阳性模板中非洲猪瘟病毒的实际拷贝数；
步骤七 数据分析
阳性膜拜检测结果显示，荧光信号显示，所测之阳性样本均显示出阳性信号，而阴性对照则无荧光信号，如图1-4。
实施例
绝对定量结果表示，样本一中非洲猪瘟病毒浓度为27134copies/μL，样本二中非洲猪瘟病毒浓度为87790copies/μL，样本三中非洲猪瘟病毒浓度为874copies/μL，样本四中非洲猪瘟病毒浓度为134copies/μL。且随着样本浓度稀释倍数增大，样本中病毒拷贝数相应减少，具体数据见表二。
表二 数字PCR检测非洲猪瘟病毒阳性样本绝对定量结果
Figure BDA0003405503950000061
Figure BDA0003405503950000071
本研究利用数字PCR技术，开发了针对非洲猪瘟病毒的检测体系，该体系以目前非洲猪瘟病毒检测的标准片段为检测位点，采用优化的反应系统，可实现低浓度非洲猪瘟病毒的绝对定量检测，为畜牧养殖业中养殖环境监测、病毒早期发现等提供支持。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种非洲猪瘟病毒的数字PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一 材料准备
包括如下材料：(1)数字PCR板
(2)QIAcuity Probe Master Mix 4X缓冲液
(3)引物1:CACGTAATCCGTGTCCCAAC 10μL/mL
(4)引物2:GCGATTAAAACCCCCGATGA 10μL/mL
(5)探针:CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG、5’:6-carboxy-fluorescein(FAM)、3’:3`BHQ1；
步骤二 样本标记
对非洲猪瘟病毒的VP72质粒样本进行了采用Taq-Man探针荧光信号检测，采用了4个非洲猪瘟阳性样本进行测试，分别标记为：样本一、样本二、样本三和样本四；
步骤三 样本稀释
采用了不同稀释倍数的阳性样本，以测试本试剂盒检测非洲猪瘟病毒的灵敏度，稀释倍数为1X、4X、16X、64X、128X；
步骤四 反应体系配置
采用了40μL的反应体系，每个反应中加入2μL不同浓度的阳性样本；
步骤五 数字PCR反应
将配置好的反应体系充分混匀，小心将样品加入数字PCR板的加样孔中，过程中应避免有气泡产生，加样后，用配套封板膜封住PCR板，将数字PCR板按标识放入QIAcuity数字PCR仪中，以95℃预变性2min，95℃变性15S，57℃退火30S，共采用30个循环；
步骤六 数据分析
采用QIAcuity数字PCR仪自带分析软件观察检测荧光结果，计算阳性样本中的模板拷贝数，按照反应体系中的稀释倍数计算样品中的总拷贝数；
步骤七 数据分析
阳性膜拜检测结果显示，荧光信号显示，所测之阳性样本均显示出阳性信号，而阴性对照则无荧光信号。
2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒的数字PCR检测方法，其特征在于：所述步骤四中反应体系配置时全程在冰上操作，探针需避光保存，阴性对照组中不含非洲猪瘟阳性样本，加入同体积的dd ddH2O补齐反应体系体积。
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