CN113943825A - 一种基于荧光定量pcr技术检测鱼致病链球菌的引物探针组及其试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌的引物探针组及其试剂盒和应用，属于分子生物学技术领域。基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或X13SY08的引物探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸如SEQ ID NO:2所示的反向引物以及核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的探针。所述引物探针组与qPCR MIX反应液、阳性对照和阴性对照组成检测试剂盒。所述试剂盒利用荧光定量PCR技术对待检样品DNA进行快速检测，通过实时扩增曲线判断样品是否为阳性样本，同时具备精准、灵敏、适用性广等优点。

Description

一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌的引物探针组 及其试剂盒和应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌的引物探针组及其试剂盒和应用。

背景技术

新型鱼致病链球菌菌株X16XC17和X13SY08是近年来在我国沿海地区新出现的一种鱼链球菌病病原。该两株菌高度同源，同属于链球菌属。由于暂未科学命名，本文中以其编号X16XC17和X13SY08指代。该新型链球菌属可致使病鱼表现出明显症状，包括游动异常、眼球突出、角膜混浊、眼出血和皮肤暗沉。该新兴致病菌的出现对当地高密度水产养殖业产生了重大的负面影响。因此，建立早期快速检测方法对鱼新型致病链球菌X16XC17和X13SY08感染的预防和控制具有十分重要的意义。目前尚未有将荧光定量 PCR技术应用于快速检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和X13SY08的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌的引物探针组及其试剂盒和应用，具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、操作方便等优点。

本发明提供了一种检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或X13SY08的特异性基因，所述特异性基因为neuB基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌菌株 X16XC17和/或X13SY08的引物探针组，包括引物对和探针；所述引物对和探针以所述特异性基因为模板设计得到；

所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸如SEQ IDNO:2所示的反向引物；

所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的，所述探针的5′端标记有荧光基团，3′端标记有淬灭基团。

优选的，所述荧光基团包括FAM，所述淬灭基团包括BHQ1。

优选的，正向引物、反向引物和探针的摩尔比为2：2：1。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌菌株 X16XC17和X13SY08的试剂盒，包括所述引物探针组。

优选的，还包括qPCRMIX反应液、阳性对照和阴性对照。

优选的，所述qPCRMIX反应液包含以下含量的组分：5U Taq酶、2.5mM dNTPs、25mMMgCl₂和2×PCRbuffer。

本发明提供了所述引物探针组在检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或 X13SY08的试剂盒中的应用。

本发明提供了所述引物探针组或所述试剂盒在非诊断目的的检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或X13SY08中的应用。

优选的，所述非诊断目的的检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或 X13SY08的方法，包括以下步骤：

1)提取待检测样品的DNA；

2)以提取的DNA为模板，用所述引物探针组进行荧光定量PCR检测，得到样品的扩增曲线；

3)根据所述样品的Ct值和扩增曲线判断检测结果，当Ct值小于35且出现“S”型曲线则为阳性，即检测样品为含有鱼新型致病链球菌X16XC17和 X13SY08；反之，则为阴性。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌菌株 X16XC17和/或X13SY08的引物探针组，包括引物对和探针；所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸如SEQ ID NO:2所示的反向引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。本发明提供的引物探针组中引物对和探针同时与模板特异性结合，具有较高的检测特异性，为快速、精准检测菌株X16XC17和/或X13SY08提供了基础。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌菌株 X16XC17和X13SY08的试剂盒，包括所述引物探针组。所述试剂盒具有以下优点：(1)检测时间短：在40min内可实现将对鱼新型致病链球菌X16XC17 和X13SY08的检测；(2)可实时监控：通过监测荧光信号，实现实时在线监控，更加直观得观察产物的增加；(3)特异性强：引入荧光探针，使引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了其特异性；(4)操作简便：仅需完成配液、上机和结果读取这三个步骤，无需进行跑胶、酶切等复杂操作，使得操作人员更容易接受，有利于方法推广；(5)污染少：采用闭管检测，无需后续对PCR产物进行开盖处理，避免了气溶胶污染；(6)检测灵敏度高：可检测浓度为0.1fg/μL的阳性质粒DNA。因此，所述试剂盒实现快速、精准的检测鱼致病链球菌X16XC17和X13SY08。

附图说明

图1为本发明实施例3中灵敏度实验的检测结果图，图中a-g依次为100 pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL的阳性对照模板浓度；

图2是本发明实施例4中特异性实验的检测结果图，图中A：新型鱼致病链球菌X16XC17和X13SY08；B：19种非目标菌株。

具体实施方式

本发明提供了一种检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或X13SY08的特异性基因，所述特异性基因为neuB基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:5 (ATGGTTTATATTATTGCAGAAATTGGTTGTAATCACAATGGTGATCTAG AACTGGCTAAAAAAATGGTAGACGTAGCTATTGAATGTGGGGTCGATG CTGTTAAGTTTCAGACCTTTAAAGCAGAGAAGTTGATCTCAAAATTTGCTCCTAAAGCGGAGTATCAAAAGGCAACGAC AGGGACTACTGACAGCCAGCTTGAGATGACAAAACGTTTGGAGTTGAGTTTCGATGAGTATTTAG AAATACGTGACTATGCACTAGCAAAAGGAGTGGATACTTTTTCAACAC CTTTTGATGATGAATCTTTGGAATTTTTGATTTCAACAGATATGCCAGTT TACAAAATTCCATCAGGGGAAATTACAAACTTGCCTTATCTTGAAAAAA TTGGGAAACAAAAGAGAAAAGTTATTCTTTCTACGGGAATGGCCACAA TGGATGAAATTCATCAAGCAGTTAATATTCTTCGTCAAAATGGAACGGC GGATATCTCTATTTTGCACTGTACCACTGAATACCCTACACCTTGCTCTT CTTTAAACTTGAATGTTATTCATACCCTTAAAAAGGAGTTTCCGGAGTT AGTGATTGGTTATTCAGACCATTCAATCGGCTCTGAAGTACCGGTTGCA GCAGCAGCTATGGGGGCTGAAGTGATTGAGAAGCACTTTACAATAGAT ACAGAAATGGAAGGACCAGACCACAAAGCGAGTGCAACACCAGAGAT TTTGTCGGCGCTAGTAAAAGGTATTCGTATCATTGAACAGTCTTTAGGA AGATTTGAGAAGATACCTGATCCAGTTGAACAAAAAAATAAGATTGTA GCTCGGAAGTCAGTTGTTGCTATAAGAAGGATTAAAGAAGGTGAAGTA TTTACAGAAGAAAATATCACTGTTAAACGTCCAGGTAACGGTATTTCACCGATGTTTTGGTATGACCTTCTAGGCAAAGAAGCACAGGAAGATTTTG AAGAAGATGAAGTTATTCGTGATTCCCGATTTGAAAATCAGCTTTAG)所示。该特异性基因为毒力基因gene0486，与编码N-乙酰神经氨酸合成酶 (N-acetyl neuramic acid synthetase)的neuB基因的同源性在86.7％。通过比对发现，X16XC17和/或X13SY08来源的特异性基因与链球菌的不同菌种的基因相似度较低，说明该基因为X16XC17和/或X13SY08菌特有的，因此，该基因作为特异性检测片段能够实现X16XC17和/或X13SY08菌和其他链球菌菌种的区分。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌菌株 X16XC17和/或X13SY08的引物探针组，包括引物对和探针。所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1(GCTCCTAAAGCGGAGTATCAAAAG)所示的正向引物和核苷酸如SEQ ID NO:2(CTCAACTCCAAACGTTTTGTCATC)所示的反向引物；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3(CAACGACAGGGACTACTGACAGCCAGC)所示。所述探针优选荧光探针；所述荧光探针的5′端标记有荧光基团，3′端标记有淬灭基团。本发明对所述荧光基团的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的荧光基团即可，例如FAM。本发明对所述淬灭基团的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的淬灭基团即可，例如BHQ1。正向引物、反向引物和探针的摩尔比优选为2：2：1。本发明对所述引物探针组的来源没有特殊限制采用本领域所熟知的人工合成方法即可。

本发明提供了一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌菌株 X16XC17和X13SY08的试剂盒，包括所述引物探针组。所述引物探针组优选为正向引物、反向引物和探针独立分装。所述试剂盒优选还包括qPCR MIX 反应液、阳性对照和阴性对照。所述qPCRMIX反应液优选包含以下含量的组分：5U Taq酶、2.5mM dNTPs、25mM MgCl₂和2×PCRbuffer。本发明对所述qPCRMIX反应液的原料没有特殊限制，采用本领域所熟知的Taq酶、 MgCl₂和2×PCRbuffer即可。所述阳性对照为含有目标片段的重组质粒。所述目标片段优选采用上述方案所述引物探针组中引物对进行PCR扩增菌株 X16XC17和/或X13SY08所获得的扩增片段。本发明对所述重组质粒的骨架质粒的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的质粒即可。本发明对所述阳性对照的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组质粒的构建方法即可。所述阴性对照为ddH₂O。

本发明提供了所述引物探针组在检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或 X13SY08的试剂盒中的应用。

在本发明中，所述鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或X13SY08参见现有技术(L.Li,C.Wang,R.H.Olsen,et al.,Characterization ofa Streptococcus species isolatedfrom Siganus guttatus in South China,aquaculture(2018), https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2021.737163；Liu Y,Zeng R,Weng B,Luo T,Luo Q,Xu L.DraftGenome Sequence of Streptococcus sp.X13SY08,Isolated from Murray Cod(Maccullochella peelii peelii).Genome Announc. 2016；4(1):e01470-15.)。

本发明提供了所述引物探针组或所述试剂盒在非诊断目的的检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或X13SY08中的应用。

在本发明中，所述非诊断目的的检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或 X13SY08的方法，优选包括以下步骤：

1)提取待检测样品的DNA；

2)以提取的DNA为模板，用所述引物探针组进行荧光定量PCR检测，得到样品的扩增曲线；

3)根据所述样品的Ct值和扩增曲线判断检测结果，当Ct值小于35且出现“S”型曲线则为阳性，即检测样品为含有鱼新型致病链球菌X16XC17和 X13SY08；反之，则为阴性。

本发明对提取待检测样品的DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取DNA的方法即可。所述待检测样品优选包括养殖鱼类。

在本发明中，荧光定量PCR的反应体系优选为25μL反应体系：10 μmol/LFP和BP引物各1μL，10μmol/L探针0.5μL，qPCRMIX反应液12.5 μL，模板5μL，用去离子水补齐到25μL。荧光定量PCR的反应程序：95℃反应5min；95℃反应15sec，60℃反应60sec，30个循环，每循环延伸结束时收集荧光信号。所述荧光定量PCR检测优选设置阳性对照孔和阴性对照孔。

在本发明中，对阳性质粒DNA进行10倍梯度稀释后，所述试剂盒采用上述检测方法可检测浓度为0.1fg/μL的阳性质粒DNA。

在本发明中，所述试剂盒仅对引起链球菌病的常见链球菌种和鱼类工业中常见的19种致病菌种，检测结果见图1，本发明方案具有良好的特异性。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌的引物探针组及其试剂盒和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

基于荧光定量PCR技术快速检测鱼新型致病链球菌X16XC17和 X13SY08的试剂盒

包括引物组、qPCRMIX反应液、去离子水、阳性对照和阴性对照。

(1)荧光定量PCR扩增引物设计：以新型鱼致病链球菌X16XC17和 X13SY08特异性保守序列为靶基因进行引物的设计。引物序列见表1。

表1引物序列表

(2)荧光定量qPCRMIX反应液含有：5U Taq酶，2.5mM dNTPs，25 mM MgCl₂，2×PCRbuffer。

(3)阳性对照为含有鱼新型致病链球菌X16XC17和X13SY08特异性基因片段的T载体克隆，其制备方法为：DNA模板来源于鱼新型致病链球菌X16XC17或X13SY08，利用表1中的FP和BP引物(SEQ ID NO：1和 SEQ ID NO：2)对模板DNA进行PCR扩增反应，得到含靶基因序列的DNA，回收该扩增片段(SEQ ID NO：4，GCTCCTAAAGCGGAGTATCAAAAGGCAACGACAGGGACTACTGACAG CCAGCTTGAGATGACAAAACGTTTGGAGTTGAG)，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。去离子水为阴性对照。

实施例2

基于荧光定量PCR技术快速检测鱼新型致病链球菌X16XC17和 X13SY08的检测方法

利用实施例1的试剂盒检测鱼新型致病链球菌X16XC17和X13SY08的方法，包括如下步骤：

(1)待检样品DNA的提取；

(2)荧光定量PCR反应体系：25μL反应体系中含有10μmol/L FP和 BP引物各1μL，10μmol/L探针0.5μL，qPCR MIX反应液12.5μL，模板5 μL，用去离子水补齐到25μL；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR 管混匀后离心，放置荧光PCR仪(如ABI7500)进行反应。

(3)反应程序如下：95℃反应10min；95℃反应15sec，60℃反应60sec， 45个循环，每循环延伸结束时收集荧光信号。

(4)结果判断：观察荧光定量PCR仪扩增Ct判断扩增结果，如果Ct 值小于35且出现“S”型曲线则为阳性，即检测样品为含有鱼新型致病链球菌X16XC17或X13SY08；反之，则为阴性。

实施例3

灵敏度验证

实施例1所述的试剂盒按照实施例2的检测方法检测新型鱼致病链球菌 X16XC17和X13SY08的阳性对照灵敏度：

将阳性对照质粒DNA进行10倍梯度稀释，分别以100pg/μL、10pg/μL、 1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、0.1fg/μL七个梯度浓度DNA作为模板和阴性对照(灭菌超纯水)按照上述反应体系和条件建立检测方法，以确定试剂盒的灵敏度。

结果如图1所示，结果表明：将阳性质粒DNA进行10倍梯度稀释后，建立的检测试剂盒可检测浓度为0.1fg/μL的阳性质粒DNA。

实施例4

特异性验证

用本发明试剂盒分别检测引起链球菌病的常见链球菌种和鱼类工业中常见的19种致病菌种(如表2所示)。

检测结果见图2，新型鱼致病链球菌X16XC17和X13SY08如图2中A 线所示，常见的19种致病菌种的扩增曲线如图2中B线所示，这表明所述引物探针组不能扩增除鱼致病链球菌X16XC17和X13SY08以外的菌种。本发明方案具有良好的特异性。

表2特异性实验所用菌株及编号

实施例5

利用实施例2记载的检测方法和实施例1的试剂盒对待测样本进行检测，选取来自海口养殖场提供的30个疑似患链球菌病点斑篮子鱼的检测，所有样本均能够检测出正确的结果，通过本发明的方案确定待检测鱼类是否感染鱼新型致病链球菌X16XC17和X13SY08，并通过测序PCR产物的方法验证，所有的扩增产物均为靶基因序列，并且通过菌株分离和16S rRNA序列测序 (参见L.Li,C.Wang,R.H.Olsen,et al.,Characterization ofaStreptococcus species isolated from Siganus guttatus in South China,aquaculture(2018), https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2021.737163)验证，准确性达100％，且方便快捷。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 暨南大学

华南理工大学

<120> 一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌的引物探针组及其试剂盒和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctcctaaag cggagtatca aaag 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcaactcca aacgttttgt catc 24

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caacgacagg gactactgac agccagc 27

<210> 4

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctcctaaag cggagtatca aaaggcaacg acagggacta ctgacagcca gcttgagatg 60

acaaaacgtt tggagttgag 80

<210> 5

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtttata ttattgcaga aattggttgt aatcacaatg gtgatctaga actggctaaa 60

aaaatggtag acgtagctat tgaatgtggg gtcgatgctg ttaagtttca gacctttaaa 120

gcagagaagt tgatctcaaa atttgctcct aaagcggagt atcaaaaggc aacgacaggg 180

actactgaca gccagcttga gatgacaaaa cgtttggagt tgagtttcga tgagtattta 240

gaaatacgtg actatgcact agcaaaagga gtggatactt tttcaacacc ttttgatgat 300

gaatctttgg aatttttgat ttcaacagat atgccagttt acaaaattcc atcaggggaa 360

attacaaact tgccttatct tgaaaaaatt gggaaacaaa agagaaaagt tattctttct 420

acgggaatgg ccacaatgga tgaaattcat caagcagtta atattcttcg tcaaaatgga 480

acggcggata tctctatttt gcactgtacc actgaatacc ctacaccttg ctcttcttta 540

aacttgaatg ttattcatac ccttaaaaag gagtttccgg agttagtgat tggttattca 600

gaccattcaa tcggctctga agtaccggtt gcagcagcag ctatgggggc tgaagtgatt 660

gagaagcact ttacaataga tacagaaatg gaaggaccag accacaaagc gagtgcaaca 720

ccagagattt tgtcggcgct agtaaaaggt attcgtatca ttgaacagtc tttaggaaga 780

tttgagaaga tacctgatcc agttgaacaa aaaaataaga ttgtagctcg gaagtcagtt 840

gttgctataa gaaggattaa agaaggtgaa gtatttacag aagaaaatat cactgttaaa 900

cgtccaggta acggtatttc accgatgttt tggtatgacc ttctaggcaa agaagcacag 960

gaagattttg aagaagatga agttattcgt gattcccgat ttgaaaatca gctttag 1017

Claims (10)

1.一种检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或X13SY08的特异性基因，其特征在于，所述特异性基因为neuB基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

2.一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或X13SY08的引物探针组，其特征在于，包括引物对和探针；所述引物对和探针以权利要求1所述特异性基因为模板设计得到；

所述引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸如SEQ ID NO:2所示的反向引物；

所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求2所述引物探针组，其特征在于，所述探针的5′端标记有荧光基团，3′端标记有淬灭基团；

所述荧光基团包括FAM，所述淬灭基团包括BHQ1。

4.根据权利要求2或3所述引物探针组，其特征在于，正向引物、反向引物和探针的摩尔比为2：2：1。

5.一种基于荧光定量PCR技术检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和X13SY08的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2～4任意一项所述引物探针组。

6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，还包括qPCR MIX反应液、阳性对照和阴性对照。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述qPCR MIX反应液包含以下含量的组分：5U Taq酶、2.5mM dNTPs、25mM MgCl₂和2×PCR buffer。

8.权利要求1～4任意一项所述引物探针组在检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或X13SY08的试剂盒中的应用。

9.权利要求1～4任意一项所述引物探针组或权利要求5～7所述试剂盒在非诊断目的的检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或X13SY08中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述非诊断目的的检测鱼致病链球菌菌株X16XC17和/或X13SY08的方法，包括以下步骤：

1)提取待检测样品的DNA；

2)以提取的DNA为模板，用所述引物探针组进行荧光定量PCR检测，得到样品的扩增曲线；

3)根据所述样品的Ct值和扩增曲线判断检测结果，当Ct值小于35且出现“S”型曲线则为阳性，即检测样品为含有鱼新型致病链球菌X16XC17和X13SY08；反之，则为阴性。

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