CN113913305B - 一株高产酸性木聚糖酶的突变菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株高产酸性木聚糖酶的黑曲霉突变菌株及其工业发酵技术。所述菌株具体为黑曲霉(Aspergillus niger)AU10‑13，保藏编号CGMCC NO.23219。该菌株发酵产木聚糖酶酶活达到45000‑48000U/mL，生产的木聚糖酶最适pH3.0，且在pH 2.0～5.0条件下具有70％以上的酶活力，即在酸性范围内具有很好的pH稳定性；最适温度40℃，在20℃仍具有80％以上的酶活力，即在低温下具有较高的酶活性。可见黑曲霉(Aspergillus niger)AU10‑13生产的木聚糖酶在低温、酸性环境下均具有较好的活性，且耐热性好，具有广阔的应用发展前景。

Description

一株高产酸性木聚糖酶的突变菌株及其应用
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株高产酸性木聚糖酶的黑曲霉突变菌株及其工业发酵技术。
背景技术：
木聚糖酶，广义的含义是指可以降解半纤维素的各种酶的总称，其包含各种内切酶、外切酶、木糖苷酶、阿拉伯糖酶、α-葡萄糖苷酶等一系列酶。狭义的木聚糖酶是指内切-β-1,4-木聚糖酶，其主要作用于木聚糖及长链木聚糖，从木聚糖主链切断木糖苷键，如本发明所述黑曲霉所产木聚糖酶。
针对不同用途所需，各科研工作者研究出了不同温度、不同酸碱度下，不同酶活力的木聚糖酶。如具有良好的抵抗蛋白酶的能力，适用于中高温环境的酸性木聚糖酶；可提高面包膨胀率、改善面包口感及色泽的低温木聚糖酶；可有效降低动物胃部食糜黏度、提高消化率和营养吸收率，进而提高动物饲料利用率的低温酸性木聚糖酶等。
木聚糖是半纤维素的主要成分，是重要的可再生资源，可以说是最具有代表性的半纤维素。而在木聚糖的降解过程中，木聚糖酶则是最为关键的酶。目前，主要通过重组大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、霉菌等，来获得相对应的木聚糖酶。
几十年来，我国科研工作者为提高木聚糖酶的发酵水平已进行了不懈地努力，如中国专利公布了一种瓶霉属的木聚糖酶，其具有良好的蛋白酶抗性，能够有效的降解小麦阿拉伯木聚糖，且其易于工业化发酵生产；另一专利公开了一种将水不溶性阿拉伯木聚糖降解为水溶性的阿拉伯木聚糖，从而改善了面团中面筋网络的弹性，增强了面团的乳化凝胶作用，使面团内部的气孔更加均匀细密，增大了面包体积；还公布了一种中温酸性木聚糖酶，其在酸性环境下具有较高的酶活性，pH稳定性好，具有良好的耐高温特性，可使其在需求高温环境的工业生产上得到应用。
尽管这些研究已经达到了一定水平，但是利用诱变、DNA重组技术或其他方法获得优良菌株，并进一步优化酸性木聚糖酶的发酵工艺条件，目前仍然是提高酸性木聚糖酶行业产能的重要手段。
发明内容：
为了提高动物饲料原料的利用率，扩大木聚糖酶在饲料行业中的应用范围，本发明旨在通过复合诱变筛选技术，提供一株能够生产高酶活力且能在低温酸性环境发挥酶解作用的木聚糖酶的菌株，以满足饲料行业的切实生产需求。这对酶制剂生产企业来说，具有极大的开发潜力和广阔的市场发展前景。
本发明提供的技术方案之一，是一种高产酸性木聚糖酶的黑曲霉，具体为黑曲霉(Aspergillus niger)AU10-13，菌株AU10-13经黑曲霉菌株GS-1通过ARTP-UV复合诱变筛选获得，目前已于2021年8月25日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC NO.23219。
本发明还提供黑曲霉(Aspergillus niger)AU10-13在生产木聚糖酶中的应用，特别是发酵法生产木聚糖酶中的应用，具体如下：
(1)种子液制备：将AU10-13斜面菌于300mLYPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)培养基中培养，培养条件：温度30℃，转速200rpm，培养24h；
(2)种子罐培养：在无菌条件下，按照2.5％的接种量，将种液接种于种子罐中，进行扩大培养，培养条件为：温度30℃，搅拌速度200rpm，通风量1vvm，罐压0.06-0.09MPa，培养15h；
(3)发酵罐培养：在无菌条件下，按照2％-3％的接种量，将种子液接种于发酵罐中，进行发酵罐培养，培养条件为：温度30-32℃，搅拌速度200-220rpm，通风量1vvm，罐压0.06-0.09MPa，pH 4.5-5.0，发酵至40h-45h开始补料，发酵至60h-65h后控制溶氧20％-30％，发酵至95h-100h，菌体自溶严重，酶活力无明显提高时放罐；
(4)补料培养：发酵至40h-45h，当pH升至5.5时开始补料，将pH控制在4.5-5.0；
(5)上述培养过程所采用的培养基如下：
YPD培养基质量体积百分比组成如下：酵母提取物1.0％，蛋白胨2.0％，葡萄糖2.0％，其余为水，pH4.5-5.0；
种子罐培养基质量体积百分比组成如下：酵母粉1.0％，蛋白胨2.0％，葡萄糖2.0％，其余为水，pH4.5-5.0；
发酵罐培养基质量体积百分比组成如下：麸皮2％-3％，蛋白胨2％-3％，酵母提取物1％-1.5％，磷酸二氢钾0.3％-0.5％，硫酸镁0.03％，其余为水，pH4.5-5.0；
补料培养基质量体积百分比组成如下：葡萄糖5％，蛋白胨2％-3％，酵母提取物1％-1.5％，磷酸二氢钾0.3％-0.5％，硫酸镁0.03％，其余为水，pH 4.5-5.0。
经过95h-100h的发酵培养，发酵液中的木聚糖酶酶活力可达到45000-48000U/mL。
由上述方法制备的木聚糖酶，酶学性质如下：
(1)最适反应温度为40℃；
(2)最适反应pH为3.0；
(3)80℃条件下保温2h后，相对酶活力为95％左右，当温度升至85℃时，相对酶活力仍在85％以上；
(4)在pH 3.0条件下保存2h，酶活力基本没有变化，在pH 2.0条件下保存2h，相对酶活力仍能保持在85％左右。
有益效果：
1、本发明通过对原始菌株进行ARTP-UV复合诱变，最终获得了遗传性质稳定、发酵水平较高的突变菌株。
2、本发明通过对发酵工艺条件进行优化，提供了一种高产饲用木聚糖酶的液体发酵方法。利用改良后方法所生产的木聚糖酶，发酵活力更高、发酵周期更短、制造成本更低，极大地提高了原料的利用率，提高了企业的生产效益。
3、由本发明提供的黑曲霉(Aspergillus niger)AU10-13生产的木聚糖酶酶活力高，在低温、酸性环境下酶活稳定，并且耐热性好，能较好的发挥酶解作用。
附图说明：
图1木聚糖酶最适反应温度曲线；
图2木聚糖酶耐热性试验曲线；
图3木聚糖酶最适反应pH曲线；
图4木聚糖酶耐酸碱性试验曲线。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案对本发明作进一步地解释说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1菌株的诱变选育
黑曲霉菌株GS-1-10是一株经ARTP诱变得到的高产酸性木聚糖酶菌株，其发酵酶活水平较原始菌株GS-1提高了10.8％，为获得产酶能力更强、遗传性更稳定的高产菌株，以其作为出发菌株进行诱变。
1、ARTP诱变
(1)取两株出发菌株GS-1的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的三角瓶中振荡，使菌体分散，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为107-108个/mL，以此作为诱变出发菌悬液。
(2)开启常温常压等离子系统，以酒精棉擦拭操作室内外，并开启紫外灯灭菌30min。灭菌结束，取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上。开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变。诱变时间分别设定为30s、60s、90s、120s、150s。
(3)每次诱变结束后均将载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1min。稀释涂布后置于30℃培养箱中培养5天，培养结束对生长出的单菌落进行观察计数。
(4)菌株初筛：从各处理组中分别挑取20个单菌落进行斜面传代以及后续的摇瓶培养。
(5)菌株复筛：从初筛结果中选出酶活提高明显的突变株，经反复多次复筛后，筛选出酶活提高明显且遗传性状稳定的典型诱变菌株，逐一进行摇瓶发酵考察，最终筛选出遗传性状稳定且酶活提高比例最大的菌株GS-1-10作为再次诱变的出发菌株。
2、UV诱变：
(1)用无菌生理盐水从培养5天的斜面培养基(菌株GS-1-10)上洗脱菌体，在有玻璃珠的三角瓶中振荡，使菌体分散，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为107-108个/mL，以此作为诱变出发菌悬液。
(2)吸取3mL菌悬液置于培养皿中，将培养皿垂直置于紫外灯下30cm处，在磁力搅拌下照射0～5min。稀释涂布后置于30℃培养箱中培养5天，培养结束对生长出的单菌落进行观察计数。选取致死率80％左右为最佳诱变剂量。
(3)菌株初筛：从各处理组中分别挑取20个单菌落进行斜面传代以及后续的摇瓶培养。
(4)菌株复筛：从初筛结果中选出酶活提高明显的突变株，经反复多次复筛后，筛选出酶活提高明显且遗传性状稳定的典型诱变菌株，逐一进行摇瓶发酵考察，最终筛选出遗传性状稳定且酶活提高比例最大的菌株AU10-13。
3、木聚糖酶高产菌株AU10-13的遗传稳定性实验
将木聚糖酶原始菌株GS-1及高产诱变菌株AU10-13于筛选分离平板上划线分离培养，挑取生长情况较好的单菌落于斜面培养基，并于30℃培养5d，然后分别经种瓶增殖培养，摇瓶发酵培养，培养结束测定木聚糖酶酶活力。将该菌株连续传代培养，传代10次的摇瓶结果如表1所示：
表1.菌株AU10-13遗传稳定性检测结果
将该突变菌株连续传代培养10代，实验结果由表1可以看出，该突变菌株的遗传稳定性良好。
实施例2木聚糖酶酶活力测定方法
1、酶活力的定义：
一定条件下(如未特别说明，所述条件为：37℃、pH为5.5)，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
2、标准曲线的绘制：
称取三水乙酸钠23.14g，加入冰乙酸1.70mL，再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH，用0.1mol/L乙酸溶液或0.1mol/L乙酸钠溶液调节至pH 5.5，备用。
称取无水木糖1.0000g，加上述乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解，定容至100mL。
吸取乙酸-乙酸钠缓冲液4.0mL，加入DNS试剂5mL，沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，制成标准空白样。
分别吸取木糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL，分别用上述乙酸-乙酸钠缓冲溶液定容至100mL，制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL、0.60mg/mL和0.70mg/mL的木糖标准溶液。
分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各2.00mL，分别加入到刻度试管中，再分别加入2.00mL乙酸-乙酸钠缓冲液和5.0mL DNS试剂。电磁震荡3s～5s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25mL。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度A值。
以木糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴，绘制标准曲线。每次新制成的DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
3、酶活力测定方法：
吸取10.0mL木聚糖溶液，于37℃平衡20min。
吸取10.0mL经过适当稀释的酶液，于37℃平衡10min。
吸取2.00mL经过适当稀释的酶液，加入到刻度试管中，再加入5mL DNS试剂，电磁振荡3s～5s。然后加入2.0mL木聚糖溶液，37糖保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁震荡3s～5s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AB。
吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡)，加入到刻度试管中，再加入2.0mL木聚糖溶液(已经过37℃平衡)，电磁振荡3s～5s，37℃精确保温30min。加入5mL DNS试剂，电磁震荡3s～5s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁震荡3s～5s，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度AE。
4、木聚糖酶酶活力计算公式：
式中：
X------稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/mL；
AE------酶反应液的吸光度；
AB------酶空白样的吸光度；
K-------标准曲线的斜率；
Co------标准曲线的截距；
M-------木糖的摩尔质量，M(C5H10O5)＝150.2g/mol；
t-------酶反应时间，min；
n------试样的稀释倍数；
1000----转化因子，1mmol＝1000μmol。
实施例3菌株AU10-13液体发酵生产木聚糖酶
1、种子液制备：
将AU10-13斜面菌于300mLYPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)培养基中培养。培养条件：温度30℃，转速200rpm，培养24h，培养结束后将种液收集到2L无菌接种瓶中，得到发酵用的种子液；
2、种子罐培养：
在无菌条件下，按照2.5％的接种量，将种子液接种于种子罐中，进行扩大培养。培养条件：温度30℃，搅拌速度200rpm，通风量1vvm，罐压0.06-0.09MPa，培养15h。
3、发酵罐培养：
在无菌条件下，按照3％的接种量，将种子液接种于发酵罐中，进行发酵罐培养。培养条件为：温度30℃，搅拌速度220rpm，通风量1vvm，罐压0.06-0.09MPa，pH 4.5-5.0，发酵至40h左右开始补料，发酵至60h后控制溶氧20％-30％，发酵至96h左右，菌体自溶严重，酶活力无明显提高时放罐。
4、补料培养：
发酵至40h左右，当pH升至5.5时开始补料，将pH控制在4.5-5.0。
5、使用的培养基：
(1)YPD培养基质量体积百分比组成如下：酵母提取物1.0％，蛋白胨2.0％，葡萄糖2.0％，其余为水，pH4.5-5.0。
(2)种子罐培养基质量体积百分比组成如下：酵母粉1.0％，蛋白胨2.0％，葡萄糖2.0％，其余为水，pH4.5-5.0。
(3)发酵培养基质量体积百分比组成如下：麸皮2％，蛋白胨2％，酵母提取物1％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.03％，其余为水，pH4.5-5.0。
(4)补料培养基质量体积百分比组成如下：葡萄糖5％，蛋白胨2％，酵母提取物1％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.03％，其余为水，pH4.5-5.0。
6、木聚糖酶的提取：
(1)絮凝：按发酵液体积加入2.3％磷酸氢二钠、1.1％无水氯化钙及150PPM聚丙烯酰胺进行絮凝。
(2)压滤：按发酵液体积加入3.2％珍珠岩助滤剂，进行压滤，压力控制0.53-0.75MPa。
(3)澄清：据压滤液体积加入5.9％硅藻土，经板框精滤机精滤，得到澄清压滤液。
(4)超滤：用10000分子量超滤膜对澄清压滤液进行超滤浓缩。
(5)添加稳定剂：按超滤浓缩液体积加入1.6％海藻糖与1.2％甘油作为酶稳定保护剂。
应用上述黑曲霉诱变菌株AU10-13及培养基进行发酵，其发酵酶活力如表2所示。
表2. 6L小罐发酵实验结果
由表2可以看出，在6L罐发酵实验中，该菌株产木聚糖酶能力较稳定，发酵液酶活力均达到45000U/mL以上，表明突变菌株AU10-13遗传稳定性良好，可以适用于工业化大生产中。
实施例4最适反应温度
取实施例3发酵液经提取制备的木聚糖酶成品，以正常条件pH5.5，分别在20、25、30、35、40、45、50℃条件下测定木聚糖酶活力，以40℃时的酶活力为100％，分别计算相对酶活。结果如图1所示，该酶最适反应温度为40℃，在20℃时酶活力仍保持在80％以上。由此可见，由该菌株所产木聚糖酶在较低温度时仍具有较强的活性。
实施例5耐热性试验
取实施例3发酵液经提取制备的木聚糖酶成品，将酶液分别置60、65、70、75、80、85、90℃条件下保温处理120min，以未经处理的原始酶活力为100％计算相对酶活，实验结果如图2所示。由图2可见，80℃条件下保温120min后，相对酶活为95％左右，当温度升至85℃时，相对酶活仍在85％以上。结果表明，由该菌株所产木聚糖酶具有较强的耐热性能。
实施例6最适反应pH
取实施例3发酵液经提取制备的木聚糖酶成品，在温度为40℃条件下，分别测定其在pH值为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0条件下的木聚糖酶酶活力，以pH3.0时的酶活力为100％分别计算相对酶活力，测定结果如图3所示。由图3可知，木聚糖酶的最适反应pH为3.0。
实施例7耐酸碱性试验
取实施例3发酵液经提取制备的木聚糖酶成品，分别用0.1M的NaOH或0.1M的HCl将其酶液的pH调整为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，分别置于室温条件下静置120min后测定酶活力，并以未用酸或碱处理之前的酶活为100％计算相对酶活力，测定结果如图4所示。由图可见，在pH3.0条件下酶活基本没有变化，在pH2.0条件下，相对酶活仍保持在85％左右。结果表明，由该菌株所产木聚糖酶耐受酸性能较强。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (4)

1.一株产酸性木聚糖酶的黑曲霉菌株，其特征在于，所述菌株具体为黑曲霉(Aspergillus niger)AU10-13，保藏编号CGMCC NO.23219。
2.权利要求1所述黑曲霉(Aspergillus niger)AU10-13在生产酸性木聚糖酶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵生产酸性木聚糖酶的方法如下：
按照2％-3％的接种量，将种子液接种于发酵培养基中，进行发酵罐培养，培养条件为：温度30-32℃，搅拌速度200-220rpm，通风量1vvm，罐压0.06-0.09MPa，pH 4.5-5.0，发酵至40h-45h，pH升至5.5时开始补料，将pH控制在4.5-5.0，60h-65h后控制溶氧20％-30％，发酵至95-100h，菌体自溶严重，酶活力无明显提高时放罐。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养基质量体积百分比组成如下：麸皮2％-3％，蛋白胨2％-3％，酵母提取物1％-1.5％，磷酸二氢钾0.3％-0.5％，硫酸镁0.03％，其余为水，pH4.5-5.0；
补料培养基质量体积百分比组成如下：葡萄糖5％，蛋白胨2％-3％，酵母提取物1％-1.5％，磷酸二氢钾0.3％-0.5％，硫酸镁0.03％，其余为水，pH4.5-5.0。
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