CN101285044A - 一种饲用木聚糖酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种饲用木聚糖酶及其制备方法，属于微生物发酵产品技术领域。本发明经诱变、筛选获得了高产木聚糖酶的黑曲霉新菌株(Aspergillus niger)XY－1，CGMCC No.2139；并采用Plackett－Burman实验设计法，从20种营养物中筛选出对黑曲霉菌株XY－1固态发酵生产木聚糖酶最具诱导作用的因子，组建成由麸皮、尿素、碳酸钠和硫酸镁按重量份92～97∶2～6∶0.3～0.9∶0.3～1比例配制成的高效发酵培养基与其配套工艺，接菌种后仅需发酵2d时间木聚糖酶活力就达到10000～13000IU/g干曲，降低了饲用木聚糖酶的生产成本，提高了生产效率；本发明可在木聚糖酶生产企业中推广应用。

Description

一种饲用木聚糖酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵产品技术领域，尤其涉及一种由黑曲霉(Aspergillusniger)新菌株生产的饲用木聚糖酶及其制备方法。

背景技术

小麦、黑麦、稻谷、麸皮等饲料中含有较多的木聚糖，这些木聚糖能结合大量的水，导致采食动物的消化道中食糜体积增大、黏度增加，阻碍对营养物质尤其是脂肪和蛋白质的消化吸收，最终导致营养物质的消化吸收率下降。此外，食糜在小肠中的滞留会引起微生物的异常繁殖，使动物生长受阻，表观代谢能(AME)受到抑制。饲料中添加木聚糖酶后，可显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，从而消除或降低消化道中的食糜黏度，提高动物内源性消化酶的活性，促进对营养物质的消化吸收。此外，木聚糖的酶解产物低聚木糖还具有调节动物肠道微生态环境、降低动物结肠炎的发生率和减少抗生素等兽药用量的功效，促进动物生产性能的进一步提高。因此，木聚糖酶的发酵生产已成为饲料行业的研究热点之一。

目前饲料用的酶制剂大多采用固态发酵生产技术，这是因为固态发酵具有发酵原料价廉易得、所需设备简单、生产能耗低等优点，而且发酵产物无需提取等处理就可直接作为饲料添加剂使用。但木聚糖酶的发酵生产能力在不同菌株间有很大的差异。以固态发酵生产木聚糖酶活力做比较，在国外文献报道中，Haltrich等(1996)报道的Schizophyllum commune利用未漂白的纸浆作为发酵基质，在30℃发酵16d最高酶活力为22700IU/g；Kalogeris等人(1998)报道的Thermoascus aurantiacus IMI 216529利用稻草作为发酵基质，在50℃发酵5d最高产酶活力为6193IU/g；Sonia等人(2005)报道的Thermomyces lanuginosus(D2W3)利用高粱秆作为发酵基质，在50℃发酵6d最高产酶活力为48000IU/g；Yang等人(2006)报道的Paecilomyces themophila J18利用稻草作为发酵基质，在50℃发酵8d最高产酶活力为18580IU/g。国内关于木聚糖酶的生产中以Aspergillus niger居多，高洁等人(2006)报道的Aspergillus niger ASP-12在以麸皮为主要原料的基质上，28℃～32℃发酵32h后，酶活力达到2000IU/g；曾莹等人(2007)利用诱变获得的Aspergillus niger 5Hu-4在以啤酒糟为主要原料的基质上，30℃培养3d，酶活力达6926IU/g；吴小刚等人(2007)利用诱变获得的Aspergillus niger在以啤酒糟作为发酵基质的基础上，经30℃发酵60～65h后，酶活力达6044.8IU/g；邬敏辰等人(2007)报道了Aspergillus usamii利用麸皮、豆饼粉等农作物废弃物为发酵基质，在28℃～32℃发酵64～72h后，木聚糖酶活力达到7783～9616IU/g，为目前国内报道的最高水平。

综上所述，虽然利用不同菌株进行固态发酵生产木聚糖酶得到了广泛的研究，但存在的问题是，或者发酵最终产物木聚糖酶活力较高但发酵时间很长，或者发酵时间虽然缩短但最终发酵产物木聚糖酶活力较低，这些问题都阻碍了木聚糖酶在饲料工业中的生产与在养殖业中的规模使用。

发明内容

本发明目的是，针对上述现有技术中所存在的，或发酵最终产物木聚糖酶活力较高但发酵时间很长，或发酵时间虽缩短但最终发酵产物木聚糖酶活力较低的问题，提供一种所用原料丰富、价格低廉、发酵时间短而所产木聚糖酶活力高的制备方法。

一种高产木聚糖酶的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)XY-1的诱变、选育及其特性：

(1)出发菌株XY的选育：

发明人从实验室保藏的曲霉菌种中，在选择性培养基上经初筛、复筛，获得一株产木聚糖酶活性最高的菌株XY，并以该菌株作为进一步诱变选育的出发菌株；

(2)诱变菌株XY-1的选育：

将在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面上生长成熟的出发菌株XY的新鲜孢子，用无菌水洗下，制成孢子悬浮液(孢子浓度在1×10⁷～10⁸个/ml)；分别取2ml孢子悬浮液于试管内，置钴源室按0(对照)、5万、7万、10万和15万R(伦琴)的处理剂量，经Co⁶⁰辐照处理后，吸取各处理的悬浮液，梯度稀释，涂布于初筛培养基上，每个稀释度3个平板，28-30℃下培养48-72h后，挑取HC值高的菌种进行固体发酵的初筛、复筛及菌株间的多重比较，最终获得一株产木聚糖酶活力高的菌株XY-1；

(1)、(2)中所用的筛选方法具体如下：

初筛：利用透明圈法，将待筛选菌株点植于初筛培养基上，置28℃下培养48h，分别测定菌落直径和透明圈直径，计算HC值(透明圈直径/菌落直径)，以HC值高的菌种作为初筛入选菌种；

复筛：将初筛入选菌种制成孢子悬浮液(孢子浓度在1×10⁷～10⁸个/ml)，吸取2ml接入发酵基础培养基，28℃培养48h，培养结束后于40℃烘干，检测木聚糖酶活性，以活力最高的菌株进行下一步研究。

初筛培养基：NaNO₃ 0.2％、KH₂PO₄ 0.1％、KCl 0.05％、MgSO₄ 0.05％、CMC-Na 1％、琼脂2％；

发酵基础培养基：麸皮9g；米糠1g；水10mL；pH自然。

(3)黑曲霉(Aspergillus niger)XY-1的生物学特性：

所得木聚糖酶高产菌株XY-1经中国科学院微生物研究所鉴定为一株黑曲霉菌种Aspergillus niger。

①形态学特征：所得酶菌种的孢子为褐黑色，分生孢子头球形至辐射形，直径150-450μm；分生孢子梗生于基质，孢梗茎1000-3000×12-20μm，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形，直径40-70μm，全部表面可育；产孢结构双层，梗基10-20×4.5-7.0μm，瓶梗6-10×2.5-3.5μm；分生孢子球形或近球形，直径3-4.5(-5)μm，褐色，壁粗糙；

②培养学特性：菌落在查氏琼脂培养基上生长迅速，25℃7天直径40-50mm，质地丝绒状或稍带絮状，分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液，菌落反面略带黄色。

黑曲霉菌株(Aspergillus niger)XY-1，于2007年8月23日保藏于北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2139。

本发明目的通过以下技术方案得以实现。

一种饲用木聚糖酶，该饲用木聚糖酶可用黑曲霉菌株XY-1为生产菌种，接种于由麸皮、尿素、碳酸钠和硫酸镁按重量份92～97∶2～6∶0.3～0.9∶0.3～1比例配制成的固体培养基中，经发酵、培养后获得。

一种饲用木聚糖酶的制备方法，该方法按以下步骤进行：

(1)黑曲霉菌株XY-1各级培养基的配制：包括，

①斜面种子培养基：去皮马铃薯200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，自然pH，经0.1Mpa灭菌20min；

②固体种子培养基：300ml三角瓶中装入由麸皮、豆粕和硫酸铵按重量份80∶19∶1比例配制而成的培养基10g，按与固形物重量1∶1比例加入自来水，搅拌均匀，经0.1Mpa灭菌30min；

③固体生产培养基：先将麸皮、尿素、碳酸钠和硫酸镁按重量份92～97∶2～6∶0.3～0.9∶0.3～1比例配制成固体培养基；再将该固体培养基与水按重量1∶1～1.3的比例加水并搅拌均匀，装入布袋中，经0.1Mpa灭菌30min，冷却后均匀置于曲盘中，发酵物料厚度为2～3cm；

(2)斜面种子制备：将黑曲霉菌株XY-1划线接种在步骤(1)①斜面种子培养基上，于28℃下恒温培养5d，放置4℃冰箱保存，备用；

(3)固体种子制备：将步骤(2)斜面种子用无菌蒸馏水制备成浓度为1×10⁷～10⁸个/ml的孢子悬浮液后，吸取2ml接入步骤(1)②固体种子培养基，于28℃下恒温培养3d；将培养后固体种子培养基与水按重量1∶100比例，注入无菌蒸馏水充分搅拌，用双层纱布在无菌条件下过滤，得到浓度为1×10⁷～10⁸个/ml固体种子孢子悬浮液，待用；

(4)发酵生产：将步骤(3)固体种子孢子悬浮液按生产培养基固形物重量15％～30％接入步骤(1)③固体生产培养基中，充分搅拌混匀，于28℃曲房中培养2d；

(5)酶曲的后处理与检测：发酵结束后，置40℃鼓风条件下烘干10h、粉碎、过80目筛，得酶干曲；将经木聚糖酶活力检测达到10000～13000IU/g的干曲包装、封口即成产品。

本发明的有益效果是：

(1)采用诱变、自选的黑曲霉菌株XY-1作为生产菌种，既保证了本发明发酵最终产物木聚糖酶具极高的活性，又保证了酶产品作为饲料添加剂使用的安全性(见实施例5)。

(2)采用Plackett-Burman实验设计法，从20种营养物中筛选出对黑曲霉菌株XY-1固态发酵生产木聚糖酶最具诱导作用的因子，组建成由麸皮、尿素、碳酸钠和硫酸镁按重量份92～97∶2～6∶0.3～0.9∶0.3～1比例配制成的高效发酵培养基(见实施例1)；采用麸皮这种原料丰富、价格低廉的农副产品作为发酵基质，且整个生产过程没有价格昂贵的试剂加入，使整个生产过程成本较低。

(3)高效的黑曲霉菌株XY-1与优化的固体发酵培养基相结合，并辅以合理的制备工艺，表现发酵效价高，发酵时间短，木聚糖酶活力高，仅需2d发酵时间发酵最终产物木聚糖酶活力就达到10000～13000IU/g干曲，降低了饲用木聚糖酶的生产成本，提高了生产效率。

具体实施方式

通过以下具体实施例，对本发明作进一步的具体说明，但本发明内容并不受这些内容所限止。

对所述材料的说明：

尿素：宁波市化学试剂有限公司，工业级。

碳酸钠：浙江省兰溪市化工试剂厂，工业级。

硫酸镁：浙江省衢州巨化试剂有限公司，工业级。

实施例1：(黑曲霉菌株XY-1固态发酵培养基的优化筛选)

(1)对木聚糖酶生产最具诱导作用的因子筛选：

发明人根据文献报道，选取可能影响黑曲霉菌株A.niger XY-1生产木聚糖酶酶活与产量的20个因素，按Plackett-Burman设计进行实验，通过分析获得各因素的主效应；发酵培养基为麸皮中添加需要考察的各因素。

由表1各因素的影响效果可知，在考查的浓度范围内(0-0.05g/10g干基质)，硝酸钠、酵母粉、尿素、碳酸钠、硫酸镁、氯化钙、蛋白胨、木糖、硫酸铵、蔗糖和棉子糖11个因素的可信度大于90％，对A.niger XY-1木聚糖酶生产影响显著。而在这11种产酶重要影响因素中，只有硝酸钠、酵母粉、尿素、碳酸钠、硫酸镁、蛋白胨和硫酸铵7种因素是最具产酶诱导作用的因子，5种以氮源形式加入的因子按照影响的重要性排列依次是硝酸钠＞酵母粉＞尿素＞蛋白胨＞硫酸铵，而且硝酸钠、酵母粉和尿素三种氮源正效应远大于蛋白胨和硫酸铵。

表1  P-B试验设计的因素及影响效果

(2)最优氮源的选择

为筛选合适的氮源，分别对硝酸钠、酵母粉和尿素这三种氮源进行初步的最适浓度探讨。发酵培养基为麸皮中加入不同浓度的各种氮源。结果，当硝酸钠浓度为40g/l、酵母粉浓度为300g/l和尿素浓度为30g/l时，木聚糖酶酶活分别最高可达到7.16×10⁵IU/g、7.07×10⁵IU/g和7.15×10⁵IU/g。从生产成本来讲，选取尿素作为生产用氮源是最经济的。

(3)培养基中各重要因子的浓度确定

经过步骤(1)对木聚糖酶生产最具诱导作用的因子筛选和步骤(2)最优氮源的选择，最终确定尿素、碳酸钠和硫酸镁为黑曲霉XY-1发酵生产饲用木聚糖酶的必要组分，对三种组分进行单因子实验和响应面分析，最终组建成由麸皮、尿素、碳酸钠和硫酸镁按重量份92～97∶2～6∶0.3～0.9∶0.3～1比例配制成的高效发酵培养基与其配套工艺。

实施例2：(木聚糖酶生产制备1)

本例木聚糖酶按以下步骤制备：

(1)木聚糖酶生产各级培养基的配制：

①斜面种子培养基：去皮马铃薯200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，自然pH，经0.1Mpa灭菌20min。

②固体种子培养基：300ml三角瓶中装入由麸皮、豆粕和硫酸铵按重量份80∶19∶1比例配制而成的培养基10g，按与固形物重量1∶1比例加入自来水，搅拌均匀，经0.1Mpa灭菌30min。

③固体生产培养基：将由麸皮、尿素、碳酸钠和硫酸镁按重量份92∶6∶0.6∶0.6比例配制而成的培养基加水搅拌均匀，加水量为固形物重量的1.2倍，装入布袋中，经0.1Mpa灭菌30min，冷却后均匀置于曲盘中，发酵物料厚度为2～3cm。

(2)斜面种子制备：将黑曲霉菌株XY-1划线接种在步骤(1)①斜面种子培养基上，于28℃下恒温培养5d，放存4℃冰箱保存，备用；

(3)固体种子制备：将步骤(2)斜面种子用无菌蒸馏水制备成浓度为1×10⁷～10⁸个/ml的孢子悬浮液后，吸取2ml接入步骤(1)②固体种子培养基，于28℃下恒温培养3d；将培养后固体种子培养基与水按重量1∶100比例，注入无菌蒸馏水充分搅拌，用双层纱布在无菌条件下过滤，得到浓度为1×10⁷～10⁸个/ml固体种子孢子悬浮液，待用；

(4)木聚糖酶发酵生产：将步骤(3)固体种子孢子悬浮液按生产培养基固形物重量20％接入步骤(1)③固体生产培养基中，充分搅拌混匀，于28℃曲房中培养2d；

(5)酶曲的后处理与检测：发酵结束后，置40℃鼓风条件下烘干10h、粉碎、过80目筛，得酶干曲；将经木聚糖酶活力检测达到12000IU/g的干曲包装、封口即成产品。

实施例3：(木聚糖酶生产制备2)

本例中：步骤(1)木聚糖酶生产各级培养基的配制：③固体生产培养基：由麸皮、尿素、碳酸钠和硫酸镁按重量份97∶2∶0.3∶0.3比例配制而成的培养基加水搅拌均匀，加水量为固形物重量的1.1倍，装入布袋中，经0.1Mpa灭菌30min，冷却后均匀置于曲盘中，发酵物料厚度为2～3cm；

步骤(4)木聚糖酶发酵生产：将步骤(3)固体种子孢子悬浮液按生产培养基固形物重量15％接入步骤(1)③固体生产培养基中，充分搅拌混匀后，于28℃曲房中培养2d。

其余工艺步骤按实施例2，经检测，将木聚糖酶活力达到12000IU/g的干曲包装、封口即成产品。

实施例4：(木聚糖酶生产制备3)

本例中：步骤(1)木聚糖酶生产各级培养基的配制：③固体生产培养基：由麸皮、尿素、碳酸钠和硫酸镁按重量份95∶4∶0.9∶1比例配制而成的培养基加水搅拌均匀，加水量为固形物重量的1.0倍，装入布袋中，经0.1Mpa灭菌30min，冷却后均匀置于曲盘中，发酵物料厚度为2～3cm；

步骤(4)木聚糖酶发酵生产：将步骤(3)固体种子孢子悬浮液按生产培养基固形物重量30％接入步骤(1)③固体生产培养基中，充分搅拌混匀后，于28℃曲房中培养2d；

其余工艺步骤按实施例2，经检测，将木聚糖酶活力达到13000IU/g的干曲包装、封口即成产品。

实施例5：(木聚糖酶活力及毒性测定)

木聚糖酶活力测定：取3支试管各加入0.5ml适当稀释的待测酶液，与用pH5.5的0.1mol/l乙酸-乙酸钠缓冲液配制的1％木聚糖底物一起40℃水浴预热5min；在第1、2试管中各加入0.5ml木聚糖底物，40℃精确反应15min，反应完后在3支试管中各加入1.5ml的DNS试剂，并在第3支试管中补加0.5ml木聚糖底物；取出并摇匀3支试管后在沸水浴中反应5min，迅速冷却至室温，用水定容至5.0ml，以第3支试管试液为对照在540nm波长下测定第1、2支试管试液的吸光度，吸光度在0.2～0.4之间为宜。酶活性定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖的酶量定义为一个活力单位(IU)。

本发明木聚糖酶产品经小鼠急性经口毒性试验，小鼠急性毒性最大耐受量为20g/kg体重，作为饲用木聚糖酶添加剂使用较为安全。

Claims (3)

1、一种高产木聚糖酶的黑曲霉菌株(Aspergillus niger)XY-1，CGMCCNo.2139。

2、一种饲用木聚糖酶，其特征在于该饲用木聚糖酶可用黑曲霉菌株XY-1为生产菌种，接种于由麸皮、尿素、碳酸钠和硫酸镁按重量份92～97∶2～6∶0.3～0.9∶0.3～1比例配制成的固体培养基中，经发酵、培养后获得。

3、一种制备权利要求2所述饲用木聚糖酶的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

(1)黑曲霉菌株XY-1各级培养基的配制，包括：

①斜面种子培养基：去皮马铃薯200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，自然pH，经0.1Mpa灭菌20min；

②固体种子培养基：300ml三角瓶中装入由麸皮、豆粕和硫酸铵按重量份80∶19∶1比例配制而成的培养基10g，按与固形物重量1∶1比例加入自来水，搅拌均匀，经0.1Mpa灭菌30min；

③固体生产培养基：先将麸皮、尿素、碳酸钠和硫酸镁按重量份92～97∶2～6∶0.3～0.9∶0.3～1比例配制成固体培养基；再将该固体培养基与水按重量1∶1～1.3的比例加水并搅拌均匀，装入布袋中，经0.1Mpa灭菌30min，冷却后均匀置于曲盘中，发酵物料厚度为2～3cm；

(2)斜面种子制备：将黑曲霉菌株XY-1划线接种在步骤(1)①斜面种子培养基上，于28℃下恒温培养5d，放存4℃冰箱保存，备用；

(3)固体种子制备：将步骤(2)斜面种子用无菌蒸馏水制备成浓度为1×10⁷～10⁸个/ml的孢子悬浮液后，吸取2ml接入步骤(1)②固体种子培养基，于28℃下恒温培养3d；将培养后固体种子培养基与水按重量1∶100比例，注入无菌蒸馏水充分搅拌，用双层纱布在无菌条件下过滤，得到浓度为1×10⁷～10⁸个/ml固体种子孢子悬浮液，待用；

(4)发酵生产：将步骤(3)固体种子孢子悬浮液按生产培养基固形物重量15％～30％接入步骤(1)③固体生产培养基中，充分搅拌混匀，于28℃曲房中培养2d；

(5)酶曲的后处理与检测：发酵结束后，置40℃鼓风条件下烘干10h、粉碎、过80目筛，得酶干曲；将经木聚糖酶活力检测达到10000～13000IU/g的干曲包装、封口即成产品。