CN113913341B - 一种兼具烟碱降解和促植物生长的副炭疽芽孢杆菌g2-13及其应用 - Google Patents

一种兼具烟碱降解和促植物生长的副炭疽芽孢杆菌g2-13及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种兼具烟碱降解和促植物生长的副炭疽芽孢杆菌G2‑13及其应用，该菌株已于2021年08月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211041。本发明的兼具烟碱降解和促植物生长的副炭疽芽孢杆菌G2‑13，可以降解烟碱，而且可以促进植物的生长。同时，本发明的副炭疽芽孢杆菌G2‑13对尖孢镰刀菌、黄瓜霜霉病菌、小麦赤霉病菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌等有拮抗效果。因此，本发明的副炭疽芽孢杆菌G2‑13可以作为调节茄科植物生长的生物制剂，无论开发新的生物防治菌剂还是生长调节剂，或是生物有机肥，都具有很好的市场前景。

Description

一种兼具烟碱降解和促植物生长的副炭疽芽孢杆菌G2-13及 其应用
技术领域
本发明涉及一种副炭疽芽孢杆菌，具体涉及一种兼具烟碱降解和促植物生长的副炭疽芽孢杆菌G2-13及其应用。
背景技术
植物根际促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR)是一类存在于土壤并定殖于植物根际的有益微生物，可通过复杂机理直接或间接作用促进植物生长，直接作用包括分泌IAA等植物生长激素、分泌铁载体、溶磷解钾等，间接作用则主要是通过分泌抗菌物质以减轻或抑制植物病害的发生。常见的PGPR类群包括：假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)等。
烤烟作为高附加值经济作物，其品质因素决定了收购价格的高低，而部分种植户为提升产量，长期单一、过量施用化肥，导致土壤理化性质变差，土传病害盛行，产品质量与产量受到较大限制。因此，农业农村部针对滥用化肥导致土地质量持续下降的现象，提出的“药肥双减”项目。
减施化肥配施PGPR菌剂，能够显著提高土壤微生物活性和微生物群落结构多样性。研究表明，烤烟根际是一个重要的细菌资源库，但有关烤烟PGPR菌株的报道较少，且研究侧重于生防作用。
烟碱又称尼古丁，是烟草生物碱的主要成分，也是衡量烟草品质的重要指标。但是，由烤烟根系合成或烤烟残茬释放的烟碱极易渗入土壤和地下水造成土壤及水体环境受到污染，影响土壤环境质量。因此，挖掘兼具烟碱降解和PGPR能力高效功能微生物菌株对于保护土壤质量，促进烤烟产业可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种兼具烟碱降解和促植物生长的副炭疽芽孢杆菌G2-13及其应用，该副炭疽芽孢杆菌G2-13不仅可以高效降解烟碱，还可以促进植物的生长，并且具有抑制植物病原菌的作用。
为了达到上述目的，本发明提供了一种兼具烟碱降解和促植物生长的副炭疽芽孢杆菌G2-13，该菌株已于2021年08月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211041。
优选地，该副炭疽芽孢杆菌G2-13的16S rRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一目的是提供所述的副炭疽芽孢杆菌G2-13在植物病害生物防治中的应用。
优选地，所述植物选自茄科作物。
优选地，所述茄科作物选自烟草。
优选地，所述植物病害包括尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、大肠杆菌(Escherichia coli)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中任意一种或两种以上引起的植物病害。
优选地，所述副炭疽芽孢杆菌G2-13作为制备防治植物病害的药物，所述药物的剂型包括：可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂和微乳剂中任意一种。具体地，可以通过常规的液体或固体培养获得包括细菌菌体培养物，通过常规的液体发酵生产，然后加入表面活性剂如分散剂、稳定剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种，或与吸附载体按一定比例混合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂。
本发明的另一目的是提供所述的副炭疽芽孢杆菌G2-13在植物生长调节中的应用。具体地，所述的副炭疽芽孢杆菌G2-13可以作为植物生长调节剂。
优选地，所述副炭疽芽孢杆菌G2-13具有产吲哚乙酸、降解无机磷和产铁载体的功能。
本发明的另一目的是提供所述的副炭疽芽孢杆菌G2-13在烟碱降解、纤维素降解方面的应用。
本发明的兼具烟碱降解和促植物生长的副炭疽芽孢杆菌G2-13及其应用，具有以下优点：
本发明的兼具烟碱降解和促植物生长的副炭疽芽孢杆菌G2-13，可以降解烟碱，其烟碱降解能力在40％以上，而且可以促进植物的生长，其IAA产量为44.90±3.36μg/mL。同时，本发明的副炭疽芽孢杆菌G2-13对尖孢镰刀菌、黄瓜霜霉病菌、小麦赤霉病菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌等有拮抗效果。因此，本发明的副炭疽芽孢杆菌G2-13可以作为调节茄科植物生长的生物制剂，无论开发新的生物防治菌剂还是生长调节剂，或是生物有机肥，都具有很好的市场前景。
附图说明
图1为本发明不同培养时段部分菌株的烟碱降解情况图。
图2为本发明的G2-13组和常规施肥组的烤烟幼苗生长情况图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验例1副炭疽芽孢杆菌G2-13的分离与鉴定
1、菌株来源
本实施例样品取于四川省攀枝花市米易县新山乡的常规烤烟品种云烟87。采样时期值为烤烟旺长期，于田间五点取样，通过抖根法获得根际土壤样品，以无菌自封袋包装带回实验室。
2、烟碱降解细菌的分离
于盛装45mL无菌水的三角瓶中加入新鲜土壤5g，28℃摇床振荡1.5h充分混匀，从中吸取1.0mL菌液进行10倍梯度稀释，分别得到10-2、10-3、10-4浓度稀释液。取10-2～10-4稀释菌液各50μL，涂布在LB-烟碱固体选择培养基(组分：酵母浸提物5g/L、胰化蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、烟碱4g/L、琼脂19g/L)中，28℃恒温培养2～3d，挑选单菌落进一步纯化。向LB-烟碱液体培养基(组分：酵母浸提物5g/L、胰化蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、烟碱4g/L)中接种菌株，30℃、140r/min培养3d，测定烟碱降解率，以烟碱降解大于筛选出烟碱降解菌。
烟碱降解率＝(空白对照培养基烟碱含量-接菌培养基烟碱)/空白对照培养基烟碱含量×100％
3、副炭疽芽孢杆菌G2-13的鉴定
用细菌基因组DNA提取试剂盒进行细菌DNA提取，稀释10倍作为PCR反应的模板进行细菌16S rRNA基因扩增，扩增引物为细菌通用引物27F和1492R，然后将扩增产物回收并进行测序，测得的序列为SEQ ID NO.1，16SrRNA基因的NCBI基因登录号为MW405813.1。
基于以上特征，将菌株G2-13鉴定为副炭疽芽孢杆菌(Bacillus paranthracis)。该菌株已于2020年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 20211041。
实验例2烟碱降解细菌的分离及降解能力
测定起始烟碱浓度为4g/L时菌株的烟碱降解能力，以未接菌LB-烟碱液体培养基为空白对照，10000r/min离心5min，上清液用0.05mol/L盐酸溶液稀释到合适的吸光度值范围。在5g/L烟碱工作液(纯烟碱加入0.05mol/L盐酸溶液配置)中加入对应量0.05mol/L盐酸溶液配置一定浓度梯度，纵坐标为259nm处所测吸光度值，横坐标为烟碱浓度，绘制烟碱紫外吸收标准曲线，标准曲线回归方程为Y＝33.686X+0.0043，R2为0.9997。在259nm下测定样品OD值，对应烟碱浓度根据标准曲线记算，烟碱降解率＝(空白对照培养基烟碱含量-接菌培养基烟碱)/空白对照培养基烟碱含量×100％。
利用LB-烟碱固体培养基，从3个样地的云烟87根际土壤样品中分离到346株细菌，所分离的细菌具备一定耐受烟碱能力，但并不意味着能够对烟碱进行降解。测定起始烟碱浓度为4g/L时菌株的烟碱降解能力，在菌株摇瓶培养过程中，记录发酵液不同培养时间(18h、36h、54h、72h)烟碱浓度，烟碱降解率为起始浓度与摇瓶培养72h浓度之差。
经统计共58株菌株可降解烟碱，占所分离菌株总数的16.76％，其中G2-9、YBG6、YBG10、G2-13、G2-3、HT2-8等13株菌株在40％以上，HT14降解率最高，达62.41％，如图1所示，展示了部分菌株的烟碱降解情况，可见在18～36h时段烟碱降解速率明显快于其它时段，54～72h时段菌株降解速率则明显降低。不同样地分离得到的烟碱降解细菌数量存在差异，分离自泸州古蔺县菌株最多，为23株；分离自攀枝花盐边县菌株为19株；分离自凉山州会东县数量最少，为16株。
实验例3产吲哚乙酸(IAA)测定
将上述分离得到58株菌株接种到金氏培养基中培养到对数期，在37℃下140r/min振荡培养3天，取50μL于洗净的白瓷板中，加50μL Salkowski显色剂，37℃下避光30min，如果出现粉红色，表明产生IAA，以没有接菌的金氏培养基为对照。
将金氏培养基中培养的菌株，8000r/min离心5min，取上清液5mL加入5mLSalkowski显色剂，37℃下避光30min后，530nm下测定吸光度值。以空白培养基作对照，并以IAA的标准样品对应的光密度做标准曲线，计算IAA的产量(mg/L)，不同菌株的IAA产生量见表1。
表1烤烟根际土壤细菌产IAA能力
Figure BDA0003354989160000051
Figure BDA0003354989160000061
结果显示，58株菌株中有28株(48.28％)能产IAA，其中10株IAA分泌量在20μg/mL以上，HT14分泌量最高，为53.67μg/mL。
实验例4无机磷降解能力
利用溶磷圈法定性测定菌株的溶磷能力，将菌株接种于无机磷固体培养基，28℃恒温培养箱避光培养3～4d，以透明圈直径(D)菌落生长直径(d)比值衡量溶磷效果，重复3次。
表2烤烟根际土壤细菌无机磷降解能力
Figure BDA0003354989160000062
Figure BDA0003354989160000071
由表2可知，58株菌株中有16株(27.59％)具溶磷能力，菌株G2-3、YBT1及YBG10溶磷能力较强(D/d≥2.50)，其中YBG10溶磷能力最强，D/d值为3.26。
实验例5纤维素降解能力
将菌株接入LB液体培养基中，在30℃、140r/min培养2d，在刚果红培养基上接种菌液，3次重复，28℃避光培养4～5d，若菌落周边出现淡黄色透明带则表明菌株分泌的纤维素酶将纤维素水解，用淡黄色透明圈直径与菌落生长直径大小评价纤维素溶解能力。
表3烤烟根际土壤细菌纤维素降解能力
Figure BDA0003354989160000081
由表3可知，具纤维素降解能力菌株有22株(37.93％)，7株菌株纤维素降解能力突出(D/d≥2.50)，菌株HT2-8与HT13的D/d值分别为4.22和4.78。
实验例6铁载体分泌能力
将菌株接入LB液体培养基中，在30℃、140r/min培养2d，利用CAS平板检测菌株产铁载体能力，于平板中央接种5μL菌液，3次重复，28℃培养3～4d。分泌铁载体细菌菌落周围出现明显橙黄色透明晕圈，记算D/d值(D为橙黄色透明晕圈直径，d为菌落直径)。
表4烤烟根际土壤细菌产铁载体能力
Figure BDA0003354989160000091
Figure BDA0003354989160000101
由表4可知，13株(22.41％)菌株具分泌铁载体能力，其中，菌株G2-3、HT2-8、HT14、YBG10与YBT6的D/d值均在2.0以上。
实验例7抗菌活性测定
采用平板对峙法测定了分离菌株对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、大肠杆菌(Escherichia coli)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)这5种病原指示菌的拮抗效果。测定抑菌圈直径(HD)与菌落直径(CD)，通过计算HD/CD的比值来筛选出有抑菌效果的菌株，具体如表5。
表5烤烟根际土壤细菌抑菌能力
Figure BDA0003354989160000102
Figure BDA0003354989160000111
注：指示菌株1、2、3、4、5分别代表大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。表中+++：HD/CD值介于3-4；++：HD/CD值介于2-3；+：HD/CD值介于1–2；-：HD/CD值小于1。
由表5可知，对大肠杆菌有拮抗效果的菌株有14株，对金黄色葡萄球菌有拮抗作用的菌株有8株，对黄瓜霜霉菌有抑制效果的菌株有19株，对小麦赤霉病菌有抑制效果的菌株有9株，对尖孢镰刀菌有抑制效果的菌株有13株。7株菌株对3种及以上病原菌有拮抗作用，其中HT2-8对所有指示病原菌均存在拮抗作用。
实验例8PGPR性能的盆栽验证
通过综合促生抗病测定指标筛选出目标功能菌，具体如下：
设置G2-13组以及对照组。挑选包衣完整的烤烟种子用于漂浮育苗，每穴2～3粒种子，置于恒温恒湿室内获得烟苗，选择长势一致烟苗移栽于塑料盆钵。
向G2-13组盆栽中接种G2-13菌株，于烟苗茎基部加入对应发酵菌液50mL，而对照组加入LB液体培养基50mL。每个处理3次重复，每盆1株。移栽后5d再次加入等量菌液及LB液体培养基。
移栽后30d收获整株植株，测定株高、叶绿素含量、根体积等指标，见下表6，烤烟幼苗生长情况见图2。
表6菌株G2-13对烤烟幼苗生长的影响
Figure BDA0003354989160000121
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
综合促生与抗病测定指标，将性能突出的G2-13菌株用于烤烟幼苗主要生理指标测定。如表4所示，G2-13处理烤烟株高较对照组分别提高33.1％和21.1％；G2-13处理可显著提高地上部鲜重，较对照组分别增加53.3％；在叶绿素含量方面，G2-13处理提升效果明显，较对照组增加8.28％；就根鲜重和根体积而言，两组无显著差异。总体上看，接种G2-13菌株的烟苗在株高、地上部鲜重及叶绿素含量三个指标上，较对照组有显著提高。
本发明分离得到烤烟根际土壤细菌，并获得了菌株G2-13，G2-13菌株具有较强促生特性，对多数指示病原菌都存在抑制能力，而且G2-13菌株具备明显的烟碱降解能力和纤维素酶活，在降解烟秆、减轻烟碱污染等方面也表现潜在应用价值。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种兼具烟碱降解和促植物生长的副炭疽芽孢杆菌G2-13及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1416
<212> DNA
<213> Bacillus paranthracis
<400> 1
cagtcgagcg aatggattaa gagcttgctc ttatgaagtt agcggcggac gggtgagtaa 60
cacgtgggta acctgcccat aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120
taacattttg aaccgcatgg ttcgaaattg aaaggcggct tcggctgtca cttatggatg 180
gacccgcgtc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc 240
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag aacaagtgct agttgaataa 420
gctggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggtggt 540
ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg aaactgggag 600
acttgagtgc agaagaggaa agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatat 660
ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactttc tggtctgtaa ctgacactga ggcgcgaaag 720
cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780
gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg aagttaacgc attaagcact ccgcctgggg 840
agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac 960
cctagagata gggcttctcc ttcgggagca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080
catcattaag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140
gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac 1200
aaagagctgc aagaccgcga ggtggagcta atctcataaa accgttctca gttcggattg 1260
taggctgcaa ctcgcctaca tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380
ccgaagtcgg tggggtaacc tttttggagc cagccg 1416

Claims (7)

1.一种兼具烟碱降解和促植物生长的副炭疽芽孢杆菌G2-13，其特征在于，该菌株已于2021年08月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211041，拉丁文名称为Bacillus paranthracis。
2.如权利要求1所述的副炭疽芽孢杆菌G2-13在植物病害生物防治中的应用，其特征在于，所述植物病害为尖孢镰刀菌、黄瓜霜霉病菌、小麦赤霉病菌及大肠杆菌中任意一种或两种以上引起的植物病害。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物选自茄科作物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述茄科作物选自烟草。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述副炭疽芽孢杆菌G2-13作为制备防治植物病害的药物，所述药物的剂型包括：可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂和微乳剂中任意一种。
6.如权利要求1所述的副炭疽芽孢杆菌G2-13在植物生长调节中的应用，其特征在于，所述植物生长调节为促进烟草生长。
7.如权利要求1所述的副炭疽芽孢杆菌G2-13在烟碱降解、纤维素降解方面的应用。
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