CN113941005A - 二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子、制备、复合物、用途 - Google Patents

二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子、制备、复合物、用途 Download PDF

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Abstract

本发明实施例涉及一种制备二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的方法，由该方法制备而得的二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子及其用途，和包含该二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的复合物及其用途。本发明实施例涉及的一种制备二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的方法包括以下步骤：将硫氰、金刚烷硫醇与硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子混合，以得到所述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子。本发明实施例涉及的方法制备的二氧化硅纳米粒子的毒性较低，可以高效负载信使核糖核酸(mRNA)并成本效益高地向肝脏器官优先靶向或递送，可以有利于例如肝脏疾病的基因治疗技术的发展等。

Description

二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子、制备、复合物、用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及制备二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的方法，由该方法制备而得的二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子及其用途，和包含该二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的复合物及其用途。
背景技术
肝脏是人体能量转换、消化、排泄、免疫和解毒等过程的重要器官。肝脏疾病是临床常见的多发病，病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化以及原发性肝癌等极大地影响着人类的健康，有研究表明近80％的原发性肝癌都是由病毒性肝炎引起。我国是肝病的重灾区，约有1.2亿乙肝病毒携带者和1000万例丙肝感染者。目前肝病的临床治疗手段包括外科手术、肝移植术和药物治疗等。此外，基因治疗也是一种潜在的治疗选择，它主要是通过载体将外源核酸导入靶细胞，改变基因表达，治疗疾病。
信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)在活细胞翻译过程中起着连接脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)和蛋白质的重要作用，因此引起了研究和工业的极大兴趣，已显示出多种应用，如疫苗、基因编辑和癌症免疫治疗。
将mRNA递送到器官中的技术对于基因治疗技术的发展至关重要。到目前为止，已经开发了多种技术递送mRNA，包括基因枪，电穿孔，体外转染和基于病毒的递送系统。然而，mRNA递送的技术尚面临挑战，从而比如肝脏疾病的基因治疗技术有待发展。
综上，科研和医药应用领域亟需一种改进的mRNA递送技术以发展比如肝脏疾病的基因治疗技术。
发明内容
本发明解决的技术问题包括，目前用于递送信使核糖核酸(mRNA)的技术尚有改进空间，从而比如肝脏疾病的基因治疗技术有待发展。
本发明实施例的一方面涉及一种制备二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的方法，其包括以下步骤：将硫氰、金刚烷硫醇与硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子混合，以得到所述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子。
可选地，所述方法包括：将磷化二氧化硅纳米粒子与3-巯丙基三甲氧基硅烷混合，以得到所述硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子。
可选地，所述磷化二氧化硅纳米粒子与所述3-巯丙基三甲氧基硅烷的物质的量的比例范围为100mg：0.1mmol至100mg：0.2mmol。
可选地，所述方法包括：将硫氰酸盐分散于氯仿中，用溴滴定氯仿，过滤，得到所述硫氰。
可选地，所述硫氰酸盐、所述氯仿与所述溴的物质的量比例范围为0.8：50：1至1：50：1。
可选地，所述硫氰酸盐包括硫氰酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸铅。
可选地，所述方法包括，将表面活性剂、二氧化硅前驱体和磷基硅烷偶联剂混合，以得到所述磷化二氧化硅纳米粒子。
可选地，所述表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵，所述二氧化硅前驱体包括正硅酸四乙酯，所述磷基硅烷偶联剂包括二乙基磷酰乙基三乙氧基硅烷。
可选地，所述方法包括：将所述硫氰与所述金刚烷硫醇加入到所述硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子的甲苯悬浮液中，在惰性气体气氛回流。
可选地，所述硫氰、所述金刚烷硫醇及所述硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子的物质的量比例范围为0.015：1：1至0.03：1：1。
可选地，所述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子粒径范围为80nm至120nm，或者80nm至90nm。
本发明实施例的另一方面涉及一种二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子，其由上述方法制备。
本发明实施例的又一方面涉及一种前述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子在递送信使核糖核酸中的用途。
本发明实施例的再一方面涉及一种上述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子在递送信使核糖核酸至肝脏中的用途。
本发明实施例的又一方面涉及一种复合物，其包括信使核糖核酸和前述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子。
可选地，所述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的氮(胺)基团与所述信使核糖核酸的磷酸酯基团的摩尔比范围为1：0.5至1：1。
可选地，所述复合物适于通过尾静脉、腹腔、或者肌肉注射。
本发明实施例的又一方面涉及一种上述复合物在制备肝脏疾病药物中的用途。
本发明实施例的技术方案可以有利于信使核糖核酸(mRNA)的递送、以及比如肝脏疾病的基因治疗技术的发展等。
下文将结合附图对本发明实施例进行进一步的描述。
附图说明
图1为本发明实验示例1中的二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的透射电镜图；
图2是本发明实验示例1里二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的扫描电镜图；
图3为本发明实验示例4中尾静脉、腹腔以及肌肉注射增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物至小鼠体内，不同时间的活体成像图；
图4是本发明实验示例5里通过尾静脉分别注射不同N/P比的增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物至小鼠体内，活体成像的靶向肝脏的数据图；以及
图5为本发明实验示例6中增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物，尾静脉注射至健康的小鼠体内，分别在1、7和28天后处死小鼠，取其心、肝、脾、肺、肾器官进行切片，再经苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，H&E)染色得到的图。
具体实施方式
本发明实施例的一方面涉及一种制备二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的方法，其包括以下步骤：将硫氰、金刚烷硫醇与硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子混合，以得到所述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子。
本发明实施例的技术方案可以有利于信使核糖核酸(mRNA)的递送、以及比如肝脏疾病的基因治疗技术的发展等。举例而言，本发明实施例涉及的方法制备的二氧化硅纳米粒子的毒性较低，可以高效负载mRNA并成本效益高地向肝脏器官优先靶向或递送，可以有助于例如肝脏疾病的基因治疗技术的发展等。
可选地，所述方法包括：将磷化二氧化硅纳米粒子与3-巯丙基三甲氧基硅烷混合，以得到所述硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子。如此，可以有利于将3-巯丙基三甲氧基硅烷附着在磷化二氧化硅纳米粒子表面，制备所述硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子。
可选地，所述磷化二氧化硅纳米粒子与所述3-巯丙基三甲氧基硅烷的物质的量的比例范围为100mg：0.1mmol至100mg：0.2mmol。如此，可以有助于所述硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子的形状、粒径的形成。
除非另外特别指出，本申请中的数值范围可以包括其中的任意数值、数值子范围，例如0.1mmol至0.2mmol可以包括0.1mmol、0.11mmol、0.15mmol、0.11-0.15mmol、0.18mmol、0.16-0.2mmol、0.2mmol等。
除非另外特别指出，本申请中的数值可以包含测量、计量等误差范围内的数值，其中误差可以在正负百分之五的范围。比如，100mg可以包含95mg、98mg、102mg、105mg等。
可选地，所述方法包括：将硫氰酸盐分散于氯仿中，用溴滴定氯仿，过滤，得到所述硫氰。如此，可以有利于制备所述硫氰。
可选地，所述硫氰酸盐、所述氯仿与所述溴的物质的量比例范围为0.8：50：1至1：50：1。如此，可以有助于保障所述硫氰的品质。
可选地，所述硫氰酸盐包括硫氰酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸铅。如此，可以有利于所述硫氰的品质。
可选地，所述方法包括，将表面活性剂、二氧化硅前驱体和磷基硅烷偶联剂混合，以得到所述磷化二氧化硅纳米粒子。如此，可以有助于制备所述磷化二氧化硅纳米粒子。
可选地，所述表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵，所述二氧化硅前驱体包括正硅酸四乙酯，所述磷基硅烷偶联剂包括二乙基磷酰乙基三乙氧基硅烷。如此，可以有利于所述磷化二氧化硅纳米粒子的形状、尺寸、性能的形成、调控。
可选地，所述方法包括：将所述硫氰与所述金刚烷硫醇加入到所述硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子的甲苯悬浮液中，在惰性气体气氛回流。如此，可以有助于形成二硫键，提高原料利用率、防止物质污染空气。惰性气体可以包括氮气。
可选地，所述硫氰、所述金刚烷硫醇及所述硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子的物质的量比例范围为0.015：1：1至0.03：1：1。如此，可以有利于形成二硫键，提升所述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的负载、递送、缓释等性能。
可选地，所述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子粒径范围为80nm至120nm，或者80nm至90nm。如此，可以有助于保障所述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的负载、递送、缓释等性能。
本发明实施例的另一方面涉及一种二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子，其由上述方法制备。
本发明实施例涉及的二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的毒性较低，可以高效负载信使核糖核酸(mRNA)并成本效益高地向肝脏器官优先靶向或递送，可以有助于例如肝脏疾病的基因治疗技术的发展等。
本发明实施例的又一方面涉及一种前述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子在递送信使核糖核酸中的用途。所述信使核糖核酸可以为短链、长链或环状。
本发明实施例涉及的二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子在递送信使核糖核酸中的用途中毒性较低，可以高效负载信使核糖核酸(mRNA)并成本效益高地向肝脏器官优先靶向或递送，可以有助于例如肝脏疾病的基因治疗技术的发展等。
本发明实施例的再一方面涉及一种上述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子在递送信使核糖核酸至肝脏中的用途。
本发明实施例涉及的二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子在递送信使核糖核酸至肝脏中的用途中毒性较低，可以高效负载信使核糖核酸(mRNA)并成本效益高地向肝脏器官优先靶向或递送，可以有助于例如肝脏疾病的基因治疗技术的发展等。
本发明实施例的又一方面涉及一种复合物，其包括信使核糖核酸和前述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子。
本发明实施例涉及的复合物可以成本效益高地向肝脏器官优先靶向或递送，可以有助于例如肝脏疾病的基因治疗技术的发展等。
可选地，所述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的氮(胺)基团与所述信使核糖核酸的磷酸酯基团的摩尔比范围为1：0.5至1：1。如此，可以有利于减少同量二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子对信使核糖核酸的使用量，降低成本，效果更佳。
可选地，所述复合物适于通过尾静脉、腹腔、或者肌肉注射。如此，可以有助于所述复合物的应用。
本发明实施例的又一方面涉及一种上述复合物在制备肝脏疾病药物中的用途。如此，可以有利于肝脏疾病药物的制备。
下述实验示例可以用于帮助理解本发明实施方式，无意用作对权利要求的限制。
实验示例
实验示例1：制备二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子
将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，250mg，0.7mmol)溶于H2O(120mL)和NaOH(875μL，2mol/L)中，加热至80℃，稳定30min，形成溶液。将正硅酸四乙酯(1.2ml)和二乙基磷酰乙基三乙氧基硅烷(DEPETS，0.2mL)的混合物滴入溶液中，同时大力搅拌后在80℃下保存2小时，离心得到产物。用甲醇彻底清洗产物，得到磷化二氧化硅纳米粒子。
将10mg磷化二氧化硅纳米粒子分散到无水甲苯(10mL)中，与(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(24μL，0.1m mol)混合，在氮气气氛下回流12h。在无水甲苯(10mL)中再次洗涤分散，获得单分散硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子。
将800mg硫氰酸铅分散于10mL氯仿中，用200μL溴滴定10mL氯仿。对混合滴定产物进行过滤，过滤孔径是22μm。滤液中氯仿含硫氰酸根呈淡黄色，得到硫化氰(硫氰)。
将金刚烷硫醇(17mg，0.1mol)和合成的硫氰加入到硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子的甲苯悬浮液中，在4℃和氮气气氛下回流反应4天。合成的材料呈黄色，用甲苯、甲醇和水依次洗涤，即得二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子。
图1和图2分别为二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的透射电镜图和扫描电镜图，可以看出二硫键功能化的纳米粒子的平均粒径范围在80-90nm，均匀且单分散。
实验示例2：制备增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EFGP)信使核糖核酸溶液
以pVAX1-增强绿色荧光蛋白质粒为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到增强绿色荧光蛋白基因的脱氧核糖核酸(DNA)片段。经琼脂糖凝胶电泳后切下与目的基因大小一致的片段区域凝胶，采用胶回收试剂盒回收该片段，得到纯化后的增强绿色荧光蛋白基因PCR产物。随后采用T7体外转录试剂盒，以0.5μg纯化后的增强绿色荧光蛋白基因PCR产物为模板，在37℃恒温条件下进行过夜转录，然后在37℃恒温条件下进行5’端加帽和3’端加尾修饰，得到修饰后的信使核糖核酸。修饰后的信使核糖核酸用转录纯化试剂盒进行纯化，用去离子水进行洗脱，得到短链增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸溶液。
实验示例3：制备增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物
以1：1(w/w)的N/P比将二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子溶液(二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子分散于去离子水中，浓度为0.5mg/ml)加入到增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸溶液(增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸分散于去离子水中，浓度为1mg/mL)中，立刻用移液枪吹打混匀，再在室温环境静置15分钟，即可制得增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物。N/P比是二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的氮(胺)基团与增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸的磷酸酯基团的摩尔比。
负载的增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸的重量、二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的重量分别用精密天平称量得到。参照后式计算：负载率＝负载的增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸的重量/(负载的增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸的重量+二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的重量)*100％，得到：当二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子与增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸的N/P比为1：1时，负载率为61％。
实验示例4：尾静脉、腹腔以及肌肉注射增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物
将实验示例3中制备的200μl的增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物与10μl吲哚菁绿(ICG)混合后，分别通过尾静脉、腹腔以及肌肉三种方式注射至小鼠体内，不同时间活体成像观察复合物进入小鼠的部位，图像结果如图3所示。
由图3可知，三种注射方式都可以藉由二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子将增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸递送、靶向至肝脏，其中，尾静脉注射增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸高效靶向肝脏，且在8小时后增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸在肝脏的量依旧很多，缓释效果相对较佳，而腹腔注射虽然增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸也高效靶向肝脏，但在8小时后在肝脏的增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸量比较少，缓释效果相对较差，肌肉注射增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸靶向肝脏的量相对最少。
实验示例5：通过尾静脉分别注射不同N/P比的增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物的靶向肝脏的效果
通过实验示例3的方法制备N/P比分别为1：0.5、1：1、1:1.25和1：5的4种增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物。此处的负载量各自差不多，可见二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子与增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸的N/P比与负载量没有直接的关系。
将200μl的每种增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物各自与10μl ICG混合后，分别通过尾静脉注射至小鼠体内，活体成像观察每种增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物进入小鼠肝脏器官的量。结果如图4所示，N/P比为1：0.5-1时比1：1.25-5时增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸递送至肝脏的量更多，减少了同量二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子对增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸的使用量，降低了成本，效果更佳。
实验示例6
根据实验示例3的方法制备N/P比为1：1的增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物，尾静脉注射200μl至健康的小鼠体内，分别在1、7和28天后处死小鼠，取其心、肝、脾、肺、肾器官进行切片，再经苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，H&E)染色得到的图示于图5，可以发现心、肝、脾、肺、肾均无损伤，表明增强绿色荧光蛋白信使核糖核酸/二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子复合物具有较好的安全性，对心、肝、脾、肺、肾器官无毒性。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (18)

1.一种制备二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将硫氰、金刚烷硫醇与硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子混合，以得到所述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：将磷化二氧化硅纳米粒子与3-巯丙基三甲氧基硅烷混合，以得到所述硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷化二氧化硅纳米粒子与所述3-巯丙基三甲氧基硅烷的物质的量的比例范围为100mg：0.1mmol至100mg：0.2mmol。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，包括：将硫氰酸盐分散于氯仿中，用溴滴定氯仿，过滤，得到所述硫氰。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述硫氰酸盐、所述氯仿与所述溴的物质的量比例范围为0.8：50：1至1：50：1。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述硫氰酸盐包括硫氰酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫氰酸铅。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括，将表面活性剂、二氧化硅前驱体和磷基硅烷偶联剂混合，以得到所述磷化二氧化硅纳米粒子。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表面活性剂包括十六烷基三甲基溴化铵，所述二氧化硅前驱体包括正硅酸四乙酯，所述磷基硅烷偶联剂包括二乙基磷酰乙基三乙氧基硅烷。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：将所述硫氰与所述金刚烷硫醇加入到所述硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子的甲苯悬浮液中，在惰性气体气氛回流。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫氰、所述金刚烷硫醇及所述硫醇基改性的磷化二氧化硅纳米粒子的物质的量比例范围为0.015：1：1至0.03：1：1。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子粒径范围为80nm至120nm，或者80nm至90nm。
12.一种二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子，其特征在于，由权利要求1-11中任一项所述的方法制备。
13.一种根据权利要求12所述的二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子在递送信使核糖核酸中的用途。
14.一种根据权利要求12所述的二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子在递送信使核糖核酸至肝脏中的用途。
15.一种复合物，其特征在于，包括信使核糖核酸和根据权利要求12所述的二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子。
16.根据权利要求15所述的复合物，其特征在于，所述二硫键功能化的二氧化硅纳米粒子的氮(胺)基团与所述信使核糖核酸的磷酸酯基团的摩尔比范围为1:0.5至1:1。
17.根据权利要求15所述的复合物，其特征在于，适于通过尾静脉、腹腔、或者肌肉注射。
18.一种根据权利要求15所述的复合物在制备肝脏疾病药物中的用途。
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