CN103689241A - 一种高活力饲用复合酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高活力饲用复合酶的制备方法，属于酶制剂制备技术领域。以高产饲用复合酶的菌株黑曲霉DM-18为出发菌株，并进行培养基优化和发酵工艺改进，经特定发酵条件下的液体深层混合发酵，制得一种酶系全、酶活力高、耐受温度较强、耐pH值较宽泛的饲用复合酶。制备的发酵液粗酶液中含有多种酶活力，其中，蛋白酶活力6500-6700U/ml、甘露聚糖酶活力1500-1700U/ml、α-半乳糖酶活力1200-1300U/ml、果胶酶活力1000-1200U/ml。在30-75℃，pH值2-7时各酶均有较高的酶活力，达到80%以上，更加适合饲料工业加工工艺需求，加工后的饲料中酶活损失低。
Description
技术领域
本发明属于酶制剂制备技术领域，具体是一种高活力饲用复合酶的制备方法。
背景技术
国内外的大量研究表明，在饲料中添加酶制剂可促进动物对营养物质的消化吸收，提高饲料利用率，增强动物防病抗病能力，其主要功能有以下几个方面：(1)补充动物内源酶的不足，提高饲料的消化率和利用率。酶制剂促进了消化道对碳水化合物和其它营养物质的消化和吸收，提高了饲料的转化效率，有利于动物的生长。(2)消除饲料中的抗营养因子，降低动物消化道食糜的黏度，改善消化机能，有利于营养物质吸收。(3)改善肠道菌群分布，提高动物健康状况。酶制剂降解非淀粉多糖后产生的甘露寡聚糖能促进双歧杆菌、酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌等有益菌群增殖，进而限制沙门氏菌、弯曲杆菌和梭酸芽孢杆菌等致病细菌生长。(4)参与动物内分泌调节，提高畜禽体内激素代谢水平，通过影响机体的激素代谢促进家禽生长。(5)减轻畜牧生产对环境的污染。几乎在所有的植物饲料中，绝大部分磷酸盐以植酸形式存在(肌醇六磷酸)。由于单胃动物消化道中植酸酶的活力很低，大部分植酸磷被排出体外，这样不仅浪费磷源，且造成环境污染。添加植酸酶，可替代饲料配方中50％～70％的碳酸氢钙，向环境排泄的磷相应减少30％以上，在环境保护中发挥巨大作用。(6)促进细胞包围的淀粉、蛋白质、脂肪的释放，通过水解细胞壁，使营养物质被充分吸收。
在禽畜产品养殖中应用饲用酶制剂既能提高饲料的消化率和利用率，提高畜禽及鱼类的生产性能，又能减少畜禽排泄物中的氮、磷的排泄量，保护水体和土壤免受污染，因而饲用酶制剂作为一类高效、无毒副作用和环保型的“绿色”饲料添加剂在21世纪将有着十分广阔的应用前景。
饲用酶制剂的商业化应用在国外也只有不到二十年的历史。英国在1988年以前，酶制剂在鸡饲料的添加率几乎等于零，而到了1993年，鸡饲料酶制剂的添加率已达到95％以上。饲用酶制剂在我国的应用始于1992年，2005年我国饲用酶制剂的年销售量已达到1万吨以上。饲用酶制剂作为一类高效、无毒、无副作用和环保型的“绿色”饲料添加剂在21世纪将有十分广阔的应用前景。我国配合饲料2009年产量达1.4亿吨，其中按50％左右加酶0.1％计，则用酶约7万吨。据国内市场预测分析，2010年饲用复合酶制剂的市场容量预计达到7.5万吨，而国内饲用酶制剂的产能不足2万吨，因此，饲用酶制剂在我国还有很大的市场空间和潜力。目前我国饲用酶制剂的市场已经初步形成，并逐步发展，各类酶制剂在国内有良好的发展势头和前景。
我国各地主要粮食作物差异较大，酶制剂对潜在饲料资源的利用和新饲料资源的开发有较大的作用。由此人们迫切需要发展酶制剂等环保节能型绿色饲料添加剂。我国政府也正积极通过禁止在饲料中使用抗生素、激素等方式来保障饲料和食品的安全，维护生态平衡。预计未来10年内，随着科技水平不断提高，生产成本的下降，饲用酶的产销量必然大幅度提高。饲用酶制剂在生产中的普遍应用虽然还面临着许多问题，但随着生物技术特别是基因工程技术和生产技术的提高，都将逐一解决。随着人们生活水平的提高及环境意识的增强，饲用酶制剂以其不产生残留、无抗药性、不污染环境等优势将会进一步被推广应用。
目前，饲用复合酶的生产主要有以下三种方法：1.完全复配法：既生产和购买各种单一酶制剂，按配方复配，再加分散剂、稀释剂等加工而成。主要缺点是成本高，使用时不易将酶活较高而剂量很少的酶制剂同大量饲料混合均匀，因而严重影响了使用的效果，这在无形中又增加了使用成本，使不少经营者望而却步，给推广和应用带来了障碍。2.多菌株混合发酵，自然互补酶系法：采用几个菌种混合发酵，互补产酶法获得与复配法较为接近的复合酶产品，之后只需稍加调整即为产品，但多菌种发酵的技术难度非常大，因为不同的菌种的各自生理特性，混合培养难免相互影响，要使它们在相同培养基上生长并合成不同的酶有一定困难。3.单菌种发酵，补加酶法：通过菌种筛选获得优良菌株，该菌株可以高产多种酶，且这些酶组成合理，能满足简单的饲料配方要求，用这样的菌株发酵后获得复合酶，再按不同的动物的不同年龄的生长需要加以补加和调整即可。
综上所述，采用单一菌种发酵生产饲用复合酶是最简单、饲用效果最好、成本最低的一种生产方法，中国专利CN101608175B公开了一种复合酶制剂及其制备方法和应用，以黑曲霉为出发菌株，经液体深层发酵制备的复合酶含有以下酶种及活性：液体酸性β-甘露聚糖酶，1300u/ml，液体a-半乳糖苷酶，300u/ml，适用于饲料和石油工业。中国专利CN101591619B公开了一种黑曲霉菌株及其应用，该菌株可以同时高产木聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶等，可生产动物饲喂用复合酶，各种酶活最适pH值为4-6。
由此看来制备一种酶活力高、热稳定性好、最适pH范围宽泛的饲用复合酶仍是本行业及广大畜禽养殖户的迫切需要。
发明内容
本发明所解决的技术问题是以高产饲用复合酶的菌株黑曲霉（Aspergillus niger）DM-18为出发菌株，并进行培养基优化和发酵工艺改进，经特定发酵条件下的液体深层混合发酵，制得一种酶系全、酶活力高、耐受温度较强、耐pH值较宽泛的饲用复合酶。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高活力饲用复合酶制备方法包括如下步骤：
（1）菌种活化
将保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌种接种于斜面培养基，28-34℃培养36-48h进行菌种活化，如此活化2-4次；
所述斜面培养基组成为：干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，琼脂20g，中草药粉剂5-20g,蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃～90℃保持2～4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃～78℃保持3～4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5。
（2）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤（1）活化后斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶中，液体种子培养基装量100毫升，28-34℃、80-120rpm摇床培养36-48h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以8%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养基装量1000毫升，28-34℃、80-120rpm摇床培养36-48h；
④种子罐培养：将三级种子以8%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，种子罐培养基装量100L，控制pH值为5-7，培养温度28-30℃，搅拌速度200-400rpm，通风量（V/V）1:0.8-1.2,培养时间36-48h，溶解氧10-20%；
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，中草药粉剂15-25g,海藻糖10-30g,蒸馏水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min。
所述种子罐培养基组成为：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，鱼粉10-15g，氯化钙6-10g，氯化铵1-3g，磷酸氢二钠1-2g，中草药粉剂15-20g，海藻糖10-30g，纯净水l000mL，pH值5-7，121℃灭菌20min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108-8.0x108个/ml；
（3）发酵罐发酵
将步骤（2）中种子罐液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度28-30℃，搅拌速度200-700r/m，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将步骤（2）中种子罐液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至30-34℃，恒温培养15-20h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30%；
PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5-7；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；
放罐标准：60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
所述发酵培养基组成为：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，鱼粉10-15g，氯化钙6-10g，氯化铵1-3g，磷酸氢二钠1-2g，中草药粉剂30-50g，海藻糖10-30g，纯净水l000mL，pH值5-7，121℃灭菌20min。
所述补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25%，鱼粉1.0-1.5%，氯化钙0.6-1.0%，氯化铵0.1-0.3%，磷酸氢二钠0.1-0.2%，中草药粉剂5-10%，不足部分纯净水补足，pH值5-7，121-123℃灭菌30-40min。
（4）发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体饲用复合酶。
所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5-5%中草药粉剂。
本发明制备的发酵液粗酶液中含有多种酶活力，其中，蛋白酶活力6500-6700U/ml、甘露聚糖酶活力1500-1700U/ml、α-半乳糖酶活力1200-1300U/ml、果胶酶活力1000-1200U/ml。
对本发明制备的发酵液粗酶液进行酶的热稳定性试验和pH稳定性试验，试验结果表明：在30-75℃，pH值2-7时各酶均有较高的酶活力，达到80%以上。
本发明的高产饲用复合酶的黑曲霉菌株具体为黑曲霉（Aspergillus niger）DM-18，是从湖南省津市市洋由乡腐殖土腐殖土、稻草混合土样分离得到的黑曲霉（Aspergillus niger）HYX0022经经紫外诱变、紫外亚硝酸诱变、紫外线亚硝基胍复合诱变，然后对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产饲用复合酶的黑曲霉DM-18。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院邮编：430072），保藏号为CCTCC NO：M 2013541，分类命名黑曲霉（Aspergillus niger）DM-18。
本发明提供的高产饲用复合酶的黑曲霉DM-18(CCTCC NO：M 2013541)具有以下微生物学特征：
1、形态学特征：
黑曲霉DM-18，生物学形态为包括分生孢子、孢梗、顶囊、产孢结构等几部分。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450μm，分生孢子梗发生于基质。孢梗茎1000-3000(长度)×12-20(直径)μm，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近似球形，直径35-50μm，表面全面可育；产孢结构双层，梗基15-20(长度)×3-4.0(直径)μm，瓶梗6-8(长度)×2-4(直径)μm，分生孢子球形或近球形，较小，直径3.5-5.0μm，褐色，壁粗糙。
2、培养学特征：
黑曲霉DM-18在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，28℃4天直径65mm；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，有少量渗出液；菌落反面略带黄色。
3、生理生化特征：
黑曲霉DM-18可在马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉，糖蜜等上生长，最适PH值4.6，最适生长温度28-34℃，最适产酶温度28-30℃。
黑曲霉DM-18的筛选技术路线为：原始菌株分离、筛选与鉴定→出发菌株→斜面培养→孢子悬液的制备→诱变处理→平板分离→初筛→复筛→再复筛→扩大实验(发酵性能测定)。
有益效果：
1.本发明的高活力饲用复合酶的制备方法，以高产饲用复合酶的菌株黑曲霉DM-18为出发菌株，并进行培养基优化和发酵工艺改进，采用梯度降温和梯度升温的发酵工艺，同时予以追加接种和适时补料，尤其是梯度降温和梯度升温的发酵工艺显著提高了出发菌株的抗应激能力，致使菌种的产酶能力最大限度地显现。并且本发明对培养基组成实施全程优化，添加了具有抗热应激原作用的黄芩、柴胡，添加了具有调整和修复机体功能、增强机体的免疫功能、具有微生态调节功能的黄芪、党参等，进一步增强了微生物在同一发酵环境下的机体功能性、传代适应性和共同协作性，进而增强了微生物的代谢功能，使得本发明所产饲用复合酶活力高、耐受温度较高、稳定性强、适于工业化生产。
2.本发明制备的发酵液粗酶液中含有多种酶活力，其中，蛋白酶活力6500-6700U/ml、甘露聚糖酶活力1500-1700U/ml、α-半乳糖酶活力1200-1300U/ml、果胶酶活力1000-1200U/ml。对发酵液粗酶液进行酶的热稳定性试验和pH稳定性试验，试验结果表明：在30-75℃，pH值2-7时各酶均有较高的酶活力，达到80%以上。
3.本发明制备的饲用复合酶包括甘露聚糖酶、α-半乳糖酶、果胶酶和蛋白酶，从而形成一种针对饲料原料的多酶复合体系，即可生产饲用复合酶，且该复合酶中的各种酶活最适pH值在2-7之间，适合动物胃肠道的消化和吸收环境，这种饲用复合酶可以广泛应用在畜禽饲料中，能够降低抗营养因子，提高消化率，具有良好的经济效益，同时也有利于保护生态环境，推动畜牧业的健康发展。
4.本发明制备的高活力饲用复合酶热稳定性和pH稳定性强，更加适合饲料工业加工工艺需求，加工后的饲料酶活损失低。
5.本发明采用液体深层发酵，产品质量更稳定，饲用复合酶杂质少，纯度高。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1 饲用复合酶酶活力测定
1）酶活力单位定义：
蛋白酶酶活力单位定义：在40℃、pH5.5.条件下，1min水解酪蛋白产生1μmol酪氨酸的酶量为1个酶活力单位，以U/ml表示。
甘露聚糖酶活力单位定义：在40℃、pH5.5条件下，1min从浓度为5mg/ml的刺槐豆胶溶液中水解释放相当于1μmol甘露糖的还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位，以U/ml表示。
α-半乳糖酶活力单位定义：在40℃、pH 5.5条件下，1min分解对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖生成1μmol对硝基酚所需的酶量为1个α-半乳糖苷酶酶活单位，以U/ml表示。
果胶酶活力单位定义：在40℃、pH5.5条件下，1min从浓度为10mg/ml的果胶溶液中水解释放相当于1μmol的还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位，以U/ml表示。
2）测定：将实施例4粗酶液用蒸馏水进行适当稀释，取四支具塞试管，分别在三支(三个重复)中加入0.1ml经稀释的饲用复合酶粗酶液，第四支试管中加入0.1ml经煮沸5min的灭活酶液作为对照，与用pH5.5的0.2mol/l乙酸-乙酸钠缓冲液配制的底物（具体底物浓度见步骤1）所述的酶活力单位定义）一起于40℃水浴中预热5min；在各试管中加入0.1ml底物，40℃精确反应30min,反应完成后在四支试管中加入0.6mlDNS试剂，摇匀，煮沸10min灭活显色，迅速冷却到室温，用水定容到5.0ml,在550nm波长下测定吸光度。调整饲用复合酶粗酶液的稀释倍数（用蒸馏水稀释），使测定的吸光度数值在标准曲线测定范围之内。
3）结果：经测定，实施例4得到的发酵液发酵液粗酶液中含有多种酶活力，其中，蛋白酶活力6700U/ml、甘露聚糖酶活力1700U/ml、α-半乳糖酶活力1300U/ml、果胶酶活力1200U/ml。
实施例2
一种高活力饲用复合酶制备方法包括如下步骤：
（1）菌种活化
将保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌种接种于斜面培养基，28℃培养36h进行菌种活化，如此活化2次；
所述斜面培养基组成为：干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，琼脂20g，中草药粉剂5g,蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪20份；党参10份；柴胡10份；黄芩10份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3倍重量的水，控制温度70℃保持2h，添加混合物料2倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至60℃保持3h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1。
（2）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤（1）活化后的宇佐美曲霉斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶中，液体种子培养基装量100毫升，28℃、80rpm摇床培养36h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以8%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养基装量1000毫升，28℃、80rpm摇床培养36h；
④种子罐培养：将三级种子以8%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，种子罐培养基装量100L，控制pH值为5，培养温度28℃，搅拌速度200rpm，通风量（V/V）1:0.8,培养时间36h，溶解氧10%；
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，中草药粉剂15g,海藻糖10g,蒸馏水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min。
所述种子罐培养基组成为：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，鱼粉10g，氯化钙6g，氯化铵1g，磷酸氢二钠1g，中草药粉剂15g，海藻糖10g，纯净水l000mL，pH值5，121℃灭菌20min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108个/ml；
（3）发酵罐发酵
将步骤（2）中种子罐液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度28℃，搅拌速度200r/m，通风量（V/V）1:1,培养时间10h；然后以1℃/h降温速率缓慢降温至10℃，恒温培养15h；继续以1℃/h降温速率缓慢降温至2℃，此时，将步骤（2）中种子罐液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20h；最后以1℃/h升温速率缓慢升温至10℃，恒温培养15h；继续以1℃/h升温速率缓慢升温至30℃，恒温培养15h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15%；
PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；
放罐标准：60%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
所述发酵培养基组成为：玉米粉50g，豆粉15g，麸皮10g，鱼粉10g，氯化钙6g，氯化铵1g，磷酸氢二钠1g，中草药粉剂30g，海藻糖10g，纯净水l000mL，pH值5，121℃灭菌20min。
所述补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，鱼粉1.0%，氯化钙0.6%，氯化铵0.1%，磷酸氢二钠0.1%，中草药粉剂5%，不足部分纯净水补足，pH值5，121℃灭菌30min。
（4）发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体饲用复合酶。
所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5%中草药粉剂。
经上述制备方法得到的发酵液粗酶液中含有多种酶活力，其中，蛋白酶活力6500U/ml、甘露聚糖酶活力1500U/ml、α-半乳糖酶活力1200U/ml、果胶酶活力1000U/ml。
实施例3
一种高活力饲用复合酶制备方法包括如下步骤：
（1）菌种活化
将保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌种接种于斜面培养基，34℃培养48h进行菌种活化，如此活化4次；
所述斜面培养基组成为：干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，琼脂20g，中草药粉剂20g,蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪30份；党参18份；柴胡15份；黄芩15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加6倍重量的水，控制温度90℃保持4h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至78℃保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.5。
（2）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤（1）活化后的斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶中，液体种子培养基装量100毫升，34℃、120rpm摇床培养48h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以8%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养基装量1000毫升，34℃、120rpm摇床培养48h；
④种子罐培养：将三级种子以8%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，种子罐培养基装量100L，控制pH值为5-7，培养温度30℃，搅拌速度400rpm，通风量（V/V）1:1.2,培养时间48h，溶解氧20%；
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，中草药粉剂25g,海藻糖30g,蒸馏水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min。
所述种子罐培养基组成为：玉米粉60g，豆粉25g，麸皮15g，鱼粉15g，氯化钙10g，氯化铵3g，磷酸氢二钠2g，中草药粉剂20g，海藻糖30g，纯净水l000mL，pH值7，121℃灭菌20min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为8.0x108个/ml；
（3）发酵罐发酵
将步骤（2）中种子罐液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30℃，搅拌速度700r/m，通风量（V/V）1:3,培养时间15h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至15℃，恒温培养20h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至5℃，此时，将步骤（2）中种子罐液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养30h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至15℃，恒温培养20h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至34℃，恒温培养20h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧30%；
PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在6；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；
放罐标准：80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
所述发酵培养基组成为：玉米粉60g，豆粉25g，麸皮15g，鱼粉15g，氯化钙10g，氯化铵3g，磷酸氢二钠2g，中草药粉剂50g，海藻糖30g，纯净水l000mL，pH值7，121℃灭菌20min。
所述补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精30%，玉米粉20%，豆粉25%，鱼粉1.5%，氯化钙1.0%，氯化铵0.3%，磷酸氢二钠0.2%，中草药粉10%，不足部分纯净水补足，pH值7，123℃灭菌40min。
（4）发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体饲用复合酶。
所述调配过程加入浓缩酶液总重量5%中草药粉剂。
经上述制备方法得到的发酵液发酵液粗酶液中含有多种酶活力，其中，蛋白酶活力6600U/ml、甘露聚糖酶活力1600U/ml、α-半乳糖酶活力1240U/ml、果胶酶活力1080U/ml。
实施例4
一种高活力饲用复合酶制备方法包括如下步骤：
（1）菌种活化
将保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌种接种于斜面培养基，30℃培养42h进行菌种活化，如此活化3次；
所述斜面培养基组成为：干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，琼脂20g，中草药粉剂12g,蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min。
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪25份；党参15份；柴胡12份；黄芩12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至70℃保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.2。
（2）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤（1）活化后的斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶中，液体种子培养基装量100毫升，30℃、100rpm摇床培养42h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以8%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养基装量1000毫升，30℃、100rpm摇床培养42h；
④种子罐培养：将三级种子以8%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，种子罐培养基装量100L，控制pH值为6，培养温度30℃，搅拌速度300rpm，通风量（V/V）1:1,培养时间42h，溶解氧20%；
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，中草药粉剂20g,海藻糖20g,蒸馏水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min。
所述种子罐培养基组成为：玉米粉55g，豆粉20g，麸皮12g，鱼粉12g，氯化钙8g，氯化铵2g，磷酸氢二钠2g，中草药粉剂18g，海藻糖20g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min。
所述种子罐发酵液菌体浓度为7.5x108个/ml；
（3）发酵罐发酵
将步骤（2）中种子罐液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30℃，搅拌速度350r/m，通风量（V/V）1:2,培养时间12h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至4℃，此时，将步骤（2）中种子罐液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养25h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至30℃，恒温培养18h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧20%；
PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5.2；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；
放罐标准：70%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
所述发酵培养基组成为：玉米粉55g，豆粉20g，麸皮12g，鱼粉12g，氯化钙8g，氯化铵2g，磷酸氢二钠2g，中草药粉剂40g，海藻糖20g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min。
所述补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精25%，玉米粉15%，豆粉18%，鱼粉1.2%，氯化钙0.8%，氯化铵0.2%，磷酸氢二钠0.2%，中草药粉剂8%，不足部分纯净水补足，pH值6，123℃灭菌40min。
（4）发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体饲用复合酶。
所述调配过程加入浓缩酶液总重量3%中草药粉剂。
经上述制备方法得到的发酵液发酵液粗酶液中含有多种酶活力，其中，蛋白酶活力6700U/ml、甘露聚糖酶活力1700U/ml、α-半乳糖酶活力1300U/ml、果胶酶活力1200U/ml。
实施例5 高活力饲用复合酶的热稳定性分析
对饲用复合酶的热稳定性进行了分析，将实施例4粗酶液分别置于30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃下，每隔10分钟取样测定饲用复合酶中各组成酶的酶活。30℃、40℃、45℃、50℃下，60分钟各组成酶酶活没有下降。55℃、60℃与65℃下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的95％，60分钟各组成酶酶活降到85％。70℃下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的90％，60分钟各组成酶酶活降到85％。75℃下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的85％，60分钟各组成酶酶活降到原有酶活的80％，与现有技术相比，同样条件下达到同样酶活耐受温度平均提高了5-10℃。
实施例6 高活力饲用复合酶的pH稳定性分析
对饲用复合酶酶的pH稳定性进行了分析，将实施例4粗酶液分别置于pH值2.0、2.5、3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0下，每隔10分钟取样测定饲用复合酶中各组成酶的酶活。粗酶液pH值5.5、6.0、6.5、7.0下，60分钟各组成酶酶活没有下降。pH值4.5、3.5下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的95％，60分钟各组成酶酶活降到原有酶活的85％。pH值2.5下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的90％，60分钟降到原有酶活的85％。pH值2.0下，30分钟各组成酶酶活降到原有酶活的85％，60分钟降到原有酶活的80％，与现有技术相比，同样条件下达到同样酶活耐pH值较宽泛。
Claims (10)
1.一种高活力饲用复合酶的制备方法，其特征在于，以黑曲霉DM-18为原菌株经液体深层发酵制备。
2.如权利要求1所述高活力饲用复合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌种经菌种活化和一级、二级、三级液体种子及种子罐扩大培养得到液体种子，以6%接种量接入发酵罐发酵培养基，培养温度28-30℃，搅拌速度200-700r/m，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后以1-2℃/h降温速率缓慢降温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h降温速率缓慢降温至2-5℃，此时，将液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h；最后以1-2℃/h升温速率缓慢升温至10-15℃，恒温培养15-20h；继续以1-2℃/h升温速率缓慢升温至30-33℃，恒温培养15-20h；发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体饲用复合酶，所述调配过程加入浓缩酶液总重量0.5-5%中草药粉剂。
3.如权利要求2所述高活力饲用复合酶的制备方法，其特征在于，所述斜面培养基组成为：干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，琼脂20g，中草药粉剂5-20g,蒸馏水l000mL，pH值5.8。
4.如权利要求2所述高活力饲用复合酶的制备方法，其特征在于，所述种子培养基组成为：磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，中草药粉剂15-25g,海藻糖10-30g,蒸馏水l000mL，pH值5.5。
5.如权利要求2所述高活力饲用复合酶的制备方法，其特征在于，所述种子罐培养基组成为：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，鱼粉10-15g，氯化钙6-10g，氯化铵1-3g，磷酸氢二钠1-2g，中草药粉剂15-20g，海藻糖10-30g，纯净水l000mL，pH值5-7。
6.如权利要求2所述高活力饲用复合酶的制备方法，其特征在于，所述种子罐发酵液菌体浓度为7.0x108-8.0x108个/ml。
7.如权利要求2所述高活力饲用复合酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：玉米粉50-60g，豆粉15-25g，麸皮10-15g，鱼粉10-15g，氯化钙6-10g，氯化铵1-3g，磷酸氢二钠1-2g，中草药粉剂30-50g，海藻糖10-30g，纯净水l000mL，pH值5-7。
8.如权利要求2所述高活力饲用复合酶的制备方法，其特征在于，发酵罐发酵过程补料培养基重量百分比组成为：麦芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25%，鱼粉1.0-1.5%，氯化钙0.6-1.0%，氯化铵0.1-0.3%，磷酸氢二钠0.1-0.2%，中草药粉剂5-10%，不足部分纯净水补足，pH值5-7。
9.如权利要求2-8任一所述高活力饲用复合酶的制备方法，其特征在于，所述中草药粉剂的制备方法如下：称取黄芪20-30份；党参10-18份；柴胡10-15份；黄芩10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加3-6倍重量的水，控制温度70℃～90℃保持2～4h，添加混合物料2-3倍重量乙醇和丙醇的混合物，所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1-1.5，控制温度至60℃～78℃保持3～4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂。
10.如权利要求2所述高活力饲用复合酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌种活化
将保存完好的黑曲霉DM-18的斜面菌种接种于斜面培养基，30℃培养42h进行菌种活化，如此活化3次；
所述斜面培养基组成为：干酪素4g，磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，琼脂20g，中草药粉剂12g,蒸馏水l000mL，pH值5.8，121℃灭菌20min；
所述中草药粉剂的制备方法如下：
称取黄芪25份；党参15份；柴胡12份；黄芩12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，然后于容器中均匀混合并添加5倍重量的水，控制温度80℃保持3h，添加混合物料3倍重量乙醇和丙醇的混合物，控制温度至70℃保持4h，过滤；滤液真空浓缩后冷冻干燥获得中草药粉剂；
所述乙醇和丙醇的质量比例为1：1.2；
（2）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将步骤（1）活化后的斜面菌种以无菌水洗下孢子，接入500毫升摇瓶中，液体种子培养基装量100毫升，30℃、100rpm摇床培养42h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以8%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，液体培养基装量1000毫升，30℃、100rpm摇床培养42h；
④种子罐培养：将三级种子以8%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，种子罐培养基装量100L，控制pH值为6，培养温度30℃，搅拌速度300rpm，通风量（V/V）1:1,培养时间42h，溶解氧20%；
所述一级、二级、三级种子培养基组成为：磷酸氢二钾2g，氯化镁0.6g，氯化钾0.8g，硫酸亚铁0.02g，葡萄糖20g，中草药粉剂20g,海藻糖20g,蒸馏水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min；
所述种子罐培养基组成为：玉米粉55g，豆粉20g，麸皮12g，鱼粉12g，氯化钙8g，氯化铵2g，磷酸氢二钠2g，中草药粉剂18g，海藻糖20g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；
所述种子罐发酵液菌体浓度为7.5x108个/ml；
（3）发酵罐发酵
将步骤（2）中种子罐液体种子以6%接种量接入发酵罐，培养温度30℃，搅拌速度350r/m，通风量（V/V）1:2,培养时间12h；然后以2℃/h降温速率缓慢降温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h降温速率缓慢降温至4℃，此时，将步骤（2）中种子罐液体种子以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养25h；最后以2℃/h升温速率缓慢升温至12℃，恒温培养18h；继续以2℃/h升温速率缓慢升温至30℃，恒温培养18h；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧20%；
PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5.2；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；
放罐标准：70%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢；
所述发酵培养基组成为：玉米粉55g，豆粉20g，麸皮12g，鱼粉12g，氯化钙8g，氯化铵2g，磷酸氢二钠2g，中草药粉剂40g，海藻糖20g，纯净水l000mL，pH值6，121℃灭菌20min；
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（4）发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得固体饲用复合酶；
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