CN113952286B - 一种靶向酪氨酸酶抑制剂、制备方法和应用及美白霜 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向酪氨酸酶抑制剂、制备方法和应用及美白霜，涉及化妆品领域。抑制剂包括间充质干细胞外泌体、卵磷脂、胆固醇、血清白蛋白和酪氨酸酶抑制剂，制备方法为：间充质干细胞外泌体与卵磷脂、胆固醇、血清白蛋白和酪氨酸酶抑制剂混合后，依次通过冰浴、水浴振荡，超低温冻存后室温融化，重复冻融，即得靶向酪氨酸酶抑制剂，可应用于化妆品领域。本申请将熊果苷同时与卵磷脂、胆固醇和血清白蛋白结合，提高熊果苷的化学稳定性，采用间充质干细胞外泌体作为载体，提高在皮肤的渗透性，从而有效抑制酪氨酸酶的活性，阻碍黑色素的生成，以达到美白祛斑效果。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品的领域，尤其涉及一种靶向酪氨酸酶抑制剂、制备方法和应用及美白霜。
背景技术
近年来以天然成分为主要配方的化妆品、护肤品逐渐受到关注和喜爱，不断开发新的天然成分护肤品，使其达到更好的美肤、护肤效果，已成为本领域当前的重要研究课题。市面上大多数化妆品或美白剂都是采用酪氨酸酶抑制剂，酪氨酸酶是通过黑素细胞生成黑色素的关键酶，因此直接抑制酪氨酸酶催化活性是最突出、最有效的靶点。由于酪氨酸酶仅由黑素细胞产生，所以靶向酪氨酸酶的抑制剂可以特异性抑制细胞内的黑素生成而无副作用。
例如熊果苷，一种对苯二酚的前体药物，是一种天然成分，减少或抑制酪氨酸酶活性从而抑制合成黑色素。然而，熊果苷的天然形态在化学上是不稳定的，可释放对苯二酚，分解为含苯代谢物，对骨髓具有潜在的毒性。此外，皮肤对于大多数物质是难以渗透的天然屏障，熊果苷要想发挥其美白祛斑效果，必须要透过角质层及更深层屏障表皮基底层，并且进入黑素细胞。
综上种种，使其在化妆品中的应用受到限制，因此，迫切需要开发具有保护作用的靶向新型酪氨酸酶抑制剂，以提高美白效果。
发明内容
本发明提供了一种靶向酪氨酸酶抑制剂、制备方法和应用及美白霜，以提高酪氨酸酶抑制剂在皮肤表面的渗透性和化学稳定性。
为了解决上述技术问题，本发明目的之一提供了一种靶向酪氨酸酶抑制剂，包括间充质干细胞外泌体及包裹在间充质干细胞外泌体的活性物质，所述活性物质包括卵磷脂、胆固醇、血清白蛋白和酪氨酸酶抑制剂。
通过采用上述方案，由于熊果苷自身的化学稳定性较差，容易发生变质，将熊果苷同时与卵磷脂、胆固醇和血清白蛋白结合，产生协同作用，可以提高熊果苷的化学稳定性，保证熊果苷的活性，同时采用间充质干细胞外泌体作为载体进行包裹，提供保护作用；此外皮肤形成天然屏障会阻挡外源物质，导致熊果苷难以直接渗透，大部分被截留在皮肤的角质层，外泌体与人体同源分子亲和力较高，在皮肤的渗透性较优，可以逃避宿主免疫系统，便于熊果苷渗入深层屏障表皮基底层，从而有效抑制酪氨酸酶的活性，阻碍黑色素的生成，以达到美白祛斑效果。
作为优选方案，包括以下原料组分：
卵磷脂：2wt％-10wt％；
胆固醇：1wt％-5wt％；
血清白蛋白：10wt％-30wt％；
酪氨酸酶抑制剂：15wt％-35wt％；
间充质干细胞外泌体：余量。
作为优选方案，所述酪氨酸酶抑制剂为熊果苷。
作为优选方案，所述间充质干细胞外泌体的提取方法为：
S01、将间充质干细胞系培养至细胞密度达到70％-80％后弃去原来的培养基，换成含有去外泌体胎牛血清的培养基培养；
S02、随后收集细胞上清液离心提取间充质干细胞外泌体。
作为优选方案，在所述S02中，所述细胞上清液离心提取间充质干细胞外泌体的方法为：将所述细胞上清液依次按照转速为1000rpm/min、4000rpm/min和10000rpm/min进行离心并收集上清，不同转速的离心时间为10min-40min，将收集的上清在转速为100000rpm/min的条件下离心90min，保留底部微小沉淀即得间充质干细胞外泌体。
通过采用上述方案，由于不断提高相对的离心转速，使得细胞上清液中的间充质干细胞、细胞器、细胞碎片和囊泡可以依次充分去除，最终获得的提取液中外泌体的纯度更高，外泌体对对人体同源分子的亲和力较优。
作为优选方案，在所述S01中，所述含有去外泌体胎牛血清的培养基中去外泌体胎牛血清的含量为0.5wt％。
为了解决上述技术问题，本发明目的之二提供了一种靶向酪氨酸酶抑制剂的制备方法，包括以下步骤：将所述间充质干细胞外泌体与卵磷脂、胆固醇、血清白蛋白和酪氨酸酶抑制剂混合后，依次通过冰浴、水浴振荡，超低温冻存10min-30min后室温融化，重复冻融3-4次，即得靶向酪氨酸酶抑制剂。
作为优选方案，所述冰浴温度为-5℃-5℃，所述冰浴时间为10min-30min。
为了解决上述技术问题，本发明目的之三提供了一种靶向酪氨酸酶抑制剂在化妆品领域中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明目的之四提供了一种美白霜，包括0.2wt％-10wt％靶向酪氨酸酶抑制剂和基料。
作为优选方案，美白霜包括以下原料组分：
蜡：2wt％-8wt％；
油：5wt％-30wt％；
乳化剂：0.5wt％-3wt％；
多元醇：5wt％-15wt％；
增稠剂：0-0.5wt％；
靶向酪氨酸酶抑制剂：0.2wt％-10wt％；
防腐剂：0.5wt％-1wt％；
水：余量。
作为优选方案，所述蜡为液体石蜡和/或蜂蜡，所述油为鲸蜡硬脂醇、异壬酸异壬酯、角鲨烷、辛酸/癸酸甘油三酯和聚二甲基硅氧烷中的一种或多种，所述乳化剂为鲸蜡硬脂基葡糖苷、甘油硬脂酸酯和PEG-100硬脂酸酯中的一种或多种，所述多元醇为甘油、丁二醇和丙二醇中的一种或多种，所述增稠剂为黄原胶、聚丙烯酸钠和丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物中的一种或多种，所述防腐剂为乙基己基甘油和/或苯氧乙醇。
相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
1、本申请将熊果苷同时与卵磷脂、胆固醇和血清白蛋白结合，产生协同作用，产生协同作用，可以提高熊果苷的化学稳定性，保证熊果苷的活性，采用间充质干细胞外泌体作为载体，提供保护作用，同时在皮肤的渗透性较优，便于熊果苷渗入深层屏障表皮基底层，从而有效抑制酪氨酸酶的活性，阻碍黑色素的生成，以达到美白祛斑效果。
2、通过不断提高相对的离心转速，使得细胞上清液中的间充质干细胞、细胞器、细胞碎片和囊泡可以依次充分去除，最终获得的提取液中外泌体的纯度更高，外泌体对对人体同源分子的亲和力较优。
附图说明
图1：为本发明制备例3中一种靶向酪氨酸酶抑制剂在复合前间充质干细胞外泌体的透射电镜图像；
图2：为本发明制备例3中一种靶向酪氨酸酶抑制剂在复合后间充质干细胞外泌体的透射电镜图像；
图3：为本发明制备例3中一种靶向酪氨酸酶抑制剂在复合前间充质干细胞外泌体的粒径结果；
图4：为本发明制备例3中一种靶向酪氨酸酶抑制剂在复合后间充质干细胞外泌体的粒径结果；
图5：为本发明制备例3中一种靶向酪氨酸酶抑制剂在一周内粒径变化的统计结果；
图6：为本发明的体外透皮吸收对比试验中Franz组件的结构示意图；
图7：为本发明制备例1-3和对比制备例1-4的体外透皮吸收对比试验检测结果；
图8：为本发明制备例1-3和对比制备例1-4的酪氨酸酶活性测定检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
网织红细胞向成熟红细胞转变过程中，细胞内晚期内涵体的界膜多处凹陷，向内出芽形成管腔状囊泡，从而转变为具有动态亚细胞结构的多囊泡体(multi-vesiclebodys，MVBs)。MVBs是真核细胞重要的蛋白运输与分拣中心，当MVB与胞膜融合后，其内的管腔状囊泡凹陷以内出芽方式形成颗粒状小囊泡，并释放入细胞外环境，即外泌体。外泌体作为载体能逃避宿主免疫系统，被靶细胞特异性吸收，具有长的循环半衰期，无毒性，生物相容性好。
在本申请一个实施方式中，一种靶向酪氨酸酶抑制剂，包括以下制备例的部分组分或全部组分，需要说明的是，在具体应用中可根据试剂需求灵活设计，只需满足各组分的一定质量配比或质量比例即可，各组分包括但不限于卵磷脂、胆固醇、血清白蛋白、酪氨酸酶抑制剂和间充质干细胞外泌体。
在其中一个实施方式中，一种靶向酪氨酸酶抑制剂，按质量分数包括：卵磷脂2wt％-10wt％、胆固醇：1wt％-5wt％、血清白蛋白：10wt％-30wt％、酪氨酸酶抑制剂：15wt％-35wt％、间充质干细胞外泌体：30wt％-60wt％，其制备方法具体包括以下步骤：将间充质干细胞外泌体与卵磷脂、5wt％胆固醇、血清白蛋白和熊果苷混合均匀后，通过冰浴、水浴震荡后，超低温冻存，随后室温超声融化，重复冻融3-4次，制得靶向酪氨酸酶抑制剂。
在其中一个实施方式中，冰浴的温度控制为-5℃-5℃范围内，冰浴时间控制为10min-30min，超低温冻存时间控制为10min-30min。
可以理解的是，在其他一些实施方式中，间充质干细胞外泌体可以购买获得，也可以制备获得，具体地，间充质干细胞外泌体的提取包括以下步骤：
S01、将培养皿中的间充质干细胞扩增至直径为15mm，培养至细胞密度达到70％-80％左右，弃掉原来的培养基，换成含有0.5wt％去外泌体胎牛血清的DMEM培养基或DMEM/F12培养基，培养48h后，收集细胞上清液，此时培养基中细胞生成的外泌体含量高且重量丰富；
S02、将细胞上清液中的间充质干细胞、细胞碎片和细胞器等杂质采用离心的方式去除，通过不断提高相对的离心转速，使得细胞上清液中的间充质干细胞、细胞器、细胞碎片和囊泡可以依次充分去除，最终获得的提取液中外泌体的纯度更高，具体包括步骤A-B三个步骤；
A、去除细胞上清液中的间充质干细胞，得到初级上清液；
具体地，将细胞上清液预先在离心条件为转速1000rpm/min、温度为4℃下离心10min，离心弃去沉淀并收集上清，以去除间充质干细胞，得到初级上清液；
B、去除初级上清液中的细胞碎片，获得次级上清液；
具体地，将初级上清液在转速4000rpm/min、温度为4℃下下离心20min，以去除细胞碎片，离心弃去沉淀并收集上清，获得次级上清液；
C、去除次级上清液中的细胞器和囊泡，得到提取液；
具体地，将次级上清液在转速10000rpm/min、温度为4℃下下离心40min，离心弃去沉淀并收集上清，以除去次级上清液中的细胞器和囊泡，最终获得提取液；
S03、将提取液固液分离，得到间充质干细胞外泌体；
在其中一个实施方式中，步骤S03具体为：将提取液在超速离心机中进行离心，控制转速为100000rpm/min、温度为4℃条件，离心时间为90min，外泌体经离心后沉淀下来，随后弃去大部分上清，留下管底部1-2mL液体，加入PBS溶液或生理盐水重悬后，再次在转速为100000rpm/min、温度为4℃条件下离心90min，小心吸走上清，加入500μL PBS溶液或生理盐水重悬底部微小沉淀，放置于1.5mL的干净EP管中，于-80℃温度条件下保存备用，以保持外泌体的活性，制得间充质干细胞外泌体。
上述制备获得的间充质外泌体与人体同源分子亲和力较高，在皮肤表面可加速吸收渗透，与熊果苷等成分复合后，作为载体促进渗透，可以用于化妆品、护肤品的制备。
在本申请一个实施方式中，一种美白霜，包括以下实施例的部分组分或全部组分，需要说明的是，在具体应用中可根据试剂需求灵活设计，只需满足各组分的一定质量配比或质量比例即可，各组分包括但不限于基料和上述靶向酪氨酸酶抑制剂。
在其中一个实施方式中，基料包括蜡、油、乳化剂、多元醇、增稠剂、靶向酪氨酸酶抑制剂、防腐剂和水。
在其中一个实施方式中，蜡可以为液体石蜡和/或蜂蜡。
在其中一个实施方式中，油可以为鲸蜡硬脂醇、异壬酸异壬酯、角鲨烷、辛酸/癸酸甘油三酯和聚二甲基硅氧烷中的一种或多种。
在其中一个实施方式中，乳化剂可以为鲸蜡硬脂基葡糖苷、甘油硬脂酸酯和PEG-100硬脂酸酯中的一种或多种，多元醇可以为甘油、丁二醇和丙二醇中的一种或多种。
在其中一个实施方式中，增稠剂可以为黄原胶、聚丙烯酸钠和丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物中的一种或多种，防腐剂可以为乙基己基甘油和/或苯氧乙醇。
在其中一个实施方式中，以质量分数计，美白霜包括：蜡2wt％-8wt％、油5wt％-30wt％、乳化剂0.5wt％-3wt％、多元醇5wt％-15wt％、靶向酪氨酸酶抑制剂0.2wt％-10wt％、防腐剂：0.5wt％-1wt％和水30wt％-90wt％。制备方法为将各组分混合均质后，制得美白霜。
以下结合具体制备例、实施例进行详细表述，以对比说明本申请中靶向酪氨酸酶抑制剂和美白霜的实际作用。
制备例一
一种靶向酪氨酸酶抑制剂，可应用于化妆品领域，包括以下制备步骤：
S01、将培养皿中的间充质干细胞扩增至直径为15mm，培养至细胞密度达到80％左右，弃掉原来的培养基，换成含有0.5wt％去外泌体胎牛血清的DMEM培养基或DMEM/F12培养基，在本实施例中，优选为DMEM/F12培养基，培养48h后，收集细胞上清液；
S02、将细胞上清液依次在不同离心条件下离心，离心条件分别为转速1000rpm/min下离心10min、转速4000rpm/min下离心20min、转速10000rpm/min下离心40min，离心温度均为4℃，每次离心弃去沉淀并收集上清，最终获得提取液；
S03、将提取液在超速离心机控制转速为100000rpm/min、温度为4℃条件下离心90min，随后弃去大部分上清，留下管底部1-2mL液体，加入PBS溶液重悬后，再次在转速为100000rpm/min、温度为4℃条件下离心90min，小心吸走上清，加入500μL PBS重悬底部微小沉淀，放置于1.5mL的干净EP管中，于-80℃温度条件下保存备用，制得间充质干细胞外泌体；
S04、将60wt％间充质干细胞外泌体与10wt％卵磷脂、5wt％胆固醇、10wt％血清白蛋白和15wt％熊果苷混合均匀后，通过0℃±5℃冰浴10min、37℃±5℃水浴10min震荡后，超低温-20℃±5℃冻存10min，随后室温超声融化，重复冻融4次，制得靶向酪氨酸酶抑制剂。
制备例二
一种靶向酪氨酸酶抑制剂，可应用于化妆品领域，包括以下制备步骤：
S01、将培养皿中的间充质干细胞扩增至直径为15mm，培养至细胞密度达到70％左右，弃掉原来的培养基，换成含有0.5wt％去外泌体胎牛血清的DMEM培养基或DMEM/F12培养基，在本实施例中，优选为DMEM培养基，培养48h后，收集细胞上清液A；
S02、将细胞上清液依次在不同离心条件下离心，离心条件分别为转速1000rpm/min下离心10min、转速4000rpm/min下离心20min、转速10000rpm/min下离心40min，离心温度均为4℃，每次离心弃去沉淀并收集上清，最终获得提取液；
S03、将提取液在超速离心机控制转速为100000rpm/min、温度为4℃条件下离心90min，随后弃去大部分上清，留下管底部1-2mL液体，加入PBS溶液重悬后，再次在转速为100000rpm/min、温度为4℃条件下离心90min，小心吸走上清，加入500μL PBS重悬底部微小沉淀，放置于1.5mL的干净EP管中，于-80℃温度条件下保存备用，制得间充质干细胞外泌体；
S04、将32wt％间充质干细胞外泌体与2wt％卵磷脂、1wt％胆固醇、30wt％血清白蛋白和35wt％熊果苷混合均匀后，通过0℃±5℃冰浴30min、37℃±5℃水浴30min震荡后，超低温-20℃±5℃冻存30min，随后室温超声融化，重复冻融3次，制得靶向酪氨酸酶抑制剂。
制备例三
一种靶向酪氨酸酶抑制剂，可应用于化妆品领域，包括以下制备步骤：
S01、将培养皿中的间充质干细胞扩增至直径为15mm，培养至细胞密度达到80％左右，弃掉原来的培养基，换成含有0.5wt％去外泌体胎牛血清的DMEM培养基或DMEM/F12培养基，在本实施例中，优选为DMEM/F12培养基，培养48h后，收集细胞上清液；
S02、将细胞上清液依次在不同离心条件下离心，离心条件分别为转速1000rpm/min下离心10min、转速4000rpm/min下离心20min、转速10000rpm/min下离心40min，离心温度均为4℃，每次离心弃去沉淀并收集上清，最终获得提取液；
S03、将提取液在超速离心机控制转速为100000rpm/min、温度为4℃条件下离心90min，随后弃去大部分上清，留下管底部1-2mL液体，加入PBS溶液重悬后，再次在转速为100000rpm/min、温度为4℃条件下离心90min，小心吸走上清，加入500μL PBS重悬底部微小沉淀，放置于1.5mL的干净EP管中，于-80℃温度条件下保存备用，制得间充质干细胞外泌体；
S04、将46wt％间充质干细胞外泌体与6wt％卵磷脂、3wt％胆固醇、20wt％血清白蛋白和25wt％熊果苷混合均匀后，通过0℃±5℃冰浴20min、37℃±5℃水浴20min震荡后，超低温-20℃±5℃冻存20min，随后室温超声融化，重复冻融4次，制得靶向酪氨酸酶抑制剂。
实施例一
一种美白霜，包括以下制备步骤：将2wt％蜡、5wt％油、0.5wt％乳化剂、5wt％多元醇、0.5wt％增稠剂、0.2wt％制备例一获得的靶向酪氨酸酶抑制剂、1wt％防腐剂和85.8wt％水混合搅拌均匀，制得美白霜，其中，蜡为液体石蜡，油由鲸蜡硬脂醇、角鲨烷和聚二甲基硅氧烷等比例混合而成，乳化剂由鲸蜡硬脂基葡糖苷、甘油硬脂酸酯和PEG-100硬脂酸酯等比例混合而成，多元醇由甘油和丙二醇等比例混合而成、增稠剂由黄原胶和丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物等比例混合而成，防腐剂为乙基己基甘油。
实施例二
一种美白霜，包括以下制备步骤：将8wt％蜡、30wt％油、3wt％乳化剂、15wt％多元醇、10wt％制备例二获得的靶向酪氨酸酶抑制剂、0.5wt％防腐剂和33.5wt％水混合搅拌均匀，制得美白霜，其中蜡为蜂蜡，油由异壬酸异壬酯、角鲨烷和聚二甲基硅氧烷等比例混合而成，乳化剂由鲸蜡硬脂基葡糖苷和PEG-100硬脂酸酯等比例混合而成，多元醇由甘油和丙二醇等比例混合而成，增稠剂由聚丙烯酸钠和丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物等比例混合而成，防腐剂为苯氧乙醇。
实施例三
一种美白霜，包括以下制备步骤：将5wt％蜡、18wt％油、2wt％乳化剂、10wt％多元醇、0.5wt％增稠剂、5wt％制备例三获得的靶向酪氨酸酶抑制剂、0.8wt％防腐剂和58.7wt％水混合搅拌均匀，制得美白霜，其中，蜡由液体石蜡和蜂蜡按等比例混合而成，油由鲸蜡硬脂醇、角鲨烷、辛酸/癸酸甘油三酯和聚二甲基硅氧烷等比例混合而成，乳化剂由鲸蜡硬脂基葡糖苷和甘油硬脂酸酯等比例混合而成，多元醇由甘油和丙二醇等比例混合而成，增稠剂由黄原胶、聚丙烯酸钠和丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物等比例混合而成，防腐剂由乙基己基甘油和苯氧乙醇等比例混合而成。
实施例四
一种美白霜，各步骤及各步骤使用的试剂和工艺参数均与实施例三相同，不同的地方在于，乳化剂由鲸蜡硬脂基葡糖苷、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯等比例混合而成。
实施例五
一种美白霜，各步骤及各步骤使用的试剂和工艺参数均与实施例三相同，不同的地方在于，增稠剂由黄原胶和丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物等比例混合而成。
对比制备例一
一种靶向酪氨酸酶抑制剂，各步骤及各步骤使用的试剂和工艺参数均与制备例三相同，不同的地方在于，卵磷脂采用间充质外泌体替代。
对比制备例二
一种靶向酪氨酸酶抑制剂，各步骤及各步骤使用的试剂和工艺参数均与制备例三相同，不同的地方在于，胆固醇采用间充质外泌体替代。
对比制备例三
一种靶向酪氨酸酶抑制剂，各步骤及各步骤使用的试剂和工艺参数均与制备例三相同，不同的地方在于，血清白蛋白采用间充质外泌体替代。
对比制备例四
一种靶向酪氨酸酶抑制剂，包括熊果苷。
对比例一
一种美白霜，将5wt％制备例三获得的靶向酪氨酸酶抑制剂和95wt％水混合而成。
性能检测试验
1、对制备例3获得的靶向酪氨酸酶抑制剂采用透视电子显微镜(TEM)和动态光散射仪检测，并获得如图1-4所示的透射电镜图像和粒径结果，同时检测一周时间里在温度为4℃和37℃条件存贮的靶向酪氨酸酶抑制剂粒径大小变化，检测结果如图5所示；
2、体外透皮吸收对比试验
试验样品：采用清水作为空白对照，同时检测制备例1-3和对比制备例1-4获得的靶向酪氨酸酶抑制剂；
试验对象：采用Franz细胞新鲜猪皮(腹部皮)进行体外透皮实验；
试验过程：
A、实验前仔细去除毛发和皮下脂肪，将猪皮肤放置并夹在Franz组件的供体和受体隔间之间，皮片的角质层面向供体隔间(如图6)，容纳室内填充了PBS，避免了皮肤底面和PBS溶液之间的气泡；
B、将样品均匀涂抹于皮肤角质层，在Franz槽底部放置一个磁力搅拌器，以400rpm的速度连续搅拌；
C、分别于1、2、4、8、12、24h取PBS溶液(100μl)，每次取样后，将相同体积的PBS重新注入Franz池；
D、采用高效液相色谱法(Agilent 1100HPLC VWD)测定提取的PBS溶液中熊果苷的浓度，色谱柱为Poroshell(120EC-C18，4.6×100mm，2.7μm)，检测波长222nm，流动相为水：甲醇：0.1M盐酸(89：10：1，v/v/v)，流速为0.5ml/min，测定熊果苷的峰面积，根据标准曲线换算成浓度，检测结果如表1和图7所示。
表1-制备例1-3和对比制备例1-4在透皮吸收试验中测得熊果苷浓度
3、酪氨酸酶活性测定
试验样品：采用清水作为空白对照，同时检测制备例1-3和对比制备例1-4获得的靶向酪氨酸酶抑制剂；
试验过程：
A、将B16鼠黑色素瘤细胞以8×10 3细胞/100uL接种到96孔板中，并使其在37℃下粘附24小时；
B、24小时后，用制备例1-3和对比制备例1-3分别对不同试样细胞处理48小时；
C、为了测量细胞酪氨酸酶活性，用冰冷的PBS洗涤细胞，然后用含有1％Triton-X100的90μL PBS裂解，然后将裂解物离心500xg，15min，4℃，然后通过BCA蛋白质测定试剂盒(P0011，碧瑶生物技术研究所，中国)测定蛋白质浓度；
D、将含有40μg蛋白质的200μL混合物加入96孔板的每个孔中，并在37℃下与2.5mM3,4-二羟基-L-苯丙氨酸(L-DOPA)孵育1小时。使用酶标仪在490nm处测量吸光度，检测结果如表2和图8所示。
表2-制备例1-3和对比制备例1-4的酪氨酸酶活性测定结果
4、美白、祛斑效果检测
试验对象：选取女性年龄在21-45周岁，面部有由于日晒、工作压力、年龄等造成的斑点，在试验期间按规定使用受试物且资料齐全；
试验样品：实施例1-5和对比例1获得的美白霜；
试验过程：每天早晚两次涂抹美白霜，使用量及使用频率为0.5g/次，2次/天(早晚各1次)，测试周期为4周，通过VISIA-CR获取脸部图像数据，L*表征亮度，值越大越偏向于白色，a*代表红绿色度，其变化表示美白产品使用前后红绿色度的变化，+a*表示红色，-a*表示绿色；b*代表蓝黄色度，其变化表示美白产品使用前后皮肤蓝黄色度的变化，+b*表示黄色，-b*表示蓝色。由测得的L*、a*和b*数值可以计算ITA值比较人群皮肤颜色的变化，ITA值越大，皮肤越明亮，反之，皮肤越晦暗，检测结果如表3所示。
表3-实施例1-5美白、祛斑效果检测结果
| 检测项目 | 使用前ITA值 | 使用后ITA值 | 提高值 |
| 实施例1 | 45.3 | 49.4 | 4.1 |
| 实施例2 | 41.7 | 46.5 | 4.8 |
| 实施例3 | 41.6 | 47.3 | 5.7 |
| 实施例4 | 43.6 | 46.3 | 2.7 |
| 实施例5 | 40.8 | 43.1 | 2.3 |
| 对比例1 | 44.2 | 47.4 | 3.2 |
如图1-2的透射电子显微镜显示结果所示，该产品最终呈圆形囊泡状，粒径约100nm左右，间充质干细胞外泌体将熊果苷等物质包裹在内部，靶向酪氨酸酶抑制剂的间充质外泌体前后形态变化不大；如图3-4的粒径结果显示，粒径略有增大,靶向酪氨酸酶抑制剂在复合前间充质外泌体粒径集中在105±5.01nm，靶向酪氨酸酶抑制剂在复合后间充质外泌体粒径集中在140±7.23nm。
如图5所示，在一周内测定载有酪氨酸酶抑制剂的间充质外泌体粒径变化情况，在4℃和37℃，靶向酪氨酸酶抑制剂的间充质外泌体粒径无明显变化，说明该靶向酪氨酸酶抑制剂在1周内可以稳定存在。
结合表1-2和图7-8中制备例3和对比制备例1-4的检测结果可知，由于熊果苷难以渗透皮肤的天然屏障，本申请采用间充质干细胞外泌体作为熊果苷的载体，在皮肤的渗透性和生物相容性较优，可以逃避宿主免疫系统，便于熊果苷渗入深层屏障表皮基底层，熊果苷在皮肤表面的渗透效率提高，从而有效抑制酪氨酸酶的活性，抑制黑色素的生成，以达到美白祛斑效果；此外，熊果苷同时与卵磷脂、胆固醇和血清白蛋白相互协同作用，提高熊果苷的化学稳定性，防止轻易发生变质，熊果苷抑制酪氨酸酶活性的效果提高。
结合表3中实施例3-5和对比例1的检测结果可知，靶向酪氨酸酶抑制剂加入美白霜成分中，与各组分相容性较好，通过与组分中各组分的协同作用，从而起到协同增效的作用，可以提高靶向酪氨酸酶抑制剂的美白功效。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种靶向酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，包括以下原料组分：
卵磷脂：2wt％-10wt％；
胆固醇：1wt％-5wt％；
血清白蛋白：10wt％-30wt％；
酪氨酸酶抑制剂：15wt％-35wt％；
间充质干细胞外泌体：余量；
靶向酪氨酸酶抑制剂的制备步骤包括以下步骤：将所述间充质干细胞外泌体与卵磷脂、胆固醇、血清白蛋白和酪氨酸酶抑制剂混合后，依次通过冰浴、水浴振荡，超低温冻存后室温融化，重复冻融，即得靶向酪氨酸酶抑制剂；所述酪氨酸酶抑制剂为熊果苷。
2.如权利要求1所述的一种靶向酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体的提取方法为：
S01、将间充质干细胞系培养至细胞密度达到70％-80％后弃去原来的培养基，换成含有去外泌体胎牛血清的培养基培养；
S02、随后收集细胞上清液离心提取间充质干细胞外泌体。
3.如权利要求2所述的一种靶向酪氨酸酶抑制剂，其特征在于，在所述S02中，所述细胞上清液离心提取间充质干细胞外泌体的方法为：将所述细胞上清液依次按照转速为1000rpm/min、4000rpm/min和10000rpm/min进行离心并收集上清，不同转速的离心时间为10min-40min，将收集的上清在转速为100000rpm/min的条件下离心90min，保留底部微小沉淀即得间充质干细胞外泌体。
4.如权利要求1-3任一所述的一种靶向酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述间充质干细胞外泌体与卵磷脂、胆固醇、血清白蛋白和酪氨酸酶抑制剂混合后，依次通过冰浴、水浴振荡，超低温冻存后室温融化，重复冻融，即得靶向酪氨酸酶抑制剂。
5.如权利要求4所述的一种靶向酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述冰浴温度为-5℃～5℃，所述冰浴时间为10min-30min；所述水浴温度为32℃-42℃，所述水浴时间为10min-30min，所述超低温冻存温度为-25℃～-15℃，所述超低温冻存时间为10min-30min。
6.一种如权利要求1-3任一所述的靶向酪氨酸酶抑制剂在化妆品领域中的应用。
7.一种美白霜，其特征在于，包括以下原料组分：
蜡：2wt％-8wt％；
油：5wt％-30wt％；
乳化剂：0.5wt％-3wt％；
多元醇：5wt％-15wt％；
增稠剂：0.5wt％；
如权利要求1-3任一所述的靶向酪氨酸酶抑制剂：0.2wt％-10wt％；
防腐剂：0.5wt％-1wt％；
水：余量；
所述油由鲸蜡硬脂醇、角鲨烷和聚二甲基硅氧烷等比例混合而成，或由鲸蜡硬脂醇、角鲨烷、辛酸/癸酸甘油三酯和聚二甲基硅氧烷等比例混合而成；所述乳化剂由鲸蜡硬脂基葡糖苷和甘油硬脂酸酯等比例混合而成；所述增稠剂由黄原胶、聚丙烯酸钠和丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物等比例混合而成。
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